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かわら版 2016年春号

二頁、 サポートします。 創薬、がん研究を 発光テクノロジーで プロメガは NanoLuc ® ルシフェラーゼってすごい 三頁、最新のGPCR 解析ツール：センサーからレポーターアッセイまで 四頁、驚きの再現性 : 発光レポーターを利用したADCC アッセイ 五頁、 遺伝子発現解析 同一細胞サンプルを用いた細胞生存性試験と マルチプレックス解析： 六頁、お客様の声：今話題のccfDNA 精製 七頁、 吸引法のススメ（プラスミド・ ‘ちょいテク’ ： PCR 産物精製） プロメガ株式会社 Promega KAWARABAN 2016年 春号 NanoLuc® ルシフェラーゼってすごい ありのままの細胞解析プロジェクト NanoBiT® ：NanoLuc® 2 分子テクノロジー PPI は細胞内のシグナル伝達ネットワークの必須要素です。セルフリー で PPI をモニタリングする方法は数多くありますが in vivo での状況を必 ずしも反映しているとは言えません。細胞を用いた従来の検出法では 細胞を溶解することなく、また特殊な装置を使わずに定量性のある検 出をすることは容易ではありませんでした。プロメガは NanoLuc® ルシ フェラーゼをベースにした、2 つのサブユニットシステムで生細胞内で の PPI 検出を可能にする NanoLuc® 2 分 子 テクノロジー（NanoBiT： NanoLuc® Binary Technology）を開発しました。Large BiT（LgBiT ; 18 kDa） および Small BiT（SmBiT ; 11 アミノ酸ペプチド）のサブユニットをそれ ぞれ標的タンパク質との融合体として発現させ、PPI が起こるとサブユ ニットの相補性が促進され発光酵素として明るい光を生じます（図 1）。 多くのスプリット系とは対照的に LgBiT：SmBiT の相互作用は可逆的で タンパク質間の迅速な解離も検出することができます。 タンパク質 A タンパク質 B LgBiT （17.6 kDa） SmBiT （11 amino acids） タンパク質 A タンパク質 B A. B. O O O O 構造的相補性による 発光シグナル BRET による蛍光シグナル BRET NanoLuc® HaloTag® ＋ 618 Ligand A SmBiT LgBiT B 図 1. NanoBiT ® の構造と再構成によるタンパク質間相互作用の測定原理 A：NanoBiT ® を構成する Large BiT と Small BiT の構造。B：タンパク質 A と B にそれぞれ Large BiT と Small BiT を融合させて細胞内で発現させ、タンパク質 A と B が相互作用する と NanoBiT ® が再構成されて発光を示す。 実験例として、ラパマイシン依存的に結合することが知られている 2 つ のタンパク FKBP と FRB の相互作用を測定しました。NanoBiT ® および 従来型のホタルルシフェラーゼのスプリットの各サブユニットに FKBP お よび FRB を融合し、細胞内でラパマイシンの刺激に応答する相互作用 の強さを発光測定しました。その結果、スプリットホタルルシフェラー ゼに比べ、NanoBiT ® の発光値はより広いレンジで結合の強さを示しま した（図 2A）。ラパマイシン存在下、FKBP – FRB 結合に対する FK506 の効果をモニタリングしました（図 2B）。NanoBiT ® はスプリットルシフェ ラーゼに比べ速やかなシグナルの低下が観察されました。このように、 NanoBiT ® は 2 分子の結合および分離を可逆的にかつ速やかにモニタ リングできます。同じ実験はコントロールベクターセット（Cat# N2016） と検出試薬（Cat# N2011）を用いて実施することができます。 さらに、NanoBiT ® は Small BiT の 11 アミノ酸というサイズにより、融合 タンパクへの活性への影響を最小限にするだけでなく、タンパク – ペプ チドの相互作用や、タンパク質や抗体用のタグとしての利用など、様々 な応用アプリケーションへの可能性が秘められています。 図 2. FRB：FKBP 相互作用の概要と NanoBiT ® とスプリットルシフェラーゼの比較 A：NanoBiT® またはスプリットルシフェラーゼを細胞内で発現させ、ラパマイシン濃度 依存的な相互作用の強さを定量した。B：FKBP と FRB の結合を阻害する FK506 をラ パマイシン存在下で添加し、添加後（t=0）の時間と発光値の関係を示した。 3×105 8×103 6×103 4×103 2×103 0 2×105 RLU RLU ［Rapamycin］（nM） ［Rapamycin］（nM） NanoBiT Firefly 1×105 10-2 10-1 101 102 103 0.01 1 100 100 0 1.3×107 1.0×107 7.5×106 5.0×106 2.5×106 RLU ［FK506］（µM） NanoBiT Firefly 10-2 10-1 101 102 100 0 5×104 4×104 3×104 2×104 1×104 0 RLU ［Rapamycin］（nM） 0.01 0.1 1 10 100 Rapamycin Only Relative response Time (min) Inhibition by FK506 120 100 80 60 40 20 0 0 40 80 120 160 200 240 3×105 8×103 6×103 4×103 2×103 0 2×105 RLU RLU ［Rapamycin］（nM） ［Rapamycin］（nM） NanoBiT Firefly 1×105 10-2 10-1 101 102 103 0.01 1 100 100 0 1.3×107 1.0×107 7.5×106 5.0×106 2.5×106 RLU ［FK506］（µM） NanoBiT Firefly 10-2 10-1 101 102 100 0 5×104 4×104 3×104 2×104 1×104 0 RLU ［Rapamycin］（nM） 0.01 0.1 1 10 100 Rapamycin Only Relative response Time (min) Inhibition by FK506 120 100 80 60 40 20 0 0 40 80 120 160 200 240 A B 分泌型 NanoLuc® プロメガでは NanoLuc® を使用する実験の多様性を広げるため、分泌型 NanoLuc® （secNluc）もご用意しております。NanoLuc® の N 末端に分泌 シグナルとして IL-6 シグナルペプチドを付加することにより、細胞外に NanoLuc® を分泌させます。secNluc は細胞外に分泌されるため、培地 をサンプリングすることにより、細胞を溶解することなく、NanoLuc® の 発光を測定することができます（図 3）。 図 3. 培養上清を用いた分泌 NanoLuc® アッセイ NanoLuc® ルシフェラーゼ（secNluc）の CRE 応答性発現を 6 時間フォルスコリン誘導あるいは DMSO コントロールの細胞で測定した。培地交換を t=0 で行った。分泌アッセイフォーマット によりレポーターの活性化カイネティクスを細胞溶解することなく測定できた。 