テクニカル資料

Technical and Legal References 略語およびシンボルマーク 2 アミノ酸と核酸データ アミノ酸構造式 4 アミノ酸の略語および分子量 4 ペプチド結合の化学式 4 コドン表 4 核酸の塩基対構造 5 IUPACによるヌクレオチドの両義性コード 5 各種NTPの特性 5 プラスミドとタンパク質の数量データ 汎用プラスミドのコピー数 5 汎用核酸の長さおよび分子量 5 核酸とタンパク質の汎用換算式 6 アガロース/ポリアクリルアミドゲル分析 色素移動度：ポリアクリルアミド変性ゲル 6 色素移動度：ポリアクリルアミド未変性ゲル 6 色素移動度：アガロースゲル（0.5-1.4%） 6 アガロースゲル濃度と直鎖状DNAの 　至適分離サイズ 6 アクリルアミドゲル濃度とタンパク質の 　至適分離サイズ 6 大腸菌 汎用大腸菌株の遺伝子型 7 大腸菌遺伝子型の説明 8 EndA+またはEndA-大腸菌 選択の重要性 9 大腸菌株制限の表現型 10 抗生物質：機能と耐性機構 10 実験用溶液の調製と特性 バッファー・溶液の調製法 11 バッファーの温度変化によるpHの影響 12 耐熱性DNAポリメラーゼの特性 12 様々なアッセイ法で利用される検出波長 蛍光または発色によるアッセイ 13 発光（ルシフェラーゼベース）によるアッセイ 13 ラジオアイソトープの特性 13 プロメガの細胞溶解剤とレポーターアッセイ/ タンパク質定量法との適合性 14 制限酵素 制限酵素用バッファーの組成（1X） 15 末端付近に制限酵素認識部位を持つ PCR産物を切断する能力 15 スター活性の要因 15 プロメガの各種10Xバッファー使用における 制限酵素の相対活性値、反応温度、熱不活性化 16 制限酵素における部位特異的なメチル化の影響 18 IUPAC核酸によるヌクレオチドの両義性コード 19 認識配列のアルファベット順リスト 19 一般的な制限酵素のイソシゾマー 20 切断末端別の制限酵素 22 プライマーとシークエンス情報 バクテリオファージRNAポリメラーゼ 　プロモーター配列について 23 in vitro転写/翻訳の鋳型とするPCR産物用の T7プライマーの設計法 23 プロメガのシークエンシング用プライマー 24 プロメガのオリゴヌクレオチドの形状と濃度 25 製品使用上の注意事項 製品に関する注意、保証 26 「トレードマーク、サービスマーク、 　使用制限、特許、その他の注意点」 26 テクニカル資料 1 Technical and Legal References www.promega.co.jp ● Technical and Legal References Technical Reference 略語およびシンボルマーク a α alpha Ab antibody Ac-DEVD-AMC acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-methyl coumarin (fluorogenic substrate for caspase-3/7) Ac-DEVD-CHO acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-1-aldehyde (reversible aldehyde inhibitor of caspase-3/7) Ac-DEVD-pNA acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-pNA (colorimetric substrate for caspase-3/7) Ac-YVAD-AMC acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp-amino methyl coumarin (fluorogenic substrate for caspase-1) Ac-YVAD-CHO acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp-1-aldehyde (reversible aldehyde inhibitor of caspase-1) ADP adenosine diphosphate Ad-2 adenovirus-2 AKAP A-kinase anchoring protein a.m.u. atomic mass unit AMC 7-amino-4-methyl coumarin amol attomole (10–18 mole) AMP adenosine monophosphate AMV avian myeloblastosis virus AP alkaline phosphatase AP1, 2 activator protein 1, 2 APC film automatic processor-compatible film ARE AU-rich element ATP adenosine triphosphate b β beta BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate BDNF brain-derived neurotrophic factor BMV brome mosaic virus bp base pairs BRET bioluminescence resonance energy transfer BSA bovine serum albumin BYDV barley yellow dwarf virus c CaM KII calcium/calmodulin-dependent protein kinase II cAMP adenosine-3′,5′-cyclic monophosphate (cyclic AMP) CAT chloramphenicol acetyltransferase CBZ benzyloxycarbonyl CCD charge-coupled device (camera) CCLR Cell Culture Lysis Reagent cdc2 cell division cycle 2 protein cDNA complementary DNA cfu colony forming unit cGMP guanosine-3′,5′-cyclic monophosphate (cyclic GMP) Ci Curie CIAP calf intestinal alkaline phosphatase CKI, CK-1 casein kinase I CKII, CK-2 casein kinase II cm centimeter CMM canine pancreatic microsomal membranes CMV cytomegalovirus CN 4-chloro-1-naphthol (a horseradish peroxidase substrate) CNBr cyanogen bromide CNS central nervous system CNTF ciliary neurotrophic factor CODIS COmbined DNA Index System cpm counts per minute CPP32 caspase-3 (DEVDase) CREB cAMP response element binding protein Ct cycle threshold CTP cytidine triphosphate CXR carboxy-X-tetramethylrhodamine d Da daltons DAB diaminobenzidine DAG diacylglycerol DAPI 4′,6-diamidino-2-phenylindole DEPC diethyl pyrocarbonate DEVDase caspase protease activity on the DEVD peptide ddRNAi DNA-directed RNA interference diAcFAM diacetyl carboxyfluorescein DLR Dual-Luciferase® Reporter DMSO dimethyl sulfoxide DNA deoxyribonucleic acid DNA-PK DNA-dependent protein kinase DNase deoxyribonuclease dNTP deoxynucleotide triphosphate DOGS dioctadecylamidoglycyl spermine DOPE L-dioleoyl phosphatidylethanolamine DPPIV dipeptidyl peptidase IV dsDNA double-stranded DNA dsRNA double-stranded RNA DTT dithiothreitol e ED50 effective dose (for 50% of effect) EDTA ethylenediaminetetraacetic acid EGF epidermal growth factor EGFR epidermal growth factor receptor EGTA ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid ELISA enzyme-linked immunosorbent assay em emission ERK1, 2 extracellular signal-regulated protein kinase 1, 2 EtBr ethidium bromide EtOH ethanol ex excitation f FAB/MS fast atomic bombardment mass spectrometry FACS fluorescence-activated cell sorting FGF fibroblast growth factor FITC fluorescein isothiocyanate FITC-VAD-FMK FITC-carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-[O-methyl]- fluoromethylketone (fluorescent marker for caspase activity) FL fluorescein fmol femtomole (10–15 mole) g γ gamma g gram GAPDH glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor GFAP glial fibrillary acidic protein GFP green fluorescent protein GLB Glo Lysis Buffer GMO genetically modified organism GMP guanosine monophosphate GPDH glycerol 3-phosphate dehydrogenase GQ genome qualified GST glutathione-S-transferase GTP guanosine triphosphate h 3H tritium h human HC high concentration hCL1 synthetic CL1, a protein degradation signal HCV hepatitis C virus HDPE high-density polyethylene HIV human immunodeficiency virus hluc+ codon-optimized firefly luciferase gene hlucCP+ hluc+ with 3′ hCL1 and hPEST sequences hlucP+ hluc+ with 3′ hPEST sequence hPEST synthetic PEST, a protein degradation signal HPLC high-pressure or high-performance liquid chromatography hRluc synthetic Renilla luciferase gene hRlucCP hRluc with 3′ hCL1 and hPEST sequences hRlucP hRluc with 3′ hPEST sequence HRP horseradish peroxidase HSV herpes simplex virus HTP high throughput HTS high-throughput screening i IC50 inhibitory concentration (50% inhibition) ICC immunocytochemistry ICE interleukin-1β-converting enzyme (caspase-1) IGF insulin-like growth factor IgG immunoglobulin G IgY immunoglobulin Y (chicken egg yolk immunoglobulin) IHC immunohistochemistry IL-4 interleukin-4 IPTG isopropyl β-d-thiogalactopyranoside iso-dC isodeoxycytosine iso-dG isodeoxyguanosine IVEC in vitro expression cloning IVT in vitro transcription J JNK c-Jun N-terminal kinase JOE 6-carboxy-4′,5′-dichloro-2′,7′-dimethoxy-fluorescein k kb kilobase; kilobase pairs kDa kilodalton Km Michaelis-Menten constant （次ページにつづく） 2 テクニカルサービス　TEL: 03-3669-7980 FAX: 03-3669-7982 E-mail: prometec@jp.promega.com ● Technical and Legal References Technical Reference 略語およびシンボルマーク（つづき） l λ lambda L liter LAR Luciferase Assay Reagent LDH lactate dehydrogenase LDPE low-density polyethylene LNGFR low-affinity NGF receptor (p75 neurotrophin receptor) LSC liquid scintillation counting luc native firefly luciferase gene luc+ synthetic firefly luciferase gene LY 294002 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4 H-1-benzopyran-4-one (PI-3 kinase inhibitor) m m murine; milli M molar mAb monoclonal antibody MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry MAO monoamine oxidase MAPK mitogen-activated protein kinase MCS multiple cloning site MEK MAPK kinase mg milligram (10–3g) MGFP Monster Green® Fluorescent Protein µg microgram (10–6g) min minute µl microliter (10–6L) µM micromolar (10–6M) miRNA micro RNA ml milliliter (10–3L) MLCK kinase 338, myosin light chain kinase M-MLV Moloney murine leukemia virus mm millimeter (10–3m) mM millimolar (10–3M) mRNA messenger RNA MTS 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide MW molecular weight n N Normal NaOAc sodium acetate NBT nitro blue tetrazolium NED N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride NF N-terminal fusion NF-κB nuclear factor kappa B NGF nerve growth factor nmol nanomole (10–9 mole) NMR nuclear magnetic resonance nt nucleotide NT-3, NT-4 neurotrophin-3, neurotrophin-4 NTP nucleotide triphosphate (same as rNTP) o OCT1 octamer-binding transcription factor 1 ONPG o-nitrophenyl β-d-galactopyranoside p P450 cytochrome P450 pAb polyclonal antibody PAGE polyacrylamide gel electrophoresis PARP poly (ADP-ribose) polymerase PCR polymerase chain reaction PD 98059 2′-amino-3′-methoxyflavone, MEK1 inhibitor PES phenazine ethosulfate PEG polyethylene glycol pg picogram (10–12g) Pgp P-glycoprotein Pi inorganic phosphate PKA cAMP-dependent protein kinase PKC protein kinase C PKG cGMP-dependent protein kinase PI 3-K phosphatidylinositol 3-kinase PLB Passive Lysis Buffer PMA phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA), PKC activator pmol picomole (10–12 mole) PMP paramagnetic particle PMS phenazine methosulfate PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride pNA p-nitroaniline PNGase F peptide N-glycosidase F PNPP p-nitrophenyl phosphate Poly(A) polyadenylation sequence PPase protein phosphatase PTPase protein tyrosine phosphatase PTK protein tyrosine kinase PTT protein truncation test PVDF polyvinylidene fluoride PVP polyvinylpyrrolidone Q qPCR quantitative PCR qRT-PCR quantitative reverse transcriptase PCR r r recombinant RAPD random amplified polymorphic DNA RF DNA replicative form DNA RISC RNA-induced silencing complex RLB Reporter Lysis Buffer RLU relative light units Rluc native Renilla luciferase gene RNA ribonucleic acid RNAi RNA interference RNase ribonuclease rNTP ribosylnucleotide triphosphate, (same as NTP) ROS reactive oxygen species rRNA ribosomal RNA RT reverse transcriptase RT-PCR reverse transcription PCR s SAM S-adenosylmethionine SAM streptavidin matrix SAP shrimp alkaline phosphatase SB 203580 (4-[4′-fluorophenyl]-2-[4′-methylsulfinylphenyl]-5-[4′-pyridyl] imidazole), a p38 MAP kinase inhibitor SDS sodium dodecyl sulfate shRNA short hairpin RNA siRNA short interfering RNA SNP single nucleotide polymorphism SP1 specificity protein 1 SSB single-stranded DNA binding protein ssDNA single-stranded DNA St stearated STR short tandem repeat SV40 simian virus 40 t TAE tris acetate EDTA TAP tobacco acid pyrophosphatase TBE tris borate EDTA TCA trichloroacetic acid TdT terminal deoxynucleotidyl transferase TE Tris-EDTA buffer TEMED N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine TFIIB transcription factor IIB TGFβ1,2 transforming growth factor β1, 2 TK thymidine kinase TLC thin-layer chromatography Tm melting temperature TMB 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine TMR carboxy-tetramethylrhodamine TNFα tumor necrosis factor-α TPA 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate TPCK N-p-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone Trk tyrosine kinase neurotrophin receptor family tRNA transfer RNA TTP thymidine triphosphate TUNEL TdT-mediated dUTP nick-end labeling u u unit UTP uracil triphosphate v (v/v) volume:volume ratio VAChT vesicular acetylcholine transporter Vmax maximum velocity (enzyme kinetics) w (w/v) weight:volume ratio x X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside Z Z-DEVD-R110 bis-(N-CBZ-L-aspartyl-L-glutamyl-L-valyl-aspartic acid amide) rhodamine 110 (fluorogenic substrate for caspase 3/7) Z-VAD-FMK carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-[O-methyl]-fluoromethylketone (pan caspase inhibitor) zmol zeptomole (10–21 mole) 3 Te c h n i c a l a n d L e g a l R e f e r e n c e s www.promega.co.jp ● Technical and Legal References Technical Reference Neutral–Nonpolar R Groups Neutral–Polar R Groups Acidic R Groups Basic R Groups 4092MA04_3A Glycine (Gly or G) HH HH O O– H N+ C C L-Alanine (Ala or A) H CH3 HH O O– H N+ C C L-Valine (Val or V) CHH HH O O– H N+ C C H3C CH3 L-Isoleucine (IIeu or I) CHH HH O O– H N+ C C CH2 CH3 H3C L-Leucine (Leu or L) H CH2 HH O O– H N+ C C CH H3C CH3 L-Phenylalanine (Phe or F) H CH2 HH O O– H N+ C C L-Proline (Pro or P) CH2 CH2 HH O O– H N+ C C CH2 L-Methionine (Met or M) H CH2 HH O O– H N+ C C CH2 S CH3 L-Serine (Ser or S) H CH2 HH O O– H N+ C C OH L-Threonine (Thr or T) CH HH O O– H N+ C C OH H CH3 L-Tyrosine (Tyr or Y) H CH2 HH O O– H N+ C C OH L-Tryptophan (Trp or W) H CH2 HH O O– H N+ C C C NH CH L-Asparagine (Asn or N) H CH2 HH O O– H N+ C C C O NH2 L-Glutamine (Gln or Q) H CH2 HH O O– H N+ C C CH2 C O NH2 L-Cysteine (Cys or C) H CH2 HH O O– H N+ C C SH L-Aspartic acid (Asp or D) H CH2 HH O O– H N+ C C C – O O L-Glutamic acid (Glu or E) H CH2 HH O O– H N+ C C CH2 C – O O L-Lysine (Lys or K) H CH2 HH O O– H N+ C C CH2 CH2 H3N CH2 + L-Arginine (Arg or R) H CH2 HH O O– H N+ C C CH2 CH2 C NH + NH2 H2N L-Histidine (His or H) H CH2 HH O O– H N+ C C C C NH HC H N+ アミノ酸構造式 アミノ酸の略語および分子量 アミノ酸 3文字表記 1文字表記 分子量 Alanine Ala A 89Da Arginine Arg R 174Da Asparagine Asn N 132Da Aspartic acid Asp D 133Da Asparagine or aspartic acid Asx B 133Da Cysteine Cys C 121Da Glutamine Gln Q 146Da Glutamic acid Glu E 147Da Glutamine or glutamic acid Glx Z 147Da Glycine Gly G 75Da Histidine His H 155Da Isoleucine Ile I 131Da Leucine Leu L 131Da Lysine Lys K 146Da Methionine Met M 149Da Phenylalanine Phe F 165Da Proline Pro P 115Da Serine Ser S 105Da Threonine Thr T 119Da Tryptophan Trp W 204Da Tyrosine Tyr Y 181Da Valine Val V 117Da アミノ酸の平均分子量は110Da コドン表 2番目 U C A G UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys U UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys C U UUA Leu UCA Ser UAA Stop UGA Stop A UUG Leu UCG Ser UAG Stop UGG Trp G CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg U CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg C C CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg A CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg G AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser U AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser C A AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg A AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg G GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly U GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly C G GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly A GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly G コドンの方向は5’→3′ 停止コドンは太文字 AUG開始コドンは太文字/斜体 3番目（3’末端側） 1番目（5’末端側） 4737MA H R1 HH H N+ C O C O– + H R2 HH H N+ C O C O– H R1 HH H N+ C O C H R2 H N C O C O– carboxy terminus amino terminus ペプチド結合の化学式 R1およびR2は2種類のアミノ酸の各側鎖基 4 テクニカルサービス　TEL: 03-3669-7980 FAX: 03-3669-7982 E-mail: prometec@jp.promega.com ● Technical and Legal References Technical Reference H 4090MA04_3A N N N H O O N N H – H – H CH2 N O H H H O N N – O N H O O CH3 CH2 N – H H – N H N H N N N H O CH2 Cytosine Guanine Thymine Adenine O=P—O—CH2 O O 5′ Phosphate O—P=O O O 3′ Hydroxyl O—P=O O O 5′ Phosphate O=P—O O O 3′ Hydroxyl HO OH 核酸の塩基対構造 汎用核酸の長さおよび分子量 核　酸 塩基長 分子量* lambda DNA 48,502 (dsDNA) 3.2 × 107 pBR322 DNA 4,361 (dsDNA) 2.8 × 106 28S rRNA 4,800 1.6 × 106 23S rRNA (E. coli) 2,900 1.0 × 106 18S rRNA 1,900 6.5 × 105 16S rRNA (E. coli) 1,500 5.1 × 105 5S rRNA (E. coli) 120 4.1 × 104 tRNA (E. coli) 75 2.5 × 104 * シークエンスに基づく分子量 核酸の平均分子量 1. Average MW of a dsDNA base pair = 660. 2. Average MW of a ssDNA base = 330. 3. Average MW of an RNA base = 340. 参考資料 1. Daniels, D.L. et al. (1983) Appendix II: Complete annotated lambda sequence. In: Lambda II, ed., R.W. Hendrix et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 519. 2. Sutcliffe, J.G. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3737. 3. Sutcliffe, J.G. (1979) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43, 77. 汎用プラスミドのコピー数 **収量 プラスミド サイズ 複製起点* コピー数 （ml培養液あたり） 文献 pGEM® series 2,700bp mutated pMB1 300–700 1.8–4.1µg 1 pUC 2,700bp mutated pMB1 500–700 2.9–4.1µg 1 pBR322 4,400bp pMB1 >25 >0.23µg 2 ColE1 4,500bp ColE1 >15 >0.15µg 3 pACYC 4,000bp p15A ~10 ~0.09µg 4 pSC101 9,000bp pSC101 ~6 ~0.12µg 5 HaloTag® pHT2 5,000bp mutated pMB1 300–700 3.3–7.6µg 1 pGL series 5,000bp mutated pMB1 300–700 3.3–7.6µg 1 pRL series 4,000bp mutated pMB1 300–700 2.7–6.0µg 1 phRL series 4,000bp mutated pMB1 300–700 2.7–6.0µg 1 phRG series 4,000bp mutated pMB1 300–700 2.7–6.0µg 1 pCBG and pCBR series 5,000bp mutated pMB1 300–700 3.3–7.6µg 1 phMGFP 4,700bp mutated pMB1 300–700 3.1–7.1µg 1 pGEM®-T/T Easy 3,000bp mutated pMB1 300–700 2.0–4.6µg 1 pGeneClip™ series 5,000bp mutated pMB1 300–700 3.3–7.6µg 1 psiCHECK™-1/2 4,000–6,000bp mutated pMB1 300–700 2.7–9.1µg 1 psiSTRIKE™ series 4,000bp mutated pMB1 300–700 2.7–6.0µg 1 pTnT™ 2,900bp mutated pMB1 300–700 1.9–4.4µg 1 pCMVTnT™ 4,000bp mutated pMB1 300–700 2.7–6.0µg 1 pACT and pBIND series 6,000bp mutated pMB1 300–700 4.0-9.1µg 1 pALTER®-1/Ex1 5,800bp pMB1 >25 >0.3µg 3 pALTER®-Ex2 5,800bp p15A ~10 ~0.13µg 4 pSP 2,500bp mutated pMB1 300–700 1.6–3.8µg 1 pCI, pSI 3,600bp mutated pMB1 300–700 2.4–5.5µg 1 * pMB1、mutated pMB1およびColE1を持つプラスミドは共に不適合グループに属する ため互いに不適合ですが、これらはp15AまたはpSC101レプリコンを持つプラスミ ドとは完全に適合します。 ** 理論上のプラスミド収量は、細胞2.0×109個/ml 菌体培養液（37℃、16時間培養） と仮定し、報告されているコピー数、各プラスミドのサイズから算出した値。 参考資料 1. Summerton, J., Atkins, T. and Bestwick, R. (1983) Anal. Biochem. 133, 79. 2. Holmes, D.S. and Quigley, M. (1981) Anal. Biochem. 114, 193. 3. Jansz, H.S., Pouwels, P.H. and Schiphorst, J. (1966) Biochem. Biophys. Acta 123, 626. 4. Birnboim, H.C. and Doly, J. (1979) Nucl. Acids Res. 7, 1513. 5. Birnboim, H.C. (1983) Meth. Enzymol. 100, 243. 各種NTPの特性 Absorbance λmax at at λmax for pH 7.0 1M Solution (E) NTP MW* (nm) (pH 7.0) α-S dATP 507.3 259 15,400 α-S dCTP 483.3 271 9,100 α-S dGTP 523.3 252 13,700 α-S dTTP 498.3 267 9,650 ATP 507.2 259 15,400 CTP 483.2 271 9,000 dITP 492.2 249 12,200 dUTP 468.2 262 10,200 GTP 523.2 253 13,700 UTP 484.2 260 10,000 dATP 491.2 259 15,400 dCTP 467.2 272 9,100 dGTP 507.2 253 13,700 dTTP 482.2 267 9,600 iso-dC 481.2 260 6,300 iso-dG 507.2 292 11,000 * 無水和の遊離酸としての分子量 吸光度/核酸濃度換算式 (observed absorbance at λmax) = molar concentration of nucleic acid absorbance at λmax for 1M solution 参考資料 1. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. IUPACによるヌクレオチドの両義性コード Y = T or C (pyrimidine) R = G or A (purine) M = A or C (amino) K = G or T (keto) S = G or C (strong interaction: 3 H bonds) W = A or T (weak interaction: 2 H bonds) B = G or T or C (not A) V = G or C or A (not T, not U) D = G or A or T (not C) H = A or C or T (not G) N = G or A or T or C (unknown nucleotide) 5 Te c h n i c a l a n d L e g a l R e f e r e n c e s www.promega.co.jp ● Technical and Legal References Technical Reference 色素移動度：ポリアクリルアミド未変性ゲル 色素は表示の2本鎖DNA長と同じポイントに移動する。 ゲル濃度（％） ブロモフェノールブルー キシレンシアノール 3.5 100bp 460bp 5.0 65bp 260bp 8.0 45bp 160bp 12.0 20bp 70bp 15.0 15bp 60bp 20.0 12bp 45bp Adapted from Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 色素移動度：ポリアクリルアミド変性ゲル 色素は表示の2本鎖DNA長と同じポイントに移動する。 ゲル濃度（％） ブロモフェノールブルー キシレンシアノール 5.0 35bp 140bp 6.0 26bp 106bp 8.0 19bp 75bp 10.0 12bp 55bp 20.0 8bp 28bp Adapted from Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. アクリルアミドゲル濃度とタンパク質の至適分離サイズ ゲル濃度（％） 至適分離サイズ（kDa） 8 40–200 10 21–100 12 10–40 色素移動度：アガロースゲル（0.5-1.4%） 色素は表示の2本鎖DNA長と同じポイントに移動する。 色素 サイズ GoTaq® blue dye 4kb Xylene cyanol FF 4kb Bromophenol Blue 300bp Orange G 50bp GoTaq® yellow dye 10bp Some information adapted from Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 核酸とタンパク質の汎用換算式 オンラインの計算サイトwww.promega.com/biomath/でこれらの計 算が行えます。 接頭語と記号 接頭語 記号 大きさ kilo k 103 centi c 10–2 milli m 10–3 micro µ 10–6 nano n 10–9 pico p 10–12 femto f 10–15 atto a 10–18 zepto z 10–21 吸光度/DNA濃度変換 1 A260 unit of double-stranded DNA = 50µg/ml 1 A260 unit of single-stranded DNA = 33µg/ml 1 A260 unit of single-stranded RNA = 40µg/ml DNA重量/mol数変換 1µg of 1,000bp DNA = 1.52pmol (3.03pmol of ends) 1µg of pBR322 DNA = 0.36pmol DNA 1pmol of 1,000bp DNA = 0.66µg 1pmol of pBR322 DNA = 2.8µg DNA重量/mol数変換式 2本鎖DNA pmol → µg： pmol × N × 660pg × 1µg = µg pmol 106pg µg → pmol： µg × 106pg × pmol × 1 = pmol 1µg 660pg N Ｎ：塩基長（bp） 660pg/pmol：1塩基の平均分子量 1本鎖DNA pmol → µg： pmol × N × 330pg × 1µg = µg pmol 106pg µg → pmol： µg × 106pg × pmol × 1 = pmol 1µg 330pg N Ｎ：塩基長（base） 330pg/pmol：1塩基の平均分子量 タンパク質のmol数／重量変換 100pmol of 100kDa protein = 10µg 100pmol of 50kDa protein = 5µg 100pmol of 10kDa protein = 1µg 100pmol of 1kDa protein = 100ng DNA長／タンパク質分子量変換 1kb of DNA = 333 amino acids of coding capacity = 37kDa protein 270bp DNA = 10kDa protein 810bp DNA = 30kDa protein 1.35kb DNA = 50kDa protein 2.7kb DNA = 100kDa protein average MW of an amino acid = 110 daltons アガロースゲル濃度と直鎖状DNAの至適分離サイズ ゲル濃度（％） 至適分離サイズ（bp） 0.5 1,000–30,000 0.7 800–12,000 1.0 500–10,000 1.2 400–7,000 1.5 200–3,000 2.0 50–2,000 6 テクニカルサービス　TEL: 03-3669-7980 FAX: 03-3669-7982 E-mail: prometec@jp.promega.com ● Technical and Legal References Technical Reference 汎用大腸菌株の遺伝子型 大腸菌の遺伝子は下記の対立遺伝子変異以外は野性型とします。 特記しない限りＦ’因子は野性型で、λ-です。*マークで表した大腸菌はコンピテントセルとしてプロメガから購入頂けます。また太文字がついて るものはグリセロールストックとしてお求めいただけます。 