ReliaPrep™ RNA Cell Miniprep System,日本語簡易プロトコル

ReliaPrep™ RNA Cell Miniprep System,日本語簡易プロトコル ReliaPrep_RNA _Cell_QuickProtocol_201204.pdf ReliaPrep™ RNA Cell Miniprep System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z6010, Z6011, Z6012 Quick PROTOCOL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM370 をご覧ください。 Revised 2012/04 RNA の精製の際には、手袋を着用するなど、RNase の混入を避け るように注意して作業を行ってください。 プロトコール概要 準備 1. 使用する4 種類の試薬、バッファーの準備をします*。 BL+TG Buffer (BL に対して、1/100 量のTG を添加) Column Wash Solution (95% エタノールを添加) RNA Wash Solution （95% エタノールを添加） DNaseI （粉末にNuclease-Free Water を添加） プロトコール 浮遊細胞の場合 2. 浮遊細胞を、300 x g 5 分間遠心して、細胞を回収します。 3. 沈殿した細胞を滅菌済みの冷却した1xPBS で洗浄します。300 x g 5 分間遠心して、上清をきれいに除きます。 4. 細胞数に応じてBL+TG Buffer を加えます（表を参照） 細胞数 BL + TG Buffer 100% ｲｿﾌﾟﾛﾊﾟﾉｰﾙ 1 x 102 ~ 5 x 105 100μl 35μl 5 x 105 ~ 2 x 106 250μl 85μl 2 x 106 ~ 5 x 106 500μl 170μl 5. BL+TG Buffer を加えたのち、ゲノムDNA のせん断のため、ボルテックス もしくは7-10 回のピペッティングを行います。 （注：>2×106の細胞からの精製の場合には、ライセートを20Gの針を4-5回通して、 ゲノムDNA のせん断を行います。） 6. 表にしたがって、サンプルに100% イソプロパノールを加えて、ボルテックス します（5 秒間） 7. 開封したミニカラムをCollection Tube をセットして、サンプルを加えて室 温（20-25℃）で遠心(12,000-14,000 x g, 30 秒間)します。 8. Collection Tube に貯まった液（フロースルー）を捨てて、再度ミニカラム をセットし、500μl のRNA Wash Solution をミニカラムに加えて、遠心を行 います(12,000-14,000 x g, 30 秒間)。 9. DNase Incubation mix を調製します。 ボルテックスを避けて穏やかに混合してください。表の液量は1 サンプル分になります。サン プル数に応じて液量を計算して、混合したものを調製してください。 10. DNase Incubation mix を30μl、ミニカラムに添加して、室温で15 間分反応させます。 11. 反応後、そのまま200μl のColumn Wash Solution をミニカラムに加 えて遠心します(12,000-14,000 x g, 15 秒間)。 12. さらに500 μ l のRNA Wash Solution を加えて遠心します (12,000-14,000 x g, 30 秒間)。 13. ミニカラムを新しいCollection Tube に移し替えて、300μl のRNA Wash Solution を加えて、遠心します(12,000-14,000 x g, 2 分間)。 14. ミニカラムを溶出用のElution Tube に移し替えて、下表を参考にして 溶出用のNuclease-Free Water をミニカラムに加えて、遠心します (12,000-14,000 x g, 1 分間)。Elution Tube の蓋同士が当たらないよ うに蓋を外側に向けます。 細胞数 Nuclease-Free Water 1 x 102 ~ 5 x 105 15μl 5 x 105 ~ 2 x 106 30μl 2 x 106 ~ 5 x 106 50μl 15. 溶出されたRNA は、チューブのキャップを閉めて-70℃で保管します。 Solution Volume ｘ サンプル数 ＝合計 Yellow Core Buffer 24μl MnCl2, 0.09M 3μl DNase I 3μl 細胞にBL+TG Buffer を加えて、ボルテッ クスやピペッティングで溶解する。 100%のイソプロパノールを加えて、5 秒間 ボルテックスする。 ミニカラムをCollection Tube にセットする。 ライセートをミニカラムに移し、30 秒間、遠心 する。フロースルーは、捨てる。 ミニカラムを新しいCollection Tube に移し 替えて、RNA Wash Solution を300μl 加 えて、最高速で2 分間遠心する。 ミニカラムをElution Tube に移し替えて、 Nuclease-Free Water を15~50μl 加え て、1 分間遠心する。 