シグナル伝達ガイド

シグナル伝達

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シグナル伝達ガイド 抗体を使わない簡便な発光法による解析法 Contents： • イントロダクション • レポーター＆センサーを利用した 細胞内シグナルのモニタリング • 発光法によるセカンド メッセンジャーの解析 • 発光法によるキナーゼの解析 • 発光法によるプロテアーゼシグナルの 解析 • 細胞メタボリズム（生存性＆毒性） • 関連製品 2 イントロダクション 抗体を使わない簡便な発光法によるシグナル伝達研究 よりシンプルでスマートな発光によるシグナル解析法 シグナル伝達研究における各パスウェイの活性化の検出や創薬分野におけるスクリーニングでは、抗体あるいは蛍光物質と組 み合わせた方法が広く用いられています。抗体を用いたウェスタン分析やELISAはコストが高く、操作が煩雑であるため多検 体の処理には適しません。また、TR-FRET を代表例とするスクリーニング用の蛍光アッセイ法は有用ですが、シグナル/バック グラウンド比は発光法にはおよびません。プロメガでは高感度でダイナミックレンジの広い発光法を駆使した、シグナル伝達 解析ツールをそろえており、GPCR シグナル、cAMP、キナーゼ活性、転写応答に至る一連のシグナルを簡便に測定することが できます。 GloSensor TM cAMP System と ELISA 法との相関性 HEK293 細胞の内在性アドレナリンβ 2 レセプターをイソプロテレノー ル :ISO（アゴニスト）、プロプラノロール :PRO（アンタゴニスト）およ びフォルスコリン :FSK（アデニル酸シクラーゼ作用薬）で順次刺激し、 GloSensor TM cAMP System および ELISA 法で cAMP レベルをモニタリング した。 発光法の利点 • 優れた定量性：発光によるアッセイ法は、抗体法や蛍光 法に比べて高感度で、化合物の蛍光による干渉もありま せん。 • 簡便性：試薬を加えて混ぜるだけのシンプルな操作なの で、多検体処理や自動化が容易です。また、細胞ベース のアッセイでは抽出/分離などの煩雑な操作は不要です。 • シンプル： 標的分子ごとに抗体を揃える必要が無く、 実験系をシンプルにまとめることができます。 シンプルな発光アッセイ法の操作例 Time (minutes) Fold induction PRO FSK ISO 100 10 1 0 5 10 15 GloSensorTM cAMP Immunoassay 8105MA 基質など 検出試薬 試薬添加 混和 混和 測定 ルミノメータ バッファー シグナル伝達ガイド 3 イントロダクション 2) センサー PDE Caspase Cell Viability GPCR Kinase Kinase cAMP Proteasome -Ubiquitin Transcription Factor ベクター 1) レポーター Nuclear receptor 3) シグナル分子の アッセイ 4 7 8 9 10 11 12 13 13 14 15 ページ 発光法のアプローチ 1）各種シグナル応答配列を含むレポーターベクターを用いたレポーターアッセイ 一般的にルシフェラーゼレポーターアッセイはその高い感度や簡便性により転写制御など幅広い研究に使用されています。 各シグナル経路に特異性を有する応答配列をレポーター遺伝子に付加することでシグナル経路の活性化を容易に捉えること ができるため、シグナル伝達解析にも多用されています。 プロメガのpGL4ルシフェラーゼベクターはオフターゲット効果の 低減や誘導倍率が飛躍的に改善されているため、 複雑な細胞内のシグナルを検出する上で最適のベクターです。 2）細胞内シグナル分子の結合を高感度に感知するバイオセンサー プロメガのGloSensor TM テクノロジーは、 特定の分子に反応する感受領域を導入したルシフェラーゼセンサーをコードするプ ラスミドを用いて細胞内 （あるいは in vitro） で発現させ、 標的分子が感受領域に特異的に作用することにより不活化したル シフェラーゼが活性化するシステムを採用しています。 プロテインキナーゼAのcAMP結合領域であるRIIβBサブユニットをル シフェラーゼに組込んだGloSensor TM cAMP Systemは、細胞内のcAMPをリアルタイムでモニタリングすることができます。 3）発光反応とカップリングさせたシグナル分子のアッセイ ルシフェラーゼ反応を構成する分子であるATPおよびルシフェリンは様々な生体分子のアッセイに利用されており、 それぞ れ 1）ATPを介した酵素反応とルシフェラーゼ発光反応のカップリング（例：キナーゼ、ADP、ATPaseなど）。 2）修飾ルシフェ リンを標的とする活性によりルシフェリンを産生する反応とルシフェラーゼ発光反応のカップリング （例 ： カスパーゼな どのプロテアーゼ） により標的分子を発光シグナルとして検出することができます。 Single Luciferase Assay ONE-GloTM Assay Dual Luciferase Assay Dual-GloTM Assay* Dual-Luciferase® Assay* Cell Viability (ATP) CellTiter-GloTM Assay Cytotoxicity (Dead Cell Protease) CytoTox-GloTM Assay cAMP cAMP-GloTM Assay ADP (Kinase) ADP-GloTM Assay Apoptosis (Caspase 3/7, 8, 9) Caspase-Glo® Assay PDE: Cyclic nucleotide (cAMP or cGMP) Phosphodiesterase PDE-GloTM Assay Calpain I&II Calpain-GloTM Assay Dipeptidyl Peptidase DPPIV-GloTM Assay DUB (deubiquitinating enzynes) DUB-GloTM Assay Kinase Kinase-GloTM Assay Proteasome (Chymotrypsin-Like, Trypsin-Like, Caspase-like) Proteasome-GloTM Assay Reporter and Sensor Vector or Stable Cells pGL4 Series Vectors GloSensor™ cAMP Assay GloResponseTM Cell Lines N S S OH N COOH N S S R N COOH 細胞内 ATP の測定 Phosphodiesterase PDE-GloTM Assay ATP の消費 (Kinase, cAMP, ATPase) N S S R N COOH ルシフェリン前駆体からの修飾基の除去 Dual-GloTM Assay* Dual-Luciferase® Assay* シグナル経路の活性化/不活性化 R = Protease substrate * Firefly and Renilla Luciferase Reaction Luciferase Luciferin ATP 〈ルシフェラーゼ反応〉 4 各種シグナル経路のモニタリング (レポーター) pGL4 Response Element Vectors 主要なシグナル伝達経路を高感度にモニタリング ルシフェラーゼレポーターは、シグナル伝達経路の研究やGPCRなどの受容体活性を制御する物質の探索に有効です。例え ば、細胞内のcAMPレベルを調節している受容体の挙動は、一般にcAMP 応答配列（CRE）によってルシフェラーゼの転写と連 動します。しかし、従来のレポーターベクターでは標的とするシグナルに応答する配列以外にも転写に影響を及ぼすコンセン サス転写因子結合サイトがベクター内に点在することでオフ-ターゲット効果が現れたり、レポーター酵素の半減期が長いため に応答性が鈍く鋭敏なシグナルの検出を困難にしていました。 pGL4 Vectorシリーズは哺乳動物細胞における最適な発現を可能にする次世代のルシフェラーゼレポーターベクターです。レポーター 遺伝子の発現や安定性に対する最適化を始め、プラスミドベクター内の転写因子結合サイトの除去、最小限プロモーター （minP）の導入など様々な改良を加えております。