大腸菌株 遺伝子型 BL21(DE3) F–, ompT, hsdSB (rB –, mB –), dcm, gal, λ(DE3) *BL21(DE3)pLysS F–, ompT, hsdSB (rB –, mB –), dcm, gal, λ(DE3), pLysS (Cmr ) BMH 71-18 mutS thi, supE, ∆(lac-proAB), [mutS::Tn10(tetr )] [F′, tra D36, proAB, laqI qZ∆M15] C600 (1) thi-1, thr-1, leuB6, lacY1, tonA21, supE44 C600hfl (1) thi-1, thr-1, leuB6, lacY1, tonA21, supE44, hflA150::Tn10(tetr ) DH1 (2) recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rK –, mK+), supE44, relA1 DH10B F–, mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ∆M15, ∆lacX74, deoR, recA1, endA1, araD139, ∆(ara, leu)7697, galU, galK, λ-, rpsL(strr ), nupG DH5α™ φ80dlacZ∆M15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rK –, mK+), supE44, relA1, deoR, ∆(lacZYA-argF) U169, phoA DM1 (3) F′, dam13::Tn9(Cmr ) dcm, mcrB, hsdr-M+, gal1, gal2, ara-, lac-, thr-, leu-, tonR, tsxR, Suo ES1301 mutS lacZ53, thyA36, rha-5, metB1, deoC, IN(rrnD-rrnE), [mutS201::Tn5] *HB101 (4) thi-1, hsdS20 (rB –, mB –), supE44, recA13, ara-14, leuB6, proA2, lacY1, galK2, rpsL20(strr ), xyl-5, mtl-1 JM101 (5) supE, thi, ∆(lac-proAB), F′ (traD36, proAB, lacI qZ∆M15) *JM109 (5) endA1, recA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rK –, mK+), relA1, supE44, ∆(lac-proAB), [F′, traD36, proAB, lacI qZ∆M15] JM109(DE3) (5) endA1, recA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rK –, mK+), relA1, supE44, ∆(lac-proAB), [F′, traD36, proAB, lacI qZ∆M15], λ(DE3) JM110 (5) rpsL(strr ), thr, leu, thi, hsdR17 (rK –, mK+), lacY, galK, galT, ara, tonA, tsx, dam, dcm, supE44, ∆(lac-proAB), [F′, traD36, proAB, lacI qZ∆M15] *KRX [F′, traD36, ∆ompP, proA+ B+, lacI q, ∆(lacZ)M15] ∆ompT, endA1, recA1, gyrA96 (Nalr ), thi-1, hsdR17 (rK –, mK + ), e14– (mcrA–), relA1, supE44, ∆(lac-proAB), ∆(rhaBAD)::T7 RNA Polymerase KW251 supE44, galK2, galT22, metB1, hsdR2, mcrB1, mcrA, [argA81::Tn10(tetr )], recD1014 LE392 (6) hsdR514, (rK –, mK+), supE44, supF58, lacY1 or ∆(lacIZY)6, galK2, galT22, metB1, trpR55 NM522 (7) supE, thi, ∆(lac-proAB), ∆hsd5 (rK –, mK –), [F′, proAB, lacI qZ∆M15] NM538 (8) supF, hsdR (rK –, mK+), trpR, lacY NM539 (8) supF, hsdR (rK –, mK+), lacY, (P2) Stbl2™ F–, mcrA, ∆(mcrBC-hsdRMS-mrr), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, supE44, relA1, λ–, ∆(lac-proAB) Stbl4™ mcrA, ∆(mcrBC-hsdRMS-mrr), recA1,endA1, gyrA96, thi-1,supE44, relA1, λ–, ∆(lac-proAB), gal, F′{proAB+, lacl q, Z∆M15, Tn10(tet R)} SURE® e14–, (mcrA–) ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)171, endA1, supE44, thi-1, gyrA96, relA1, lac, recB, recJ, sbcC, umuC::Tn5 (kanr ), uvrC, [F′ proAB, lacl qZ∆M15::Tn10 (tet r )] TOP10 F–, mcrA, ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80lacZ∆M15, ∆lacX74, deoR, recA1, araD139, ∆(ara, leu)7697, galU, galK, rpsL (strR), endA1, nupG TOP10F′ F′{lacl q Tn10 (tetR)}, mcrA, ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80lacZ∆M15, ∆lacX74, deoR, recA1, araD139, ∆(ara-leu)7697, galU, galK, rpsL (strr ), endA1, nupG XL1-Blue recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rK –, mK+), supE44, relA1, lac, [F′, proAB, lacl qZ∆M15::Tn10(tetr )] XL10-Gold® Tetr , ∆(mcrA)183, ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, endA1, supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, lac Hte [F′ proAB lacl qZ∆M15, Tn10 (Tet r ) Amy Camr ] Y1089 (9) ∆(lacU169), proA+, ∆(lon), araD139, strA, hflA150, [chr::Tn10(tetr )], (pMC9) Y1090 (9) ∆(lacU169), proA+, ∆(lon), araD139, strA, supF, rpsL(strr ), [trpC22::Tn10 (tetr )], (pMC9), hsdR (rK –, mK+) 表示 F’：F’エピソームを持ち、菌株によっては特徴が加えられます。 λ（）：宿主菌ゲノムにポリメラーゼ遺伝子を持つバクテリアファージ λが組み込まれています。pMC9はlaclqを持つpBR322で、amp耐性およ びtet耐性を供与します。 参考資料 1. Jendrisak,J., Young, R.A.and Engel,J. (1987) In: Guide to Molecular Cloning Techniques, Berger, S.and Kimmel, A.,eds., Academic Press, San Diego, CA. 2. Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. 166, 557. 3. Lorow-Murray, D. and Bloom, F. (1991) Focus 13, 20. 4. Lacks, S. and Greenberg, J.R. (1977) J. Mol. Biol. 114, 153. 5. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985) Gene 33, 103. 6. Murray, N. et al. (1977) Mol. Gen. Genet. 150, 53. 7. Gough, J. and Murray, N. (1983) J. Mol. Bio. 166, 1. 8. Frischauf, A. et al. (1983) J. Mol. Biol. 170, 827. 9. Huynh, T., Young, R.A. and Davis, R. (1985) In: DNA Cloning, Vol. 1, Glover, D., ed., IRL Press Ltd., Oxford, UK. 7 Te c h n i c a l a n d L e g a l R e f e r e n c e s www.promega.co.jp ● Technical and Legal References Technical Reference 大腸菌遺伝子型の説明 遺伝子型 説明 変異による効果 ara-14 アラビノース代謝変異 アラビノース異化作用の阻害 araD L-リブロースリン酸4-エピメラーゼ変異 アラビノース異化作用の阻害 argA N-アセチルグルタミン酸シンターゼ変異 最少培地での増殖にアルギニンが必要 cycA D-アラニン、グリシン、D-セリン、D-サイクロ 炭素の供給源としてD-アラニンを利用不能 セリンの輸送、L-アラニンキャリアーに関連 dam アデニンメチラーゼ変異 5′…GmATC…3′配列内のアデニンのメチル化阻害 dapD スクシニルジアミノピメリン酸 スクシニルCoAの合成を障害し、コハク酸またはリジン+メチオニンの アミノトランスフェラーゼ変異 補充を要求 dcm シトシンメチラーゼ変異 5′…CmCAGG…3′と5′…CmCTGG…3′配列内のシトシンのメチル化阻害 deoC デオキシリボース-リン酸アルドラーゼ変異 deoR 調節遺伝子の変異 長いプラスミドの効果的な増殖 デオキシリボース合成遺伝子からの発現を安定化 dut1 dUTPをdUMP+PPiに変換する dUTPからdUMPへの変換が障害され、dUTPプールが増加し、チミジンの デオキシウリジントリホスファターゼ変異 代わりにウラシルが取込まれる。dUTPの安定した取込みにはung遺伝子 の変異が必要。 endA1 エンドヌクレアーゼI 変異 精製プラスミドDNAの質が向上 galE galETKオペロンの一部で、UDPガラクトース- バクテリオファージP1の感染に対する抵抗性獲得 4-エピメラーゼをコード galK ガラクトキナーゼ変異 ガラクトースの異化作用を阻害 galT ガラクトース-1-リン酸ウリジリルトランスフェ ガラクトースの異化作用を阻害 ラーゼ変異 gyrA96 DNAジャイレース変異 ナリジキシン酸に対する抵抗性獲得 hflA150 cll遺伝子産物の安定化を誘導するプロテアーゼ変異 λファージの溶原化頻度増大（1） hflB プロテアーゼ変異 λファージの溶原化頻度増大 hsdR 制限マイナス、修飾プラス トランスフォームしたDNAが内在性制限酵素で切断されず、クローニング (rK –, mK+) （E.coli K株メチレーションシステム） 可能。この宿主菌から調製したDNAはrK +大腸菌へトランスフォーム可能。 hsdS20 制限マイナス、修飾マイナス トランスフォームしたDNAが内在性制限酵素で切断されず、クローニン (rB –, mB –) （E.coli B株メチレーションシステム） グ可能。この宿主菌から調製したDNAはhsdS20メチラーゼによるメチル 化を受けていません。 lacl q lacリプレッサーの過剰発現 lacリプレッサーによりlacプロモーターからの転写を阻害 lacY ガラクトシドパーミアーゼ変異 ラクトース利用阻害 lacZ∆M15 β-D-ガラクトシダーゼ遺伝子の部分欠失 ベクター側（pGEM®-Z Vectorなど）から発現するα-ペプチドの補充（α相 補）により、β-ガラクトシダーゼ活性を回復。X-Galを含むプレートで組 換体を選別する青／白選択が可能。 leuB β-イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ変異 最少培地での増殖にロイシンが必要 ∆(lon) lonプロテアーゼ欠失 発現したタンパク質の分解を抑制 LysS pLysSプラスミドがホストゲノムに統合 このプラスミドを持つ菌株はtet耐性を持ち、Ｔ7リゾチーム（T7 RNAポリ メラーゼの天然阻害物質）産生により、T7 RNAポリメラーゼプロモータ ーに制御される転写のバックグラウンドが低減 (2)。 mcrA メチルシトシン制限システム変異 5′…GmCGC…3′配列でメチル化されたDNAの制限阻害 mcrB メチルシトシン制限システム変異 5′…AGmCT…3′配列でメチル化されたDNAの制限阻害 metB シスタチオンγ-シンターゼ変異 最少培地での増殖にメチオニンが必要 metC シスタチオニン-β-リアーゼ変異 最少培地での増殖にメチオニンが必要 メチオニンの生合成に関与 mtl マンニトール代謝変異 マンニトール異化作用の阻害 mutS メチル基質依存的ミスマッチ修復マイナス株 メチル化されていない新合成鎖のミスマッチ修復を阻害 ompT プロテアーゼVII（外膜タンパク質）変異 発現したタンパク質の分解を抑制 P2 P2バクテリオファージ溶原菌 P2溶原菌ではred, gam遺伝子を持つλファージの増殖を阻害（3） proA γ-グルタミルリン酸レダクダーゼ変異 proA/argD変異はプロリン合成を阻害しないが、アルギニンにより抑制。 変異体は最少培地にプロリンを放出し、プロリンアナログに耐性を獲得。 proA/argD/argRの3重変異体は最少培地+アルギニンで緩やかに増殖。 proAB プロリン代謝変異 最少培地での増殖にプロリンが必要 recA1, 組換え変異 導入DNAと宿主菌DNAの組換えを阻害するためインサートを安定に保持。 recA13 recA13宿主菌よりrecA1宿主菌の方がインサートを安定に保持します。 recB, recC エクソヌクレアーゼV変異 一般的な組換えを低減し、放射線障害の修復に影響 recD Rec BCD3量体（エクソヌクレアーゼV）は、ATP 逆位反復配列を容易に増殖 依存的にssDNAおよびdsDNAをオリゴヌクレオチド に分解。相同組換えに関与 recF 組換え・修復 変異 変異体は娘鎖のギャップ（複製後修復）を修復不能 （次ページにつづく） 8 テクニカルサービス　TEL: 03-3669-7980 FAX: 03-3669-7982 E-mail: prometec@jp.promega.com ● Technical and Legal References Technical Reference 大腸菌遺伝子型の説明（つづき） 遺伝子型 説明 変異による効果 relA ppGppシンセターゼＩ 変異 タンパク質合成のないRNA合成 未結合tRNA感受リボゾームタンパク質relA (ppGpp シンセターゼＩ) はアミノ酸枯渇に応答して新規な ヌクレオチドグアノシン5′-2リン酸-3′-2リン酸を合成 rha メチルペントースであるL-ラムノースの利用 ラムノースの異化作用を阻害 rpsL 30SリボゾームのS12サブユニット変異 ストレプトマイシン耐性獲得 sbcB エクソヌクレアーゼI変異 recBC変異株での組換え strA 変異体はリボゾームタンパク質S12を変化させる ストレプトマイシン耐性獲得 supB, supC, supG, サプレッサー変異 オーカー（UAA）変異およびアンバー（UAG）変異のサプレッサー変異 supL, supM, supN, supO supD, supE, supF サプレッサー変異 アンバー（UAG）変異のサプレッサー変異 thi-1 チアミン代謝変異 最少培地での増殖にチアミンが必要 thr スレオニン生合成変異 変異体はスレオニン要求株 thyA チミジル酸シンターゼ; ｄTTP生合成 変異体はチミジン要求株 Tn5 トランスポゾン カナマイシン耐性獲得 Tn10 トランスポゾン テトラサイクリン耐性獲得 tonA 外膜タンパク質の変異 バクテリオファージT1抵抗性獲得 traD36 転移因子変異 F′エピソーム転移阻害 trpC ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ変異; トリプトファン生合成経路の一部 trpR trpRアポリプレッサー ; トリプトファンの生合成の 調節と輸送に関与 tsx T6ファージおよびコリシンK受容体; ヌクレオシド バクテリオファージT6およびコリシンKに耐性 の特異的拡散に関わる外膜タンパク質; 抗生物質 アルビシジン（albicidin）の輸送 ung1 ウラシル-DNA N-グリコシラーゼ プラスミドDNA内へのウラシル許容 xyl-5 キシロース代謝変異 キシロース異化作用阻害 参考資料 1. Hoyt, A. et. al. (1982) Cell 31, 565. 2. Studier, F.W. (1991) J. Mol. Biol. 219, 37-44. 3. Kaiser, K. and Murray, N. (1985) In: DNA Cloning, Vol. 1, Glover, D., ed., IRL Press Ltd., Oxford, UK. EndA+またはEndA-大腸菌 選択の重要性 エンドヌクレアーゼＩは、2本鎖DNAを分解するendA遺伝子にコードされた12kDaのペリプラズム タンパク質です。大腸菌遺伝子型endA1は野生型 endA遺伝子の変異型として知られています。この変異を持つ大腸菌株はEndAネガティブ (EndA-) と呼ばれ、野生型はEndA+と表記されます。下表は EndA-およびEndA+菌株のリストです。良質なDNAは、プロメガのPureYieldTMおよびWizard® Plus SV Plasmid Purification Systemを用いてEndA+およびEndA-菌株 のどちらからでも容易に得ることができます。しかし、産生されるエンドヌクレアーゼＩのレベルは菌株の種類に依存するので、非常に多くの エンドヌクレアーゼＩを産生する菌株を用いる場合、調製したプラスミドDNAから完全にエンドヌクレアーゼＩを排除することは困難です。通常、 可能な限りEndA-菌株を使用することを推奨しています。 EndA+大腸菌株 ABLE® C KW251 ABLE® K LE392 BL21(DE3) MC1061 BMH 71-18 NM522 (all NM series strains are EndA+) CJ236 P2392 C600 PR700 (all PR series strains are EndA+) DH12S™ Q358 ES1301 RR1 HB101 TB1 HMS174 TG1 JM83 TKB1 JM101 Y1088 (all Y10 series strains are EndA+) JM110 EndA–大腸菌株 BJ5183 JM108 SURE® DH1 JM109 TOP10 DH10B KRX XLO DH20 MM294 XL1-Blue DH21 SK1590 XL10-Gold® DH5α™ SK1592 JM103 SK2267 JM105 SRB JM106 Stbl2™ JM107 Stbl4™ 9 Te c h n i c a l a n d L e g a l R e f e r e n c e s www.promega.co.jp ● Technical and Legal References Technical Reference 大腸菌株制限の表現型 抗生物質：機能と耐性機構 抗生物質 Ampicillin (Amp) Chloramphenicol (Cm) Kanamycin (Kan) Streptomycin (Sm) Tetracycline (Tet) Neomycin (Neo) Hygromycin (Hygro) Puromycin (Puro) G418 機能 ペニシリン派生物質で、バクテリアの細胞 壁合成反応を阻害 リボゾームの50Sサブユニットに結合し、 ペプチド結合の形成を妨げることにより タンパク質合成を阻害する静菌剤 70Sリボゾームに結合し、mRNAの誤読の 原因となる殺菌剤 リボゾームの30Sサブユニットに結合し、 mRNAの誤読の原因となる殺菌剤 リボゾームの30Sサブユニットに結合し、 タンパク質合成を阻害する光感受性静菌剤 原核生物70Sリボゾームサブユニットに結合し、タ ンパク質合成を阻害する殺菌剤。高濃度では、原核 生物リボゾームに類似したミトコンドリアリボゾー ムと相互作用し、その他の真核生物リボゾームの親 和性も低下させるため、真核生物に対しても有毒性 80Sリボゾームの転移を妨害するタンパク質 合成阻害剤で誤翻訳の原因となる アミノヌクレオシド抗生物質は、原核生物 および真核生物のリボゾーム上におけるペ プチジル転移反応を特異的に阻害すること によりタンパク質合成をブロックし、早期 ペプチド伸張終結の原因となる 真核生物にのみ存在する80Sリボゾームサブ ユニットに結合し、タンパク質合成を阻害 耐性機構 耐性遺伝子（bla）はペリプラズム酵素の β-ラクタマーゼをコードしており、抗生 物質のβ-ラクタム環を切断する 耐性遺伝子（cat）はアセチルトランスフェ ラーゼをコードしており、抗生物質にア セチル基を転移し、不活性化する 耐性遺伝子（kan）はアミノグリコシド ホスホトランスフェラーゼをコードして おり、抗生物質を修飾し、リボゾームと の結合を阻害する 耐性遺伝子（str）にコードされる酵素が、抗生 物質を修飾し、リボゾームとの結合を阻害する 耐性遺伝子（tet）にコードされるタンパ ク質はバクテリア膜を修飾し、抗生物質 の細胞内侵入を防ぐ バクテリアAPH（アミノグリコシドホス ホトランスフェラーゼ）遺伝子（Tn5由 来）の発現 耐性遺伝子 (hph) はホスホトランスフェラー ゼをコードし、シクリトール環 (hyosamine) 上の4-水酸基をリン酸化する。生成した 7′-O-ホスホリル-ハイグロマイシンBはin vivo、in vitroの両方で生物学的活性を失う 耐性遺伝子 (pac) はピューロマイシン Nアセチル-トランスフェラーゼをコード する 真核細胞でバクテリアAPH（アミノグリ コシドホスホトランスフェラーゼ）遺伝 子（Tn5由来）を発現し、G418を解毒 適正濃度 50-125µg/ml in water 20-170µg/ml in ethanol 30µg/ml in water 30µg/ml in water 10µg/ml in liquid culture; 12.5µg/ml in plates 50µg/ml for bacterial selection 50-1,000µg/ml for mammalian selection; 20-200µg/ml for bacterial selection 1–10µg/ml for mammalian selection G418 is often used for initial selection at 500µg/ml, with a range of 50–1,000µg/ml ストック溶液 50mg/ml 34mg/ml 50mg/ml 50mg/ml 12.5mg/ml in ethanol 25mg/ml in water 100mg/ml in HEPES buffer (pH7.0) or water 10mg/ml in HEPES buffer (pH 7.0) or water 50mg/ml in either water or 100mM HEPES (pH 7.3)— prepared in a highly buffered solution to maintain tissue culture media pH EcoK 大腸菌株 mcrA mcrBC R M C600 – + + + C600hfl – + + + DH5α™ + + – + DH10B – – – – HB101 + – – – JM109 (–) (+) – + JM109(DE3) (–) (+) – + KW251 – – – + LE392 – + – + NM538 – + – + NM539 – + – + Select96™ – – – – Stbl2™ – – – – Stbl4™ – – – – SURE® – – – – TOP10 – – – – Y1089 (–) + + + Y1090 (–) + + + 記号 ( ) = 前後世代より推定 + = 野生型 – = 変異型 大腸菌は外来DNAの侵入を防ぐために、制限システム、修飾システムを持ってい ます。通常、これらのシステムはメチラーゼと制限酵素を利用して、外来DNAと 宿主菌のDNAを区別し、外来DNAを破壊します。このようなシステムは、異種 DNAを組込んだベクターを大腸菌に導入する際に問題となります。しかし、制限 システムを除去した様々な変異株を使用することにより、その問題を解決する ことができます。 大腸菌にはmcrA, mcr BCの2つのmcr（methyl-cytosine restricting）システムとmrr （modified adenine recognition and restriction）システムがあり、それぞれメチル化 シトシン（m5C）やメチル化アデニン（m6A）を含む特殊な配列を持つDNAを制 限し、多くの研究室で使用される大腸菌はこのタイプに属します。mcrA, mcr BC, mrrメチル化制限システムは配列に特異的で、この特殊配列がメチル化されてい る場合にのみ攻撃を受けます。一方、EcoKI制限システムでは、特定の認識部位 がメチル化により防御されていない場合にDNAが制限されます。DNAはCpG methylases（M. Sss I）によりCpG配列のシトシンがメチル化され、様々なアデニ ンメチラーゼによりアデニンのメチル化を受けます。Dam（DNA adenine methyltransferase）はGATC配列を、Dcm（DNA cytosine methyltransferase）はCC(A/T) GG配列を修飾します。mcrA, mcr BCおよびmrrシステムはdcmサイトを修飾した DNAを制限せず、またmrrシステムはdam, EcoK IおよびEcoR Iサイトを修飾した DNAを制限しません (1)。 哺乳動物、高等植物や多くの原核生物のゲノムDNAにはメチルシトシンが含ま れています (2)。そのため、このようなゲノム塩基配列をクローニングし、大腸 菌で増やす場合はmcrおよびmrrシステムが欠除した大腸菌を使用する必要があ ります。 参考資料 1. Neidhardt, F.C. et al. (1996) In: Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, ASM Press, Washington, D.C. 2. Woodcock, D.M. et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17, 3469. 