かわら版 2016年 夏号

Promega KAWARABAN 2016年夏号 サポートします。 創薬、がん研究を 発光テクノロジーで プロメガは 二頁、 定量 免疫チェックポイントをレポーターで PD-1/PD-L1 四頁、 三頁、グルコースの取込みとエネルギー代謝 エピジェネティクス酵素の発光アッセイ 五頁、 NanoLuc® ってすごい！： より高感度なレポーターアッセイ 六頁、実験をすすめるための RentaMAX 活用術 七頁、 FRET 細胞内タンパク質相互作用の高感度バイオセンサー と BRET の活用 高感度検出装置 GloMax® Discover System プロメガ株式会社 免疫チェックポイントをレポーターで定量 PD-1/PD-L1 バイオ医薬プロジェクト バイオ医薬プロジェクト第二回目は今一番ホットなターゲットの一つ、 抗 PD-1/PD-L1 抗体の新しい評価法とその他の免疫チェックポイント アッセイを取り上げます。 PD-1/PD-L1 経路はもともと正常組織を免疫反応から保護するための チェックポイントの一つであり、過剰な T 細胞活性化をコントロールす る経路です。T 細胞に発現している PD-1 と、抗原提示細胞の PD-L1 が 結合すると T 細胞は抑制され、活発な免疫反応が妨げられます。がん 細胞はこの経路を利用し、自ら PD-L1 を発現することにより T 細胞の 攻撃から逃れています。従って中和抗体などにより PD-1/PD-L1 経路を ブロックすれば、がん細胞近辺の T 細胞が活性化されてがんを攻撃・ 除去することができるのです。 このメカニズムに基づき、抗 PD-1/PD-L1 ブロック抗体はこれまで①抗 体結合アッセイ、②プライマリー T 細胞活性化アッセイ（細胞増殖、サ イトカイン放出、細胞表面マーカー検出）、などの方法で評価されてき ました。しかし①の抗体結合アッセイは機能アッセイではないという問 題があり、また②の T 細胞活性化アッセイはプライマリー T 細胞を使う ためアッセイが煩雑で結果のバラつきが大きく、スクリーニングや安定 した抗体評価に使えないという問題がありました。 この問題を克服するため、プロメガではレポーターアッセイを応用した PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay を開発しました。PD-1/PD-L1 経路による T 細胞活性化抑制機構は、主に NFAT シグナル経路の抑制を介したメカ ニズムであることが分かっていたため、NFAT シグナル経路をレポーター 検出するアッセイを構築しました。T 細胞の代わりに NFAT レポーター と PD-1 タンパク質を発現する Jurkat 細胞を使用し、抗原提示細胞 （artificial antigen presenting cells, aAPC）として PD-L1 を発現させた CHO-K1 細胞を使用することで、プライマリー細胞を調製する煩雑さや 結果の不安定さを克服しています（図 1）。 また ADCC Reporter Bioassay 開発などで培ったノウハウをもとに細胞培 養が不要な Thaw-and-Use フォーマットを採用し、より簡便かつ安定な アッセイプロトコールにしました。これにより従来はプライマリー T 細 胞の調製から1 週間以上かかっていたアッセイを、たった 1 日半で終え ることができます（図 2）。また HTS にも適したフォーマットであるため、 抗体のほかにも PD-1/PD-L1 をブロックするペプチドや化合物のスク リーニングも容易に実施できます（図 3）。 プロメガではこの他にも T 細胞活性化をベースとした免疫チェックポ イントアッセイを多数開発しています。もう一つの PD-1 リガンドである PD-L2 のアッセイをはじめ、CTLA-4、TIGIT/CD155 などの Co-inhibitory アッセイ、GITR、CD40、4-1BB、OX40 などの Co-stimulatory アッセイが 開発済みであり、今後も新たなターゲットや既存ターゲットのコンビ ネーションアッセイを開発していく予定です。 ここでご紹介した免疫チェックポイントアッセイの他にも、プロメガで は抗体医薬品開発をサポートする画期的な製品を次々に開発していま す。次回の記事をお楽しみに！ 抗体をズバッと断片化！ IdeS、IdeZ 抗体の構造解析を行っている方、抗体を効率よく切断できる IdeS や IdeZ プロテアーゼはご存知ですか ? 抗体はサイズが大きいためそのままの解析が難しい反面、トリプシン などの消化に耐性があり、分析者を困らせてきました。お困りの方、ぜ ひ一度 IdeS や IdeZ をお試しください。IdeS はトリプシンやペプシンと 異なり、抗体の特定部位を高効率で切断する酵素です（図 4）。IdeZ は IdeS では切断できなかったマウス IgG2a や IgG3 も切断できる改良型で、 さらに汎用性を高めた製品です。 品質管理試験では ADCC、ADCP アッセイで測定できる抗体力価と並ん で、抗体の物性解析も重要です。IdeS、IdeZ で物性解析もワンランクアッ プさせましょう。 関連製品 サイズ カタログ番号 価格（￥） 免疫チェックポイントアッセイ PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay 1 kit J1250 151,000 特 5 kit J1255 680,000 サイズ カタログ番号 価格（￥） IdeZ Protease, Frozen 2000 u V8342 86,000 特 IdeS Protease, Frozen 2000 u V7512 81,000 特 キャンペーン対象製品：詳細については 8 ページをご覧ください。 抗体医薬に代表されるバイオ医薬品の研究開発が加速しています。このセクションでは、抗体医薬の研究・評価試験のうち従来法の問題を新たな技 術で克服したアッセイや、従来法では対応できなかった新しいニーズに応えるアッセイをシリーズでご紹介していきます。 プロメガ　PD-1/PD-L1 検索 図 2. 従来 1-2 週間かかっていたプロトコールが大幅に簡便化され、早ければ 1 日で結果 が出る 12052MA 約1～2週間（従来法） 調達した細胞 培養 細胞数カウント、回収、 バッファーに懸濁、プレートに播種 測定 キットに添付の細胞 （解凍してそのまま使用） ‘Cells as reagents’: Frozen, thaw-and-use cells (3-24hr) バッファーに懸濁、 プレートに播種 測定 24時間以内（PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay） 図 1. 