10561MA –8 –7 –6 –5 –4 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 1 × 109 Log[Forskolin], M Luminescence (RLU) B. Time (hours) Luminescence (RLU) 0 1 2 3 4 5 6 1 × 104 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 DMSO Forskolin A. 関連製品 サイズ カタログ番号 価格（￥） NanoBiT ® システム スターターキット（クローニングベクター、コントロール、検出試薬） NanoBiT ® PPI MCS Starter System 1 システム N2014 180,000 NanoBiT ® PPI Flexi® Starter System 1 システム N2015 180,000 特 コントロールベクターセット NanoBiT ® PPI Control Pair（FKBP, FRB） 1 セット N2016 75,000 検出試薬 Nano-Glo® Live Cell Assay System 100 回分 N2011 28,000 特 1,000 回分 N2012 180,000 10,000 回分 N2013 1,530,000 ルシフェラーゼは感度の高さからレポーター酵素で最も汎用されるようになりました。プロメガではさらに研究に有効なツールとしてより高輝度で、 分子量も小さい NanoLuc® を開発しました。NanoLuc® は深海エビ（Oplophorus gracilirostris）由来のルシフェラーゼで、発光レポーターとして最適なパ フォーマンスを発揮するために改変された分子量の小さな発光酵素（19 kDa）です。このルシフェラーゼはホタルやウミシイタケのものより約 100 倍 以上明るく、高レベルの発光を長時間維持するための新規な基質 furimazine を用いて測定します。100 倍の明るさは 1/100 の分子数のレポーター酵 素でも十分に検出でき、分子量の小ささは標的タンパク質と融合させる場合においてもその機能への影響が最小限に抑えられることを意味します。 これらの特長は細胞内で起こる現象をよりありのままに、細胞・タンパク質機能への影響を最小限に抑えた実験ツールとしての可能性を秘めています。 今回は活用例として、タンパク質間相互作用（PPI）へ応用した NanoBiT ® システム、および分泌型 NanoLuc® についてご紹介します。 サイズ カタログ番号 価格（￥） NanoLuc® レポーターベクター 分泌型 NanoLuc® レポーターベクター pNL1.3 [secNluc] Vector 20 µg N1021 73,000 特 pNL3.3 [secNluc/minP] Vector 20 µg N1051 73,000 特 pNL2.3 [secNluc/Hygro] Vector 20 µg N1081 73,000 特 pNL1.3.CMV [secNluc/CMV] Vector 20 µg N1101 73,000 特 特 キャンペーン対象製品：詳細については 8 ページをご覧ください。 プロメガ　NanoLuc 検索 今すぐ始めたいけど装置が無い？そんな時は… www.promega.co.jp/rentamax/ 2 最新の GPCR 解析ツール：センサーからレポーターアッセイまで アカデミア創薬サポートプロジェクト 創薬における重要な過程に、in vitro での活性評価があげられます。薬効薬理と異なり、多くの化合物を評価する必要性から、評価系は偽陽性・偽陰 性が少なく、かつ簡便で定量性があることが求められます。プロメガは独自のバイオルミネッセンスを主軸の技術として、創薬に最適なアッセイ系を 構築しています。今回は、G たんぱく質共役型受容体（GPCR）を標的としたツールをご紹介します。GPCR は、作用薬アゴニストの結合を引き金とし て細胞にさまざまな変化をもたらします。これらの変化をライブセルで検出できるユニークなアッセイ系を紹介します。 cAMP センサーを内蔵したルシフェラーゼ GloSensor™ cAMP を細胞内 に導入することにより、細胞内の cAMP 濃度のカイネティクスを観察する ことができます（図 1）。cAMP の測定は一般的に競合法で測定すること が多く、通常 cAMP 増加に合わせてシグナルが低下しますが、本系はシ グナルが増加する点と細胞数の至適化の必要が無い点が大きな特徴で す。また、cAMP 増加にともなう PKA の活性化、すなわち PKA 触媒ドメイン （CA）から調節ドメイン（R2A）の解離をタンパク質間相互作用検出ツー ル NanoBiT ® あるいは NanoBRET ™で測定することができます（図 2, 3） 7707TA N 359–544 RIIβB 4–355 C N C N C 図 1. GloSensor™ cAMP の反応模式図 ルシフェラーゼに組み込まれた cAMP 結合ドメインに cAMP が結合することに より、構造が変化してルシフェラーゼ 活性を獲得する。 LgBiT Protein Kinase A SmBiT cAMP cAMP cAMP cAMP cAMP cAMP Regulatory （R2A） Catalytic （CA） 図 2. NanoBiT ® による PKA 活性化の反 応模式図 PKA 触媒ドメイン（CA）-SmBiT およびタ イプ 2 調節ドメイン（R2A）-LgBiT は複 合体を形成しており、細胞内 cAMP の 増加に伴い R2A が解離し、NanoBiT® も 2 つに分かれて消光する。 （ ※このアッ セイ 系 は、NanoBiT® PPI Starter System のコントロールアッセイと して付属しています）。 100 1000 100 10 1 75 50 25 0 0 0 20 40 60 Time (minutes) NanoBiT NanoBiT (% signal decrease) (fold signal increase) GloSensor cAMP 22F 13380MA Isoproterenol cAMP Forskolin cAMP Propranolol cAMP GloSensor cAMP 22F 図 3. cAMP 濃度変化のダイナミックスをモニタリングできる 2 種類のバイオセンサー β 2-アドレナリン作動性受容体発現細胞に、GloSensor™ cAMP あるいは NanoBiT ® （SmBiT-CA および LgBiT-R2A）を発現させ、アゴニスト（イソプロテレノール；ISO）, アンタゴ ニスト（プロプラノール；PRO）, アデニル酸シクラーゼ アクティベーター（フォルスコリン； FSK）を順次添加した。NanoBiT ® 反応の可逆性が観察されるとともに、GloSensor™ cAMP による 細胞内 cAMP 濃度の変化と対称的なパターンを示した。 多くの GPCR のシグナル伝達は共役する G α サブユニットにより異なり ますが、β -アレスチンの GPCR への結合は、G α サブユニットに依存し ない系として知られています。プロメガでは、NanoBRET ™ および NanoBiT ® （図 4）を用いて、β -アレスチンの結合実験系を構築しました。 この系ではカイネティクスを取ることにより、タイプ A 受容体とタイプ B 受容体では、異なった様式を示しました。 