これらの技術革新により、従来のレポーターベクターでは実現できない微細 な細胞内シグナルの変化を検知し、応答配列に応じた様々なシグナルを正確に測定することができます。 pGL4 応答配列導入ベクターには現在7種類のシグナル経路に対応した応答配列を有するベクターがあり、応答配列の最適化も行わ れています。また、これらのpGL4 応答配列導入ベクターを安定にトランスフェクションした細胞株もございます。また、任意の 応答配列をpGL4に組込み、標的とする様々なシグナルを捉えることができます。 Baso AD-b Pax1 Dec1 AD-b CDF-1 TALE PL Hox-1.3 HNF1 Avian C Pax NKX3.1 GBF1 E4BP4 E4BP4 NKX3.1 Cart-1 Cart-1 Cart-1 Mamm C Avian C Pdx-1 PAR RP58 Clox IRF1 Nkx2.5 Tal-1a GBF3 OBF1 AD-b FOXC1 Brn-3 Cdx-2 GBF1 NUDR TCF/LEF1 CDF1 AP1 MIT/TFE Runt-2 COMP1 CDP Avian C Pbx1 Runt-2 Pbx-1 TEF-1 Nco I Cdx-2 Brn-3 FOXC1 Cart-1 OBF-1 AB-D GBF3 GBF1 GBF1 GBF1 Tal-1a COMP1 CDP AC-t Pbx1 PR CDP NUDR MyT1OBF1 Elk-1 Clox Pbx-1 IF1 Pax1 CDP CDP Arnt NKX3.1 AC-t Neu1/3 Nkx2.5 RFX1 TCF v-Myb NF-kB SRF E2F PAX9 RFX1 Cone-rod HLF Tal-1a PAX-6 c-Myb Gfi-1B CDF-1 Bright B-cell B-cell EBV FOXL1 CPBP EG3 MOK-2 NFAT RFX1 STAT5 MMC c-Myb MEIS1 MEIS1 C2HC1 Mus MIBP-1 MyT1 v-Myb Neu-r Neu-r NKX3.1 NKX3.1 c-Myb v-Myb HOX RFX1 TATA Brn-2 CCAAT CCAAT CCAAT CCAAT CCAAT CCAAT CCAAT POZ E2F ST/TA HNF1 Brn-3 HNF 1 HNF 1 AD-b Nkx2.5 GBF3 GBF3 HIF-1 ATF EKLF Musc. GBF1 PAX6 Tax/CREB MEIS1 X-Box B-cell Elk-1 IRF2 FoxA2 HMX3 LHX3 Neu1/3 Sox-5 HoxC-Rel HNF1 CDE HNF3 HNF4 MEIS1 Msx-1 Pax2/5/8 TALE GBF1 E4BP4 Arnt FAST-1/Smad WTS Pro S8 STs L HLF NF Y NF-kB MRE MIS POZ HLF SF1 Tax Lmo2 ST/TA RP58 HLF NUDR NUDR NUDR NUDR AC-t Pbx1 TCF11 BACH1 GBF1 AD-b FLI Hox1.3 CREB CREB PAR PAR Lmo2 KLF3 Cut-like Pax-3 Pax1 Pax1 Pax1 AC-t HAND2 E2F Gut Ikaros2 Ikaros2 B-cell Ikaros3 HNF4 Elf-2E2F IRF-3 Barb Gut E2F E2F FAST-1 MEF2 OBF1 GBF1 NRF2 B-cellTTF1 Ras E2F ELF-2 E4BP4 CREB PAR Neu-r Gsh-1 STAT5 STAT5 Brn-3 Elk-1 Elk-1 RP58 PAR Pdx1 NKX3.1 Myo Myo Myo OBF1 OBF1 Pit1 Mamm.C PAR Mamm.C E4BP4 Cart-1 Cart-1 E2F My11 OBF1 v-Mar IS Prom L Cdf1 E2F Nco I ori ori Ampr Ampr 4761MAj luc+ POZ Brn2 GBF3 GBF2 E4BP4 COMP1 Avian C Pbx1 Pbx1 Pbx1 Pax-3 Pbx-1 HAND2 MOK-2 MyT1 Thing1 C2H2 COMP1 PXR/RXR/CAR NMP4 NMP4 P53 P53 NUR77/Nurr1/Nor-1 C2HC GFI1 NKX3.1 TEF-1 RFX1 SRF NGN1/3 ATF4 AREB6 NF-KB WHP OBF1 MEIS 1 TALE SOX-5 c-Myb Clox CDF-1 B-cell AhR NMP4 Gfl-1B NKX3.1 MOK-2 MOK-2 RF-7 NFY MMC PBX/MEIS1 MEIS1 GFI1 MESI1 MIBP-1/RFX1 v-Myb v-Myb v-Myb PAX2/5/8 c-Myb C-Myb c-Myb c-Myb v-Myb v-Myb Pbx1/Meis1 RFX1 TATA Brn3 CHOP CCAAT CCAAT CCAAT VIS1 CDE/CHR Smad4 Se-CtRNA ST/TA ST/TA ST/TA ST/TA ST/TA ST/TA ST/TA ST/TA HNF1 SRF SRF GATA MSX1/MSX-2 GBF1 GBF3 COMP1 E4BP4 Otx2 SRE AP 2 Oct1,2 OBF1 Elk-1 Elk-1 Elk-1 FLI FOXF2 MZF-1 MAZ ATF SRF Sox-5 Tst-1/Oct-6 CBF 3 HNF4 HNF1 MEF HNF6 PXR/CAR/RXR Pax1 FOXF2 MIBP1 GLI-k TCF/LEF-1 Pax-6 TALE VIS1 HEN1 VIS1 GABP COMP1 WHP Pbx1/Meis1 AD-b Pit1 CREB CREB CREB CREB CREB CREB CDE/CHR RAR PAR PAR PAR Lmo2 SRF Cut-like Cut-like Cut-like Cut-like Cut-like OBF 1 Pbx-1 c-Ets-1 En-1 FAST-1/S MAD VIS 1 Ikaros 3 POZ Ikaros-3 VIS 1 FLI E2F E2 E2F E2F E2F E2F E2F E2F E2F FAST-1/SMAD MEF2 HIF1 BPV C-r C-r HEN1 ZF BRN-23 POZ TCF/LEF-1 Brn23 Pax-3 C-Ets-1 PAR GLI-K Lmo2 MyT1 Mt Tst-1/Oct-6 GSh-1 Albumin D-box E4BP4 E4BP4 CDF-1 C-Abl MyT1 Tax/CREB OBF1 MEF Lmo2 TCF/LEF-1 luc2 v-Myb v-Myb LBP1c/LSF Bel-1 c-Myb Baso p53 CDF1 PAX9 FKHRL1 VDR/RXR PAX9 p53 p53 NF-kB Backbone Luc gene pGL3 pGL4 Hygror luc2P 4897MA Ampr pGL4 Response Element Vectors ori SV40 late poly(A) signal SV40 early enhancer/ promoter Synthetic poly(A) Poly(A) block (for background reduction) minP Response Element 応答配列を導入した典型的な pGL4 ベクターのサークルマップ 変則的な発現要因となるコンセンサス配列の pGL3 と pGL4 の違い 従来型のルシフェラーゼレポーターベクターのレポーター遺伝子 およびベクター骨格に存在する転写因子結合サイトの多くが pGL4 ベクターでは除去されている。 5280MA 0 50 100 150 200 250 Time (hours) Fold Induction luc 2CP luc 2P luc 2 0 1 234 5 6 7 不安定化ルシフェラーゼによる反応性の向上と 最大誘導到達時間の短縮 luc2；ホタルルシフェラーゼ、luc2P；hPEST 配列を付加したホ タルルシフェラーゼ、luc2CP；hCL1、hPEST 配列を付加したホ タルルシフェラーゼ。これらのルシフェラーゼは cAMP 応答配列 （CRE）の反応をモニタリングするために用いられた。