SV Total RNA Isolation System

作成日：注意：この日本語マニュアルは製品に添付される英文マニュアルを翻訳したものですが、常に更新されるものではありません。最新の英文マニュアルについては以下のサイトよりご覧ください。 SV Total RNA Isolation System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z3100, Z3101,AND Z3105 Quick PROTOCOL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 Revised 08/07 プロトコル（遠心法、吸引法共通）備考:すべての遠心操作は、12,000～14,000 × g (室温)で行う。 1. オートクレーブしたチューブに SV RNA Lysis Buffer (+ β-メルカプトエタノール) 175µl を分注する。 2. 溶解するサンプルを準備する。 3. サンプルをすぐに分注した Lysis Buffer に入れ、転倒混和により混合する。備考: Lysis Buffer の容量とサンプル量の最適な比率を確認する（標準プロトコル TM048 の表 1 を参照）。また、様々なサンプルの前処理についても標準プロトコルを参照する。 4. SV RNA Dilution Buffer (blue) 350µl を添加し、3～4 回転倒混和し、70℃、3 分間加熱する。備考:70℃、3 分間の加熱は、サンプルの種類などによっては標準プロトコール（TM048）に記載されていない場合もあるが、最大収量を得るために行うことを推奨する。 5. 10 分間の遠心後、クリアーライセートを新しいチューブに移す。 6. クリアーライセートに 95% エタノール 200µl を加え、ピペッティングで混合する。遠心法プロトコル遠心法プロトコル 7. 混合液を Spin Basket Assembly に移し、1 分間遠心後、溶出液を捨てる。 8. SV RNA Wash Solution (+ エタノール) 600µl を添加し、1 分間遠心後、溶出液を捨てる。 9. 下の表を使用して DNase incubation mix を調製する。 Solution Volume × Number of Preps = Total Yellow Core Buffer 40µl MnCl2, 0.09M 5µl DNase I 5µl 備考:DNase incubation mix の調製は、ピペッティングにより穏やかに混合する。ボルテックスは不可。 10. メンブレンに DNase incubation mix 50µl を添加し、室温で 15 分間インキュベートする。 11. SV DNase Stop Solution (+ エタノール) 200µl を添加し、1 分間遠心後、溶出液を捨てる。 12. SV RNA Wash Solution 600µl を添加し、1 分間遠心後、溶出液を捨てる。 13. SV RNA Wash Solution 250µl を添加し、2 分間遠心後、Spin Basket を Elution Tube に移す。 14. Nuclease-Free Water 100µl をメンブレンに添加し、1 分間の遠心により RNA を溶出する。精製した RNA は-70℃で保存する。吸引法プロトコル吸引法プロトコル 7. マニホールドのポートに取り付けられた Luer-Lok®に Miniprep Vacuum Adapter を装着する。静かに SV RNA Spin Basket をアダプターに挿入し、混合液を Spin Basket に移し、吸引する。備考: ステップ 13 で使用するために Collection Tube にサンプル名などを記載しておく。 8. SV RNA Wash Solution 900µl を添加し、溶液がメンブレンを通過するまで吸引する。ポンプを停止し、未使用のポートを開き、マニホールド内の陰圧を開放する。 9. 下の表を使用して DNase incubation mix を調製する。 Solution Volume × Number of Preps = Total Yellow Core Buffer 40µl MnCl2, 0.09M 5µl DNase I 5µl 備考:DNase incubation mix の調製は、ピペッティングにより穏やかに混合する。ボルテックスは不可。 10.メンブレンに DNase incubation mix 50µl を添加し、室温で 15 分間インキュベートする。 11.SV DNase Stop Solution (+ エタノール) 200µl を Spin Basket に添加し、開いているポートを閉じて、吸引する。 12.SV RNA Wash Solution 900µl を用いて洗浄を 2 回繰り返す。 13.吸引停止後、ステップ 7 で準備した Collection Tube を Spin Basket に挿入。Spin Basket/Collection Tube を 1 分間遠心する。 14.Spin Basket を Elution Tube に移し、Nuclease-Free Water 100μl を添加し、1 分間遠心する。