0 10 20 30 40 50 0 5 10 15 20 Time (min) Fold vs. vehicle ADRB2/ARRB2-ISO (10 µM) AVPR2/ARRB2-AVP (100 nM) Injection 図 4. NanoBiT ® による GPCR：β -アレスチンの相互作用モニタリング β 2-アドレナリン作動性受容体（ADRB2）およびアルギニンバソプレシン受容体（AVPR2） に対する β -アレスチン 2（ARRB2）の結合を NanoBiT ® で観察した。ADRB2 アゴニスト であるイソプロテレノール（ISO）および AVPR2 アゴニスト Arg8- バソプレシン（AVP）で それぞれを刺激前後の発光量を vehicle に対する比としてあらわした。（ACS Chem. Biol., 2015, DOI: 10.1021/acschembio.5b00753） このほか、BRET を用いた GPCR の二量体化およびインターナリゼー ション、細胞内 Ca 測定、エンドポイントでの cAMP の定量、応答配列 によるレポーターアッセイなどがバイオルミネッセンスを用いて測定す ることができます（図 5）。特にレポーターアッセイでは、最 新の NanoLuc® を用いたアッセイ系も可能になっています。 GPCR ではすべてセルベースアッセイをご紹介しましたが、セルフリーで 行う多くの酵素アッセイ系もサポートしています。しかもすべて、混ぜ るだけのホモジニアスアッセイです。 b g Gαs/i β-arrestin β-arrestin β-arrestin β-arrestin β-arrestin AC PK ATP cAMP CRE PKA 活性化 • NanoBiT™* レポーターアッセイ • NanoLuc • FLuc cAMP モニタリング • GloSensor™ cAMP* • cAMP-Glo™ 受容体の2量体化 • NanoBRET™* β-arrestin の結合 • NanoBRET™* • NanoBiT™* 受容体のインターナリゼーション • NanoLuc®* • HaloTag®* β-arrestin の解離 • NanoBRET™ * • NanoBiT™* CRE の他、その他のGPCR シグナルに応答する SRE, AP-1, SRF-RE, NFAT-RE 応答配列を含む レポーターベクターもございます。 cAMP 量の変化に応じて 活性化するPKA を ATP の 減少量としてとらえる 発光アッセイ。 *カイネティック測定が可能 図 5. GPCR 研究を加速させる様々な発光アッセイツール プロメガでは様々なセンサー、レポーターを用いたセルベースの GPCR 研究ツールを揃 えています。 関連製品 サイズ カタログ番号 価格（￥） センサー センサー発現ベクター pGloSensor™ -22F cAMP Plasmid 20 µg E2301 114,000 特 pGloSensor™ -20F cAMP Plasmid 20 µg E1171 114,000 検出試薬 GloSensor™ cAMP Reagent 25 mg E1290 57,000 特 250 mg E1291 260,000 タンパク質間相互作用 NanoBiT ® スターターキット NanoBiT® PPI MCS Starter System 1 キット N2014 180,000 NanoBiT ® PPI Flexi® System 1 キット N2015 180,000 特 サイズ カタログ番号 価格（￥） NanoBRET ™ スターターキット NanoBRET ™ PPI MCS Starter System 1 キット N1811 180,000 特 NanoBRET ™ PPI Flexi® Starter System 1 キット N1821 150,000 特 NanoBRET ™ Nano-Glo® Detection System 1,000 回分 N1662 200,000 特 NanoBRET に関しては、ベクター構築のお手伝いも行います。 レポーターベクター NanoLuc® シグナル応答ベクター pNL [NlucP/CRE/Hygro] Vector 20 µg 非カタログ品 78,000 特 pNL [NlucP/SRE/Hygro] Vector 20 µg 非カタログ品 78,000 特 pNL [NlucP/AP1-RE/Hygro] Vector 20 µg 非カタログ品 78,000 特 pNL [NlucP/NFAT-RE/Hygro] Vector 20 µg 非カタログ品 78,000 特 pNL [NlucP/SRF/Hygro] Vector 20 µg 非カタログ品 78,000 特 特 キャンペーン対象製品：詳細については 8 ページをご覧ください。 プロメガ　創薬 検索 今すぐ始めたいけど装置が無い？そんな時は… www.promega.co.jp/rentamax/ 3Promega KAWARABAN 驚きの再現性 : 発光レポーターを利用した ADCC アッセイ 第一回目は抗体医薬の主要な作用機序の一つ、Antibody-dependent cellmediated cytotoxicity（ADCC）アッセイを取り上げます。従来の ADCC アッ セイは ①初代 NK 細胞（PBMC など）をエフェクター細胞として使用し、 ②エフェクター細胞が惹起したターゲット細胞死を検出していました。 しかし、バックグラウンドが高いため十分な検出感度が得られず、初代 NK 細胞の活性が不安定であるため再現性が低い、という問題がありま した。その上作業が煩雑で時間がかかるため開発研究においても使い づらいアッセイでしたが、さらに厳密さが要求される品質管理試験のク ライテリアを満たすことは極めて難しいものでした。 この問題を克服するため、プロメガではレポーターアッセイを応用した ADCC Reporter Bioassay を開発しました。ADCC では、抗体によるエフェク ター細胞活性化の際に NFAT シグナル経路が活性化されることがターゲッ ト細胞死につながるトリガーであることが報告されています。この NFAT シ グナル経路活性化をレポーターで検出することにより、従来のようにター ゲット細胞死を検出する方法に比べてバックグラウンドが大幅に低くなり、 検出感度が格段に向上しました（図 1）。またエフェクター細胞として組換 え Jurkat 細胞を使うことにより、NK 細胞の不安定さに起因する問題を克服 し、品質管理試験に使用できる高い再現性と信頼性を実現しました（図 2）。 10338MA NFAT-RE Luc 抗原 抗体 エフェクター細胞 （遺伝子組換えJurkat 細胞） ターゲット細胞 FcγRIIIa NFAT パスウェイ 図 1. ADCC Reporter Bioassay の概要 NFAT 応答配列により発現制御される ホタルルシフェラーゼの発光シグナルを測定。 10338MA 11427MB Percent ADCC Biolocigical Activity (Relative to N-glycosylated trastuzumab) Percent N-glycosylated trastuzumab 0 10 20 30 40 50 0 20 40 60 80 100 120 ADCC Reporter Bioassay PBMC-based ADCC assay 図 2. 