免疫チェックポイント遮断アッセイの概要 13008MA イベント 1 TCR（T 細胞受容体）を介した NFAT の活性化 イベント 3 抗PD-1 または 抗PD-L1 抗体による NFAT シグナルの回復 イベント 2 PD-1:PD-L1 による NFAT シグナル の阻害 PD-1 Effector Cell PD-L1 aAPC Cell Glo NFAT-RE Luciferase Signal Recovery PD-1 PD-L1 図 4. IdeS、IdeZ は IgG ヒンジ領 域の下を一か所切断して F(ab’)2 と Fc 断片を生じる IdeS or IdeZ cleavage site IdeS or IdeZ lgG1 Hinge Sequence: S-C-D-K-T-H-T-C-P-P-C-P-A-P-E-L-L-G-G-P-S-V 図 3. 抗 PD-1 抗体医薬品での力価測定 PD-L1 aAPC/CHO-K1 細胞を播種し、16-20 時間インキュベーションした。PD-1 エフェクター 細胞とペンブロリズマブ（パネル A）またはニボルマブ（パネル B）の濃度を変えて添加し、 37℃で 6 時間インキュベーションした後、Bio-Glo™ Reagent を加え、GloMax® Discover System を用いて測光した。データは GraphPad Prism® Software を用いて4PL curve にフィッ ティングさせた。EC50 値はそれぞれ 0.25 µg/ml（ペンブロリズマブ ; パネル A）および 0.44 µg/ml （ニボルマブ ; パネル B）。データは thaw-and-use の細胞を用いて取得した。 Log10 [pembrolizumab] g/ml Luminescence (RLU) 0 5.0 × 105 1.5 × 106 1.0 × 106 2.0 × 106 2.5 × 106 –9 –8 –7 –6 –5 –4 A. 13490MA Log10 [nivolumab] g/ml Luminescence (RLU) 0 5.0 × 105 1.5 × 106 2.0 × 106 –9 –8 –7 –6 –5 –4 1.0 × 106 2.5 × 106 B. 2 発光テクノロジーによるグルコース取り込み活性評価 生体を構成する細胞において、グルコースは主要なエネルギー源の 1 つ です。これまで放射性標識、蛍光または吸光により取り込み活性の測 定が行われてきましたが、従来法では感度やバックグラウンドなどに問 題がありました。これらの問題点を改善すべく、プロメガでは発光での 測定アッセイ Glucose Uptake-Glo™ Assay を開発しました。従来法と 同じく、蓄積された 2- デオキシグルコース -6- リン酸（2DG6P）を発光 シグナルに変換することでグルコースの取り込み能を評価します。さら にプロトコルも見直し、細胞の洗浄がほぼ不要の Add to Measure プロ トコルにより、簡便な測定が可能になりました（図 1）。 発光テクノロジーの代謝アッセイへの応用 Glucose Uptake-Glo™ Assayで培った技術をさらに他の代謝産物や栄養 成分の測定アッセイに応用しました。これまでに乳酸、グルタミン、グ ルタミン酸などを発光シグナルに変換して測定することに成功していま す（図 2）。この技術を活用した例として、図 3 に代謝経路の変化を観 察した結果を示しました。細胞では酸素が欠乏するとミトコンドリアで の代謝反応に進まず、解糖系が働きます。乳酸は解糖系の最終生成物 であり、分泌された乳酸は解糖系の活性化の指標となります。2 つの 乳がん細胞株を低酸素条件下で培養したところ、MCF7 細胞では低酸 素条件下において乳酸の分泌量が増加している結果が得られ、解糖系 への代謝経路の変化が観察されました。一方で、MDA-MB-231 細胞は 低酸素誘導因子 HIF1 が高発現しており、恒常的に解糖系が亢進してい るため、代謝経路の変化は観察されませんでした。 MDA-MB-231 細胞のように、がん細胞では正常細胞と比較し、種々の 代謝経路に異常がみられることが明らかになっており、有用な治療標的 の 1 つとして捉えられています。プロメガのシンプルな発光測定法はバ ラつきも最小限に抑えられており、疾患特異的な代謝経路を標的とし た化合物のハイスループットスクリーニングにも最適です。 最後に ここで紹介した Glucose Uptake-Glo™ Assay の他にもプロメガでは、代 謝経路を標的とした薬剤の評価・創薬をサポートする製品を開発中です。 また、同一細胞サンプルを用いたマルチプレックス解析が可能な組み 合わせを多数構築しています。例えば、細胞内の ATP により生細胞を 測定する CellTiter-Glo® や還元能から生細胞を測定する RealTime-Glo™ とのマルチプレックス解析を行っており、1 枚のプレートからルミノメー ターだけで、代謝産物や栄養成分の測定アッセイと生細胞アッセイが実 施可能になっています。詳細については弊社 Web サイトを参照いただ くか直接お問い合わせください。 関連製品 サイズ カタログ番号 価格（￥） グルコースの取込み量測定 Glucose Uptake-Glo™ Assay 5 ml J1341 63,000 特 10 ml J1342 110,000 50 ml J1343 440,000 CellTiter-Glo® 2.0 Assay 10 ml G9241 15,000 PC 100 ml G9242 59,000 RealTime-Glo™ MT Cell Viability, 100 100 回分 G9711 20,000 10 × 100 回分 G9712 97,000 特 キャンペーン対象製品：詳細については 8 ページをご覧ください。 PC プロメガクラブ対象製品です。詳細については 8 ページをご覧ください。 