CRE-luc を 安定発現させた HEK293 細胞を 1µM イソプロパノール /100µMRo20-1724 で誘導し、4 時間ごとに細胞を収集して測光した。 4 Hours 6325MA 1 × 104 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 Luminescence (RLU) pGL4.11-CRE-TK 誘導無し pGL4.11-CRE-TK 誘導有り pGL4.24-CRE-minP 誘導無し 誘導有り CRE-minP を含む pGL4 の誘導倍率 luc2P レポーター遺伝子上流に CRE および HSV-TK プロモーター の一部を含む pGL4.11 (pGL4.11-CRE-TK)、CRE および minP を 含む pGL4.24 (pGL4.24-CRE-minP) をそれぞれ内部標準用ベク ター（pGL4.74）とともに HEK293 細胞にトランスフェクション した。24 時間後、1µM イソプロテレノールを添加して内在する 受容体を刺激し、4 時間後のレポーター活性を測定した。 Cell Based In Vitro Cell Based シグナル伝達ガイド 5 各種シグナル経路のモニタリング (レポーター) ベクター 応答エレメント シグナル経路 pGL4.29[luc2P/CRE/ Hygro] Vector （カタログ番号 E8471） cAMP 応答エレメント (cyclic AMP Response Element; CRE) cAMP/PKA pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/ Hygro] Vector （カタログ番号 E8481) NFAT 応答エレメント (Nuclear Factor of Activated T-Cells Response Element; NFAT-RE) カルシウム / カルシ ニウリン pGL4.35[luc2P/9X GAL4UAS/Hygro] Vector （カタログ番号 E1370） GAL4 上流活性化配列 (GAL4 upstream activating sequence; GAL4UAS) 多様（GAL4-DNA 結合ドメインによ る結合と活性化を 要する ) pGL4.32[luc2P/NF-kBRE/Hygro] Vector （カタログ番号 E8491） NF-kB 応答エレメント (Nuclear Factor kB Response Element; NF-kB-RE) NF-kB pGL4.33[luc2P/SRE/ Hygro] Vector （カタログ番号 E1340） 血清応答配列 (Serum Response Element; SRE) MAPK/ERK pGL4.34[luc2P/SRF-RE/ Hygro] Vector （カタログ番号 E1350） 血清応答因子 応答配列 (Serum Reponse Factor Response Element; SRFRE) RhoA pGL4.36[luc2P/MMTV/ Hygro] Vector （カタログ番号 E1360） マウス乳癌ウイルス末端 反復配列 (Murine Mouse mammary Virus Long Terminal Repeat; MMTVLTR) アンドロゲン受容 体、グルココルチ コイド受容体を含 むいくつかの核内 受容体 pGL4.32 vector NF-κB response element Competitor vector 1 254-fold induction TNFα induced noninduced TNFα 5-hr stimulation HEK293 24-fold induction 14-fold induction Competitor vector 2 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 7882MC Luminescence (RLU) % of Control SRE SRF-RE Control U0126 C3 100 75 50 25 0 NF-kB 応答配列を有する pGL4 と他社ベクターとの発光レベルの比較 pGL4 に含まれる SRE と SRF-RE の明瞭な応答性の違い HEK293 に SRE-luc2P または SRF-RE-luc2P を含むベクターとウミ シイタケレポーターベクターをコトランスフェクションし、U0126 （MEK 阻害剤）または C3 Transferase（RhoA 阻害剤）で前処理し、 SRE は PMA、SRF は FBS で誘導した。 AC PLC Gαs Gαi Gαq Gα12/13 Gβγ 5257MA Plasma Membrane Nucleus CRE RE Luciferase SRE AP-1 NFAT-RE SRF-RE cAMP Ras DAG PIP2 RhoGEF RhoA SRF Actin dynamics IP3 PKC Ca2+ Calcineurin fos/jun Raf MEK-1 MAPK ELK-P PKA CREB-P ATP NFAT NFAT-P Modulator Modulator Modulator Modulator Rsk-2 Glo ルシフェラーゼレポーターを利用した GPCR シグナル伝達経路の解析 6 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） pGL4 Response Element Vectors pGL4 転写因子応答配列 pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro] Vector 20μg E8471 64,000 pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro] Vector 20μg E8481 64,000 pGL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro] Vector 20μg E8491 64,000 pGL4.33[luc2P/SRE/Hygro] Vector 20μg E1340 64,000 pGL4.34[luc2P/SRF-RE/Hygro] Vector 20μg E1350 64,000 pGL4.35[luc2P/9XGAL4UAS/Hygro] Vector 20μg E1370 64,000 pGL4 核内受容体応答配列 pGL4.31[luc2P/Gal4UAS/Hygro] Vector 20μg C9351 64,000 pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro] Vector 20μg E1360 64,000 pGL4 任意応答配列導入用 pGL4.24 [luc2P/minP] Vector 20μg E8421 64,000 pGL4.27 [luc2P/minP/Hygro] Vector 20μg E8451 64,000 ※上記以外の pGL4 については www.promega.co.jp/lit/pgl4.html をご覧 下さい 安定発現細胞株 GloResponse™ NF-kB-RE-luc2P HEK293 Cell Line 2 バイアル E8520 715,000 GloResponse™ CRE-luc2P HEK293 Cell Line 2 バイアル E8500 715,000 GloResponse™ NFAT-RE-luc2P HEK293 Cell Line 2 バイアル E8510 715,000 GloResponse™ 9XGAL4UAS-luc2P HEK293 Cell Line 2 バイアル E8530 715,000 核内受容体融合タンパク質発現 pBIND-ER Vector 20μg E1390 64,000 pBIND-GR Vector 20μg E1581 64,000 pFN26A (BIND) hRluc-neo Flexi® Vector 20μg E1380 64,000 受容体発現 pF9A CMV hRluc-neo Flexi® Vector 20μg C9361 58,000 アッセイ試薬 Dual-Glo™ Luciferase Assay System 10ml E2920 33,000 100ml E2940 264,000 Dual-Luciferase® Reporter Assay System 100 回分 E1910 27,500 10×100 回分 E1960 218,000 ONE-Glo™ Luciferase Assay System 10ml E6110 18,500 100ml E6120 121,000 プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/pgl4.html ※製品購入における注意点 : pGL4 の使用は非営利組織（大学、公的研究 機関など）、営利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容 (www.promega.co.jp/license/) をご確認頂く必要があります。 