抗体グリコシル化にともなう ADCC 活性の従来法との比較 従来法（■）に比べ、レポーター法（■）のエラーバーは非常に小さい アッセイプロトコールにも工夫を凝らしています。細胞培養が不要な Thaw-and-Use フォーマットを採用し、細胞を試薬のように使うことがで きるようになりました。このため従来 1 週間以上かかっていたアッセイ を、たった 1 日で終えることができます（図 3）。 図 3. 飛躍的に短縮されたプロトコル 従来法（1-2 週間） 製品に付属 する細胞 アッセイバッファーに懸濁、 アッセイ、測定 プレートに播く 細胞 培養 細胞数カウント、回収 アッセイ、測定 アッセイバッファーに懸濁、 ‘Cells as reagents’: Frozen‘Cells as reagents’: Frozen , th‘Cells as reagents’: Frozen aw-and-use cells (3-24hr) , tha, thw-and-use cells (3-24hr) aw-and-use cells (3-24hr) ‘Cells as reagents’: Frozen プレートに播く , thaw-and-use cells (3-24hr) ‘Cells as reagents’: Frozen, thaw-and-use cells (3-24hr) ドナーからの 細胞調達 準備 不要 ‘Cells as reagents’: Frozen, thaw-and-use cells (3-24hr) ADCC レポーターアッセイ（24 時間以内） 所要時間 ‘Cells as reagents’: Frozen ‘Cells as reagents’: Frozen ‘Cells as reagents’: Frozen , thaw-and-use cells (3-24hr) , thaw-and-use cells (3-24hr) , thaw-and-use cells (3-24hr) ‘Cells as reagents’: Frozen, thaw-and-use cells (3-24hr) ‘Cells as reagents’: Frozen ‘Cells as reagents’: Frozen ‘Cells as reagents’: Frozen , tha,w-and-use cells (3-24hr) th,a thw-and-use cells (3-24hr) aw-and-use cells (3-24hr) ADCC Reporter Bioassay のメリットはこれだけではありません。ADCC に おいて、抗体はエフェクター細胞表面の Fc γ RIIIa 受容体と結合しますが、 この受容体には抗体と親和性の高い V variant と親和性の低い F variant があり、F variant は ADCC が起きにくい事が報告されています。従来法 では親和性の高い V variant でなければ十分な差が見られなかったため、 V variant をホモで持つドナーからの細胞を使用していましたが、実際は 約 85％ の人が F variant をヘテロまたはホモで持つと報告されており、 V variant の調達が困難でした。そのため、多くの患者様での効き目を 評価できない点が問題となっていました。ADCC Reporter Bioassay では Jurkat 細胞に外来性 Fc γ RIIIa 受容体を導入しているため、V variant ま たは F variant を単独で発現するエフェクター細胞を容易に作ることが できます。また感度が高いため、抗体への応答性が低い F variant でも 十分なシグナルが得られ、効果判定ができるようになったのです（図 4）。 0 12447MA 20 40 60 80 Fold Induction F Variant ADCC V Variant ADCC –12 –11 –10 –9 –8 –7 –6 Log10[rituximab], g/ml 図 4. V variant と F variant の応答性比較 今回紹介した ADCC アッセイの他にも、プロメガでは抗体医薬品開発を サポートする画期的な製品を次々に開発しています。次回は免疫チェック ポイントでホットな抗 PD-1 / PD-L1 抗体のアッセイをご紹介する予定で す。お楽しみに！ ADCP レポーターバイオアッセイについては次ページをご覧ください。 バイオ医薬プロジェクト 抗体医薬に代表されるバイオ医薬品の研究開発が加速しています。バイオ医薬品の一般化を後押しすると期待されているバイオシミラーの開発も活 発化しています。「同程度の薬効を示す＝バイオシミラー」だけでなく「よりよい効果を持つ＝バイオベター」という考え方も出てきており、開発研究 から製造、品質管理まで、新たな技術が求められていることは間違いありません。 このセクションでは、抗体医薬の研究・評価試験のうち従来法の問題を新たな技術で克服したアッセイや、従来法では対応できなかった新しいニーズに応 えるアッセイをシリーズでご紹介します。 関連製品 サイズ カタログ番号 価格（￥） ADCC レポーターアッセイ コンプリートキット ADCC Reporter Bioassay, Complete（WIL2-S） 1 キット G7014 138,000 特 ADCC Reporter Bioassay, Complete（Raji） 1 キット G7015 138,000 コアキット ADCC Reporter Bioassay, Core Kit 1 キット G7010 115,000 5 キット G7018 515,000 特 キャンペーン対象製品：詳細については 8 ページをご覧ください。 ※コンプリートキットはエフェクター細胞（組換え Jurkat 細胞［Fc γ RIIIa-V158 バリアント , luc2］）、ターゲット細胞（WIL2-S または Raji）、コントロール抗体（Anti-CD20）、アッセ イ試薬などが付属します）。 ※コアキットにはコンプリートキットに含まれるターゲット細胞およびコントロール抗体 が除かれています。 ※この他のエフェクター細胞として、Fc γ RIIIa-F158 バリアント、マウス Fc γ RIV、マウス Fc γ RIII などもご用意しております。詳細については弊社までお問合せください。 プロメガ　抗体医薬 検索 今すぐ始めたいけど装置が無い？そんな時は… www.promega.co.jp/rentamax/ 4 ADCP もレポーターバイオアッセイ 最近 ADCC と並んで、ADCP という言葉を見たまたは聞いたことが あるのではないでしょうか？ ADCP とはどういう現象でしょうか？ また ADCC と何が違うのでしょうか？ ADCC（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）の主役は NK 細胞です。活性化した NK 細胞は液性成分を分泌してターゲット 細 胞 を 殺 し ま す。 一方、ADCP （Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis）の主役はマクロファージです。活性化したマクロファー ジはターゲット細胞を貪食することで排除します（図 5）。ADCP で はエフェクター細胞の種類のほか、関係する Fc γ 受容体の種類も違 います。