アッセイキット 測定用途 カタログ番号 Glucose Detection assay 細胞内グルコース量の測定 お問合せ下さい Lactate Detection assay 細胞内乳酸量の測定 お問合せ下さい Glutamate Detection assay 細胞内グルタミン酸量の測定 お問合せ下さい Glutamine Detection assa 細胞内グルタミン量の測定 お問合せ下さい グルコースの取込みとエネルギー代謝 高次元細胞プロジェクト 糖尿病やがんなどの種々の疾患において、細胞内の代謝経路が大きく変化していることが明らかになっており、疾患特異的な代謝経路が有用な治療 標的となりうると考えられています。プロメガでは細胞内の様々なシグナル経路やシグナル因子を測定する技術を提供しており、このセクションでは 新たに登場した代謝経路を標的としたアッセイシステムを紹介します。 プロメガ　高次元細胞プロジェクト 検索 図 1. Glucose Uptake-Glo™ アッセイの概要と手順 グルコース類似体 2- デオキシグルコース (2-DG) を細胞に取り込ませ、グルコースの取り込 み量を発光シグナルに変換して評価する（上図）。プロトコルが大幅に簡便化され、約 70 分で測定結果が取得可能（下図） 2DG 2DG 2DG6P 2DG6P 6PDG Step 1. 2DG の取り込み Step 3. 発光による取り込みの量の測定 Step 2. 細胞溶解 2DG6P 2DG6P 2DG6P 2DG6P G6PDH NADP+ NADPH + reductase proluciferin luciferin ATP Ultra-Glo™ rLuciferase Light Light GloMax ルミノメーター ～ 10 min ～ 60 min グルコースを含む 培地を除き、 2DG を添加 細胞溶解試薬や 発光測定試薬を 順次添加 ‘Cells as reagents’: Frozen, thaw-and-use cells (3-24hr) ‘Cells as reagents’: Frozen, thaw-and-use cells (3-24hr) w-and-use cells (3-24hr) a th , ‘Cells as reagents’: Frozen ‘Cells as reagents’: Frozen , thaw-and-use cells (3-24hr) w-and-use cells (3-24hr) a th , ‘Cells as reagents’: Frozen NAD(P)H NAD(P) ルシフェリン前駆体 ルシフェリン ルシフェラーゼ デヒドロゲナーゼ レダクターゼ Light Light グルコース、乳酸、 グルタミン、グルタミン酸 図 2. プロメガの代謝アッセイの測定プラットフォーム 代謝産物や栄養成分に対する特異的デヒドロゲナーゼとレダクターゼを用いた方法によ り、代謝産物・栄養成分を発光シグナルに変換して測定。 図 3. 発光テクノロジーを用いた代謝シフトの解析 乳がん細胞株 MDA-MB-231 細胞と MCF7 細胞を通常酸素分圧下（約 20% O2）および低 酸素条件下（3% O2）でそれぞれ培養し、細胞内グルコース量と分泌された乳酸量を比較 した。MCF7 細胞では低酸素条件下で培養することにより、乳酸の産生量が亢進し、解 糖系への代謝シフトが観察された。一方で、MDA-MB-231 細胞では代謝経路の変化は観 察されていない。 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 RLU Hypoxia MDA-MB-231 MCF7 Normoxia Hypoxia Normoxia Glucose Lactate キーポイント 高感度 従来法の蛍光や吸光よりも高感度。RI 法とも同 等の感度。 RI 不要！スムーズな測定プロトコル 細胞の洗浄がほぼ 不要。Add to Measure の簡単プロトコル マルチアッセイへの応用 同一ウェル内で細胞生存性試 験が実施可能 3Promega KAWARABAN エピジェネティクス酵素の発光アッセイ アカデミア創薬サポートプロジェクト ゲノム解読完了後の重要なテーマとして急速に発展したエピジェネティクス研究により、 がんを始めとする多くの疾患にエピジェネティクス異常が関与していることが分かって きました。現在ではエピジェネティック制御の関連分子は重要な創薬ターゲットとして 注目を集めており、ヒストンアセチル化制御にかかわるヒストン脱アセチル化酵素 （HDAC）阻害剤をはじめ、ヒストンメチル化・脱メチル化酵素やそれらの制御因子をコン トロールする薬剤の開発が急ピッチで進められています。ここではエピジェネティック 制御タンパク質のうち、メチル化・アセチル化関連の酵素アッセイをご紹介します。 プロメガ　エピジェネ 検索 ヒストンアセチル化・脱アセチル化酵素アッセイ 2006 年にボリノスタット（SAHA）が最初のヒストン脱アセチル化酵素 （HDAC）阻害薬として米国で承認されたのを皮切りに、ヒストンアセチ ル化制御酵素をターゲットとした創薬ブームが起こりました。脱アセチ ル化を担う HDAC はヒトでは 11 種類が報告されており、Class I（1、2、3、 8）、Class II（4、5、6、7、9、10）、Class IV（11）に分類されています。 ボリノスタットは汎 HDAC 阻害剤であるため、次世代 HDAC 阻害剤とし てより選択性の高い化合物の探索が続けられています。 プロメガが提供する HDAC-Glo™ Assay（図 1）はこのような阻害剤探索 にぴったりのアッセイです。 DNA、ヒストンメチル化・脱メチル化酵素アッセイ 今ホットなターゲットは何と言っても DNA やヒストンのメチル化・脱メ チル化酵素です。主にタンパク質を修飾するアセチル化と異なり、メチ ル化はタンパク質だけでなく DNA も制御します。必然的に酵素の数も 多く、新しい酵素の阻害剤やより選択性の高い阻害剤を求めて各国の 製薬メーカーや研究所が新薬開発にしのぎを削っています。 このニーズに応え、プロメガはこの 4 月にメチル化酵素アッセイ MTase-Glo™ Methyltransferase Assay を発売しました。メチル化酵 素は数が多いものの、反応機序は DNA・タンパク質メチル化酵素で共 通しており、いずれも代謝産物として S-アデノシルホモシステイン（SAH） を産生します。MTase-Glo™ は SAH を測定することによりすべてのメチ ル化酵素活性を測定することができます（図 2）。 メチル化酵素と合わせて脱メチル化酵素も重要です。 プロメガでは、2 種 類のヒストン脱 メチル 化 酵 素 のうち、Jumonji C-domain を含む脱メチル化酵素（JHDM）の活性測定に使用できる Succinate-Glo™ を開発しました（図 3）。