各種シグナル経路のモニタリング (レポーター) 5456MAj Gal4UAS luc GAL4 DBD NR-LBD Glo Glo RE luc NR 核内受容体の リガンド結合ドメイン Gal4の DNA結合ドメイン 内在性あるいは 外来性の核内受容体 ・pBIND-ERα Vector ・pBIND-GR Vector ・pFN26A (BIND) hRluc-neo Flexi ® Vector ・pGL4.35[luc2P/9XGAL4UAS/Hygro] Vector ・GloResponse™ 9XGAL4UAS-luc2P HEK293 Cell Line ・pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro] Vector リガンド A. B. 核内受容体によるシグナル解析のための 2 つのアプローチ 5251MB RE luc2P PSV40 Hygr pGL4-RE-luc2P PCMV GPCR PSV40 Rluc-Neor pF9A CMV hRluc-Neor 5938MA 0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 0.10 1.00 10.00 100.00 [dihydrexidine] µM Fold Induction Luminescence (RLU) Renilla RLU Firefly induction Dual-Luciferase® GPCR アッセイに使用する 2 種類のプラスミドの概略図 RE；Response Element/ Promoter、luc2P；hPEST 配 列 を 付 加 し た Rapid Response ™ ホタルルシフェラーゼ、PSV40；SV40 プロモーター、 PCMV；CMV プロモーター、Rluc-NEOr ；ウミシイタケルシフェラーゼ とネオマイシン耐性遺伝子のフュージョン 内部標準により明らかになった擬陰性（化合物の毒性による誘導倍率の 低下） CRE-luc2P を 含 み、DRD1 受 容 体 を 発 現 す る HEK296 細 胞 を Dihydrexidine で処理した後、Dual-Glo ™ Assay System ( カタログ番号 E2920) でホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼを検出した。 デュアル-ルシフェラーゼアッセイ スクリーニングなどで化合物を添加する場合、細胞毒性が 正味のレポーター発現を低下させ、擬陰性としてあらわれ る場合があります。しかし、第2のレポーターを用いれば内 部標準レポーターの正味の発現も低下するため、このよう な擬陰性を避けることが出来ます。 核内受容体 レポーターを利用した核内受容体のシグナル解析として、 核内受容体のリガンド結合ドメイン (LBD) を酵母のGAL4 転写因子のDNA結合ドメインに融合した発現タンパク質を 利用するワン-ハイブリットシステム[A]とアンドロゲン受容 体、グルココルチコイド受容体などが結合することが知ら れているマウス乳癌ウイルス (MMTV) 末端反復配列 を利用 する方法 [B]があります。 シグナル伝達ガイド 7 cAMPのモニタリング（センサー） GloSensorTM cAMP Assay 組換えルシフェラーゼ センサーによる直接的なcAMPモニタリング GloSensor™ cAMP Assayは、細胞内のcAMPレベルを測定する新しいアプローチを提供します。cAMPはGαsおよびGαiタンパク 質を介したGPCRのシグナル伝達に関与する重要なセカンドメッセンジャーです。ホタルルシフェラーゼの内部にcAMP結合部位 を組み込んであるため、cAMPが結合すると構造が変化して発光量が増加します。この生細胞アッセイはcAMPを通じたシグナル 伝達のカイネティックスやモジュレーションの研究に最適です。 選択した細胞株で標的受容体およびバイオセンサーを一過性に発現させてGloSensor™ cAMP Assayを行います。また、バイオ センサーと受容体を安定に発現する細胞株を調製して実施することもできます。プロトコルはシンプルで、細胞をGloSensor™ cAMP Reagentで事前に約2時間平衡化します。その後、特異的なアゴニスト/アンタゴニストあるいは化合物で処理し、10～30分 後に発光を測定します。それ以外に試薬の添加や手作業は不要です。インジェクターが付属する標準的なルミノメーターで測定 することができます。GloSensor™ cAMP Reagentは、本アッセイでの使用に必要です。 7649MA pGloSensor™-20F cAMP Plasmid (6990bp) Hygr Ampr Synthetic poly(A) ori signal GloSensor™ cAMP coding region CMV Immediate/Early Enhancer/Promoter SV40 Early Enhancer/Promoter SV40 Late Poly(A) T7 promoter RVprimer3 binding site RVprimer4 binding site GloSensor TM cAMP Assay の発光原理 Allosteric（アロステリック型）改変ルシフェラーゼ遺伝子：cAMP が結 合するドメイン (RII β B ) の構造変化により発光シグナルが調節される。 アロステリック cAMP バイオセンサー 生細胞（37℃）におけるシグナルのカイネティクスと可逆性。cAMP バイオセンサーを一過性に発現する HEK293 細胞を 10µM イソプロ テレノール (ISO) または 10µM フォルスコリン (FSK) それぞれ単独 で処理した。変調を加える細胞は、10µM ISO, 10µM プロプラノール (PRO) および 10µM FSK で連続的に処理した (n=3)。Fan, F. et al. (2008) ACS Chem. Biol. 3, 346-51. より許可を得て転載した。 pGloSensor ™ -20F cAMP Plasmid のベクターマップ 7707TA N 359–544 RIIβB 4–355 C N C N C 7708MA 1 × 105 1 × 104 1 × 103 Luminescence (RLU) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 MOD FSK ISO NA ISO PRO FSK Time (minutes) 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） GloSensor TM cAMP Assay ベクターおよび安定発現細胞株 pGloSensor™-20F cAMP Plasmid 20μg E1171 100,000 GloSensor™ cAMP HEK293 Cell Line 2 バイアル E1261 800,000 アッセイ試薬 GloSensor™ cAMP Reagent 1 vial (25mg*) E1290 50,000 1 vial (250mg*) E1291 230,000 プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/glosensor.html * 25mg は 384 ウェル形式で 817 ウェル分 ※製品購入における注意点 : GloSensor™ cAMP Assay の使用は非営利 組織（大学、公的研究機関など）、営利組織にかかわらず、ライセンス プログラムの内容 (www.promega.co.jp/license/) をご確認頂く必要が あります。 ・シンプルなアッセイ :HTS や ultra HTS ( 例 : 3456- ウェル形式 ) に理想的な 0 ステップアッセイ ・リアルタイムの測定 : 処理後 15 分で cAMP レベルを検出 ・より生体反応に近いデータ : 非溶解性の生細胞アッセイによる カイネティックなデータ取得 Cell Based In Vitro Cell Based 8 cAMPアッセイ cAMP-GloTM Assay 細胞内cAMPを発光法により高感度に検出 cAMP-GloTM Assayは、細胞内のcAMPレベルを測定するための試薬で、発光法によるホモジニアスなハイスループットアッセイ を可能にします。cAMP-GloTM Assayは、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）におけるアゴニストまたはテスト化合物の影響に よって変動する細胞内cAMP量をモニタリングします。アデニル酸シクラーゼと共役するGPCR は細胞内 cAMPを増加あるいは 減少させます。本アッセイは、cAMPがプロテインキナーゼA ホロ酵素活性を刺激し、ルシフェラーゼ反応に利用可能なATP量 を減少させ、それに伴い発光レベルが低下するという原理に基づいています。cAMP-GloTM Assayは96、384または1536ウェルプ レートでアッセイすることができます。cAMPレベルが変化する適切な時間をかけて、細胞をテスト化合物で誘導します。誘導 後、cAMPを遊離させるために細胞を溶解し、プロテインキナーゼAを含む cAMP detection solutionを添加します。次にPKA反 応を停止させ、ルシフェラーゼ反応により残存するATPを検出するKinase-Glo® Reagentを加えます。プレートはマイクロプレー ト用のルミノメーターで測定します。cAMP標準曲線を用いることにより発光レベルからcAMP濃度が決定されます。発光シグ ナルの半減期は4時間以上です。シグナルの半減期が長いため、ルミノメーターにインジェクターは不要で、マルチプレートの バッチモード処理を可能にします。 6872MA r 2 = 0.9937 0 200,000 400,000 600,000 800,000 1,000,000 1,200,000 1,400,000 0 2 4 6 8 10 Extract Volume (µl) Luminescence (∆RLU) 6125MA –10 –9 –8 –7 –6 –5 0 250,000 500,000 750,000 1,000,000 1,250,000 SCH23390 Alprenolol Luminescence (RLU) Log Drug Concentration (M) IC50 = 9nM 6127 MA α α Ligand P β γ β γ GDP GTP cAMP ATP R R C C C C cAMP cAMP R R G protein G protein-coupled receptor Protein kinase A substrate Phosphorylated protein kinase A substrate ATP ADP Active protein kinase A Inactive protein kinase A holoenzyme Inactive adenylate cyclase Active adenylate cyclase luciferin + O2 luciferase oxyluciferin + AMP + Light cAMP-GloTM Assay の原理の概略図 細胞内 cAMP 濃度の変化により、ヘテロ四量体として存在する不活性状 態の cAMP 依存性プロテインキナーゼ (PKA) が修飾され、調節サブユ ニット二量体から酵素活性を有する触媒サブユニット 2 個が遊離する。 PKA の活性化は、キナーゼ反応における ATP 基質の減少によりモニター でき、残存する ATP はルシフェラーゼ反応により定量できる。 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） AMP-Glo ™ Assay cAMP-Glo™ Assay 300 ウェル分 V1501 53,000 3,000 ウェル分 V1502 286,000 30,000 ウェル分 V1503 お問い合せ下さい ・表示のサイズは 384 プレートの場合。 ・バルク注文については別途お問合わせください。 プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/campglo.html ･ 迅速で簡便：細胞溶解後 2 ステップで完了するシンプルなホ モジニアスフォーマット（所要時間約 45 分） ･ 優れたシグナル / バックグラウンド比（S/B 比）：優れた S/B 比（>200 [cAMP], >15 [ 細胞 ] ）を示し、1536 ウェルプレー ト以上のフォーマットにも簡単に変更可能 ･ 優れた発光技術を採用：定評のある Ultra-Glo ™ Recombinant Luciferase を使用しており、蛍光化合物による干渉もありま せん（Non-RI）。 組織抽出液を用いた cAMP-GloTM Assay ラット脳抽出液 2 ml/gm を、0.5 mM IBMX および 100 µM Ro20- 1724 を含有する cAMP-GloTM Lysis Buffer でホモジナイズし、70℃で 5 分間加熱した。0、2、4、6、8 および 10 µl のサンプルに等量の Krebs Ringer バッファーを添加した後、cAMP-GloTM 反応バッファー を添加することにより試験を行った。反応液を室温で 20 分間イン キュベーションした後、等量の Kinase-Glo® Reagent を添加した。 10 分後の相対発光量を測定し、溶解バッファーのみの RLU 値から 各サンプルの RLU 値を減じることにより、Δ RLU を算出した。Δ RLU = RLU (0µl) – RLU ( サンプル ) SCH23390 の IC50 の決定 D1 受容体を発現する HEK293 細胞を 100nM SKF38393（アゴニス ト）の存在下で表示量の SCH23390 で処理した後、cAMP-GloTM で 測定した。 Cell Based In Vitro Cell Based シグナル伝達ガイド 9 PDEアッセイ PDE-Glo™ Assay 発光法によるcAMP & cGMP-ホスホジエステラーゼアッセイ PDE-Glo™ Phosphodiesterase Assay は、精製物よりサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（PDE）活性を発光で 測定するハイスループットスクリーニング（HTS）を行うためのシステムです。サイクリックヌクレオチドPDEは加水分解能 を持ち、セカンドメッセンジャーであるシグナル分子cAMPやcGMPのレベルをコントロールするため、様々な細胞内プロセス に関与します。PDEに対する選択的阻害能は、サイクリックヌクレオチドのシグナリングの研究や細胞・組織の病理における PDEの役割を調べる上で有用です。本製品は化合物ライブラリーから阻害剤を同定するための候補化合物の探索に使用するこ とができます。アッセイは384ウェルプレート用にデザインされていますが、アッセイボリュームは96や1536ウェルプレート フォーマットへ容易に変更することができます。PDE-Glo™ Phosphodiesterase Assay はcAMPおよびcGMP依存性ホスホジエ ステラーゼの両方の測定に最適化されています。アッセイの所要時間はPDE反応後1時間以内です。 