PureYieldTM Plasmid Midiprep System
PureYieldTM Plasmid Midiprep System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS A2490, A2492, A2495 , A2496 Quick PR OTO COL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM253 をご覧ください。 Revised 2012/05 Endotoxin Removal Wash イソプロパノール Coulmn Wash 95% エタノール 4 preps system (A2490) 10ml 4 preps system (A2490) 55ml 25 preps system (A2492) 57ml 25 preps system (A2492) 350ml 100 preps system (A2495) 210ml 100 preps system (A2495) 635ml 300 preps system (A2496) 210ml 300 preps system (A2496) 635ml プロトコル共通（遠心法、吸引法） 大腸菌培養液 大腸菌クリアライセートの調製 50-100ml 101-250ml 1. 培養液を 遠心（5,000×g）し大腸菌を沈殿させ、培地を取り除く。 10 分 10 分 2. 大腸菌を Cell Resuspension Solution に懸濁する。 3ml 6ml 3. Cell Lysis Solution を添加し転倒混和後、 室温で 3 分間インキュベーションする。 3ml 6ml 4. Neutralization Solution を添加し転倒混和させる。 5ml 10ml 5. 遠心（15,000×g 室温） （または、遠心（7,000×g 室温））し 上清（大腸菌クリアライセート）を取得する。 15 分 (30 分） 15 分 (30 分） このステップでの遠心はアングルローターを利用してください。 遠心法プロトコール（スイングローター注） <カラムへの吸着＞ 1. 50ml の遠心チューブに PureYield™ Clearing Column（青色; 以下 Clearing Column）を挿入する。 大腸菌クリアライセートを Clearing Column に注ぎ、2 分間インキュベートする。 注）細胞残渣が少ない場合は、すぐにステップ 2 を行うことができます。 2. 遠心（1,500×g, 5 分間, 室温）する。もし、大腸菌クリアライセートが Clearing Column 上に残っていれば再度遠心を繰り返す。 3. 新しい 50ml 遠心チューブに PureYield™ Binding Column (白色; 以下 Binding Column)を挿入する。 ステップ 2 で得た大腸菌ライセートを Binding Column へ注ぎ、遠心（1,500×g, 3 分間, 室温）する。 ＜洗浄＞ 5. 5ml の Endotoxin Removal Wash（イソプロパノール添加済）を Binding Column に加え、遠心（1,500×g, 3 分間, 室温）する。 50ml 遠心チューブから Binding Column をはずし、溶液を捨てたのち、再度 Binding Column をセットする。 6. 20ml の Column Wash Solution（エタノール添加済）を Binding Column に加え、遠心（1,500×g, 3 分間, 室温）する。 50ml 遠心チューブから Binding Column をはずし、溶液を捨てたのち、再度 Binding Column をセットする。 7. 遠心（1,500×g, 10 分間, 室温）し、メンブレン上に残っている Column Wash Solution を完全に取り除く。 ＜遠心による溶出 ＞ 8. Binding Column を新しい 50ml の遠心チューブに挿入する。 9. 600l の Nuclease-Free Water を Binding Column 内のメンブレンにしみ込ませるように加え、1 分間静置させる。 10. 遠心（1,500×g, 5 分間, 室温）する（約 400l が溶出されます。）。 ＊長鎖（10kb 以上）のプラスミドを溶出させる場合、あらかじめ 65℃に加温した Nuclease-Free Water を用いることで メンブレンから核酸の解離を促進することができます。 注） アングルローターは、溶液がカラムに残存するため利用はできません。 注意： 本製品を遠心法により使用するときは、スイングローターが必要になります（アングルローターでの DNA 溶出はできません。） ご使用前に、Endotoxin Removal Wash には、イソプロパノール、Column Wash には、エタノールを所定の量（下表）を添加してください。 添加後は、しっかりと蓋を閉めアルコール成分が揮発しないようにご注意ください。 すべての操作は、室温（22～25℃）行ってください。 PureYieldTM Plasmid Midiprep System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS A2490, A2492, A2495 , A2496 Quick PR OTO COL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM253 をご覧ください。 Revised 2012/05 吸引法プロトコール 1. PureYield™ Binding Column(白色; 以下 Binding Column)の上に PureYield™ Clearing Column（青色; 以下 Clearing Column）を 挿入する（下の写真(A)を参照）。 2. 大腸菌クリアライセートを Clearing Column に注ぐ。 3. 吸引を開始する。溶液が、Clearing Column および Binding Column を完全に通過するまで吸引を続ける。 4. コックを閉めたのち、ゆっくりと Clearing Column を取り除く。 ＊Binding Column 内のメンブレンが、底面から外れたら滅菌したチップ（ピペットを接続する側）で元の位置に押し込んでください。 ＜洗浄＞ 5. 5ml の Endotoxin Removal Wash（イソプロパノール添加済）を Binding Column に加えたのち、コックを開けて吸引を開始する。 溶液が Binding Column を完全に通過するまで続けたのち、コックを閉める。 6. 20ml の Column Wash Solution（エタノール添加済）を Binding Column に加え、コックを開けて吸引を開始する。 7. 溶液が Binding Column を完全に通過したのち、さらに空の状態で、30～60 秒間吸引し続け、メンブレン上に残っている試薬を完全に取り除く。 終了後、吸引を停止する。 ＜Eluator™を用いた溶出 ＞ 8. Eluator™ Vacuum Elution Device の base unit に、滅菌した 1.5ml チューブをセットしチューブキャップをセットする（下の写真(B)を参照）。 9. Vac-Man® Manifold から、Binding Column を取り外し、チップの先の残液をペーパータオル等で拭き取る。Binding Column を、 Eluator™ Vacuum Elution Device にセットする（写真(C)を参照）。 10. 400～600l の Nuclease-Free Water を Binding Column 内のメンブレンにしみ込ませるように加え、1 分間静置させたのち、吸引を 1 分間 行う。 11. 吸引を停止し、溶出したプラスミドを含む 1.5ml チューブを回収する。 ＊長鎖（10kb 以上）のプラスミドを溶出させる場合、あらかじめ 65℃に加温した Nuclease-Free Water を用いることで メンブレンから核酸の解離を促進することができます。