10 テクニカルサービス　TEL: 03-3669-7980 FAX: 03-3669-7982 E-mail: prometec@jp.promega.com ● Technical and Legal References Technical Reference バッファー・溶液の調製法 溶液 調製法 アガロースゲルサンプルバッファー (6X) TEバッファー（10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA）6mlにスクロース4gとブロモフェノール ブルー 2.5mgを溶解し、TEバッファーで10mlにメスアップします。室温保存。 7.5M酢酸アンモニウム 57.81gの酢酸アンモニウムを水に溶解し、水で100mlにメスアップします。0.2µmフィルターで 濾過滅菌します。pH5.5。 BigDye® 希釈バッファー 250mM Tris-HCl (pH9.0), 10mM MgCl2 D-ビオチン, 100mM 100mM Na2HPO4に必要量のビオチンを溶解し、100mM NaH2PO4でpH7.2に調整します。100mMリ ン酸ナトリウムバッファー (pH7.2) で必要容量までメスアップした後、0.22µmフィルターで濾過 滅菌し、無菌状態で分注します。 デンハルト溶液 (50X) 水300mlにFicoll® 5g，ポリビニルピロリドン5g，BSA 5gを溶解し、水で500mlにメスアップしま す。濾過後25mlずつ分注し、–20℃保存。 DEPC処理 処理する溶液100mlに0.2ml DEPC（diothylpyrocarbonate）を加え良く攪拌した後、ドラフトで一 晩静置。残留DEPCを不活性化するためにオートクレーブします。注意：DEPCは発ガン性物質 であるとされていますので、グローブ着用の上ドラフト内で取り扱ってください。Trisなどの一 級アミンを含む溶液にはDEPC処理を行わないで下さい。 1M DTT（dithiothreitol） 0.01M 酢酸ナトリウム (pH 5.2) 20mlにDTT 3.09gを溶解します。濾過滅菌後、1mlずつ分注し、 –20℃で保存。 0.5M EDTA (pH 8.0) 水800mlにdisodium ethylenediaminetetraacetate･2H2Oを186.1g溶解します。マグネットスタラーを 用いて良く攪拌します。NaOHでpH8.0に調整し、分注後、オートクレーブにより滅菌します。 エチジウムブロマイド, 10mg/ml 水100mlにエチジウムブロマイド 1gを溶解します。マグネットスタラーで色素が完全に溶解す るまで数時間攪拌します。容器をアルミホイルで包むか溶液を褐色瓶に移し、4℃で保存します。 注意：エチジウムブロマイドは変異誘発性であり、毒性を有します。エチジウムブロマイド溶 液を使用する際はグローブを着用し、粉末を秤量する場合はマスクをつけて下さい。 IPTG（0.1M） 脱イオン水にIPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 1.2gを溶解し、50mlにメスアップします。 濾過滅菌（0.2µm）後、5mlずつ分注して–20℃で保存します。このIPTGストック溶液は–20℃で 2-4 ヶ月安定です。 LB 脱イオン水にBacto®-tryptone 10g, Bacto®-yeast extract 5g、NaCl 5gを溶解し、脱イオン水で1Lにメ スアップします。10M NaOHでpH7.5に調整し、オートクレーブにより滅菌します。500mlずつ分 注し、室温で保存します。 5X MOPSゲルランニングバッファー DEPC処理水1.6LにMOPS (free acid) 83.72g，酢酸ナトリウム8.23gを加え攪拌し完全に溶解しま す。DEPC処理した0.5M EDTA溶液20mlを加え、10N NaOHでpH7.0に調整します。DEPC処理水で 2Lにメスアップした後、200mlずつ分注してオートクレーブします。溶液は黄色を呈しますが、 バッファーの品質に影響はありません。分注した溶液は遮光して、室温または4℃に保存します。 M9 プレート（1mM thiamine-HCl） 脱イオン水にNa2HPO4 6g、KH2PO4 3g、NaCl 0.5g、NH4Cl 1g、寒天15gを溶解し、1Lにメスアップ します。10N NaOHでpH7.4に調整後、オートクレーブし、50℃になるまで冷やします。1M MgSO4溶液2.0ml、1M CaCl2 0.1ml、20％グルコース10ml、1M thiamine-HCl 1.0mlを加えます。こ の完全培地を濾過滅菌（0.2µm）し、プレートに注ぎます。カバーをしたプレートを逆さまにし て4℃で保存します。1-2 ヶ月は安定です。 Mueller Hinton II Broth 脱イオン水に牛肉エキス300g、Bacto® casamino acids 17.5g、Bacto® soluble starch 1.5gを加え、1L にメスアップします。pH7.3に調整し、オートクレーブで滅菌します。 Mueller Hinton II Broth (cation-adjusted) 脱イオン水100mlにMgCl2・6H2O 8.36gを溶解し、マグネシウムストック溶液を調製します（Mg2+ の終濃度10mg/ml）。脱イオン水 100mlにCaCl2・2H2O 3.68gを溶解し、カルシウムストック溶液 を調製します（Ca2+の終濃度10mg/ml）。2つのストック溶液を濾過滅菌します。マグネシウムス トック溶液をMg2+終濃度10-12.5mg/mlになるように加え、カルシウムストック溶液はCa2+終濃度 20-25mg/mlになるように加えます。 フェノール (acid) (RNAにのみ使用) 50mM酢酸ナトリウム (pH 4.0) 500mlにフェノール500gを55℃に暖めて溶解します。分離した水 相（上部）を除去し、50mM酢酸ナトリウム (pH 4.0) 500mlを加え乳化させるために撹拌します。 この操作を上部の水相がpH 4.1以下になるまで繰り返し行います。 PBS (phosphate-buffered saline) 滅菌水800mlにNaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.44g、KH2PO4 0.24gを溶解します。HClでpH 7.4に調 整し、1Lにメスアップします。分注後、オートクレーブで滅菌します。 酢酸カリウム（アルカリ溶解用） 5M酢酸カリウム60mlに氷酢酸11.5ml、水28.5mlを加えます（本溶液はカリウムは3M、酢酸は5M です）。 RNAローディングバッファー 50%グリセロール、1mM EDTA、0.4%ブロモフェノールブルー、1mg/mlエチジウムブロマイドに なるように、DEPC処理水に各試薬を加えます。リボヌクレアーゼの混入を防ぐために、グレー ドの高いグリセロールを使用してください。500µlずつ分注し、–20℃に保存します。10-20µl RNA サンプル（RNA ＋サンプルバッファー）に2µlのローディングバッファーを使用します。 RNAサンプルバッファー 脱イオンホルムアミド10.0ml、37%ホルムアルデヒド3.5ml、5X MOPS 2.0mlを混合します。 500µlずつチューブに分注してキャップをしっかり閉めた後、–20℃で保存します。–20℃で保存 すれば6 ヶ月は保存できます。1種類のRNAサンプルには2つのサンプルバッファーを使用してく ださい。注意：ホルムアミドは催奇物質であり、ホルムアルデヒドは毒性を持つ発ガン物質で す。操作はドラフト内で行い、研究室の安全規定に従ってください。 （次ページにつづく） 11 Te c h n i c a l a n d L e g a l R e f e r e n c e s www.promega.co.jp ● Technical and Legal References Technical Reference バッファー・溶液の調製法（つづき） 溶液 調製法 SDSゲルサンプルバッファー (2X) グリセロール20ml、β-メルカプトエタノール5ml、10% SDS 20ml、ブロモフェノールブルー 20mg、4Xスタッキングゲルバッファー（Tris 6.06g、10% SDS 4ml [pH 6.8] を水100mlに溶解） 25mlを混合します。溶解後、水で100mlにメスアップし、12N HClでpH6.8に調整後、室温に保存 します。 10% SDS ( sodium dodecyl sulfate) 水900mlに電気泳動グレードSDS 100gを溶解（68℃に加温）します。HClでpH 7.2に調整後、1L にメスアップし、分注します。SDSは刺激剤なので粉末を秤量する場合はマスクをして下さい。 20X SSC 水800mlにNaCl 175.3g、クエン酸ナトリウム88.2gを溶解し、10N NaOHでpH 7.0に調整します。 1Lにメスアップし、分注後オートクレーブで滅菌します。 20X SSPE 水800mlにNaCl 175.3g、NaH2PO4･H2O 27.6g、EDTA 7.4gを溶解しNaOHでpH 7.4に調整します（10N NaOH溶液 約6.5ml）。1Lにメスアップし、分注後オートクレーブで滅菌します。 SOC 脱イオン水97mlにBacto®-tryptone 2.0g, Bacto®-yeast extract 0.5g、1M NaCl 1ml、1M KCl 0.25mlを加 え完全に溶解するまで攪拌します。オートクレーブの後室温まで冷まします。2Mマグネシウム ストック (1M MgCl2、1M MgSO4) 1mlと2Mグルコースストック1ml（終濃度は各20mM）を加え た後、濾過滅菌（0.2µm）します。PH7.0に合わせ、25-50mlずつに分注後、室温で保存します。 50X TAE 脱イオン水700mlにTris-base 242g、Na2 EDTA･(2H2O) 37.2gを溶解します。さらに氷酢酸57.1mlを 加え、水で1Lにメスアップします。室温または4℃で保存します。 10X TBE 脱イオン水900mlにTris-base 108g、ホウ酸55gを溶解します。さらに0.5M EDTA (pH 8.0) 40mlを加 え、水で1Lにメスアップします。室温または4℃で保存します。 TCA（trichloroacetic acid）100%溶液 500g TCAの入っているボトルに水227mlを加えます。この溶液は100％ (w/v) TCAです。 1X TEバッファー (pH 8.0) 10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA TE-saturated phenol:chloroform: isoamyl alcohol クロロホルム500mlにフェノール500gを溶解した後、イソアミルアルコール25mlを加えます。 TEバッファー（10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA）を等量加え、攪拌して乳化します。2相に分 離したら、上相を除き、再びTEバッファーを加えます。再度2相に分離したら、液相を1cm残して、 上部を除去します。褐色瓶に入れて4℃で保存します。 TE-4 buffer (pH 8.0) 脱イオン水 900mlにTris-base 2.21g、EDTA (Na2 EDTA・2H2O) 0.037g を溶解します。HClでpH8.0に 調整し、脱イオン水で1Lにメスアップします。 尿素ポリアクリルアミドゲルサンプルバッファー 脱イオンホルムアミド90mlにスクロース10g、ブロモフェノールブルー 20mg、キシレンシア ノール20mgを溶解します。その後、水で100mlにメスアップします。 X-Gal 液量が2mlになるようにN,N’-dimethylformamideにX-Gal 100mgを溶解します。500µlずつ分注した 後、遮光して–20℃で保存します。X-Galの終濃度は50mg/mlです。このX-Galストック溶液は –20℃で2-4 ヶ月安定です。 バッファーの温度変化によるpHの影響 バッファー pKa/20°C ∆pKa/10°C Mes 6.15 –0.110 Ada 6.60 –0.110 Pipes 6.80 –0.085 Aces 6.90 –0.200 Bes 7.15 –0.160 Mops 7.20 –0.013 Tes 7.50 –0.200 Hepes 7.55 –0.140 Tricine 8.15 –0.210 Tris 8.30 –0.310 Bicine 8.35 –0.180 Glycylglycine 8.40 –0.280 参考資料 Good, N.E. (1986) Biochemistry 5, 467. 耐熱性DNAポリメラーゼの特性 Taq* Tfl Tth Tli Pfu (Thermus (Thermus (Thermus (Thermococcus (Pyrococcus 由来 aquaticus) flavus) thermophilus) litoralis) furiosus) MW 80kDa 94kDa 94kDa 90kDa 92kDa Extension temperature 74°C 74°C 74°C 74°C 75°C 5′→3′ Exonuclease Activity Yes Yes Yes No No 3′→5′ Exonuclease Activity No No No Yes Yes Reverse Transcriptase Activity Weak Yes Yes No NA Predominant 70% Blunt; PCR Product 30% Single- Ends 3′-A 3′-A 3′-A Base Overhangs Blunt * GoTaq® DNA PolymeraseおよびPCR Master MixにはTaq DNA Polymeraseが含まれています。 NA = Not available. 参考資料 Newton, C.R. and Graham, A. (1994) In: PCR, BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford, U.K. 13. 12 テクニカルサービス　TEL: 03-3669-7980 FAX: 03-3669-7982 E-mail: prometec@jp.promega.com ● Technical and Legal References Technical Reference ラジオアイソトープの特性 ラジオアイソトープの核は不安定でランダムに崩壊し、異なる元素に 変ります。この崩壊に伴い高エネルギーを持つ原子構成要素が放出さ れます。これらの粒子はα粒子（2陽子＋ 2中性子）、β-粒子（電子） があり、高エネルギー放射線（γ-線, x-線）も放出されます。各ラジ オアイソトープは放射活性の50%減衰時間（半減期）で特徴づけられ ます。 ラジオアイソトープ（β線）の物性 ラジオ 比活性 アイソトープ 半減期 （mCi/mmol） 娘核 tritium [3H] 12.43 years 102–105 helium-3 carbon-14 [14C] 5,730 years 1–102 nitrogen-14 sulphur-35 [35S] 87.4 days 1–106 chlorine-35 phosphorus-33 [33P] 25.5 days 10–104 sulphur-33 phosphorus-32 [32P] 14.3 days 10–106 sulphur-32 ラジオアイソトープ（γ線／ x線）の物性 ラジオ 比活性 アイソトープ 半減期 （mCi/mmol） 娘核 iodine-131 [131I] 8.06 days 102–104 xenon-131 iodine-125 [125I] 60 days 102–106 tellurium-125 蛍光または発色によるアッセイ 表示された波長は、各製品で推奨されるもので、この推奨波長と最大 吸収/励起/蛍光波長とは異なる場合があります。 製品名（化合物） 吸収 励起/蛍光 Apo-ONE® System (rhodamine 110) — 485nm/530nm AttoPhos® System (2′-[2-benzothiazoyl]- 6′-hydroxybenzothiazole; BBT) — 435nm/555nm β-Galactosidase Enzyme Assay System (o-nitrophenol) 420nm — CaspACE™ Assay System, Colorimetric (p-nitroaniline; pNA) 405nm — CellTiter 96® Assay (MTT formazan product) 570nm — CellTiter 96® AQueous Assay (MTS formazan product) 490nm — CellTiter 96® AQueous One Solution Assay (MTS formazan product) 490nm — CellTiter-Blue® Assay (resorufin) 570nm (1) 560nm/590nm ChipShot™ Labeling and Clean-up System • Cy®3 550nm 550nm/570nm • Cy®5 650nm 650nm/670nm CytoTox 96® Assay (formazan product) 490nm — CytoTox-Fluor™ Assay — 485nm/520nm CytoTox-ONE™ Assay (resorufin) 570nm (1) 560nm/590nm DAPI (nucleic acid stain) — 360nm/460nm DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System (fluorescein) — 494nm/520nm Emax® ImmunoAssay Systems (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine; TMB) 450nm — FluoroTect™ GreenLys tRNA (BODIPY®-FL) — 502nm/510nm Griess Reagent (azo compound) 520–550nm — HaloTag® diAcFAM Ligand (after hydrolysis) — 494nm/562nm HaloTag® TMR Ligand — 555nm/585nm HaloTag® Coumarin Ligand — 353nm/442nm Hemoglobin (present in rabbit reticulocyte lysates) 300–600nm — Monster Green® Fluorescent Protein (hMGFP) — 480nm/540nm MultiTox-Fluor Assay — 400nm/505nm and 485nm/520nm Nucleic acids 260nm — PepTag® peptides 570nm 540nm/592nm Phosphatase assay (molybdate dye) 600nm or 630nm — Polysaccharides (potential contaminant in DNA preparations) 230nm — PowerPlex® Systems • 6-carboxy-4′,5′-dichloro-2′, 7′-dimethoxyfluorescein (JOE) — 520nm/548nm • carboxy-tetramethylrhodamine (TMR) — 550nm/573nm • carboxy-X-rhodamine (CXR) — 578nm/604nm • fluorescein (FL) — 494nm/520nm ProFluor® Assays • rhodamine 110 (R110) — 485nm/530nm • 7-amino-4-methyl-coumarin (AMC) — 355nm/460nm Propidium iodide (nucleic acid stain) — 540nm/620nm Protein 280nm — 1 レゾルフィンレベルは、570nmで分光光度（比色法）により定量できますが、感 度を増加させるために蛍光測定を推奨します。詳細についてはCellTiter-Blue® Cell Viability Assay Technical Bulletin #TB317またはCytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay Technical Bulletin #TB306をご覧下さい。 発光（ルシフェラーゼベース）によるアッセイ ルシフェラーゼは、基質内の化学エネルギーを光子として放出させる ことにより発光を生じる酵素です。この発光の原理は、蛍光の化学反 応とは異なり、光を発生させるために関連する分子を励起させる必要 はありません。 全てのルシフェラーゼは広いピーク幅を持った発光スペクトルを持つ ため、一般的に出来るだけ多くの可視スペクトルを測定することが推 奨されます。しかし、2つの異なるルシフェラーゼを使用するChromaLuc™ テクノロジーについてはこのルールに当てはまりません。これ らのルシフェラーゼ発光は重複する部分がありながらも明確に区別可 能な発光スペクトルを有しているため、それぞれの発光測定には異な る波長レンジを使用します。 発光波長の フィルターの 製品名 ピーク 必要性 BacTiter-Glo™ Microbial Cell Viability Assay 560nm No Filter Beta-Glo® Assay System 560nm No Filter (β-Galactosidase assay coupled to a firefly luciferase reaction) Calpain-Glo™ Protease Assay 560nm No Filter Caspase-Glo® Assays 560nm No Filter (Caspase assay coupled to a firefly luciferase reaction) CellTiter-Glo® Assay 560nm No Filter (ATP assay using firefly luciferase) (Chroma-Luc™) Click beetle luciferase (Red) CBRluc 613nm 610 long pass (Green) CBG99luc or CBG68luc 537nm 510/60 (510±30) DPPIV-Glo™ Protease Assay 560nm No Filter Firefly luciferase 560nm No Filter (luc, luc+, hluc+ or luc2 genes from pGL3 and pGL4 Vector series or other vectors such as psiCHECK™-2) Kinase-Glo® Assay and Kinase-Glo® Plus Assay 560nm No Filter (Kinase assay coupled to a firely luciferase reaction) MAO-Glo™ Assay 560nm No Filter P450-Glo™ Assays 560nm No Filter (Cytochrome P450 assay coupled to a firefly luciferase reaction) Pgp-Glo™ Assay System 560nm No Filter Proteasome-Glo™ Cell-Based Assay 560nm No Filter Renilla luciferase 480nm No Filter (Rluc or hRluc genes from pRL, phRL, phRG and pGL4 Vector series or other vectors such as psiCHECK™-1 and -2) 13 Te c h n i c a l a n d L e g a l R e f e r e n c e s www.promega.co.jp ● Technical and Legal References Technical Reference プロメガの細胞溶解剤とレポーターアッセイ/タンパク質定量法との適合性 細胞溶解剤 適合するレポーターアッセイ 適合するタンパク質定量法 (4) ウェスタンブロット (5) (1) Luciferase Assay Systemはホタルルシフェラーゼ活性のみを測定するようにデザインされています。