ADCC ではタイプ III 受容体（Fc γ RIIIa）を介してエフェクター 細胞が活性化しますが、ADCP ではタイプ II 受容体（Fc γ RIIa）を介 するため、ADCC アッセイ用の細胞では ADCP アッセイができません。 ADCP アッセイのニーズが高まったことを受け、この度プロメガでは ADCP Reporter Bioassay を発売しました。タイプ II 受容体にも高親和 性の H variant と低親和性の R variant があることが分かっており、プ ロメガでは両方のアッセイキットをご用意しています。R variant キッ トはまだカスタム品ですが、将来的にカタログ品化する予定です。 図 5. ADCC と ADCP の作用機序比較 ADCC 抗体 パーフォリンと グランザイム NK細胞 マクロファージ Fc γRIIIa Fc γRIIa ADCP 液性成分によるがん細胞の破壊 ファゴサイトーシスによるがん細胞の破壊 がん細胞 ADCC および ADCP バイオアッセイ バイオアッセイ システムに含まれる細胞 カタログ番号 ADCC Reporter Bioassays Complete Kit （WIL2-S）1 Effector Cells: Fc γ RIIIa-V158 Jurkat cells Target Cells: WIL2S or Raji cells G7014 Complete Kit （Raji） G7015 Core Kit2. G7010 ADCC Reporter Bioassays, F Variant5 Core Kit Effector Cells: Fc γ RIIIa-F158 Jurkat cells G9790 mFc γ RIV ADCC Reporter Bioassays Complete Kit Effector Cells: Mouse Fc γ RIV Jurkat cells カスタム品 mFc γ RIII ADCC Reporter Bioassays Core Kit Effector Cells: Mouse Fc γ RIII Jurkat cells カスタム品 Fc γ RIIa-H ADCP Reporter Bioassays 新発売！ Complete Kit Effector Cells: Fc γ RIIa-H131 Jurkat cells G9901 Core Kit G9991 Fc γ RIIa-R ADCP Reporter Bioassays Core Kit Effector Cells: Fc γ RIIa-R131 Jurkat cells カスタム品 Fc γ RI ADCP Reporter Bioassays Core Kit Effector Cells: Fc γ RI Jurkat cells カスタム品 ※カスタム品については弊社テクニカルサービス部までお問合せください。 APromega KAWARABAN マルチプレックス解析： 同一細胞サンプルを用いた細胞生存性試験と遺伝子発現解析 高次元細胞プロジェクト 培養細胞を用いた実験が日常化している現在、より生体に近い高次な細胞モデルである 3 次元培養細胞あるいは初代培養細胞、ES/iPS 分化細胞な ど特殊かつ貴重な細胞が多く利用されてきています。プロメガでは、これらに対応すべく高次元細胞プロジェクトとして、3 次元培養対応、カイネティ クス測定、多重測定（マルチプレックスアッセイ）あるいは、細胞内エネルギー代謝測定システムなど、より高度なツールを提供しています。今回は、 マルチプレックスアッセイの中でも、特にユニークな例をご紹介します。 細胞生存性測定と RNA 精製あるいはレポーターアッセイとのマルチ プレックス解析 培養細胞 核酸精製 （Maxwell® RSC / Reliaprep™） 細胞生存性試験 （RealTime-Glo® ） RT-qPCR （GoTaq® ） レポーターアッセイ （ONE-Glo® ） 細胞の継続的な生存性を測定するために、細胞非侵襲的な方法として RealTime-Glo™ が開発されました。この非侵襲的な特徴を生かして、 細胞生存性測定後に細胞を他の目的に利用することが可能です。薬剤 による細胞刺激、siRNA などによるノックダウンの影響の指標として、 細胞生存性試 験あるいは発 現量（転写量）の変化を測定します。 RealTime-Glo™ は両試験を同一細胞で測定することを可能にしました。 これを確認するために RealTime-Glo™ の RNA 精製に対する影響を調べた ところ、その収量に影響が認められず（図 1）、また、ホタルルシフェラー ゼによるレポーターアッセイに対する影響も認められませんでした（図 2）。 160 212 442 1075 1 10 100 1000 Microtissue Diameter (µm) RNA yield Yield (ng) Maxwell® + RT-Glo Maxwell® − RT-Glo ReliaPrep® + RT-Glo ReliaPrep® − RT-Glo 図 1. Maxwell® （自動精製）あるいは ReliaPrep™（マニュアル精製）による RNA 精製に 対する RealTime-Glo™ の影響 さまざまなサイズの HEK293 スフェロイドを RealTime-Glo™ を用いて細胞生存性を測定 した後、Maxwell® 16 LEV simply RNA Tissue Kit あるいは ReliaPrep™ RNA Tissue Miniprep System を用いて RNA 精製を行った。RealTime-Glo™ は、RNA の収量に影響を与えなかった。 図 2. ホタルルシフェラーゼアッセイに対する RealTime-Glo™ の影響 RealTime-Glo™ 試薬添加 2 時間後に細胞生存性を測定し、次にルシフェラーゼアッセイ 試薬である ONE Glo™ を添加して、ルシフェラーゼ活性を測定した。レポーターアッセイ の結果、RealTime-Glo™ 非処理（▲）と比較し RealTime-Glo™ 処理（■）による影響は 認められなかった。 0 1000 2000 3000 0.00E+00 1.60E+06 1.20E+06 8.00E+05 4.00E+05 2.00E+06 0.00E+00 4.00E+04 3.00E+04 2.00E+04 1.00E+04 5.00E+04 cells/well ONE-Glo (RLU) RealTime-Glo (RLU) ONE-Glo multiplex ONE-Glo alone RealTime-Glo 次に細胞周期をコントロールする CDK2 に対する siRNA をトランスフェ クションし、同一細胞を用いて細胞生存性および転写産物を定量しま した。CDK2 siRNA をトランスフェクションすると、継時的な細胞生存 性の低下が認められ、併せて細胞内の転写量が低下していることも確 認することができました（図 3）。この結果は CDK2 のノックダウンによ り細胞周期が停止し、細胞数が減少したことを示唆していました。 