精製した RNA は-70℃で保存する。 SV Total RNA Isolation System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z3100, Z3101,AND Z3105 Quick PROTOCOL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 Revised 08/07 Q1) A260/A280 の値が低い原因には何が考えられますか？ A1) 一般的にはタンパク質の混入が考えられます。フェノール/クロロフォルム抽出を行うことで改善されますが、RNA の収量は下がることが予想されます (最大 40%程度低下) Q2) A260/A230 の値が低い原因には何が考えられますか？ A2) 一般的にはグアニジンチオシアン酸の混入が考えられます。エタノール沈殿を行うことで改善されます。 Q3) RNA の収量が低い原因には何が考えられますか？ A3-1) サンプル中の RNA 量が少ないのかもしれません。組織や細胞によって湿重量あたりの精製できる RNA 量は異なります。また、凍結保存された組織または細胞溶解液は、Total RNA 量が減っている場合があります。サンプル摘出後すぐに精製ができない場合は、液体窒素で直ちに凍結し、-70℃ で保存してください。SV RNA Lysis Buffer (+ BME)でホモジナイズしたサンプルも-70℃で保存してください（少なくとも 1 週間は保存できます）。 A3-2) Spin Basket のメンブレン結合容量を超えているかもしれません。メンブレンの結合容量は、150-160ugRNA です。サンプルから最大の回収量が必要な場合には、サンプルのホモジネートを分けて精製し、得られた RNA 溶液をひとつに集めて、最終的な収量を決定してください。 A3-3) 最大の回収量を得るためには、70℃で 3 分間の加熱を必ず行ってください。この操作は、RNA の 2 次構造を変性させて、メンブレンへの結合を促すこと、タンパク質とゲノム DNA の凝集を減らすこと、RNase を不活化することに役立ち、安定して RNA を精製することができます。この操作を省くと収量が 15-50％低下します。 Q4) ゲノム DNA の混入が確認されました。何に注意すればよいでしょうか？ A4-1) RT-PCR 反応でゲノム DNA の混入が確認された場合は、ゲノム DNA 由来の増幅を回避するために RT 反応に用いる Tota RNA 量を 50 ～ 100ng に減らしてください。一般的に 50ng Total RNA を使用すれば、希少な mRNA からも特異的な産物を確認できます。 A4-2) ホモジネートを調製するときに用いる組織量を減らしてください。1 回の精製に使用する量が 30mg またはそれ以下であれば、ほとんどの組織でゲノム DNA の混入は見られません。腎臓組織に関しては 1 回の精製で 20mg 、また脾臓組織に関しては 15mg をそれぞれ超えないようにします。培養細胞は、1 回のプレップが 5×106 cells を超えないようにします。 A4-3) DNase I 溶液が完全にメンブレンを覆っているかどうか、目で確認して下さい。溶液は、容易に確認できるよう黄色く着色されています。また、インキュベーション時間を標準プロトコルの 15 分間から 30 分間まで長くすることも効果があります。 A4-4) 密度の高い組織や培養細胞では DNA が多く含まれているために十分にゲノム DNA を除去できない場合もあります。もし、サンプル中への DNA の混入が問題であれば、RNA を単離した後に RQ1 RNase-Free DNase (カタログ番号 M6101) を使用して DNase 処理し、続いてフェノール /クロロフォルム抽出を行うことをお薦めします。 Q5) Spin Basket のメンブレンが目詰まりしました。まりしました。 A5) ライセートの濃度が高すぎることが原因として考えられます。ライセートの粘性が高いようであれば、SV RNA Dilution Buffer を添加する前に、SV RNA Lysis Buffer で希釈してください。1 回の精製には、175µl 以上のライセートを用いないでください。 Q6) RNA が分解しています。 A6) 操作中に RNase が混入したのかもしれません。RNA の操作や保存には、DEPC 処理したガラス容器や溶液、および使い捨てのプラスチック容器を使用してください。また、全行程で、手袋を着用してください。溶出後の RNase の混入によっても RNA は分解されます。 Q7) 精製する RNA 溶液の濃度を高くすることはできますか？くすることはできますか？ A7) RNA 溶液の濃度を高くする場合は、溶出液を遠心エバポレーターなどで濃縮した後に少量の水に懸濁することをお薦めします。また、標準プロトコルでは、100µｌでの溶出を推奨していますが、溶出液量を少なくすることでも、以下の図に示したように濃度を高くすることができます。ただし、RNA の収量は低下しますので、ご注意ください。詳しくは、Promega Notes Number 64, p.7 をご参照ください。