RNA Wash Solution を500μl 加えて、30 秒 間遠心し、通過した液体を捨てる。 DNase Incubation Mix を用意して、ミニカラム へ30μl をむらなく加える。15 分間反応する。 Column Wash Solution を200μl 加えて、15 秒間遠心する。 RNA Wash Solution を500μl 加えて、30 秒 間遠心する。 精製したRNA は、-70℃で保管する。 ReliaPrep™ RNA Cell Miniprep System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z6010, Z6011, Z6012 Quick PROTOCOL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM370 をご覧ください。 Revised 2012/04 プロトコール 接着細胞の場合 ２．培地を除いたのち、細胞を滅菌済みの冷却した1xPBSを加えて洗浄します。PBSをきれいに除きます。 プレートの種類 Wash (PBS/well) Lysis (BL+TG Buffer) 96-well 100μl 100μl 48-well 250μl 100μl 24-well 500μl 100μl 6-well 2.0ml 250μl T-25 flask 5.0ml 500μl ３．ウェルの大きさに応じて、BL＋TG Bufferを加えて、滅菌済みのチューブに移し替えます。 4. ゲノムDNAのせん断のため、ボルテックスもしくは7-10回のピペッティングを行います。 （注：>2×106の細胞からの精製の場合には、ライセートを20Gの針を4-5回通して、ゲノムDNAのせん断を行います。） 5. 加えたBL+TG Bufferの液量に応じて、100% イソプロパノールをサンプルに加え、ボルテックスします（5秒間） 細胞数 BL + TG Buffer 100% ｲｿﾌﾟﾛﾊﾟﾉｰﾙ 1 x 102 ~ 5 x 105 100μl 35μl 5 x 105 ~ 2 x 106 250μl 85μl 2 x 106 ~ 5 x 106 500μl 170μl 6. 開封したミニカラムをCollection Tubeをセットして、サンプルを加えて室温（20-25℃）で遠心(12,000-14,000 x g, 30秒間)します。 7. Collection Tubeに貯まった液（フロースルー）を捨てて、再度ミニカラムをセットし、500μlのRNA Wash Solutionをカラムに加えて、遠心を行います(12,000-14,000 x g, 30秒間)。 8. DNase Incubation mixを調製します。 9. DNase Incubation mixを30μl、カラムに添加して、室温で15分間反応させます。 10. 反応後、そのまま200μlのColumn Wash Solutionをミニカラムに加えて遠心します(12,000-14,000 x g, 15秒間)。 11. さらに500μlのRNA Wash Solutionを加えて遠心します(12,000-14,000 x g, 30秒間)。 12. ミニカラムを新しいCollection Tubeに移し替えて、300μlのRNA Wash Solutionを加えて、遠心します(12,000-14,000 x g, 2分間)。 13. ミニカラムを溶出用のElution Tubeに移し替えて、表を参考にして溶出用のNuclease-Free Waterをミニカラムに加えて、遠心します(12,000-14,000 x g, 1分間)。Elution Tubeの蓋同士が当たらないように蓋を外側に向けます。 細胞数 Nuclease-Free Water 1 x 102 ~ 5 x 105 15μl 5 x 105 ~ 2 x 106 30μl 2 x 106 ~ 5 x 106 50μl 14. 溶出されたRNAは、チューブのキャップを閉めて-70℃で保管します。 ◎RNA Wash Solution, Column Wash Solutionの調製 *キットのサイズに応じて添加量が異なります 添加後は、ふたをしっかり閉めて、15-30℃で保管してください。 ◎BL+TG Bufferの調製 BL Bufferに対して1/100量の1-Thioglycerol (TG)を加えてください。調製したBL+TG Bufferは、2-10℃で30日間利用できます。 ◎DNaseI の調製 凍結乾燥したDNaseIにNuclease-Free Waterを加えて溶解します。溶解する際には、穏やかに撹拌し、ボルテックスはしないでください。溶解したDNaseI溶液は、使用量に応じて分注して、-20℃で保存します。 ボルテックスを避けて穏やかに混合してください。表の液量は1サンプル分になります。サンプル数に応じて液量を計算して、混合したものを調製してください。 カタログ番号 RNA wash Solution Column Wash Solution + 95% エタノール + 95% エタノール Z6012 350ml 36ml Z6011 60ml 7.5ml Z6010 20ml 1.5ml Solution Volume ｘ サンプル数 ＝合計 Yellow Core Buffer 24μl MnCl2, 0.09M 3μl DNase I 3μl