CDK2 Cyclophillin B Relative Expression 2 1.5 1 0.5 0 Non-Targeting CDK2 Cyclophillin B Non-Targeting CDK2 Cyclophillin B 120 100 80 60 40 20 0 CDK2 CyclophillinB Cell Viability RT-qPCR % of Non-Targeting Control Signal 24hr 48hr 図 3. siRNA 処理による細胞生存性試験と遺伝子発現解析のマルチアッセイ CDK2 およびハウスキーピング遺伝子 Cyclophilin B に対する siRNA 処理後 24 時間および 48 時間に RealTime-Glo™ による細胞生存性試験を行った。さらに、同一の細胞サンプ ルより抽出した RNA と GoTaq® 1-Step RT-qPCR System を用いて RT-qPCR を行い各遺伝 子の転写物を定量した（コントロール：GAPDH）。CDK2 のノックダウンは細胞生存性を 低下させたが、Cyclophilin B では顕著な影響は認められなかった。 RealTime-Glo™ については、このほかに ATP 測定による細胞生存性試 験 CellTiter-Glo®、アポトーシス試験 Caspase-Glo® 3/7 などを組み合わせ たマルチプレックスアッセイが可能で、その他 Promega の多くのアッセ イシステムでもマルチプレックスアッセイが構築されています。詳細につ いては弊社 Web サイトを参照いただくか直接お問い合わせください。 今すぐ始めたいけど装置が無い？そんな時は… www.promega.co.jp/rentamax/ 関連製品 サイズ カタログ番号 価格（￥） セルベースアッセイ 細胞生存性試験（リアルタイム） RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay 100 回分 G9711 20,000 特 10 × 100 回分 G9712 97,000 1000 回分 G9713 88,000 ホタルルシフェラーゼアッセイ ONE-Glo™ Luciferase Assay System 10 ml E6110 22,000 特 100 ml E6120 139,000 核酸精製 RNA 自動精製 Maxwell® RSC System 1 台 AS4500 2,800,000 Maxwell® RSC simplyRNA Tissue 48 回分 AS1340 39,000 RNA マニュアル精製 ReliaPrep™ RNA Tissue Miniprep System 50 回分 Z6111 34,000 PC 250 回分 Z6112 152,000 PC RT-qPCR GoTaq® 1-Step RT-qPCR System 200 回分 A6020 75,000 PC 特 キャンペーン対象製品：詳細については 8 ページをご覧ください。 PC プロメガクラブ対象製品です。会員価格については www.promega.co.jp/promegaclub.html でご確認ください。 高次元細胞プロジェクト 検索 5 イントロダクション： 近年、がんのバイオマーカーとして ccfDNA が大注目されています。 今回ご登場いただく日本医科大学 消化器外科 山田岳史先生の研究室では、ccfDNA の解析により、主に 大腸がんを対象とした有効な治療法の研究が行われています。先生の研究室では、ccfDNA 精製に、 Maxwell® RSC Instrument（自動精製装置）と Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit をいち早く採用いただき、日々 の研究にご利用いただいております。Maxwell® RSC Instrument とその ccfDNA Plasma Kit を採用したその理 由をお客様の視点から語っていただきました。 装置のレンタルプログラム RentaMAX 核酸精製のお悩みなら機器貸出 & コンサルティングのレンタマックスへ！ 詳細、 お問合せ・お申込みは www.promega.co.jp/rentamax/ 日本医科大学 消化器外科 山田 岳史 先生 Maxwell® RSC System 今話題の ccfDNA 精製 多忙な方におすすめ！ トレーニング不要・誰でも確実に再現可 癌細胞に由来する ccfDNA は 低侵襲性バイオマーカーとして 期待が集まっています！ 3 ステップ （Maxwell® 法） カートリッジを セット スタートボタンを 押す カラムに ライセートを添加 ProK を添加 血漿を添加 血漿を添加 吸引 遠心 遠心 17ステップ （他社マニュアル法） お客様の声 しかも 自動！ 問題点 改善点 ccfDNA を抽出するために、手術を受けた患者さんは 3 ヶ月に 1 回、化学療法中の患者さんは 2 ヶ月 1 回 の頻度で採血しています。検体があっという間にたまってしまうので、これらの検体から ccfDNA を精製 する時間の確保が大変で、若手のドクターが ccfDNA 抽出のため、休日出勤することもありました。 ① それまで使っていたマニュアル操作のキットより 20 分長くかかりますが、 実際に手を動かす時間は短いので、手離れがよく、臨床ドクターにとっては非常にありがたい ② 外来診療や回診の前にセットして、帰ってきたら終わっている ③ 手動のキットとは異なり、あまり経験を積まなくても、再現性良く精製できるので安心 • 臨床ドクターには自由になる時間が少ない • 毎年、新人が入ってきて教えるのがたいへん • 実験に不慣れな者が多いので、サンプル間のバラつきが心配 また、取り違え・コンタミのリスクが心配 • 血漿 1 ml をカートリッジに加えて、75 分待つだけ。診療の合間に 1 ラン完了 • シンプルな操作のため、一度教えるだけで誰でも操作を習得 • 機器による全自動精製のため、サンプル間・オペレーター間のバラつきがない • 試薬をプレパック済みの精製用カートリッジ、ディスポのチップ類を採用しており、 コンタミやサンプルのロスの心配がない 先生のお悩みごと Maxwell® RSC 導入後のお喜びの声 ccfDNA はがんの診断、分子標的治療薬の効果予測・耐性予測に有用なバイオマーカーと考えられてい ますが、術後のサーベランスや分子治療薬以外の化学療法におけるバイオマーカーとしての利用も期待 されています。KRAS の変異は EGFR 阻害剤の薬効に大きな影響を及ぼします。大腸癌では原発巣にお いて KRAS が野生型であっても、転移巣では約 10% で変異型となっているそうです。ccfDNA を用いる ことで転移巣での KRAS 変異の有無を知ることが可能となりますが、ccfDNA から KRAS 変異が検出さ れる症例では EGFR 阻害剤の効果はあまり期待できません。また EGFR 阻害剤に耐性化した症例では ccfDNA から KRAS 変異が検出されます。 通常、ccfDNA は血漿サンプルから精製されますが、より低侵襲なことから尿サンプルも注目されてい ます。先生の研究室では、尿サンプルを ccfDNA の研究に利用する計画が倫理委員会にて認可され、 こちらも Maxwell® RSC Instrument を使って ccfDNA の精製にトライされるそうです。大注目の ccfDNA 研 究において、また新しい知見が得られると思います。 Maxwell® RSC Instrument は、1 回のランで最大 16 サンプルを同時処理する自動核酸精製装置で、精製 用の試薬をプレパックしたカートリッジにサンプルを加え、装置にセットするだけです。