JHDM は代謝産物としてコハク 酸（Succinate）を産生することを利用し、コハク酸定量によって JHDM 活性を測定するアッセイです。 ここでは酵素アッセイに焦点を当てましたが、他の分野と同様エピジェ ネティクス研究でも生細胞で解析できるライブセルアッセイが求められ ています。特に多様な制御タンパク質や DNA の相互作用は生細胞で解 析することが重要であり、プロメガは生細胞解析の強力なツールも開 発しています。こちらは紙面を改めてご紹介する予定です。お楽しみに！ MTase-Glo™ アッセイ論文 Methyltransferase-Glo: a universal, bioluminescent and homogenous assay for monitoring all classes of methyltransferases Epigenomics (2016) 8(3), 321–339. http://www.futuremedicine.com/doi/abs/10.2217/epi.15.113 Characterization of the histone methyltransferase PRDM9 using biochemical, biophysical and chemical biology techniques Biochem. J., Jul 2014; 461: 323 – 334. http://www.biochemj.org/content/461/2/323 Quantitative profiling of the activity of protein lysine methyltransferase SMYD2 using SILAC-based proteomics Mol. Cell. Proteomics, Mar 2016; 15: 892 – 905. abstract 関連製品 サイズ カタログ番号 価格（￥） メチル化酵素測定 MTase-Glo™ Methyltransferase Assay 400 回分 V7601 85,000 特 2000 回分 V7602 320,000 脱アセチル化酵素測定 HDAC-Glo™ I / II Assay 10 ml G6420 77,000 特 HDAC-Glo™ Class IIa Assay 10 ml G9560 77,000 特 HDAC-Glo™ 2 Assay 10 ml G9590 77,000 特 脱メチル化酵素測定 Succinate-Glo™ お問合せ下さい バイサルファイト処理 & 精製 MethylEdge™ Bisulfite Conversion System 50 回分 N1301 40,000 PC 特 キャンペーン対象製品：詳細については 8 ページをご覧ください。 PC プロメガクラブ対象製品です。詳細については 8 ページをご覧ください。 13146MA SAM ペプチド、ヒストン、 コアヒストン、 2本鎖オリゴ ヌクレオチド、DNA、 ヌクレオソーム ペプチド、ヒストン、 コアヒストン、 2本鎖オリゴ ヌクレオチド、DNA、 ヌクレオソーム CH3 SAH ADP メチルトランス フェラーゼ MTase-Glo™ Reagent MTase-Glo™ Detection Solution Light Light 図 2. MTase-Glo™ アッセイ原理 図 3. Succinate-Glo™ アッセイ原理 ヒストンまたは ペプチド Jmjc 試薬 I コハク酸 + コハク酸 中間体 脱メチル化 基質 ステップ 1：コハク酸の変換 2-OG ステップ 2：中間体から ATPと光への変換 試薬 II ルシフェラーゼ / ルシフェリン 中間体 Light 10548MA “Glow-type” luminescence Boc-XX N H S N S N H N O H N O O OH O N H S N S N NH O NH2 O OH O Boc-XX H2 N S N S N OH O Developer Reagent Ultra-Glo™ Luciferase HDAC-Glo™ I/II Substrate HDAC ATP, Mg 脱アセチル化クロマチン アセチル化クロマチン 遺伝子発現なし 遺伝子発現 HATs HDACs Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac A. B. 図 1. HDAC と測定原理 パネル A. HDAC およびヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）。パネル B. HDACGlo™ I/II Assay の反応は 1 種類の試薬の添加により起こる。 4 従来の Dual アッセイに比べて高い発光値 新しい Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay は一つのウェルから、 NanoLuc® luciferase とホタルルシフェラーゼの 2 つを検出することがで きます。NanoLuc® Luciferase は、従来のホタルルシフェラーゼに比べ 150 倍 以 上 明 る い ル シフェラ ー ゼ で す。 図 1 で従来の Dual-Glo® Luciferase Assay および Dual-Luciferase® Reporter Assay における各ルシ フェラーゼと発光値を比較しています。Dual-Glo® Luciferase Assay のホタ ルルシフェラーゼの発光値に比べ、Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay の NanoLuc® の発光値は、飛躍的に高くなっています。ルシフェラー ゼの発光値が高いことにより、これまで見えていなかったシグナル、例 えばトランスフェクション効率が低い細胞、またシグナルレベルが低く、 バックグラウンドに埋もれていたシグナルを検出できるようになります。 また、従来の Dual-Glo® Luciferase Assay と同じように、培地に直接試薬 を加える簡便なプロトコールで実験を行うことができます。さらに、従 来の Dual-Luciferase® Reporter Assay に匹敵する発光値が得られますの で、簡単なプロトコール、インジェクターを使った操作が不要になります。 