また、シグナルの半減期は延長されていません。これらにはカタログ番 号E1500, E1501, E4030, E4550およびE1483が含まれます。 (2) β-Galactosidase Enzyme Assayに添付の停止バッファーを使用しなければ、1ＸRLBの代わりの細胞溶解剤またはライセートの希釈液として使用できます。システムに添付さ れている1M sodium carbonateを加えると沈殿が起こり、正確な測定ができなくなるため、1xCCLR, 1XGLBで調製したサンプルを用いる場合は、停止バッファーとして1M Tris baseを使用することを推奨します。 (3) 活性はRLBを使用した場合ほど高くは検出されません。CATの発現が非常に低い場合、最適な感度を得るためにRLBの使用を推奨します。 (4) どのタンパク質定量システムを用いる場合にも、最適な精度を得るためにアッセイと同濃度の細胞溶解剤を使用して標準曲線を作成してください。タンパク質定量に 問題がある場合はライセートを水でさらに希釈し、スケールを上げてアッセイしてください。 (5) ウェスタンブロット分析は、APまたはHRP標識2次抗体を用い、HRPではTMB stabilized substrate、APにはWester Blue®を用いた発色法により検出しました。細胞溶解剤（CCLR, RLB, PLB, GLB）は 1X、2X、5Ｘの各濃度でテストしました（GLBは 1Xのみ）。 (6) 異なる細胞内オルガネラ（細胞膜、核、ミトコンドリア）に対する溶解力について調べました。試験は、細胞質、ミトコンドリア、核それぞれに特異的な抗原である ERK1/2、シトクロームオキシダーゼ サブユニットＩ、ヒストンに対するウエスタンブロット分析を用いて行いました。 Cell Culture Lysis Reagent (CCLR) 1. Luciferase Assay System (1) 2. β-Galactosidase assay (β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer) (2) • GenoTechnology NI™ Protein Assay • Pierce BCA Protein Assay with Compat-Able™ Protein Assay Preparation Reagent Set • Bio-Rad RC DC™ Protein Assay • Molecular Probes NanoOrange® Protein Quantitation Kit (dilute lysate 1:10) • BioRad DC Protein Assay or Pierce BCA Protein Assay (dilute lysate at least 1:2) • Compatible • Can release cytoplasmic, mitochondrial and nuclear contents (6) Reporter Lysis Buffer (RLB) 1. Luciferase Assay System(1) 2. β-Galactosidase assay (including both β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer and Beta-Glo® Assay System) 3. CAT Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer • GenoTechnology NI™ Protein Assay • Pierce BCA Protein Assay with Compat-Able™ Protein Assay Preparation Reagent Set • Pierce Coomassie® Plus protein assay • Bio-Rad RC DC™ Protein Assay • Normal Bradford assay with 2–8µl of undiluted lysate • Molecular Probes NanoOrange® Protein Quantitation Kit (dilute lysate 1:10) • BioRad DC Protein Assay (large scale only) or Pierce BCA Protein Assay (dilute lysate at least 1:2) • Compatible • Can release cytoplasmic and nuclear contents. RLB releases nuclear contents more efficiently with a freezethaw cycle (6) Passive Lysis Buffer (PLB) 1. Luciferase Assay System(1) 2. β-Galactosidase assay (including both β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer and Beta-Glo® Assay System) 3. CAT Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer 4. Dual-Luciferase® Reporter Assay • GenoTechnology NI™ Protein Assay • Pierce BCA Protein Assay with Compat-Able™ Protein Assay Preparation Reagent Set • Pierce Coomassie® Plus protein assay • Bio-Rad RC DC™ Protein Assay • Pierce BCA Protein Assay (dilute lysate 1:10) • Molecular Probes NanoOrange® Protein Quantitation Kit (dilute lysate 1:10) • Compatible • Can release cytoplasmic and nuclear contents(6) Glo Lysis Buffer (GLB) 1. Luciferase Assay System (1) 2. Bright-Glo™ Luciferase Assay and Steady-Glo® Luciferase Assay 3. ONE-Glo™ Luciferase Assay System 4. β-Galactosidase assay (including both β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer and Beta-Glo® Assay System) (up to 45µl of lysate in assay) (2) 5. CAT Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer (up to 25µl of lysate in assay) (3) • GenoTechnology NI™ Protein Assay • Pierce BCA Protein Assay with Compat-Able™ Protein Assay Preparation Reagent Set • Bio-Rad RC DC™ Protein Assay • Pierce BCA protein assay (dilute lysate 1:10) • Molecular Probes NanoOrange® Protein Quantitation Kit (dilute lysate 1:10) • Compatible • Can release cytoplasmic, mitochondrial and nuclear contents(6) Renilla Luciferase Assay Lysis Buffer (RLALB) 1. Renilla Luciferase Assay 2. β-Galactosidase assay (up to 45µl of lysate in assay) 3. CAT Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer (up to 25µl of lysate in assay) • GenoTechnology NI™ Protein Assay • Pierce BCA Protein Assay with Compat-Able™ Protein Assay Preparation Reagent Set • Bio-Rad RC DC™ Protein Assay • Molecular Probes NanoOrange® Protein Quantitation Kit (dilute lysate 1:10) • Not tested 14 テクニカルサービス　TEL: 03-3669-7980 FAX: 03-3669-7982 E-mail: prometec@jp.promega.com ● Technical and Legal References Technical Reference スター活性の要因 標準的でない条件で制限酵素処理を行った場合に、目的の認識部位と異なった配列でDNAが切断されることがあります。“スター活性”とはこのよ うな至適化されていない条件下における認識部位に非特異的なDNAの消化を表します。最も頻繁に起こる現象 (活性)は認識配列外での1塩基置換、 欠失、及び1本鎖のニックです(1)。一般的に、推奨されるバッファーや適切な温度で制限酵素処理を行えばスター活性は生じません。多くの制限 酵素で下記の要因によりスター活性が生じることが示されています (2)。 1. 高い酵素濃度（一般的に100 units/µg以上） 2. 高いグリセロール濃度 ( 5% v/v以上） 3. Mg+2の代用としたMn+2の使用 (またはその他の2価陽イオンの代用） 4. 低い塩濃度（一般的に 25 mM以下） 5. 高い pH,（特にpH 8.0以上） 6. DMSO, エタノール, 有機溶媒の存在下 参考資料 1. Barany, F. (1988) Gene 65, 149. 2. Brown, T.A., Hames, B.D. and Rickwood, D. (1991) In: Molecular Biology Lab Fax, BIOS Scientific Publishers Limited, Oxford, United Kingdom. 末端付近に制限酵素認識部位を持つPCR産物を切断する能力 PCR産物上の制限酵素認識配列末端とPCR産物自体の末端が0, 1, 2, 3ベース離れている場合の切断能力を様々な制限酵素でテストしました（1）。精製したPCR産物 (10-50ng) を0.5unitの制限酵素を含む10µlの適切な反応バッファー中で45分間消化しました。消化能は、切断可能 (+)、切断不能 (-)、低い再現性 (±) で示しました。データは少なくと も2回の反復実験より得られ、Eaton Publishingの許可を得て追試を行いました。 参考資料 1. Zimmermann, K. et al. (1998) Digestion of terminal restriction endonuclease recognition sites on PCR products. BioTechniques 24, 582. PCR断片末端からの距離（bp） 酵素 0 1 2 3 ApaI – – ± + BamHI – ± + + BstXI – ± + + ClaI – ± + + EcoRI – ± + + EcoRV – + + + HindIII – – + + NotI – – + + PCR断片末端からの距離（bp） 酵素 0 1 2 3 PstI – – ± + SacI – ± + + SalI + + + + SmaI – ± + + SpeI + + + + XbaI – ± + + XhoI – – ± + 制限酵素用バッファーの組成（1X） pH Tris-HCl MgCl2 NaCl KCl DTT バッファー (at 37°C) (mM) (mM) (mM) (mM) (mM) A 7.5 6 6 6 — 1 B 7.5 6 6 50 — 1 C 7.9 10 10 50 — 1 D 7.9 6 6 150 — 1 E 7.5 6 6 100 — 1 F 8.5 10 10 100 — 1 G 8.2 50 5 — — — H 7.5 90 10 50 — — J 7.5 10 7 — 50 1 K 7.4 10 10 — 150 — L 9.0 10 3 100 — — MULTI-CORE™ Buffer (1X) = 25mM Tris-acetate (pH 7.5 at 37°C), 100mM potassium acetate, 10mM magnesium acetate, 1mM DTT. 備考 1. 0℃〜25℃までの範囲では、Trisバッファーの温度が10℃上昇する ごとに、TrisバッファーのpHが0.31 pH unitsずつ減少します。 2. 25℃〜37℃までの範囲では、Trisバッファーの温度が10℃上昇す るごとに、TrisバッファーのpHが0.25 pH unitsずつ減少します。 3. プロメガの制限酵素には全て10mg/ml Acetylated BSAが添付されま す。BSAは制限酵素の活性に必ずしも必要ではありませんが、多 くの制限酵素で活性の増加が認められます。全ての制限酵素消化 反応にBSAを終濃度0.1mg/mlになるように添加することを推奨し ます。 15 Te c h n i c a l a n d L e g a l R e f e r e n c e s AatII J 50–75% 10–25% <10% <10% 10–25% <10% <10% + 37°C AccI G 50–75% 25–50% 25–50% 10–25% <10% <10% 25–50% – 37°C AccIII F <10% 10–25% 25–50% 25–50% n.d. n.d. <10% – 65°C Acc65I D 10–25% 50–75% 75–100% 100% 75–100% 100–125%** 100% + 37°C AccB7I E 10–25% 50–75% 100%* <10% 100% n.d. 100% + 37°C AgeI K 25–50% 25–50% 25–50% 50–75% n.d. n.d. 100% + 37°C AluI B 75–100% 100% 75–100% 10–25% n.d. n.d. 10–25% + 37°C Alw44I C <10% 25–50% 100% 25–50% n.d. n.d. 100% + 37°C ApaI A 100% 50–75% 50–75% <10% 10–25% <10% 75–100% + 37°C AvaI B 10–25% 100% 50–75% 25–50% 100% 10–25% <10% +/– 37°C AvaII C 50–75% 50–75% 100% 25–50% n.d. n.d. 25–50% + 37°C BalI G 10–25% <10% <10% <10% n.d. n.d. <10% + 37°C BamHI E 75–100%* 75–100% 75–100% 50–75% 100% 50–75% 75–100% + 37°C BanI G 25–50% 25–50% 10–25% <10% n.d. n.d. 100% – 50°C BanII E 75–100% 75–100% 75–100% 25–50% n.d. n.d. 100% + 37°C BbuI A 100% 75–100% 75–100% <10% 10–25% 10–25% 100% + 37°C BclI C 10–25% 75–100% 100% 50–75% 50–75% 50–75% 10–25% – 50°C BglI D 10–25% 25–50% 75–100% 100% 25–50% 75–100% 100% + 37°C BglII D 25–50% 75–100% 75–100% 100% n.d. n.d. <10% – 37°C BsaMI D 10–25% 25–50% 50–75% 100% n.d. n.d. 25–50% – 65°C Bsp1286I A 100% 50–75% 25–50% 10–25% n.d. n.d. 75–100% + 37°C BsrSI D 10–25% 25–50% 10–25% 100% n.d. n.d. 100% – 65°C BssHII H 75–100% 50–75% 75–100% 50–75% n.d. 100% 75–100% – 50°C Bst98I D <10% 10–25% 10–25% 100% n.d. n.d. 25–50% – 37°C BstEII D 25–50% 50–75% 50–75% 100% n.d. n.d. 100% – 60°C BstOI C 10–25% 25–50% 100% 25–50% n.d. n.d. <10% – 60°C BstXI D <10% 10–25% 25–50% 100% 100% 75–100% 10–25% +/– 50°C BstZI D <10% <10% 10–25% 100% 10–25% 75–100% 10–25% – 50°C Bsu36I E <10% 25–50% 50–75% 25–50% 100% n.d. 50–75% – 37°C CfoI B 75–100% 100% 75–100% 25–50% n.d. n.d. 100% +/– 37°C ClaI C 75–100% 75–100% 100% 75–100% 100% 50–75% 100% + 37°C CspI K <10% 10–25% 25–50% 50–75% 100% 100–125%** 10–25% + 30°C Csp45I B 25–50% 100% 50–75% 25–50% 100% 25–50% 50–75% + 37°C DdeI D 25–50% 25–50% 50–75% 100% n.d. n.d. 25–50% +/– 37°C DpnI B 50–75% 100% 75–100% 50–75% n.d. n.d. 100% + 37°C DraI B 75–100% 100% 75–100% 50–75% n.d. n.d. 25–50% + 37°C EclHKI E <10% <10% 75–100% 10–25% 100% n.d. 50–75% + 37°C Eco47III D <10% 25–50% 50–75% 100% n.d. n.d. 25–50% + 37°C EcoICRI B 10–25% 100% 75–100% <10% 25–50% n.d. 100% + 37°C EcoRI H 25–50% 50–75% 50–75% 50–75% 75–100% 100% 100%* + 37°C EcoRV D 10–25% 25–50% 50–75% 100% 25–50% 50–75% 100% + 37°C FokI B 75–100% 100% 75–100% 25–50% n.d. n.d. 50–75% + 37°C HaeII B 50–75% 100% 50–75% 10–25% n.d. n.d. 100% – 37°C HaeIII C 75–100% 75–100% 100% 50–75% n.d. n.d. 100% – 37°C HhaI C 50–75% 75–100% 100% 50–75% n.d. n.d. 75–100% + 37°C HincII B 25–50% 100% 25–50% 50–75% 75–100% 50–75% 100% + 37°C HindIII E 25–50% 100% 75–100% 10–25% 100% 25–50% 50–75% + 37°C HinfI B 50–75% 100% 75–100% 75–100% n.d. n.d. 50–75% – 37°C HpaI J 25–50% 50–75% 25–50% 10–25% n.d. n.d. 100% – 37°C HpaII A 100% 50–75% 50–75% 10–25% n.d. n.d. 100% – 37°C www.promega.co.jp ● Technical and Legal References Technical Reference プロメガの各種10Xバッファー使用における制限酵素の相対活性値、反応温度、熱不活性化 それぞれの制限酵素に添付される10Xバッファーは100%の活性が得られるように至適化されています。ほとんどの場合、4-CORE® 10X Buffer（Buffer A〜D）の中のいずれかで十分な活性が得られます。バッファー EおよびHは、汎用される多くのクローニング用酵素に対する最適なバッファーで もあるため、プロメガの酵素の多くはこれらのバッファーを用いた活性測定が行われています。この表から複数の制限酵素で消化する場合に最 適なバッファーを選択することができます。図に示した相対活性値は、それぞれの酵素について最適なバッファーを用いた時の活性値を100%と した時の値です。 （次ページにつづく） 16 試験バッファー Promega 制限酵素 添付 バッファー A B C D E H MULTICORE™ 熱不活性化 反応温度 AatII J 50–75% 10–25% <10% <10% 10–25% <10% <10% + 37°C AccI G 50–75% 25–50% 25–50% 10–25% <10% <10% 25–50% – 37°C AccIII F <10% 10–25% 25–50% 25–50% n.d. n.d. <10% – 65°C Acc65I D 10–25% 50–75% 75–100% 100% 75–100% 100–125%** 100% + 37°C AgeI K 25–50% 25–50% 25–50% 50–75% n.d. n.d. 100% + 37°C AluI B 75–100% 100% 75–100% 10–25% n.d. n.d. 10–25% + 37°C ApaI A 100% 50–75% 50–75% <10% 10–25% <10% 75–100% + 37°C AvaI B 10–25% 100% 50–75% 25–50% 100% 10–25% <10% +/– 37°C AvaII C 50–75% 50–75% 100% 25–50% n.d. n.d. 25–50% + 37°C BalI G 10–25% <10% <10% <10% n.d. n.d. <10% + 37°C BamHI E 75–100%* 75–100% 75–100% 50–75% 100% 50–75% 75–100% + 37°C BanI G 25–50% 25–50% 10–25% <10% n.d. n.d. 100% – 50°C BclI C 10–25% 75–100% 100% 50–75% 50–75% 50–75% 10–25% – 50°C BglI D 10–25% 25–50% 75–100% 100% 25–50% 75–100% 100% + 37°C BglII D 25–50% 75–100% 75–100% 100% n.d. n.d. <10% – 37°C BsrSI D 10–25% 25–50% 10–25% 100% n.d. n.d. 100% – 65°C BssHII H 75–100% 50–75% 75–100% 50–75% n.d. 100% 75–100% – 50°C BstEII D 25–50% 50–75% 50–75% 100% n.d. n.d. 100% – 60°C BstOI C 10–25% 25–50% 100% 25–50% n.d. n.d. <10% – 60°C BstXI D <10% 10–25% 25–50% 100% 100% 75–100% 10–25% +/– 50°C BstZI D <10% <10% 10–25% 100% 10–25% 75–100% 10–25% – 50°C Bsu36I E <10% 25–50% 50–75% 25–50% 100% n.d. 50–75% – 37°C CfoI B 75–100% 100% 75–100% 25–50% n.d. n.d. 100% +/– 37°C ClaI C 75–100% 75–100% 100% 75–100% 100% 50–75% 100% + 37°C CspI K <10% 10–25% 25–50% 50–75% 100% 100–125%** 10–25% + 30°C DdeI D 25–50% 25–50% 50–75% 100% n.d. n.d. 25–50% +/– 37°C DpnI B 50–75% 100% 75–100% 50–75% n.d. n.d. 100% + 37°C DraI B 75–100% 100% 75–100% 50–75% n.d. n.d. 25–50% + 37°C Eco47III D <10% 25–50% 50–75% 100% n.d. n.d. 25–50% + 37°C EcoICRI B 10–25% 100% 75–100% <10% 25–50% n.d. 100% + 37°C EcoRI H 25–50% 50–75% 50–75% 50–75% 75–100% 100% 100%* + 37°C EcoRV D 10–25% 25–50% 50–75% 100% 25–50% 50–75% 100% + 37°C HaeII B 50–75% 100% 50–75% 10–25% n.d. n.d. 100% – 37°C HaeIII C 75–100% 75–100% 100% 50–75% n.d. n.d. 100% – 37°C HhaI C 50–75% 75–100% 100% 50–75% n.d. n.d. 75–100% + 37°C HincII B 25–50% 100% 25–50% 50–75% 75–100% 50–75% 100% + 37°C HindIII E 25–50% 100% 75–100% 10–25% 100% 25–50% 50–75% + 37°C HinfI B 50–75% 100% 75–100% 75–100% n.d. n.d. 50–75% – 37°C HpaI J 25–50% 50–75% 25–50% 10–25% n.d. n.d. 100% – 37°C HpaII A 100% 50–75% 50–75% 10–25% n.d. n.d. 100% – 37°C Hsp92I F 10–25% 75–100% 50–75% 25–50% n.d. n.d. 10–25% + 37°C Hsp92II K 10–25% 25–50% 25–50% <10% n.d. n.d. <10% + 37°C I-PpoI I-PpoI 10–25% 25–50% 25–50% 25–50% n.d. n.d. n.d. + 37°C KpnI J 100%* 25–50% 25–50% <10% 25–50% <10% 75–100% +/– 37°C MboI C 10–25% 75–100% 100% 50–75% n.d. n.d. <10% + 37°C MboII B 10–25% 100% 50–75% 75–100% n.d. n.d. 100% + 37°C MluI D 10–25% 25–50% 50–75% 100% 25–50% 100–125%** 10–25% +/– 37°C MspI B 75–100% 100% 75–100% 25–50% n.d. n.d. 25–50% + 37°C MspA1I C 25–50% 100%* 100% 10–25% n.d. n.d. 100% + 37°C NaeI A 100% 50–75% 25–50% <10% n.d. n.d. 50–75% + 37°C NarI G 75–100% 50–75% 75–100% 25–50% n.d. n.d. 50–75% + 37°C NciI B 100%* 100% 25–50% 25–50% n.d. n.d. 50–75% + 37°C NcoI D 50–75% 75–100% 75–100% 100% 100% 100–125%** 75–100% + 37°C NdeI D <10% <10% 25–50% 100% n.d. n.d. 25–50% + 37°C NdeII D <10% <10% 10–25% 100% n.d. n.d. 25–50% + 37°C NheI B 75–100% 100% 75–100% 10–25% 75–100% 10–25% 100% + 37°C NotI D <10% 10–25% 25–50% 100% 25–50% 100–125%** 25–50% + 37°C NruI K <10% <10% <10% 50–75% n.d. n.d. 10–25% + 37°C NsiI D 10–25% 50–75% 50–75% 100% 25–50% >125%** 10–25% +/– 37°C PstI H 10–25% 50–75% 50–75% 50–75% 25–50% 100% 25–50% + 37°C PvuI D 10–25% 25–50% 50–75% 100% n.d. n.d. <10% – 37°C PvuII B 25–50% 100% 50–75% 25–50% n.d. n.d. 50–75% + 37°C RsaI C 75–100% 75–100% 100% <10% n.d. n.d. <10% + 37°C SacI J 75–100% 25–50% 25–50% <10% 100% 25–50% 100% + 37°C SacII C 100% 50–75% 100% 50–75% 25–50% >125%** <10% + 37°C SalI D <10% 10–25% 25–50% 100% 25–50% 25–50% <10% + 37°C Sau3AI B 25–50% 100% 75–100% <10% n.d. n.d. 100% + 37°C ScaI K <10% 100%* 50–75% 75–100% n.d. n.d. 10–25% + 37°C SfiI B 75–100% 100% 75–100% 25–50% 75–100% 50–75% 75–100% – 50°C SgfI C 25–50% 25–50% 100% <10% n.d. n.d. <10% +/– 37°C SinI A 100% 75–100% 50–75% 10–25% n.d. n.d. 100% + 37°C SmaI J <10% <10% <10% <10% <10% <10% 100% + 25°C SnaBI B 50–75% 100% 50–75% <10% n.d. n.d. 100% – 37°C SpeI B 75–100% 100% 75–100% 75–100% 100% 25–50% 100% + 37°C SphI K 75–100% 75–100% 100%* 75–100% 100% >125%** 10–25% + 37°C SspI E 10–25% 50–75% 50–75% 75–100% 100% 100–125%** 50–75% + 37°C StuI B 75–100% 100% 75–100% 50–75% n.d. n.d. 50–75% + 37°C StyI F 25–50% 75–100% 75–100% 75–100% 10–25% 50–75% <10% + 37°C TaqI E 10–25% 25–50% 50–75% 50–75% 100% n.d. 100% – 65°C Tru9I F 75–100% 50–75% 75–100% 25–50% n.d. n.d. 25–50% – 65°C Tth111I B 50–75% 100% 75–100% 25–50% n.d. n.d. 100% – 65°C VspI D <10% 25–50% 75–100% 100% n.d. n.d. <10% + 37°C XbaI D 50–75% 75–100% 75–100% 100% 100% 100–125%** 100% – 37°C XhoI D 25–50% 75–100% 75–100% 100% 25–50% 100–125%** 10–25% + 37°C XhoII C 25–50% 25–50% 100% 10–25% n.d. n.d. <10% + 37°C XmaI B 50–75% 100% 25–50% <10% 25–50% <10% 50–75% + 37°C XmnI B 75–100% 100% 75–100% 10–25% n.d. n.d. 75–100% + 37°C テクニカルサービス　TEL: 03-3669-7980 FAX: 03-3669-7982 E-mail: prometec@jp.promega.com ● Technical and Legal References Technical Reference プロメガの各種10Xバッファー使用における制限酵素の相対活性値、反応温度、熱不活性化（つづき） * スター活性が認められるため、推奨いたしません。 ** 酵素活性は推奨するバッファーの使用に基づいていますが、いくつかの酵素でbuffer Hの使用で活性が増加します。 n.d. = テストされていません。 はゲノム品質保証を示します。これらの酵素はアガロースプラグに包埋した染色体DNAを用いてテストしています。 熱不活性化の表記 + = 95%以上不活性化（DNAは消化されない） – = 96%以下の不活性化(DNAは完全に消化されます。例：20活性ユニットの 5%［1ユニット以上］以上が残ります。） +/– = 部分的な不活性化（DNAは部分的に消化されます。） 熱不活性化実験の条件 各制限酵素の最適バッファー 50µl中に20ユニットの酵素を加え65℃、15分のインキュベーションを行った。その後、ユニット定義に従い1µgのDNAを加え1時間のインキュ ベーションを行った後、アガロースゲル電気泳動で分析した。 17 試験バッファー Promega 制限酵素 添付 バッファー A B C D E H MULTICORE™ 熱不活性化 反応温度 Hsp92I F 10–25% 75–100% 50–75% 25–50% n.d. n.d. 10–25% + 37°C Hsp92II K 10–25% 25–50% 25–50% <10% n.d. n.d. <10% + 37°C I-PpoI I-PpoI 10–25% 25–50% 25–50% 25–50% n.d. n.d. n.d. + 37°C KpnI J 100%* 25–50% 25–50% <10% 25–50% <10% 75–100% +/– 37°C MboI C 10–25% 75–100% 100% 50–75% n.d. n.d. <10% + 37°C MboII B 10–25% 100% 50–75% 75–100% n.d. n.d. 100% + 37°C MluI D 10–25% 25–50% 50–75% 100% 25–50% 100–125%** 10–25% +/– 37°C MspI B 75–100% 100% 75–100% 25–50% n.d. n.d. 25–50% + 37°C MspA1I C 25–50% 100%* 100% 10–25% n.d. n.d. 100% + 37°C NarI G 75–100% 50–75% 75–100% 25–50% n.d. n.d. 50–75% + 37°C NciI B 100%* 100% 25–50% 25–50% n.d. n.d. 50–75% + 37°C NcoI D 50–75% 75–100% 75–100% 100% 100% 100–125%** 75–100% + 37°C NdeI D <10% <10% 25–50% 100% n.d. n.d. 25–50% + 37°C NheI B 75–100% 100% 75–100% 10–25% 75–100% 10–25% 100% + 37°C NotI D <10% 10–25% 25–50% 100% 25–50% 100–125%** 25–50% + 37°C NruI K <10% <10% <10% 50–75% n.d. n.d. 10–25% + 37°C NsiI D 10–25% 50–75% 50–75% 100% 25–50% >125%** 10–25% +/– 37°C PstI H 10–25% 50–75% 50–75% 50–75% 25–50% 100% 25–50% + 37°C PvuI D 10–25% 25–50% 50–75% 100% n.d. n.d. <10% – 37°C PvuII B 25–50% 100% 50–75% 25–50% n.d. n.d. 50–75% + 37°C RsaI C 75–100% 75–100% 100% <10% n.d. n.d. <10% + 37°C SacI J 75–100% 25–50% 25–50% <10% 100% 25–50% 100% + 37°C SacII C 100% 50–75% 100% 50–75% 25–50% >125%** <10% + 37°C SalI D <10% 10–25% 25–50% 100% 25–50% 25–50% <10% + 37°C Sau3AI B 25–50% 100% 75–100% <10% n.d. n.d. 100% + 37°C ScaI K <10% 100%* 50–75% 75–100% n.d. n.d. 10–25% + 37°C SfiI B 75–100% 100% 75–100% 25–50% 75–100% 50–75% 75–100% – 50°C SgfI C 25–50% 25–50% 100% <10% n.d. n.d. <10% +/– 37°C SmaI J <10% <10% <10% <10% <10% <10% 100% + 25°C SnaBI B 50–75% 100% 50–75% <10% n.d. n.d. 100% – 37°C SpeI B 75–100% 100% 75–100% 75–100% 100% 25–50% 100% + 37°C SphI K 75–100% 75–100% 100%* 75–100% 100% >125%** 10–25% + 37°C SspI E 10–25% 50–75% 50–75% 75–100% 100% 100–125%** 50–75% + 37°C StuI B 75–100% 100% 75–100% 50–75% n.d. n.d. 50–75% + 37°C TaqI E 10–25% 25–50% 50–75% 50–75% 100% n.d. 100% – 65°C Tru9I F 75–100% 50–75% 75–100% 25–50% n.d. n.d. 25–50% – 65°C VspI D <10% 25–50% 75–100% 100% n.d. n.d. <10% + 37°C XbaI D 50–75% 75–100% 75–100% 100% 100% 100–125%** 100% – 37°C XhoI D 25–50% 75–100% 75–100% 100% 25–50% 100–125%** 10–25% + 37°C XhoII C 25–50% 25–50% 100% 10–25% n.d. n.d. <10% + 37°C XmaI B 50–75% 100% 25–50% <10% 25–50% <10% 50–75% + 37°C XmnI B 75–100% 100% 75–100% 10–25% n.d. n.d. 75–100% + 37°C Te c h n i c a l a n d L e g a l R e f e r e n c e s www.promega.co.jp ● Technical and Legal References Technical Reference 制限酵素における部位特異的なメチル化の影響 この表はプロメガ制限酵素のいくつかについて、dam, dcm, CpGおよび CpNpG部 (p ＝リン酸基)での部位特異的メチル化に対する感受性を示して います。これら4種類の修飾は細菌、真核生物、ウイルスのDNAで頻繁に見られます。多くの大腸菌株は部位特異的なdamやdcm DNAメチラーゼ を含んでいます。高等真核生物では部位特異的な CpGやCpNpG DNAメチラーゼを含んでいます。哺乳類のゲノムではCGジヌクレオチドにおいて メチレーションが主に起こります。植物のゲノムではCGやCNGの配列でメチレーションが起こる可能性があります。 制限酵素 認識部位 dam dcm CpG CpNpG AatII GACGTC i i s i AccIII TCCGGA s(ol) i i i Acc65I GGTACC i s(ol) i i ApaI GGGCCC i s(ol) s(ol) i AvaI CYCGRG i i s i AvaII GGWCC i s(ol) s(ol) s(ol) BalI TGGCCA i s(ol) i s(ol) BamHI GGATCC i i i s(ol) BclI TGATCA s i i i BglI GCCNNNNNGGC i i s(ol) s(ol) BglII AGATCT i i i s(ol) BssHII GCGCGC i i s i BstEII GGTNACC i i i i BstOI CCWGG i i i n.d. BstXI CCANNNNNNTGG i i i i BstZI CGGCCG i i s(ol) s(ol) CfoI GCGC i i s n.d. ClaI ATCGAT s(ol) i s i CspI CGGWCCG i i i s DdeI CTNAG i i i s(ol) Eco47III AGCGCT i i s i EcoRI GAATTC i i s(ol) i HaeIII GGCC i i i s(ol) HhaI GCGC i i s s(ol) HincII GTYRAC i i i i HindIII AAGCTT i i i i HpaII CCGG i i s s 制限酵素 認識部位 dam dcm CpG CpNpG KpnI GGTACC i i i i MboII GAAGA(8/7) s(ol) i i i MluI ACGCGT i i s i MspI CCGG i i i s NarI GGCGCC i i s i NheI GCTAGC i i s(ol) s(ol) NotI GCGGCCGC i i s s NruI TCGCGA s(ol) i s i PmeI GTTTAAAC i i s(ol)* s(ol)* PstI CTGCAG i i i s PvuI CGATCG i i s s(ol) PvuII CAGCTG i i i s SacI GAGCTC i i i i SacII CCGCGG i i s s SalI GTCGAC i i s n.d. Sau3AI GATC i i s(ol) s(ol) ScaI AGTACT i i i i SfiI GGCCNNNNNGGCC i s(ol) s(ol) s(ol) SgfI GCGATCGC i i s n.d. SmaI CCCGGG i i s s SnaBI TACGTA i i s i SphI GCATGC i i i i StuI AGGCCT i s(ol) i s(ol) TaqI TCGA s(ol) i i i XbaI TCTAGA s(ol) i i i XhoI CTCGAG i i s i XhoII RGATCY i i i s(ol) XmaI CCCGGG i i i n.d. XmnI GAANNNN i i n.d. n.d. * Pme I は両鎖のシトシンのメチル化により阻害されます。 原核生物のメチレーション dcm シトシンメチラーゼ変異：5’...CCTGG...3で内側のシトシ ン塩基のC5位をメチル化する。 dam アデニンメチラーゼ変異：5’....GATC...3’でアデニン塩基 のN6位をメチル化する。 真核生物のメチレーション CpG ジヌクレオチド配列5’...CG...3’でシトシン塩基のC5位を メチル化する。 CpNpGp トリヌクレオチド配列5’...CNG...3’ （N = すべての塩基）のシトシン塩基のC5位をメチル化 する。 部位特異的メチレーションに関するさらに詳細な情報については McClelland, M., Nelson, M. and Raschke, E. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 3640.をご覧ください。 記号： s = このメチレーションに感受性を持つ。 i = このメチレーションに感受性を持たない。 s(ol) = オーバーラップ（メチレーション配列に制限酵素部位が重なる場合に感 受性を持つ。) n/a = 情報なし 18 テクニカルサービス　TEL: 03-3669-7980 FAX: 03-3669-7982 E-mail: prometec@jp.promega.com ● Technical and Legal References Technical Reference 認識配列のアルファベット順リスト A▼AGCTT HindIII AAT▼ATT SspI A▼CCGGT AgeI ACTGG(1/–1) BsrSI A▼CGCGT MluI A▼CTAGT SpeI A▼GATCT BglII AGC▼GCT Eco47III AG▼CT AluI AGG▼CCT StuI AGT▼ACT ScaI AT▼CGAT ClaI ATGCA▼T NsiI AT▼TAAT VspI CAG▼CTG PvuII CA▼TATG NdeI CATG▼ Hsp92II CCAN5 ▼NTGG BstXI C▼CATGG NcoI C▼CCGGG XmaI CCC▼GGG SmaI CCGC▼GG SacII C▼CGG HpaII, MspI CC▼SGG NciI CC▼TNAGG Bsu36I CC▼WGG BstOI CGAT▼CG PvuI C▼GGCCG BstZI CG▼GWCCG CspI CMG▼CKG MspA1I C▼TCGAG XhoI CTCTCTTAA▼GGTAGC I-PpoI CTGCA▼G PstI C▼TNAG DdeI C▼YCGRG AvaI GAAGA(8/7) MboII GAANN▼NNTTC XmnI G▼AATTC EcoRI GACGT▼C AatII GR▼CGYC Hsp92I GAG▼CTC EcoICRI GAGCT▼C SacI G▼ANTC HinfI GAT▼ATC EcoRV ▼GATC MboI, Sau3AI GmeA▼TC DpnI GCATG▼C SphI GCCN4 ▼NGGC BglI GCGAT▼CGC SgfI GCG▼C CfoI, HhaI G▼CGCGC BssHII GC▼GGCCGC NotI G▼CTAGC NheI G▼GATCC BamHI GG▼CC HaeIII GGCCN4 ▼NGGCC SfiI GG▼CGCC NarI GGGCC▼C ApaI G▼GTACC Acc65I GGTAC▼C KpnI G▼GTNACC BstEII G▼GWCC AvaII G▼GYRCC BanI GT▼AC RsaI G▼TCGAC SalI GT▼MKAC AccI GTT▼AAC HpaI GTY▼RAC HincII R▼GATCY XhoII RGCGC▼Y HaeII TAC▼GTA SnaBI T▼CCGGA AccIII T▼CGA TaqI TCG▼CGA NruI T▼CTAGA XbaI T▼GATCA BclI TGG▼CCA BalI T▼TAA Tru9I TTT▼AAA DraI 備考：認識部位の外側に切断部位が存在する場合は （ ）内に示す。例えば GTCTC(1/5)と表記されたものは、 次の位置で切断されます。 