ccfDNA 精製キッ ト以外にも miRNA 精製キット、FFPE からの DNA 精製キット、組織・細胞からの total RNA を抽出するキッ トも取り揃え、精製した ccfDNA は、デジタル PCR、NGS による網羅的変異解析、Pyrosequence による メチレーション解析にも利用されています。 サイズ カタログ番号 価格（￥） 自動核酸精製システム 自動核酸精製装置 Maxwell® RSC System 1 台 AS4500 2,800,000 ccfDNA 精製キット Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit 48 回分 AS1480 96,000 Maxwell® RSC LV ccfDNA Kit, Custom 48 回分 AX1114 120,000 Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit • 圧倒的に簡便！たったの 3 ステップ • 高純度で精製可能 • 1 ml 血漿用（AS1480）と 4 ml 血漿用（AX1114）の 2 タイプ 装置をお持ちでない方でも！ 6Promega KAWARABAN 吸引法の特長 • ハイスピードな核酸精製 • 吸引マニホールド Vac-Man® で 20/96 サンプルを 1 度に精製 • 洗浄ステップが大幅に簡略化（煩わしい遠心操作の繰り返しを低減） プラスミド、PCR 産物、ゲノム DNA、 Total RNA の各種キットを用意 日常的に行われている PCR から近年普及してきた次世代シークエンシングまで、質の高い DNA を調製することは実験を成功させるキーポイントであ ることに変わりはありません。誰でも簡単に、しかも確実に DNA を精製することは非常に重要です。市販の核酸精製キットの多くは遠心操作が多用 されているため煩雑で操作ミスを招くこともあります。プロメガの DNA 精製システムの多くは遠心法だけでなく吸引法を選ぶことができ、より簡便、 確実に DNA を精製することができます。 未経験者が明日からスペシャリスト !? プロメガクラブ“寺子屋” １から始める吸引法 プラスミド抽出によるトレーニング プロメガの実験トレーニングサービスが始まります！ プロメガの小さなラボにてトレーナーがきめ細かく実験のノウハウを お教えします。テキストからは読み取れなかったコツをお持ち帰り いただけます。実験は一度体験するとしないとでは大違い！新入生や 実験補助の方、もちろんベテランの方も、お気軽にお申込みください。 お申込み・詳細は www.promega.co.jp/promegaclub.html 日程：6/7, 14, 21, 28（火曜日） 午前コース 10：00 ～ 12：00 午後コース 15：00 ～ 17：00 場所 : プロメガ株式会社（東京都中央区日本橋） 参加費無料、各回とも定員 5 名前後 お申込み締め切り：各開催日の 7 日前まで いつものワークフローがレベルアップ ‘ちょいテク’ 吸引法スタートアップセット（プラスミド・PCR 産物精製） 吸引法のススメ　～ 今日も遠心機は大混雑。そんなときどうする？ ～ シリカメンブレンテクノロジーを採用した DNA 精製システムである Wizard® および PureYield ™ は、カオトロピックな条件下で核酸を選択的 に捕捉するシリカの特性を活かした多孔性シリカメンブレンを共通の担 体として利用し、優れた洗浄効率、乾燥特性、迅速な操作性などいくつ もの優れた特性を持ちます。さらにこれらのキットは遠心法だけでなく吸 引法による処理が可能です。 遠心法による洗浄ステップでは遠心操作を繰り返すため（Wizard® SV Minipreps の場合 3 回）、各ミニカラム / チューブを遠心機にセットし、遠 心後に洗浄廃液を捨てる作業も同様に繰り返す必要があります。それに 対して吸引法では吸引マニホールドにカラムを一度セットすれば面倒な洗 浄廃液除去工程である煩雑なミニカラム / チューブの付け替えを繰り返 す必要がありません。Wizard® および PureYield ™ にはミニやラージ、96 ウェルプレートフォーマットなど処理量や処理数に応じたシステムがあ り、それぞれに適した吸引マニホールドも用意されているため、実験に 最適なシステムを選択できます。 シリカメンブレンテクノロジーと吸引法を組み合わせることで、DNA 精製 ワークフローは今よりもっとシンプル化・効率化することができるのです。 お問合せの多い吸引ポンプを含む、便利なセットです プラスミドや PCR 産物の精製など、DNA 精製時の遠心ステップが煩雑ではありませんか？ 吸引法なら面倒なカラムの入れ替え作業が不要なため手間と時間を大幅に低減でき、遠心機の占領時間を少なくして混雑緩和にも役立ちます。 吸引法のセットアップ例 手前の青い器具が Vac-Man® （吸引マニホールド） 吸引ポンプなど吸引装置に接続して使用する Vac-Man® 96 96 サンプルから一度に核酸精製を 行うことができる吸引マニホールド セット内容、価格は次のページをご覧ください 吸引法をすぐにマスターしたい方、実験初心者の方 短時間のトレーニングで手技が身に付きます！ 吸引法 セットは 1 度で OK 遠心法 遠心機へ複数回の出し入れが必要 6 月 開講 今期のお題 5 名以上でご参加希望のラボには 出張トレーニングもいたします ! DNA 精製 PCR 電気 泳動 9334TA ×3 吸引ポンプ 核酸精製キット 吸引マニホールド （Vac-Man® ） お得情報あり プロメガ クラブ特典 NEW 7 特 特 掲載ページ 製品名 サイズ カタログ番号 定価（￥） 特別価格（￥） 2 NanoLuc ルシフェラーゼってすごい NanoBiT ® PPI Flexi ® Starter System 1 システム N2015 180,000 108,000 Nano-Glo® Live Cell Assay System 100 回分 N2011 28,000 22,400 pNL1.3 [secNluc] Vector 20 µg N1021 73,000 51,100 pNL3.3 [secNluc/minP] Vector 20 µg N1051 73,000 51,100 pNL2.3 [secNluc/Hygro] Vector 20 µg N1081 73,000 51,100 pNL1.3.CMV [secNluc/CMV] Vector 20 µg N1101 73,000 51,100 3 最新の GPCR 解析ツール：センサーからレポーターアッセイまで pGloSensor™ – 22F cAMP Plasmid 20 µg E2301 114,000 79,800 GloSensor™ cAMP Reagent 25 mg E1290 57,000 45,600 NanoBRET ™ PPI MCS Starter System 1 セット N1811 180,000 144,000 NanoBRET ™ PPI Flexi® Starter System 1 セット N1821 150,000 120,000 NanoBRET ™ Nano-Glo® Detection System 1,000 回分 N1662 200,000 160,000 4 驚きの再現性 : 発光レポーターを利用した ADCC アッセイ ADCC Reporter Bioassay, Complete（WIL2-S） 1 Kit G7014 138,000 110,400 5 