安定かつ高い応答性の NanoLuc® Luciferase NanoLuc® Luciferase の特長の一つとして、高い安定性が挙げられます。 図 2 では細胞内でのホタルおよび NanoLuc® Luciferase の安定性を示し ております。NanoLuc® はホタルルシフェラーゼに比べ、長時間高い安 定性を保持しています。その一方で、タンパク質分解配列 PEST を付加 した場合、より速やかに分解されます。この高い安定性と迅速な分解は、 データの安定性あるいは応答性の高さに直結します。また、細胞種に よらず安定したデータが得られますので、これまでのような、細胞種に よりデータが得られないという問題が解消されます。 スクリーニングに最適な NanoLuc® レポーター NanoLuc® Luciferase は、レポーターアッセイを用いた化合物スクリーニン グに適しています。従来のホタルルシフェラーゼはその発光反応に ATP を必要とする一方で、NanoLuc® Luciferase は ATP を必要としませんので、 発光反応に対する影響が最小限に抑えられます。また、温度や pH の変 化に対して広い範囲で耐性があります（ACS Chem. Biol., 2012, 7 (11), pp 1848–1857）。さらにプロメガは、ルシフェラーゼと化合物が直接相互 作用して生じる偽陽性をあらかじめ検出するシステムを開発しました。 pNLCoI Vectors は次世代の Coincident ベクターシステムで、同じ mRNA 転写物からホタルルシフェラーゼ（luc2）と PEST 不安定化ドメインが融 合した NanoLuc（® NlucP）の両方を発現します。これにより2 つのルシフェ ラーゼに対する化合物との相互作用プロファイルが得られます（図 3）。 化合物のハイスループットスクリーニングで使用すれば、どちらか片方 のルシフェラーゼと化合物との直接相互作用による偽陽性が、両方のル シフェラーゼで同様の反応を示す真の陽性と区別することができます ので、デュアルアッセイを行うことにより偽陽性のヒット率が下がりま す。また、1 次スクリーニングを NanoLuc® で、2 次スクリーニングをデュ アルで行うことにより、偽陽性を振るい落とすことができます（8 ペー ジ参照）。 NanoLuc® ってすごい！：より高感度なレポーターアッセイ ありのままの細胞解析 レポーターアッセイのニーズは、実験対象の広がりに伴い、より高感度、より簡便な系が求められています。近年は希少なプライマリー細胞や iPS 細 胞での検出での使用例が多くなり、より高感度なアッセイシステムが必要とされています。プロメガはタンパク間相互作用（PPI）等のタンパクレベル での解析を目的とした Protein Reporter と、遺伝子発現解析を目的とした Genetic Reporter の 2 つのレポーターシステムをご用意しております。前 回は Protein Reporter として、PPI 解析システムである NanoBRET™、NanoBiT® をご紹介しました。今回は特に Genetic Reporter について、新しく開 発した Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay に焦点を当ててご紹介致します。 プロメガ　NanoLuc® 検索 12881MA 104 105 106 107 108 Relative Luminescence (RLU) RLuc in DLR FLuc in DLR NLuc in NanoDLR FLuc in NanoDLR RLuc in Dual-Glo FLuc in Dual-Glo Time After Reagent Addition (minutes) 0 20 40 60 80 100 120 図 1. NanoDLR™ アッセイのより明るく安定な発光特性 NanoDLR™ アッセイのより明るく安定な発光特性 TK-RLuc（ウミシイタケ）：TK-FLu（c ホ タル）：キャリア DNA または TK-NLuc（NanoLuc® ）：TK-FLuc：キャリア DNA をそれぞれ 1：1： 8 の割合で HEK293 細胞にトランスフェクションし、NanoDLR™、DLR™ または Dual-Glo® Dual-Luciferase® Assay System を用いて測定した。同じプロモーターでルシフェラーゼを発 現させた場合、NanoDLR™ Assay により測定した NLuc レポーターで最も明るい長時間発 光シグナルが得られ、Fluc レポーターも十分明るい長時間発光シグナルが得られた。 各種ルシフェラーゼ アッセイとの発光比較 % activity 100 50 0 t［min］ 0 100 200 300 NLuc NLucP NLuc HEK293 HeLa NLucP FLuc FLuc-P NanoLuc NanoLuc-P % activity 100 50 0 100 200 300 t［min］ 0 図 2. 細胞内における NanoLuc® およびホタルルシフェラーゼの安定性の比較 細胞内での各種ルシフェラーゼの安定性を評価した。HEK293 細胞に各種ルシフェラー ゼ Nluc、NlucP、Fluc、FlucP を一過的に恒常発現させ、シクロヘキシミドの添加によりタン パク合成をブロックしてからの発光値の変化を示す。 シクロヘキシミドの添加によりタンパク合成をブロックしてからの発光半減期 Cell line FLuc FLucP NLuc NLucP HEK-293 >6 h 2.0 ± 0.4 h >6 h 18 ± 11 min HeLa 3.8 ± 1.3 h 1.4 ± 0.2 h >6 h 20 ± 6 min U2OS（n=1） >6 h 2.8 h >6 h 36 min ※ FLucP および NLucP はタンパク質分解配列 PEST を付加し、応答性を向上させるため のベクターです。 0 5 10 15 HuTlR9/HuUnc93B1 Fold Induction None 1 ng/well 5 ng/well 10 ng/well 25 ng/well 50 ng/well 100 ng/well 200 ng/well 図 4. レポーター DNA 量に 依存しない安定した誘導倍率 HEK293 細胞に pNL3.2.NF-κ B-RE Vector（各濃度）およびヒト Toll like receptor 9/ ヒト Unc93B1 発現ベク ターを導入し、一定量の誘導剤を 添加した際のレポーター活性を Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay で測定し、その Fold Induction を示した。