アポトーシス & ネクローシスをリアルタイムに一発測定

アポトーシスと Annexin V アポトーシスは不要な細胞や老化した細胞、異常な細胞を取り除く、分子機構に制御された細胞死です。DNA のフラグメント化やミトコンドリア膜電位の変化などがアポトーシスの特徴として知られており、アポトーシスの検出マーカーに活用されています。細胞膜の内側に存在するリン脂質、フォスファチジルセリン（PS）もその 1 つです。 PS は細胞膜の内側のみに局在しますが、アポトーシスが起こると PS は細胞膜の外側に露出するようになります。Annexin Vはカルシウムイオン依存的に PS に強く結合するリン脂質結合タンパク質です。Annexin V の特性を活用し、初期アポトーシスの検出に利用されています。発光法を用いた Annexin V・PS の検出従来法では蛍光標識した Annexin V と、細胞膜非透過性の DNA 結合蛍光色素を用いて、アポトーシスとネクローシスをフローサイトメトリーを使って評価しています。アポトーシス初期には PS を介して結合した蛍光 Annexin V により標識された細胞が検出されます。後期アポトーシスでは、細胞膜の完全性が失われるため、より強い Annexin V の標識がなされるのに加え、DNA 結合蛍光色素が細胞膜を透過し、DNA に結合することで蛍光シグナルを発するようになります。フローサイトメトリーを使用するメリットの１つとして、細胞集団中の生細胞、アポトーシス、ネクローシスの細胞の割合を出せる点があります。その一方で、フローサイトメーターでの測定ではサンプル調製が煩雑・スループット性が低いというデメリットがあります。従来法のデメリットを改善するため、プロメガは得意の発光測定技術を活用し、Annexin V をプレートリーダーで測定可能にしました。図 .1 にはその原理を示しています。プロメガは、NanoLuc® をもとに開発した NanoBiT® の各タグと Annexin V の融合タンパク質（SmBiT-AnxV および LgBiT-AnxV）を合成しました。これら融合タンパクを試薬としてアポトーシスを起こした細胞に振りかけると、細胞膜外に露出した PS と SmBiT-AnxV / LgBiT-AnxV が結合、 PS との結合を介して AnxV が重合し、SmBiT : LgBiT が接合、NanoLuc® の酵素活性が回復します。すなわち、Annexin V と PS の結合を発光シグナルにて評価します。また、細胞膜非透過性の DNA 結合色素も加える事で、従来法と同じく後期アポトーシスも同時に解析することが出来ます。（NanoBiT® については、かわら版 2016 年春号をご覧ください：www. promega.co.jp/pdf/kawara_1604_p2.pdf）経時的なアポトーシスの評価・測定プロメガは Annexin V 検出技術を発光アッセイに応用して従来法よりも高感度・低バックグラウンド測定を可能にしただけでなく、アポトーシスの経時変化を追跡できるリアルタイムアッセイを実現しました。アポトーシスの評価では測定タイミングが重要なファクターであり、従来法では複数のサンプルを用意し、最適なタイムポイントを見出す必要がありました。プロメガの Annexin V の発光測定では、試薬を添加するのみで、細胞を培養した状態で経時的にアッセイできるため、1 枚のプレートから多くの情報を引き出す事が可能です（［アポトーシス + ネクローシス］× 経時変化）。図 2 にはアポトーシス誘導を行い、経時的に Annexin V の測定を行った例を示しました。Annexin V の発光シグナルの増加の後に、DNA 結合試薬の蛍光シグナルの増加が観察されており、1 枚のプレートから最適な測定タイミングや細胞死の作用機序を調べる事が可能です。 Annexin V に付加した NanoBiT® の発光は非常に強くプレートリーダーで高感度にアッセイすることができますが、さらにその発光強度によりオリンパス社 LV-200 を用いた発光イメージングにより初期アポトーシスの様子を観察することができます。最後に今回紹介した Annexin V に加え、カスパーゼの活性化もアポトーシスの主要なマーカーとしてよく使用されています。Annexin V のシグナルが上がってきたタイミングでカスパーゼの活性評価を行うマルチアッセイも可能です。プロメガには発光でカスパーゼの活性を測定する技術もあります。Annexin V とカスパーゼ活性の同時評価についてもお気軽にお問い合わせください。キーポイント簡単な測定プロトコル Add to Measure の簡単プロトコル・最大 48 時間までの経時的なアッセイが可能。