5′...GTCTCN▼...3′ 3′...CAGAGNNNNN▲...5′ IUPACによるヌクレオチドの両義性コード Y = T or C (pyrimidine) R = G or A (purine) M = A or C (amino) K = G or T (keto) S = G or C (strong interaction: 3 H bonds) W = A or T (weak interaction: 2 H bonds) B = G or T or C (not A) V = G or C or A (not T, not U) D = G or A or T (not C) H = A or C or T (not G) N = G or A or T or C (unknown nucleotide) 19 Te c h n i c a l a n d L e g a l R e f e r e n c e s www.promega.co.jp ● Technical and Legal References Technical Reference 一般的な制限酵素のイソシゾマー（太文字の制限酵素はプロメガから入手できます。） AatI StuI, Eco147I, Pme55I, SseBI AGG▼CCT AatII — GACGT▼C AccI FblI, XmiI GT▼(A/C)(G/T)AC AccIII BspEI, MroI T▼CCGGA Acc65I Asp718I G▼GTACC KpnI* GGTAC▼C AccB1I BanI, BshNI, Eco64I G▼G(C/T)(G/A)CC AccB7I PflMI, Van91I CCAN4 ▼NTGG AclNI Spel A▼CTAGT AclWI AlwI GGATCNNNN▼ AcyI BbiII, Hin1I, Hsp92I, G(A/G)▼CG(T/C)C BsaHI, Msp171I AcsI ApoI (G/A)▼AATT(C/T) AfaI RsaI GT▼AC Csp6I G▼TAC AfeI Eco47III AGC▼GCT AflII Bst98I C▼TTAAG AgeI PinAI A▼CCGGT AhaIII DraI TTT▼AAA AhdI EclHKI GACNNN▼NNGTC AluI — AG▼CT AlwI AclWI GGATCNNNN▼ Alw44I ApaLI G▼TGCAC AocI Bsu36I, CvnI CC▼TNAGG ApaI — GGGCC▼C Bsp120I* G▼GGCCC ApaLI Alw44I, VneI G▼TGCAC ApoI AcsI (G/A)▼AATT(C/T) AseI VspI, AsnI AT▼TAAT AsnI VspI, AseI AT▼TAAT AspI Tth111I GACN▼NNGTC AspEI AhdI, Eam1105I, EclHKI GACNNN/NNGTC Asp700I XmnI GAANN▼NNTTC Asp718I Acc65I G▼GTACC KpnI* GGTAC▼C AsuI Sau96I, Cfr13I G▼GNCC AsuII Csp45I, BstBI TT▼CGAA AsuHPI HphI GGTGAN8 ▼ AvaI Ama87I, BcoI, BsoBI, Eco88I C▼(C/T)CG(G/A)G AvaII SinI, Eco47I, HgiEI G▼G(A/T)CC AxyI Bsu36I CC▼TNAGG BalI MscI, MluNI TGG▼CCA BamHI — G▼GATCC BanI AccBI, BshNI, Eco64I G▼G(T/C)(A/G)CC BanII Eco24I G(A/G)GC(T/C)▼C BbeI — GGCGC▼C NarI* GG▼CGCC Bbr PI Eco72I, PmlI CAC▼GTG BbsI1 Bsc91I, BpiI GAAGAC(2/6) BbuI PaeI, SphI GCATG▼C BclI BsiQI, FbaI T▼GATCA BcnI NciI CC▼(C/G)GG BfrI Bst98I C▼TTAAG BglI — GCCNNNN▼NGGC BglII — A▼GATCT BmyI Bsp1286I G(G/A/T)GC(C/A/T)▼C BpmI GsuI CTGGAG(16/14) BsaHI Hsp92I G(A/G)▼CG(T/C)C BsaMI BsmI GAATGC(1/–1) BsaOI Bsh1285I, BsiEI CG(A/G)(T/C)▼C BseAI AccIII T▼CCGGA BseNI BsrSI, BsrI ACTGGN (1/–1) BsePI BssHII, PauI G▼CGCGC Bsh1285I BsaOI CG(A/G)(T/C)▼CG BshNI BanI, AccB1I, Eco64 I G▼G(T/C)(A/G)CC Bsh1365I BsrBRI GATNN▼NNATC BsiEI BsaOI CG(A/G)(T/C)▼CG BsmI BsaMI GAATGCN▼ BsoBI AvaI, Ama87I, BcoI, Eco88I C(C/T)CG(G/A)G Bsp19I NcoI C▼CATGG Bsp68I NruI TCG▼CGA Bsp106I ClaI, BspDI AT▼CGAT Bsp119I Csp45I, NspV, BstBI TT▼CGAA Bsp120I — G▼GGCCC ApaI GGGCC▼C Bsp143I MboI, Sau3AI, NdeII ▼GATC Bsp143II HaeII (A/G)GCGC▼(T/C) Bsp1286I BmyI, SduI G(G/A/T)GC(C/A/T)▼C BspCI PvuI CGAT▼CG BspDI ClaI AT▼CGAT BspEI AccIII T▼CCGGA BsrI1 BsrSI, BseNI ACTGGN(1/-1) BsrSI1 BseNI, BsrI ACTGGN(1/-1) BssHII BsePI, PauI G▼CGCGC Bst98I AflII, BfrI C▼TTAAG BstBI Csp45I, NspV, Bsp119I TT▼CGAA BstEII BstPI, Eco91I, PspEI G▼GTNACC BstNI BstOI, MvaI CC▼(A/T)GG EcoRII* ▼CC(A/T)GG BstOI BstNI, MvaI CC▼(A/T)GG EcoRII* ▼CC(A/T)GG BstXI – CCANNNNN▼NTGG BstYI XhoII, MflI (A/G)▼GATC(T/C) BstZI Eco52I, EagI, XmaIII, EclXI C▼GGCCG Bsu15I ClaI AT▼CGAT Bsu36I CvnI, AocI, Eco81I CC▼TNAGG BsuRI HaeIII, PalI GG▼CC CfoI HhaI GCG▼C Hin6I, HinP1I G▼CGC Cfr9I XmaI C▼CCGGG SmaI* CCC▼GGG Cfr13I Sau96I G▼GNCC Cfr42I SacII CCGC▼GG ClaI BanIII, Bsp106I, BspDI, Bsu15I AT▼CGAT CpoI CspI, RsrII CG▼G(A/T)CCG CspI CpoI, RsrII CG▼G(A/T)CCG Csp6I — G▼TAC RsaI*, AfaI* GT▼AC Csp45I BstBI, NspV, Bsp119I TT▼CGAA CvnI Bsu36I CC▼TNAGG DdeI BstDEI C▼TNAG DpnI2 — GmeA▼TC DpnII* GA▼TC DpnII MboI, Sau3AI, NdeII, ▼GATC DpnI* GA▼TC DraI — TTT▼AAA EagI Eco52I, BstZI, EclXI, XmaIII C▼GGCCG Eam1105I EclHKI, AhdI, AspEI GACNNN▼NNGTC Ecl136II EcoICRI GAG▼CTC SacI* GAGCT▼C EclHKI AhdI, Eam1105I, AspEI GACNNN▼NNGTC EclXI BstZI, EagI, Eco52I, XmaIII C▼GGCCG Eco24I BanII, FriOI G(AG)GC(TC)▼C Eco32I EcoRV GAT▼ATC Eco47I AvaII, SinI G▼G(A/T)CC Eco47III AfeI AGC▼GCT Eco52I BstZI, XmaIII, EagI, EclXI C▼GGCCG Eco64I BanI, BshNI, Eco64I G▼G(TC)(AG)CC Eco81I Bsu36I CC▼TNAGG Eco88I AvaI C▼(TC)CG(AG)G Eco91I BstEII G▼GTNACC 制限酵素 イソシゾマー 認識配列 制限酵素 イソシゾマー 認識配列 （次ページにつづく） 20 テクニカルサービス　TEL: 03-3669-7980 FAX: 03-3669-7982 E-mail: prometec@jp.promega.com ● Technical and Legal References Technical Reference 一般的な制限酵素のイソシゾマー（太文字の制限酵素はプロメガから入手できます。）（つづき） 制限酵素 イソシゾマー 認識配列 制限酵素 イソシゾマー 認識配列 Eco105I SnaBI TAC▼CTA Eco130I StyI C▼C(A/T)(T/A)GG Eco147I StuI AGG▼CCT EcoICRI Ecl136II GAG▼CTC SacI*, SstI* GAGCT▼C EcoRI — G▼AATTC EcoRII — ▼CC(A/T)GG BstOI*, BstNI*, MvaI* CC▼(A/T)GG EcoRV Eco32I GAT▼ATC EcoT14I StyI C▼C(A/T)(A/T)GG EcoT22I NsiI ATGCA▼T EheI — GGC▼GCC NarI* GG▼CGCC FokI2 — GGATG(9/13) HaeII Bsp143II (A/G)GCGC▼(T/C) HaeIII BsuRI, PalI GG▼CC HapII HpaII, MspI C▼CGG HgiEI Eco47I, SinI, AvaII G▼G(A/T)CC HhaI CfoI GCG▼C HinP1I*, Hin6I* G▼CGC Hin1I AcyI, Hsp92I G(A/G)▼CG(T/C)C HincII HindII GT(T/C)▼(A/G)AC HindII HincII GT(T/C)▼(A/G)AC HindIII — A▼AGCTT HinfI — G▼ANTC HinP1I — G▼CGC HhaI*, CfoI* GCG▼C HpaI KspAI GTT▼AAC HpaII3 MspI, HapII C▼CGG Hsp92I AcyI, BsaHI, Hin1I G(A/G)▼CG(C/T)C Hsp92II NlaIII CATG▼ I-PpoI — CTCTCTTAA▼GGTAGC KasI — G▼GCGCC NarI* GG▼CGCC KpnI — GGTAC▼C Acc65I*, Asp718I* G▼GTACC KspI SacII CCGC▼GG MboI Sau3AI, NdeII, DpnII ▼GATC MboII1 — GAAGA(8/7) MflI XhoII (A/G)▼GATC(T/C) MluI — A▼CGCGT MluNI BalI, MscI TGG▼CCA MroI AccIII T▼CCGGA MscI BalI, MluNI TGG▼CCA MseI Tru9I T▼TAA MspI3 HpaII, HapII C▼CGG MspA1I NspBII C(A/C)G▼C(G/T)G MstII Bsu36I CC▼TNAGG MvaI BstOI, BstNI CC▼(A/T)GG EcoRII* ▼CC(A/T)GG NaeI — GCC▼GGC NgoMIV G▼CCGGC NarI — GG▼CGCC EheI* GGC▼GCC KasI* G▼GCGCC BbeI* GGCGC▼C NciI BcnI CC▼(C/G)GG NcoI Bsp19I C▼CATGG NdeI — CA▼TATG NdeII MboI, Sau3AI, DpnII ▼GATC NgoMIV — G▼CCGGC NaeI* GCC▼GGC NheI — G▼CTAGC NlaIII Hsp92II CATG▼ NotI — GC▼GGCCGC NruI Bsp68 I TCG▼CGA NsiI EcoT22I, Mph1103I ATGCA▼T NspV Csp45I, Bst BI, Bsp119I TT▼CGAA NspBII MspA1I C(A/C)G▼C(G/T)G PaeI BbuI, SphI GCATG▼C PaeR7I XhoI C▼TCGAG PalI HaeIII, BsuRI GG▼CC PflMI AccB7I, Van91I CCAN4 ▼NTGG PinAI AgeI A▼CCGGT PstI — CTGCA▼G PvuI BspCI CGAT▼CG PvuII — CAG▼CTG RsaI AfaI GT▼AC RsrII CspI, CpoI CG▼G(A/T)CCG SacI SstI GAGCT▼C Ecl136II*, EcoICRI* GAG▼CTC SacII SstII, KspI, Cfr42I CCGC▼GG SalI — G▼TCGAC Sau3AI MboI, NdeII, DpnII ▼GATC Sau96I Cfr13I G▼GNCC ScaI — AGT▼ACT SduI Bsp1286I G(G/A/T)GC(C/A/T)▼C SfiI — GGCCNNNN▼NGGCC SfuI Csp45I TT▼CGAA SgfI — GCGAT▼CGC SinI AvaII, Eco47I G▼G(A/T)CC SmaI — CCC▼GGG XmaI*, Cfr9I* C▼CCGGG SnaBI Eco105I TAC▼GTA SpeI AclNI A▼CTAGT SphI BbuI, PaeI GCATG▼C SspI — AAT▼ATT SstI SacI GAGCT▼C EcoICRI* GAG▼CTC SstII SacII CCGC▼GG StuI AatI, Eco147I AGG▼CCT StyI EcoT14I C▼C(A/T)(A/T)GG TaqI TthHB8I T▼CGA Tru9I MseI T▼TAA Tth111I AspI GACN▼NNGTC TthHB8I TaqI T▼CGA Van91I AccB7I, PflMI CCAN4 ▼NTGG VneI ApaLI, Alw44I G▼TGCAC VspI AseI, AsnI AT▼TAAT XbaI — T▼CTAGA XhoI PaeR7I C▼TCGAG XhoII BstYI, MflI (A/G)▼GATC(T/C) XmaI Cfr9I, XmaCI, C▼CCGGG SmaI* CCC▼GGG XmaIII Eco52I, BstZI, EagI, Ecl XI C▼GGCCG XmaCI XmaI C▼CCGGG SmaI* CCC▼GGG XmnI Asp700I GAANN▼NNTTC 記号：N = A, C, G or T * = ネオシゾマー 備考： 1. 認識部位の外側に切断部位が存在する場合は( )内に示す。例えば GTCTC(1/5)と 表記されたものは、次の位置で切断されます。 5′...GTCTCN▼...3′ 3′...CAGAGNNNNN▲...5′ 2. Dpn Iは切断するために認識配列中のアデニンのメチル化を要求する唯一の市販 酵素です。そのためDpn IはGATCを認識するその他の制限酵素（例, Mbo I, Sau3A I）での代用はできません。 3. Hpa II と Msp Iは同じヌクレオチド配列を認識しますが、Msp Iが認識配列の外側 に位置するシトシンのメチル化にのみ感受性を持つのに対して、Hpa II はどちら のシトシンのメチル化にも感受性を持つため、すべての用途で相互に代用でき るとは限りません。 参考資料 Roberts, R. J. (1991) Nucl. Acids Res. 19, (supp), 2077. 21 Te c h n i c a l a n d L e g a l R e f e r e n c e s www.promega.co.jp ● Technical and Legal References Technical Reference 切断末端別の制限酵素 5′ 突出末端を形成するプロメガの制限酵素 突出部位 適合性確認済み 適合の可能性有り 5′-S NciI 5′-W BstOI 5′-AT AccI 5′-CG ClaI, HpaII, Hsp92I, MspI, NarI, TaqI 5′-GN BsrSI 5′-MK AccI 5′-TA NdeI, Tru9I, VspI 5′-ANT HinfI 5′-GWC AvaII, CspI 5′-TNA Bsu36I, DdeI 5′-AATT EcoRI 5′-AGCT HindIII 5′-CATG NcoI 5′-CCGG AccIII, AgeI, XmaI AvaI 5′-CGCG BssHI, MluI 5′-CTAG NheI, SpeI, XbaI 5′-GATC BamHI, BclI, BglII, MboI, Sau3AI, XhoII 5′-GCGC BanI 5′-GGCC BstZI, NotI 5′-GTAC Acc65I BanI 5′-GTNAC BstEII 5′-GYRC BanI 5′-TCGA SalI, XhoI AvaI 5′-YCGR AvaI 3′ 突出末端を形成するプロメガの制限酵素 突出部位 適合性確認済み 適合の可能性有り AT-3′ SgfI, PvuI CG-3′ CfoI, HhaI CN-3′ BsaMI GC-3′ SacII BsaOI NNN-3′ AccB7I, BglI, SfiI ACGT-3′ AatII AGCT-3′ SacI CATG-3′ Hsp92II, SphI GCGC-3′ HaeII GGCC-3′ ApaI GTAC-3′ KpnI NNNN-3′ BstXI TGCA-3′ NsiI, PstI TTAA-3′ I-PpoI 記号： D = A or G or T H = A or C or T K = G or T M = A or C N = A or C or G or T R = A or G S = C or G W = A or T Y = C or T 22 テクニカルサービス　TEL: 03-3669-7980 FAX: 03-3669-7982 E-mail: prometec@jp.promega.com ● Technical and Legal References Technical Reference バクテリオファージRNAポリメラーゼプロモーター配列に ついて SP6: ATTTAGGTGACACTATAGAA T7: TAATACGACTCACTATAGGG T3: TATTAACCCTCACTAAAGGG 上記の各RNAポリメラーゼプロモーター配列は、ポジション-17から +3までを示しており、下線のついたGで転写が開始されます。各ポリ メラーゼは認識配列に対して非常に強い特異性を示しますが、転写を 開始するための認識配列は上記の配列と100％同じである必要はあり ません。一般的に、転写効率はポジション+3を変更するとわずかに低 下し、ポジション+2の変更では50％に、ポジション+1の変更では急激 な減少が認められます。 in vitro転写/翻訳の鋳型とするPCR産物用のT7プライマーの 設計法 フォワードプライマー： 必須項目： • T7プロモーター配列 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3') は鋳型 DNAからの転写に必須 • 翻訳開始に必要なATG開始コドン (5'-ATG-3')（増幅する配列に存在 しない場合） • 標的遺伝子のプライミングに必要な遺伝子特異的な配列 要求項目： • Kozak配列 (5'-CCACCATGG-3') または、 増幅する配列からの真核生物翻訳開始配列（翻訳開始効率が増加） • プロモーター上流の余分な6-10塩基（プロモーターの効率が改善） • プロモーター配列とKozak配列間の3-6塩基のスペーサー（Kozak配 列の上流数塩基からの転写開始を確実にし、RNAへのリボゾーム 結合が向上） 模範的なフォワードプライマーのデザイン： 5′- (N6-10)TAATACGACTCACTATAGGG (N3-6) CCACCATGG (N17-22)-3′ リバースプライマー： 必須項目： • 遺伝子特異的配列（標的遺伝子へのプライミングに必要） 要望項目： • 停止コドンと逆相補的配列 (TTA, ATC, TCA)（増幅する配列に存在 しない場合）。（翻訳の終結、次ラウンドの翻訳のための効率的な リボゾームの放出） • poly(A) tailを付加することにより、RNAの安定性が飛躍的に向上 し、高レベルの翻訳が可能。 