レポーターベクターの濃 度によらず、同等な誘導を示してい ることが分かる。 Reporter 1 p2A Reporter 2 Fluc Nluc True Hit Nluc Stabilization Fluc Stabilization 12519MA 図 3. タンデムレポーターを用いたスクリーニングにおける偽陽性の簡便な検出 タンデムレポーターベクターは、同じ mRNA 転写産物よりホタルルシフェラーゼと分解配 列をつけた NanoLuc® ルシフェラーゼを発現する。2 つのレポーターはリボソームスキッ プ機構を引き起こす短い P2A 配列により 2 つの未融合の可溶性ルシフェラーゼに分断さ れるため、より正確な化合物プロファイルの作成が可能となる。 東京大学医科学研究所　感染遺伝学　 柴田 琢磨 先生 レポーター DNA 量の希釈系列を作製し、 最適な導入条件を検討しました。 • 従来のホタルルシフェラーゼを利用した Luciferase Assay System では、高濃度のレポー タープラスミドの条件下では誘導倍率が低下することから至適条件 の検討が必要でした。またシグナルの活性化が見られる実験条件が 限られていた為、実験間および実験者によりデータがバラついてい ました。 • ホタルルシフェラーゼから NanoLuc® に変えることにより、広いレン ジのレポータープラスミド量で同等の誘導を検出でき、データが安定 するようになりました（図 4）。 レポーター DNA 量に関わらず一定の誘導倍率が得られ、トランスフェ クション効率や手技の違いによらず、安定した結果が得られるように なった。 お客様 の声 関連製品については 8 ページをご覧ください。 5Promega KAWARABAN RentaMAX 断念 実施 ルシフェラーゼレポーター アッセイがやりたいが 測定装置が無い… ルシフェラーゼレポーター アッセイやりたいので プロメガに相談！ 改善点 Dual-Luciferase® Reporter Assay System の測定のために、GloMax® 20/20 Luminometer を RentaMAX で利用しています。GloMax® 20/20 Luminometer はシングルチューブ対応ルミノメーターなので、本体を置いて、電源ケー ブルをつなぐだけで、簡単に使い始めることができます。低バックグラ ウﾝドかつ高感度であり、安定した結果が得られるので、とても助かっ ています。 • レポーターアッセイを行い、転写制御因子の解析を 進めることができた。 RentaMAX で解決！ RentaMAX とは ? RentaMAX はプロメガの GloMax® プレートリーダー /Maxwell® RSC 自動精製装置を、無償で一定期間お貸出しするプログラムで、試薬 / 機器の両面からのサポート・コンサルティングも行います。本サービスは皆様に大変ご好評をいただいており、研究の効率的な遂行 や新規の実験系の立ち上げ時の検討など様々な場面で役立ていただいています。 今回は、実際に RentaMAX を活用されている先生方の利用方法や RentaMAX のメリットをお届けします。 RentaMAX の活用 こちらの研究室では、3 ～ 4 週の間隔で、数日間の RentaMAX をご利用いた だいています。サンプルをストックし、100 検体程度になったところで、随 時お申し込みをいただいています。 したいときにすぐに実験できないというもどかしさは感じつつも、優位点を 考えて、いつも RentaMAX を使っていますとのお話いただきました。 このもどかしさの改善のために、機器の購入をすでにご検討いただいています。 植物からの RNA 自動精製 Maxwell® RSC Instrument 発光レポーターアッセイ GloMax® 20/20 Luminometer 武庫川女子大学 スポーツ健康科学部 玉村 禎宏 先生 実験をすすめるための RentaMAX 活用術 お客様の声 問題点 問題点 イネの葉身から RNA 抽出を行っており、サンプルの凍結粉砕の操作だ けで、12 サンプルあたり約 40 分の時間を費やさねばならない。その 後の RNA 抽出の工程においても、劇物指定のフェノール系有機溶媒を 用いて、1 時間以上の付きっきりの作業が必要となっている。 有機溶媒を用いた RNA 抽出試薬では、遠心操作後のピペッティングに よる水相の分取が求められるが、それによるサンプルロスやコンタミの の危険性があり、RNA 分解が進む恐れがあることを懸念している。 現在の RNA 抽出の問題点をまとめると以下のようになる。 軟骨細胞の分化や形成の仕組みの解明のために、樹立細胞株や初代培 養コンドロサイト（軟骨産生細胞）にルシフェラーゼ遺伝子（or レポー ター）とともに Wnt や TGF β などを共発現させ、転写調節因子の研究 を行っている。当施設にプレートタイプのマルチリーダーを所有してい るが、発光測定の感度が非常に悪く、ダイナミックレンジも狭いため、 ルシフェラーゼ遺伝子を利用したレポーターアッセイに不向きであるこ とが分かった。ルシフェラーゼを用いた発光技術は、ノイズが低く、高 感度であり、最も優れたレポーター遺伝子であることは理解しているが、 実験に使うことができなかった。 • 長時間の拘束時間（サンプル破砕 40 分 + RNA 抽 出 1 時間） • 有機溶媒（フェノール）の使用による、安全性と廃 棄の問題 • ピペッティング操作が多く、RNA 分解の懸念 • 個人間のテクニックの差（qPCR のリファレンス値 がばらつく） • 多糖類の残存による、純度の低下 • ルシフェラーゼ遺伝子を利用したレポーターアッセ イをしたいが、高感度のルミノメーターがない • 予算申請しているが、購入できるのは、早くても次 年度 先生のお悩みごと 先生のお悩みごと 改善点 RNA 抽出は全自動なので、作業はサンプル破砕だけになりました。 Maxwell® RSC で RNA 抽出している間に、次のランのためのサンプル破 砕をすることで、スループットが上がり、ほかの実験をすることができ ました。Maxwell® RSC のキットでは劇物指定の有機溶媒を使っていな いので、試薬の管理、廃棄も簡単でした。