マルチプレックス解析：同一細胞サンプルを用いた細胞生存性試験と遺伝子発現解析 RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay 100 回分 G9711 20,000 14,000 ONE-Glo™ Luciferase Assay System 10 ml E6110 22,000 15,400 7 ‘ちょいテク’：吸引法のススメ（プラスミド・PCR 産物精製） Wizard® SV Gel and PCR Pump Set（セット販売①） 1 JKC003 70,000 構成品 Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System 50 回分 A9281 13,000 x-tracta™ Gel Extractor 25 個 A2121 4,000 Vac-Man® Laboratory Vacuum Manifold, 20-sample capacity 1 セット A7231 51,000 Welch Vacuum Pump, for Japan Electrical 1 台 A6724 90,000 Vacuum Adapters 20 個 A1331 3,000 Wizard® SV miniprep Pump Set（セット販売②） 1 JKC004 70,000 構成品 Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System + Vacuum Adapters 50 回分 A1340 14,000 Vac-Man® Laboratory Vacuum Manifold, 20-sample capacity 1 セット A7231 51,000 Welch Vacuum Pump, for Japan Electrical 1 台 A6724 90,000 PureYield ™ Midi & Maxi Pump Set（セット販売③） 1 JKC005 80,000 構成品 PureYield ™ Plasmid Midiprep System 4 回分 A2490 7,000 PureYield ™ Plasmid Maxiprep System 2 回分 A2391 7,000 Eluator™ Vacuum Elution Device 4 個 A1071 23,000 Vac-Man® Laboratory Vacuum Manifold, 20-sample capacity 1 セット A7231 51,000 Welch Vacuum Pump, for Japan Electrical 1 台 A6724 90,000 かわら版掲載製品を特別価格でご提供！ NanoLuc® ベクターをスペシャルオファー 製品名 サイズ カタログ番号 定価（￥） 特別価格（￥） pNL [NlucP/AP1-RE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL [NlucP/CEBP-RE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL [NlucP/MycMax-RE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL[NlucP/ARE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL[NlucP/SRE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL[NlucP/SRF/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL[NlucP/SBE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL [NlucP/TCF/LEF-RE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL [NlucP/XRE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL3.2.NF-B-RE [NlucP/NF-B-RE/Hygro] Vector 20 µg N1111 73,000 51,100 本かわら版の各記事でご紹介した製品の一部を対象としたお試しキャンペーンです。 期間：2016 年 4 月18 日~6 月 30 日受注分まで NanoLuc® は最高感度を誇る発光レポーターで、レポーターアッセイでも最適なパフォーマンスを発揮します。 今回シグナル解析用ベクター（非カタログ品 21 種を含む）を特別価格にてご提供！ 製品名 サイズ カタログ番号 定価（￥） 特別価格（￥） NanoLuc® 応答配列レポーター pNL [NlucP/NFAT-RE/Puro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL [NlucP/NFAT-RE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL [NlucP/CRE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL [NLucP/p53-RE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL [NlucP/ATF6-RE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL [NlucP/ATF4-RE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL [NlucP/MRE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL [NlucP/HRE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL [NlucP/GAS-RE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL [NlucP/ISRE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL [NlucP/SIE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 pNL [NlucP/STAT5-RE/Hygro] Vector 20 µg – 非カタログ品 78,000 期間：2016 年 4 月18 日~6 月 30 日受注分まで テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982　● E-Mail : prometec@jp.promega.com PK1604-02B 販売店 日本語 Web site：www.promega.jp プロメガ株式会社 本　　　社　〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所　〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2016年4月現在のものであり予告なしに変更することがあります。