フローサイトメーター不要発光測定と蛍光測定に対応したプレートリーダーにて簡便に測定可能！Throughput も格段にアップ！様々なサンプルでの応用例通常の 2 次元培養サンプルに加え、3 次元培養サンプルや共培養アッセイ（CTL アッセイ）にも応用可能。アポトーシス & ネクローシスをリアルタイムに一発測定細胞ビックバン – 高次元細胞プロジェクト細胞が増殖するのか、それとも細胞死が起こるのか…細胞に起こる現象を調べることは、遺伝子機能の解析や創薬開発などの研究における初期ステップの１つです。これまでに種々のマーカーを用いて、細胞の増殖やプログラムされた細胞死（アポトーシス）を評価・測定する手法が開発されています。アポトーシスマーカーであるカスパーゼのアッセイ法は操作性もシンプルであり、スクリーニングなどの用途に最適ですが、細胞内の酵素を測定するために細胞を溶解するエンドポイントアッセイであり、最も活性の高いタイミングを事前に見極める必要がありました。Annexin V を利用した測定方法は細胞表面に起こる変化を捉えているため細胞を破壊せずにアポトーシスの形成過程（細胞死メカニズム）を詳細に観察するためにはきわめて有用です。今回プロメガが開発した発光 Annexin V アッセイは、従来のフローサイトメトリーによる検出法で抱えていた簡便性、スループットなどに関わる問題を解決すると同時に経時的な観察を可能にしたアポトーシスアッセイの決定版とも言えるツールです。図 2. 経時的なアポトーシス / ネクローシスアッセイ DLD-1 細胞を 400 ng/mL rhTRAIL（パネル A）、K562 細胞を 1.1 µ M Bortezomib（パネル B）でそれぞれ処理してアポトーシスを誘導した。検出試薬を加えたタイミングを 0hr とし、各点線は Annexin V 検出試薬（発光：●）と DNA 結合試薬（蛍光：□）のシグナルが検出され始めたタイミングを示す。図 1. Real-time™ Glo Annexin V Apoptosis Assay の原理 RealTime-Glo™ Annexin V Assay については 7 月末発売予定製品名サイズカタログ番号価格（￥） RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay （アポトーシス& ネクローシスデュアルアッセイ） 100 回分 JA1011 80,000 1000 回分 JA1012 400,000 RealTime Glo™ Annexin V Apoptosis Assay　　　（アポトーシスシングルアッセイ） 100 回分 JA1000 68,000 1000 回分 JA1001 340,000 Caspase-Glo® 3/7 Assay （アポトーシス：カスパーゼ 3/7 アッセイ） 10 ml （100 回分） G8091 75,000 プロメガ　高次元細胞プロジェクト検索図 3. LV200 を用いた Annexin V の発光イメージング HeLa 細胞にスタウロスポリン（終濃度 1 µM）を添加し、アポトーシスを誘導した。添加 2.5 時間（左図）および 5 時間（右図）の代表的な像を示す。LV200（Olympus）にてイメージングを行い、位相差と発光の像を重ねあわせた。＜オリンパス社秋吉様の御厚意によりデータ提供＞ Anx V Anx V SmBiT LgBiT 細胞膜 Anx V （発光） DNA （蛍光）ホスファチジルセリンアポートシス誘導試薬の処理時間細胞の状態シグナルの変化生細胞初期アポトーシス後期アポトーシス（2 次的ネクローシス） 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 0 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 A. Time (hours) Luminescence (RLU) Fluorescence (RFU) 1.5 hr 10 hr Apoptosis 2゜Necrosis Apoptosis 2゜Necrosis 0 8 16 24 32 40 48 0 70,000 140,000 210,000 280,000 350,000 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 Time (hours) Luminescence (RLU) Fluorescence (RFU) B. 8 hr 20 hr 核酸結合蛍光色素 4