同時に、遠心機の問題も解 決です。 • 作業時間を 60% 以上削減 ( サンプル破砕のみ ) • 有機溶媒不使用のため、安全性向上 • 遠心機も不使用 • 全自動抽出機のため、個人間のテクニックの差はなし • 高い洗浄効率の磁性体ビーズ方式で夾雑物の除去 効率を劇的に改善 RentaMAX で解決！ 先生から一言 劇物指定の試薬を用いない安全で均一な RNA 抽出。 失敗も少なく、実はコストパフォーマンスもよい。 多検体の実験の際には特に威力を発揮。 先生から一言 すでにシグナル応答配列がクローニングされたレポーターベクターを 購入することができるので、レポーターアッセイを始めるための敷居は あまり高くないように思います。また、ルシフェラーゼ自体も進化して おり、高い発光量かつ非特異的な影響を受けにくい NanoLuc® が発売 されています。立ち上げ時には、ルミノメーターを RentaMAX で借りる ことができるので、あきらめずに一度レポーターアッセイを始めてみて はいかがでしょうか。 東京大学 生物生産工学研究センター 環境保全工学研究室　准教授 岡田 憲典 先生 RentaMAX の活用 玉村先生には、複数種類のコンストラクトを作成できた際に、RentaMAX を お申し込みいただき、数か月おきにご利用いただいています。 学内に分子生物学の実験を行っている研究室が少ないため、ほかの研究室 に借りに行ったり、充実した共通機器室がありません。 このため、RentaMAX はレポーターアッセイができる唯一の手段でした。 RentaMAX のお申込みについては www.promega.co.jp/rentamax/ をご覧ください。 サンプル破砕（40 分） これまでの方法 計 200 分間 / 2 × 12 サンプル （うちマニュアル 200 分間） Maxwell® RSC 法 計 120 分間 / 2 × 12 サンプル （うちマニュアル 80 分間） サンプル破砕（40 分） RNA 抽出（60 分） （有機溶媒含むキット） RNA 抽出（60 分） （有機溶媒含むキット） サンプル破砕（40 分） RNA 自動抽出（40 分） サンプル破砕（40 分） RNA 自動抽出（40 分） 6 イントロダクション： タンパク質相互作用解析は、個々のタンパク質機能だけでなく細胞内タンパク質ネットワーク、さらには 細胞内プロセスを解明する上で重要な研究手法です。共免疫沈降（Co-IP: Co-immunoprecipitation）法、プ ルダウンアッセイ法、ファーウェスタンブロッティング法、表面プラズモン共鳴法など従来より様々なタン パク質相互作用解析法が開発されてきました。しかし、これらの方法の多くは細胞を破壊してタンパク質 を取り出すため、生体内での真の相互作用を反映したものとは言えません。そのため、生きた真核細胞内 でタンパク質相互作用をリアルタイムに観察できる手法の開発が強く求められてきました。このような要 望に対するブレイクスルーとして期待される手法が FRET および BRET です。 今回ご登場いただく松田道行先生は、蛍光による生体イメージング技術の第一人者であり、蛍光技術を利 用した研究ツールの開発に尽力されています。また、松田先生はこれまで開発されてきた FRET を応用し た化合物スクリーニングについても検討されてきました。しかし、FRET 特有のいくつかの問題から新たに 発光技術を基にした BRET を導入されました。本稿では蛍光を知り尽くした松田先生に FRET と BRET のメ リット / デメリットならびに BRET を導入する際の重要な点についてお聞きしました。 細胞内タンパク質相互作用の高感度バイオセンサー FRET と BRET の活用 高感度検出装置 GloMax® Discover System 京都大学大学院 生命科学研究科 生体制御学医学研究科 病態生物医学　教授 松田 道行 先生 タンパク質相互作用の研究ツール FRET および BRET とは…… FRET を用いた化合物スクリーニングでの問題 これまで開発してきた FRET を応用した化合物スクリーニング（上図） を検討しましたが、いくつかの問題が生じました。1 つは、FRET では 励起光を生細胞に照射するため、細胞自身からの自家蛍光も検出してし まうという問題です。また、細胞だけでなく、スクリーニングにかける 化合物自身が持つ自家蛍光も多く、100 サンプルに 1 つ程度の高い頻 度で強い自家蛍光が観察されました。これは、顕微鏡ベースの測定で も同様であり、検出装置側で対応することは困難でした。そこで、FRET と類似の技術で、励起不要の BRET を用いたアッセイ系の開発を検討 しました。 BRET を用いた化合物スクリーニングでの問題 BRET を用いた化合物スクリーニングを検討しました。BRET は FRET と は異なり、強力な励起光を照射する必要が無いために、バックグラウン ドを極めて低く抑えることができますが、いくつかの弱点をクリアする 必要がありました。BRET は励起光としての役割を生物発光に代えてい るため、発光量が弱く十分な蛍光量が得られない場合があるという点 です。近年では生物発光技術の進化により、その発光強度は飛躍的上 昇していますが、一般的なランプを用いた励起光に比べると生物発光 による励起の強度は低くならざるを得ません。この問題は、検出装置 側のスペック（高感度な発光検出および励起光としての生物発光を遮断 するフィルター）により解決することができます。 問題の解決 BRET に対応するスペックのプレートリーダーを各社比較検討したとこ ろ、プロメガ社の GloMax® Discover System は他の BRET/FRET を検出で きる大がかりなプレートリーダーとは異なり、コンパクトでありながら フィルターを装備した超高感度かつ広いダイナミックレンジを有するた め実験に最適な機器であることを確認することができ、採用にいたりま した。GloMax® Discover System を用いて、BRET によるアッセイ系を無 事に構築することができ、Preliminary な実験では化合物による影響も認 められませんでした。これから GloMax® Discover System を用いた BRET アッセイにより本格的に化合物をスクリーニングする予定です。 まとめ • タンパク質相互作用の測定は、細胞内で何が起こっているのか知る ために重要な情報を得ることができる。 • FRET/BRET は、従来法とは異なり、生きた細胞内でのタンパク質相 互作用を観察できる点で非常に優れた実験手法である。 • FRET は、サンプルである低分子化合物の自家蛍光のみならず、細胞 に内在性の自家蛍光があり、プレートリーダーを用いたアッセイには 適していない。 • BRET はスペックの合ったルミノメーター（フィルター、超高感度、広 いダイナミックレンジ）が必要だが、FRET における自家蛍光の問題を 排除することができ、生細胞でタンパク質相互作用をアッセイできる。 その他の BRET と FRET のそれぞれの優位点 BRET • 励起光不要による高い S/N 比 • 強い励起光による光毒性がない • プレートリーダーに励起光のシステムが不要 FRET • 基質が不要な高時空間分解能イメージング • 蛍光タンパク質の種類が豊富 関連製品 サイズ カタログ番号 価格（￥） GloMax® Discover System / 本体 （発光・蛍光・吸光［UV / 可視光］） 1 台 GM3000 4,600,000 GloMax® Dual Injectors with Pumps （デュアルインジェクター） 1 セット GM3030 900,000 • マニュアル不要の直感操作（大型タブレット PC 付属） • プロメガの各種アッセイプロトコールをインストール済み • 高感度と広いダイナミックレンジで確実な検出を 感度：3 × 10-21 moles ルシフェラーゼ レンジ： > 9 桁 • 細胞のアッセイに最適な機能を搭載 • NanoBRET™ / BRET やマルチアッセイなどに対応 FRET 励起光 基質 試験化合物 生体成分 シグナル シグナル 励起光 BRET シグナル バックグラウンド シグナル 蛍光 Prot X 蛍光 Prot Y シグナル 蛍光 Prot X Prot Y 発光 酵素 7Promega KAWARABAN プロメガクラブキャンペーン プロメガクラブ会員の方を対象としたキャンペーンで、ご注文にはプロメガクラブ会員 ID が必要です。 様々な特典をご利用いただけるプロメガクラブは以下より簡単にお申込みいただけ、 会員 ID はすぐにメールにてお届けいたします。 プロメガクラブ：www.promega.co.jp/promegaclub.html 特 掲載ページ 製品名 サイズ カタログ番号 定価（￥） 特別価格（￥） 3 Glucose Uptake-Glo™ Assay 5 ml J1341 63,000 44,100 2 PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay 1 kit J1250 151,000 120,800 2 IdeZ Protease, Frozen 2000 u V8342 86,000 60,200 4 MTase-Glo™ Methyltransferase Assay 400 回分 V7601 85,000 59,500 4 HDAC-Glo™ I/II Assay, 10ml 10 ml G6420 77,000 53,900 4 HDAC-Glo™ Class IIa Assay, 10ml 10 ml G9560 77,000 53,900 4 HDAC-Glo™ 2 Assay, 10ml 10 ml G9590 77,000 53,900 5 pNLCoI1[luc2-P2A-NlucP/Hygro] Vector 20 µg N1461 100,000 70,000 5 pNLCoI2[luc2-P2A-NlucP/minP/Hygro] Vector 20 µg N1471 100,000 70,000 5 pNLCoI3[luc2-P2A-NlucP/CMV/Hygro] Vector 20 µg N1481 100,000 70,000 5 pNLCoI4[luc2-P2A-NlucP/PGK/Hygro] Vector 20 µg N1491 100,000 70,000 かわら版掲載製品期間限定キャンペーン 期間：2016 年 7月11日~9 月 30 日受注分まで 特 製品名 サイズ カタログ番号 定価（￥） 特別価格（￥） CellTiter-Glo® 2.0 Assay 10 ml G9241 15,000 9,000 Nano-Glo® Luciferase Assay 10 ml N1110 23,000 18,000 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay/pNL1.1.TK Bundle 1 セット N1521 80,000 40,000 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay/pNL1.1.PGK Bundle 1 セット N1531 80,000 40,000 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay/pGL4.54 [luc2/TK] Bundle 1 セット N1541 80,000 40,000 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay/pGL4.53 [luc2/PGK] Bundle 1 セット N1551 80,000 40,000 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System 10 ml N1610 39,000 31,000 MethylEdge™ Bisulfite Conversion System 50 回分 N1301 40,000 20,000 一押し！プロメガクラブ対象製品 プロメガクラブ対象品の中から本かわら版に関連する製品をご紹介いたします。 その他会員対象製品は上記 URL を参照ください。 テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982　● E-Mail : prometec@jp.promega.com PK1607-01B 販売店 日本語 Web site：www.promega.jp プロメガ株式会社 本　　　社　〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所　〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2016年7月現在のものであり予告なしに変更することがあります。