6148MA –12.5 –10.0 –7.5 –5.0 –2.5 0 0.5 × 106 1.0 × 106 1.5 × 106 2.0 × 106 2.5 × 106 3.0 × 106 3.5 × 106 cGMP cAMP EC50 (cGMP) = 597nM EC50 (cAMP) = 6.81nM Log10 cNMP (M) Luminescence (RLU) PDE-Glo ™ Assay による cAMP および cGMP 用量反応曲線 ウシ脳 PDE を用いた阻害剤 IBMX のタイトレーション PDE-Glo ™ Assay の測定原理 6387MA IC50 = 0.1µM Luminescence (RLU) Log10 IBMX Concentration (µM) –3 –2 –1 0 100,000 75,000 50,000 25,000 0 6289MA P cNMP NMP R R C C C C cNMP cNMP R R Protein kinase A substrate Phosphorylated protein kinase A substrate ATP ADP Active protein kinase A Inactive protein kinase A holoenzyme luciferin + O2 luciferase oxyluciferin + AMP + Light cNMP = cAMP or cGMP NMP = AMP or GMP PDE ・柔軟性：cAMP および cGMP PDE の両方を測定可能 ・ 高感度： 優れたシグナル / バックグラウンド比、1536 ウェル フォーマットにも対応 ・迅速・簡便：ホモジニアスフォーマットで 1 時間以内にアッセ イ完了 ・ 信頼性の高い発光技術：Ultra-Glo ™ Luciferase を使用した Non-RI アッセイ ・安心：蛍光化合物による阻害もなし 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） PDE-Glo ™ Assay PDE-Glo™ Assay 1,000 ウェル分 V1361 95,500 10,000 ウェル分 V1362 お問い合せ下さい ・表示のサイズは 384 プレートの場合。 ・バルク注文については別途お問合わせください。 プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/pdeglo.html Cell Based In Vitro Cell Based 10 ADPアッセイ（キナ—ゼ、ATPase） ADP-Glo™ Assay 初めてのADP発光測定システム ADP-Glo™ Kinase Assay は、キナーゼ反応より生成するADPを発光法により測定するキナーゼアッセイシステムです。ADPは ATPに変換され Ultra-Glo™ Luciferaseにより発光シグナルを生じます。発光シグナルはキナーゼ活性と正の相関性を有します。 このシステムは広範な精製キナーゼの活性に対する化合物の影響を測定する際に有効で、1次スクリーニングおよびキナーゼ選 択性のプロファイリングにも利用することができます。また、ADP-Glo™ Kinase Assayは最大1mM ATPを使用してADPを生成 するあらゆる酵素（例. キナーゼ、ATPase）の活性をモニタリングすることができます。アッセイは2段階のステップにより行 われます。まず、キナーゼ反応後に等量のADP-Glo™ Reagent を加えてキナーゼ反応（ADP 生成反応）を停止させ、残存する ATPを枯渇させます。次に、Kinase Detection Reagent を添加し、ADPからATPへの変換反応とルシフェラーゼ/ルシフェリン/生 成ATPによる発光反応が同時に行われます。ADP-Glo™ Kinase Assay は広いダイナミックレンジを有し、低いATP/ADP変換率 においても高いシグナルを生じるため、成長因子受容体チロシンキナーゼなど活性の低いキナーゼのスクリーニングにも最適で す。このアッセイ法では擬陽性も低く、Z’値は0.8以上を示します。 ・ATP/ADP 変換率が低くても高いシグナル強度：研究者はより生 体内に近い条件でキナーゼ活性を測定可能 ・高感度：低濃度の ADP でも高感度に測定可能なことから、他の アッセイ法に比べ使用する酵素量を低く抑えられ、低コストを 実現可能 ・ユニバーサル：実質的にあらゆるキナーゼ測定に使用でき、研 究者は広範なキナーゼを 1 つのシステムで測定可能（費用の高 いキナーゼ選択性プロファイリングのアウトソーシングは不要） ・正確：様々な初期 ATP 濃度で正確に ADP レベルが測定できる ため、キナーゼ活性を反映した測定値が保証され、RI ベースの アッセイ法と同等の正確な IC50 値が得られます ・広範な ATP レベルで測定可能：最大 1mM の ATP 濃度で利用で きるため、ATP に対する Km 値の高いキナーゼにも適応 ・安定な発光シグナル：厳密に時間制御されたインキュベーショ ンは不要で、プレートでのバッチ処理が可能 ・ATP 非活性・活性阻害を見分けられる 8051MA Kinase or ATPase Reaction ADP-Glo™ Reagent Kinase Detection Reagent Step 1: ATP Depletion Step 2: ADP Detection ATP ADP Luminescence ADP-GloTM Kinase Assay の測定原理 PI3 kinase Phosphatidylinositol (lipid) -1 0 1 2 3 4 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000 16000000 18000000 20000000 EC50= 81.6ng log10 [ERK2], ng RLU -3 -2 -1 0 1 2 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000 16000000 18000000 20000000 EC50= 0.2mU log10 [Hexokinase], mU RLU Serin-Threonine Kinase MBP (Protein) Hexokinase Glucose (Sugar) -1 0 1 2 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 EC50= 2.79ng log10 [PI3 kinase p120γ], ng RLU -3 -2 -1 0 1 0 1.0×10 6 2.0×10 6 3.0×10 6 4.0×10 6 5.0×10 6 6.0×10 6 7.0×10 6 8.0×10 6 9.0×10 6 EC50= 0.376 units log10 [PKA], units RLU Protein Kinase A Kemptide (Peptide) -2 -1 0 1 2 3 0 50000000 100000000 150000000 200000000 250000000 EC50= 15µg log10 [Pgp membranes], µg RLU ABC Transporter (MDR) (ATP + Verapamil [Activator] ) -2 -1 0 1 2 3 0 70000000 140000000 210000000 280000000 350000000 EC50= 4.7mU log10 [Na+/K+ ATPase], mU RLU Sodium Pump (ATP + Na+ /K+ ) ADP-GloTM Kinase Assay を利用したキナーゼをはじめとする様々な ADP 生成酵素のアッセイ例 Cell Based In Vitro Cell Based シグナル伝達ガイド 11 キナーゼアッセイ Kinase-Glo® Assay キナーゼが消費するATPを高感度に検出 Kinase-Glo® Luminescent Kinase Assayは、キナーゼ反応後に残存する溶液中のATPを定量することにより、精製キナーゼの活 性を測定するNon-RIのホモジニアスアッセイ法を採用しています。マルチウェルプレートフォーマット用にデザインされてお り、タンパク質や脂質、糖質のリン酸化アッセイに使用できます。アッセイは1種類の試薬 (Kinase-Glo® Reagent) をキナーゼ 反応に直接加えます。この添加により、キナーゼ反応が停止し、残存するATP量に比例した発光シグナルが生じます。生じる 光の半減期は5時間以上で、プレートのバッチ処理が可能です。また、このアッセイでは96または384ウェルフォーマットで優 れたZ’値 (>0.7)を示し、IC50値も文献で報告されたデータと同様の値を示しました。Kinase-Glo® Assay SystemにはATPに対 する応答性の異なる3システムがあります。