模範的なリバースプライマーのデザイン： 5′-T30 stop anticodon (N17–22)-3′ 23 Te c h n i c a l a n d L e g a l R e f e r e n c e s www.promega.co.jp ● Technical and Legal References Technical Reference プロメガのシークエンシング用プライマー プライマーシークエンス カタログ番号 Tm (°C)* 適応ベクター RNA Polymerase Promoter Primers SP6 5′-d(TATTTAGGTGACACTATAG)-3′ Q5011 42 pGEM®-4Z, -3Zf(+/–), -5Zf(+/–), -7Zf(+/–), -9Zf(–), -11Zf(+/–), -13Zf(+); pGEM®-luc ; pSP-luc +; pSP-luc +NF; pALTER®-1; pGEM®-T, -T Easy; PinPoint™ Xa-1, -2, -3; pTnT™ Vector; pCMVTnT™ Vector; pGeneClip™ Basic, Puromycin, Hygromycin, Neomycin, hMGFP T7 5′-d(TAATACGACTCACTATAGGG)-3′ Q5021 47 pGEM®-4Z, -3Zf(+/–), -5Zf(+/–), -7Zf(+/–), -9Zf(–), -11Zf(+/–), -13Zf(+); pGEM®-luc ; pSP-luc +NF; pALTER®-1; pGEM®-T, -T Easy; pTargeT™; pGeneClip™ Basic, Puromycin, Hygromycin, Neomycin, hMGFP; pF1A, pF1K T7 Flexi® Vector; pFN2A, pFN2K (GST) Flexi® Vector; pF4A, pF4K CMV Flexi Vector; pF5A, pF5K CMV-neo Flexi® Vector; pFC8A, pFC8K (HaloTag®) CMV Flexi® Vector; pF9 CMV Rluc-neo Flexi Vector; pFN10A (ACT) Flexi® Vector; pFN11A (BIND) Flexi® Vector T3 5′-d(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)-3′ Q5741 50 pACT, pALTER®-MAX, pBIND; pCI-neo; HaloTag® pHT2 T7 EEV 5′-d(AAGGCTAGAGTACTTAATACGA)-3′ Q6700 50 pALTER®-MAX, pSI, pCI, pCl-neo, pCMVTnT™, pTnT™, phMGFP Vector; HaloTag® pHT2; psiCHECK™-1, -2 pUC/M13 Primers Forward (17mer) (–40) 5′-d(GTTTTCCCAGTCACGAC)-3′ Q5391 50 pGEM®-3Z, -4Z, -3Zf(+/–), -5Zf(+/–), -7Zf(+/–), -9Zf(–), -11Zf(+/–), -13Zf(+); pGEM®-luc ; pGEM®-T, -T Easy; pALTER®-1; pCAT®-Basic, -Promoter, -Enhancer, -Control; pGeneClip™ Basic, Puromycin, Hygromycin, Neomycin, hMGFP Forward (24mer) (–47) 5′-d(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)-3′ Q5601 64 [sameas Forward (17mer)] Reverse (17mer) 5′-d(CAGGAAACAGCTATGAC)-3′ Q5401 47 pGEM®-3Z, -4Z, -3Zf(+/–), -5Zf(+/–), -7Zf(+/–), -9Zf(–), -11Zf(+/–), -13Zf(+); pGEM®-luc ; pSP64, -64 Poly(A), -65; pGEM®-T, -T Easy; pCAT®-Basic, -Promoter, -Enhancer, -Control; pALTER®-1, Ex-1, Ex-2; pGeneClip™ Basic, Puromycin, Hygromycin, Neomycin, hMGFP; psiSTRIKE™ Basic, Puromycin, Hygromycin, Neomycin, hMGFP; psiLentGene™ Basic, Puromycin, Hygromycin, Neomycin Reverse (22mer) 5′-d(TCACACAGGAAACAGCTATGAC)-3′ Q5421 55 [sameas Reverse(17mer)] Luciferase Primers GLprimer1 5′-d(TGTATCTTATGGTACTGTAACTG)-3′ E1651 50 pGL2-Basic, -Promoter, -Enhancer, -Control GLprimer2 5′-d(CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA)-3′ E1661 55 pSP-luc+; pGL3-Basic, -Promoter, -Enhancer, -Control; pGL2-Basic, -Promoter, -Enhancer, -Control RVprimer3 5′-d(CTAGCAAAATAGGCTGTCCC)-3′ E4481 53 pGL3-Basic, -Promoter, -Enhancer, -Control; pCAT®3-Basic, -Promoter, -Enhancer, -Control; pGL3(R2.1)-Basic; pGL3(R2.2)-Basic; pGL4.10[luc2]; pGL4.11[luc2P]; pGL4.12[luc2CP]; pGL4.13[luc2/SV40]; pGL4.14[luc2/Hygro]; pGL4.15[luc2P/ Hygro]; pGL4.16[luc2CP/Hygro]; pGL4.17[luc2/Neo]; pGL4.18[luc2P/Neo]; pGL4.19[luc2CP/Neo]; pGL4.20[luc2/Puro]; pGL4.21[luc2P/Puro]; pGL4.22[luc2CP/ Puro]; pGL4.70[hRluc]; pGL4.71[hRlucP]; pGL4.72[hRlucCP]; pGL4.73[hRluc/SV40]; pGL4.74[hRluc/TK]; pGL4.75[hRluc/CMV]; pGL4.76[hRluc/Hygro]; pGL4.77[hRlucP/ Hygro]; pGL4.78[hRlucCP/Hygro]; pGL4.79[hRluc/Neo]; pGL4.80[hRlucP/ Neo]; pGL4.81[hRlucCP/Neo]; pGL4.82[hRluc/Puro]; pGL4.83[hRlucP/Puro]; pGL4.84[hRlucCP/Puro]; pCBR-Basic, -Control; pCBG68-Basic, -Control; pCBG99- Basic, -Control RVprimer4 5′-d(GACGATAGTCATGCCCCGCG)-3′ E4491 60 pGL3-Basic, -Promoter, -Enhancer, -Control; pCAT®3-Basic, -Promoter, -Enhancer, -Control; pGL3(R2.1)-Basic; pGL3(R2.2)-Basic; pGL4.10[luc2]; pGL4.11[luc2P]; pGL4.12[luc2CP]; pGL4.13[luc2/SV40]; pGL4.14[luc2/Hygro]; pGL4.15[luc2P/ Hygro]; pGL4.16[luc2CP/Hygro]; pGL4.17[luc2/Neo]; pGL4.18[luc2P/Neo]; pGL4.19[luc2CP/Neo]; pGL4.20[luc2/Puro]; pGL4.21[luc2P/Puro]; pGL4.22[luc2CP/ Puro]; pGL4.70[hRluc]; pGL4.71[hRlucP]; pGL4.72[hRlucCP]; pGL4.73[hRluc/SV40]; pGL4.74[hRluc/TK]; pGL4.75[hRluc/CMV]; pGL4.76[hRluc/Hygro]; pGL4.77[hRlucP/ Hygro]; pGL4.78[hRlucCP/Hygro]; pGL4.79[hRluc/Neo]; pGL4.80[hRlucP/ Neo]; pGL4.81[hRlucCP/Neo]; pGL4.82[hRluc/Puro]; pGL4.83[hRlucP/Puro]; pGL4.84[hRlucCP/Puro]; pCBR-Basic, -Control; pCBG68-Basic, -Control; pCBG99- Basic, -Control Miscellaneous Sequencing Primers PinPoint™ Sequencing Primer 5′-d(CGTGACGCGGTGCAGGGCG)-3′ V4211 66 PinPoint™ Xa-1, -2, -3; PinPoint™ Xa-1 T-Vector pTargeT™ Sequencing Primer 5´-d(TTACGCCAAGTTATTTAGGTGACA)-3´ Q4461 55 pTargeT™ Vector * 各プライマーのTm値はBase stacking free energy methodにより決定しました。詳しくはwww.promega.com/biomath/をご覧下さい。 N/A = プロメガでの取扱いはありません。 24 テクニカルサービス　TEL: 03-3669-7980 FAX: 03-3669-7982 E-mail: prometec@jp.promega.com ● Technical and Legal References Technical Reference プロメガのオリゴヌクレオチドの形状と濃度 モル濃度 オリゴヌクレオチド カタログ番号 鎖長 鎖の形状(1) 濃度 (µM = pmol/µl) Gel Shift Oligos (2) AP1 Consensus Oligonucleotide E3201/E3202 21mer ds 24.0µg/ml 1.75µM AP2 Consensus Oligonucleotide E3211/E3212 26mer ds 29.8µg/ml 1.75µM CREB Consensus Oligonucleotide E3281/E3282 28mer ds 32.1µg/ml 1.75µM NF-κB Consensus Oligonucleotide E3291/E3292 22mer ds 25.2µg/ml 1.75µM OCT1 Consensus Oligonucleotide E3241/E3242 22mer ds 25.2µg/ml 1.75µM SP1 Consensus Oligonucleotide E3231/E3232 22mer ds 25.2µg/ml 1.75µM TFIID Consensus Oligonucleotide E3221/E3222 26mer ds 29.8µg/ml 1.75µM Miscellaneous Biotinylated Oligo(dT) Probe Z5261 25mer ss 437µg/ml 50µM EcoR I Adaptors C1291 16mer, 12mer ds (3) 91.8µg/ml 10µM Oligo(dT)15 Primer C1101 15mer ss 500µg/ml 101µM Random Primers C1181 6mer ss 500µg/ml 252.5µM Mutagenesis Oligos Ampicillin Repair Oligonucleotide Q6311 27mer ss 2.25µg/ml 0.253µM GeneEditor™ Bottom Strand Selection Oligonucleotide Q9301 35mer ss 2.9µg/ml 0.251µM GeneEditor™ Top Strand Selection Oligonucleotide Q9321 35mer ss 2.9µg/ml 0.251µM Primer Pairs for RT-PCR β-Actin Primer Pair G5740 2 26mers ss 852µg/ml 100µM CNTF Primer Pair G5770 2 25mers ss 819µg/ml 100µM NT-3 Primer Pair G6801 2 25mers ss 819µg/ml 100µM p75 Primer Pair G6861 2 20mers ss 654µg/ml 100µM Sequencing Primers pUC/M13 Primer, Forward Q5391 17mer ss 10µg/ml 1.78µM pUC/M13 Primer, Forward Q5601 24mer ss 10µg/ml 1.26µM pUC/M13 Primer, Reverse Q5401 17mer ss 10µg/ml 1.78µM pUC/M13 Primer, Reverse Q5421 22mer ss 10µg/ml 1.38µM SP6 Promoter Primer Q5011 19mer ss 10µg/ml 1.60µM T7 Promoter Primer Q5021 20mer ss 10µg/ml 1.52µM T3 Promoter Primer Q5741 20mer ss 10µg/ml 1.52µM T7 EEV Promoter Primer Q6700 22mer ss 10µg/ml 1.38µM GLprimer1 (clockwise) E1651 23mer ss 2µg (dried) 264pmol (dried) GLprimer2 (counter clockwise) E1661 23mer ss 2µg (dried) 264pmol (dried) RVprimer3 (clockwise) E4481 20mer ss 2µg (dried) 304pmol (dried) RVprimer4 (counter clockwise) E4491 20mer ss 2µg (dried) 304pmol (dried) pTargeT™ Sequencing Primer Q4461 24mer ss 10µg/ml 1.25µM (1) ds = 2本鎖、ss= 1本鎖 (2) 全てのゲルシフト用オリゴは、ゲル精製、アニーリング済みで平滑末端、5'水酸基を持つ2本鎖DNA (3) 突出末端を片方に持つ2本鎖DNA 25 Te c h n i c a l a n d L e g a l R e f e r e n c e s www.promega.co.jp ● Technical and Legal References Product Use Limitations, Warranty, Disclaimer ■ 使用上の注意 特に記載の無い限り、全てのプロメガ製品は研究用で、人, 動 物, 治療等に使用されるものではありません。また、製品には 人体に有害な化学物質を含むものがありますので、人体に直 接ふれることの無いよう取り扱いには十分注意して下さい。 毒性のある製品には製品安全データシート（MSDS）が添付 されており、現在知られている取り扱いにおける危険性など も記載されています。MSDSについては弊社ウェブサイトか らも入手することができます。 （www.promega.co.jp/msds/）。 ※詳細については www.promega.co.jp/msds/ をご覧くだ さい。 ■ 毒劇物の表示 ：「毒物及び劇物取締法」に基づく医薬用外毒物です。法規 制に従って、保管、廃棄等を行なって下さい。 ：「毒物及び劇物取締法」に基づく医薬用外劇物です。法規 制に従って、保管、廃棄等を行なって下さい。 ■ カルタヘナ法規制対象製品の表示 ：「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物 の多様性の確保に関する法律（通称カルタヘナ法）」における 第二種使用等に相当します。法規制に従って、拡散防止措置 を行ってください。 ※詳細については www.promega.co.jp/cartagena.html をご覧 ください。 ■ 保　証　製品には技術資料とともに品質保証書（Promega Product Information）が添付されます。この品質保証書には 弊社の品質管理部で定めた機能試験の条件とロットごとの データーが記載されています。プロメガ製品の性能に関する 保証については、製品の品質保証書の条件に満たない場合に 限り適用されます。弊社により製品の欠陥が確認された場合、 交換または購入代金の保証を致します。 製品のプロトコルは、弊社の実験室で成功し、または学術発 表から引用したもので有用です。試薬、機器の差異や各自の 実験手技の違いによりいつも同じ結果がこれらの方法によっ て得られるとは限りません。正確な判断と的確な実験が成功 をもたらします。 製品に関する注意、保証 Product Use Limitations, Warranty, Disclaimer Promega manufactures products for a number of intended uses. Please refer to the product label for the intended use statements for specific products. Promega products contain chemicals which may be harmful if misused. Due care should be exercised with all Promega products to prevent direct human contact. Each Promega product is shipped with documentation stating specifications and other technical information. Promega products are warranted to meet or exceed the stated specifications. Promega’s sole obligation and the customer’s sole remedy is limited to replacement of products free of charge in the event products fail to perform as warranted. Promega makes no other warranty of any kind whatsoever, and SPECIFICA LLY DISCLAIMS AND EXCLUDES ALL OTHER WARRANTIES OF ANY KIND OR NATURE WHATSOEVE R, DIRECTLY OR INDIRECTLY, EXPRESS OR IMPLIED, INCLUDING , WITHOUT LIMITATION, AS TO THE SUITABILITY, PRODUCTIVITY, DURABILITY, FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE OR USE, MERCHANTABILITY, CONDI TION, OR ANY OTHER MATTER WITH RESPEC T TO PROMEGA PRODUCTS. In no event shall Promega be liable for claims for any other damages, whether direct, incidental, foreseeable, consequential, or special (including but not limited to loss of use, revenue or profit), whether based upon warranty, contract, tort (including negligence) or strict liability arising in connection with the sale or the failure of Promega products to perform in accordance with the stated specifications. Product claims are subject to change. Please contact Promega Technical Services (techserv@promega.com) or access the Promega online catalog (promega.com/catalog/) for the most up-to-date information on Promega products. Applications mentioned in Promega literature are provided for informational purposes only. Promega does not warrant that all applications have been tested in Promega laboratories using Promega products. Promega products labeled “For Laboratory Use” are intended For Research Use Only outside the United States. Copyright © 2012 Promega Corporation. All Rights Reserved. Promega Trademarks 4-CORE, Altered Sites, AluQuant, Anti-ACTIVE, Apo-ONE, AttoPhos, Beta-Glo, Caspase-Glo, CellTiter 96, CellTiter-Blue, CellTiter-Glo, CytoTox 96, Dual-Glo, Dual-Luciferase, EGGstract, Emax, ENLITEN, Flexi, fmol, GenePrint, GenePrint® logo, GloMax, GoTaq, HaloTag, HeLaScribe, ISOQUANT, Kinase-Glo, MagaCell, MagaZorb, MagnaBot, MagneSil, MagneSphere, Maxwell, Monster Green, Packagene, pALTER, pCAT, PepTag, pGEM, pGEMEX, Plexor, PolyATtract, PowerPlex, Prime-a-Gene, ProFection, ProFluor, Promega, ProMega-Markers, ProtoBlot, QuantiLum, RiboClone, Riboprobe, , RNAgents, RNasin, SAM2, SignaTECT, SilverSTR, Steady-Glo, Stop & Glo, TnT, Transfectam, Vac-Man, Western Blue, Western Express and Wizard are all trademarks of Promega Corporation and are registered with the U.S. Patent and Trademark Office by Promega Corporation, Madison, WI, USA. AAF-Glo, AccessQuick, ADP-Glo, AgarACE, ApoLive-Glo, ApoTox-Glo, BacTiter-Glo, Bright-Glo, BRYT, Calpain-Glo, cAMP-Glo, CaspACE, Cell ID, CellTiter-Fluor, CelluACE, CheckMate, ChipShot, Chroma-Glo, Chroma-Luc, CodeBreaker, CytoTox-Fluor, CytoTox-Glo, CytoTox-ONE, DeadEnd, Differex, DLR, DLReady logo, DNA IQ, DPPIV-Glo, DUB-Glo, Eluator, EnduRen, FastBreak, FluoroTect, GeneClip, GeneEditor, GloResponse, GloSensor, GoScript, GSH-Glo, GSH/GSSG-Glo, HaloCHIP, HaloLink, HDAC-Glo, Helix, HisLink, ImProm-II, InCELLect, Instinct, LigaFast, Luciferin-EF, MagaCharc, MagnaCel, MagneGST, MagneHis, MagZ, MAO-Glo, MULTI-CORE, ONE-Glo, P450-Glo, pAdVAntage, pBESTluc, pCMVTnT, PDE-Glo, Personal Automation, pGeneClip, pGloSensor, Pgp-Glo, PhosphoCatch, PinPoint, PowerTyper, PromegaExpress, Promega Points, Protease-Glo, ProteaseMAX, ProteasomeGlo, psiCHECK, psiLentGene, psiSTRIKE, pTargeT, pTnT, PureYield, QuantiFluor, R110Direct, Rapid Response, READase, READIT, READIT® design, ReadyAmp, ReliaPrep, Renilla-Glo, RiboMAX, RNase ONE, siCHECK, siLentGene, SILVER SEQUENCE, SIRT-Glo, siSTRIKE, Slicprep, SoftLink, StemElite, Suc-LLVY-Glo, TaqBead, TetraLink, Tfx, TMRDirect, Transcend, TransFast, Turbo, UGT-Glo, Ultra-Glo, ViviRen, VivoGlo, Z-LRR-Glo, Z-nLPnLD-Glo, Z-RLRGG-Glo, Z-VDVAD-Glo and Z-VEID-Glo are all trademarks of Promega Corporation, Madison, WI, USA. Acknowledgments/Disclaimers Certain applications of Promega products may require licenses from others. Promega products may be covered by pending or issued patents or may have certain limitations. Please visit our Web site for more information (www. promega.co.jp/license/). トレードマーク、サービスマーク、使用制限、特許、その他の注意点 26 ※この資料は、2012-2013年の資料をもとに作成されたものです。