Kinase-Glo®は10µM ATPまでの直線性、Kinase-Glo® Plusは100µM ATPまでの直線 性を有します。新しいKinase-Glo® Maxは500µM ATPまでの直線性があり、ATPに対して高いKm値を有するキナーゼの測定や ATP結合サイトで競合しないキナーゼ阻害剤のスクリーニングなどに適しています。 8052MA R² = 0.99 R² = 0.99 R² = 0.99 R² = 0.99 0 0.5 × 105 1.0 × 105 1.5 × 105 2.0 × 105 2.5 × 105 3.0 × 105 0 20 40 60 80 100 120 Luminescence (RLU) Luminescence (RLU) 0 0.5 × 105 1.0 × 105 1.5 × 105 2.0 × 105 2.5 × 105 Luminescence (RLU) Luminescence (RLU) Percent ATP-to-ADP Conversion 0 20 40 60 80 100 120 Percent ATP-to-ADP Conversion 0 20 40 60 80 100 120 Percent ATP-to-ADP Conversion Percent ADP in an ATP + ADP Mixture 0 20 40 60 80 100 120 Percent ATP-to-ADP Conversion 1µM 10µM 0 0.4 × 107 0.8 × 107 1.2 × 107 1.6 × 107 2.0 × 107 100µM 0 0.3 × 108 0.6 × 108 0.9 × 108 1.2 × 108 1.5 × 108 1.8 × 108 1mM 100 80 60 40 20 10 54321 0 1µM 80 54 41 28 15 8 4 4 3 2 2 1 10µM 135 110 84 57 31 16 8 7 6 4 2 1 100µM 125 97 77 56 31 17 9 8 6 5 3 1 1mM 117 91 74 51 28 14 8 7 6 4 2 1 Signal-to-Background Ratios [ATP + ADP] A. B. 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） Kinase-GloTM Kinase Assay Kinase-Glo® ｨ Luminescent Kinase Assay 10ml V6711 14,500 100ml V6713 55,000 Kinase-Glo® ｨ PlusｨLuminescent Kinase Assay 10ml V3771 22,000 100ml V3773 88,000 Kinase-Glo® ｨ Max Luminescent Kinase Assay 10ml V6071 26,500 100ml V6073 106,500 ・10ml は 96 ウェルプレートの場合 200 ウェル分に相当。 ・バルク注文については別途お問合わせください。 プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/kinaseglo.html ATP 量に応じた発光シグナル Kinase-Glo® Assay system で得られた発光量は反応液中の ATP 量に比 例する。Kinase-Glo® Max Assay は 500µM ATP までの直線性を有する。 6979MB A. B.Luminescence (RLU) Luminescence (RLU) 0 r2=0.9993 0 0.5 × 108 1.0 × 108 1.5 × 108 2.0 × 108 2.5 × 108 3.0 × 108 20 40 60 80 100 120 ATP (µM) ATP (µM) y = 280837x + 2 × 1016 r 2 = 0.9971 0 2 × 107 4 × 107 6 × 107 8 × 107 1 × 108 1.2 × 108 1.4 × 108 1.6 × 108 0 100 200 300 400 500 600 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） ADP-GloTM Kinase Assay ADP-GloTM Kinase Assay 1,000 回分 V9101 97,000 10,000 回分 V9102 560,000 100,000 回分 V9103 お問い合せ 下さい ・表示のサイズは 384 プレートの場合。 ・バルク注文については別途お問合わせください。 プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/adpglo.html ADP-GloTM と TR-FRET（蛍光）法との比較 ADP に対する抗体を利用した TR-FRET 法との ATP → ADP 変換率に ともなう倍率変化の比較 ADP-GloTM Kinase Assay の感度、直線性と低ATP/ADP 変換率での高い S/B 比 50 Fold change 1 11 21 31 41 51 61 0 10 20 30 40 % ATP to ADP conversion ADP-GloTM TR-FRET Cell Based In Vitro Cell Based 12 カスパーゼシグナリング Caspase-Glo® Assay 高感度でシンプルなカスパーゼアッセイシステム Caspase-Glo® Assayは、各種カスパーゼ活性を測定するためのホモジニアスフォーマット発光アッセイシステムです。本アッセ イでは、プロテアーゼ認識配列を付加した発光基質アミノルシフェリンと特殊な耐熱性ルシフェラーゼを含む試薬がベースに なっており、カスパーゼ活性に最適化されています。Caspase-Glo® Reagent を添加すると細胞が溶解し、続いてカスパーゼによ り基質が切断されます。遊離したアミノルシフェリンは耐熱性のUltra-Glo™ Recombinant Luciferaseにより消費され、“グロー タイプ”の発光シグナルを生じます。このシグナルはカスパーゼ活性に比例します。安定化されたルシフェラーゼおよび特殊な バッファーシステムは、広範なアッセイ条件でのパフォーマンスを向上させます。本アッセイは、蛍光法や発色法のアッセイに 比べて化合物による影響を受け難くなっています。 Caspase-Glo® 3/7, 8 および 9 Assay は培養細胞あるいは精製酵素を用いたマルチウェルプレートでのアッセイ用にデザイン されています。Caspase-Glo® 2 および 6 Assay は、精製酵素を用いたアッセイ用に開発されています。Caspase-Glo® 8 および 9 Assay には、非特異的なバックグラウンドをより低減させるプロテアーゼ阻害剤MG-132が新たに添付されています。 ・30 分で完了：最も簡便なアポトーシスの判定法（サンプルと等 量の試薬を 1 種類加えるのみ） ・高感度：感度の優れる発光法（20 個の細胞でも検出） ・優れた S/N：蛍光法に比べ、低いバックグラウンド ・優れたパフォーマンス：細胞ベース、酵素ベースのアッセイと も優れた Z’-factor 値を提示。 ・長時間発光：3 時間安定なグロータイプのシグナルによりバッ チ法によるプレート処理も可能。 ・マルチアッセイ：他のセルベースアッセイとの併用が可能 0h 24h 48h 72h 0h 24h CP70 R182 48h 72h Active Caspase-3 Beta-actin p17/p19 4546TA Western Analysis Caspase-Glo® 3/7 0 4 8 12 16 20 0 24 48 72 CP70 (DOC sensitive) R182 (DOC resistant) Relative Caspase-3/7 Activity Duration of Docetaxel Treatment (hours) ウェスタン分析と Caspase-Glo® の相関性 4098MA04_3A Anti-Fas Treated Cells Untreated Cells Luminescence (RLU, Blank Subtracted) 10,000 1,000 100 10 1 10 100 1,000 10,000 Cell # 0.5 hour read 1 hour read 2 hour read 3 hour read A. B. 1,600 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 100 200 300 400 500 600 700 –10 1,400 1,200 1,000 800 600 400 200 0 0 –200 10,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 7,000 8,000 9,000 Luminescence (RLU, Blank Subtracted) Cell # Jurkat 細胞を用いた場合の Caspase-Glo® 3/7 Assay の感度 Jurkat 細胞は抗 -Fas mAb で 4.5 時間処理し、アポトーシスを誘導した。 Caspase-Glo® Reagent 添加 1 時間後に測定した。 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） Caspase-Glo® 3/7 Assay 細胞・酵素ベースアッセイ Caspase-Glo® 3/7 Assay 2.5ml G8090 17,500 10ml G8091 66,000 100ml G8092 319,000 Caspase-Glo® 8 Assay 2.5ml G8200 17,500 10ml G8201 66,000 Caspase-Glo® 9 Assay 2.5ml G8210 17,500 10ml G8211 66,000 酵素ベースアッセイ Caspase-Glo® 2 Assay 10ml G0940 66,000 Caspase-Glo® 6 Assay 10ml G0970 66,000 プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/caspglo.html * 10ml は 96 ウェル形式で 100 ウェル分 * バルク注文については別途お問合わせください。 Cell Based In Vitro Cell Based Cell Based In Vitro Cell Based シグナル伝達ガイド 13 その他のプロテアーゼアッセイ Protease Assay Solution 任意のプロテアーゼを発光で検出 認識配列設計タイプ：プロテアーゼ認識配列を自由に設計で きるProtease-Glo™ Assayは、遺伝子改変したホタルルシフェ ラーゼセンサー（GloSensor™）を含むベクターに任意のプ ロテアーゼ認識配列をコードするオリゴヌクレオチドを導入 します。無細胞発現系で発現させたバイオセンサーはプロテ アーゼにより分解されると発光酵素として活性化します （詳細は www.promega.co.jp/lit/proteaseglo.html）。 修飾ルシフェリンタイプ：プロテアーゼ認識配列が付加され た修飾ルシフェリンを利用すれば、タンパク質分解反応後に 生成されるルシフェリンが発光反応に利用され、プロテアー ゼ活性に比例した発光シグナルを生じます。Caspase-GloTMな どはこのような修飾ルシフェリンを利用したシステムです。 詳細についてはお問い合せください。 ユビキチン・プロテアソームシグナリング Proteasome-Glo™ Assay DUB-Glo™ Protease Assay (DUB/SENP/NEDP) プロテアソームおよび脱ユビキチン化酵素（DUB）の発光測定 Proteasome-GloTM Systemは、プロテアソームに関連する3種類のプロテアーゼ活性を測定するためのホモジニアスな発光試薬3 種類で構成されており、細胞ベースあるいは酵素ベースの測定フォーマットを採用しています。3つの発光基質は、プロテアソー ムのキモトリプシン様（Suc-LLVY-aminoluciferin）、トリプシン様（Suc-LRR-aminoluciferin）、力スパーゼ様（Z-nLPnLD-aminoluciferin）の活性モニタリングに使用します。DUB-Glo™ Protease Assay（DUB/SENP/NEDP）は、脱ユビキチン化（DUB）、脱 SUMO化（SENP）、脱NEDD化（NEDP）プロテアーゼを含む脱結合酵素の活性を測定します。各発光基質を含む試薬をテストサン プルに加えると、基質が切断されてルシフェリンが遊離します。このルシフェリンがルシフェラーゼ反応により消費され、酵素活 性あるいは阻害効果に応じたグロータイプの発光を生じます。 8100MA 1 10 100 1,000 10,000 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 Signal-to-Noise Ratio UCH-L3 (nM) Ub-AMC, 30 minutes Z-RLRGG-aminoluciferin, 30 minutes Z-RLRGG-aminoluciferin, 90 minutes Z-RLRGG-AMC, 90 minutes 1,000 100,000 UCH-L3 を用いた DUB-GloTM と蛍光アッセイ法との比較 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） Proteasome-GloTM & DUB-GloTM Protease Assay 細胞ベースアッセイ Proteasome-Glo™ Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay 10ml G8660 88,000 Proteasome-Glo™ Trypsin-Like Cell-Based Assay 10ml G8760 88,000 Proteasome-Glo™ Caspase-Like Cell-Based Assay 10ml G8860 88,000 Proteasome-Glo™ 3-Substrate Cell-Based Assay System 各10ml G1180 216,500 酵素ベースアッセイ Proteasome-Glo™ Chymotrypsin-Like Assay 10ml G8621 58,500 Proteasome-Glo™ Trypsin-Like Assay 10ml G8631 58,500 Proteasome-Glo™ Caspase-Like Assay 10ml G8641 58,500 Proteasome-Glo™ 3-Substrate System 10ml G8531 143,000 DUB-Glo™ Protease Assay 10ml G6260 72,000 10ml G6261 260,000 プロメガ資料： www.promega.co.jp/lit/proteasomeglo.html www.promega.co.jp/lit/dubglo.html * 10ml は 96 ウェル形式で 100 ウェル分 ・上記以外のサイズについてはお問い合せください。 N C N C N S H S -N N COOH – N S H S -H2 -N N COOH – 無細胞発現 タンパク質 分解反応 ルシフェリン試薬 タンパク質 分解反応 ルシフェラーゼ試薬 認識配列設計タイプ 修飾ルシフェリンタイプ プロテアーゼ活性測定のための 2 つの発光アッセイ法 Cell Based In Vitro Cell Based 14 細胞メタボリズム CellTiter-Glo® Assay 細胞内ATPをベースとした代謝活性を鋭敏に測定 CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assayは、代謝活性のある細胞に由来するATPを定量することで培養中の生存細胞数を測 定するワン-ショットタイプの細胞増殖・毒性システムです。マルチプレートのアッセイ用にデザインされており、自動化された ハイスループットスクリーニング（HTS）にも最適です。優れた感度を示すため、発色法では困難な浮遊細胞を用いる場合にも 威力を発揮します。1種類の試薬を培養細胞（血清含有）に加えるだけで、培地の除去・細胞の洗浄や複数回のピペッティングは 不要です。試薬を加えると細胞溶解が始まり、存在するATP量に比例した発光シグナルが生じます。また、この試薬にはATPase 阻害剤が含まれ、細胞溶解時にATPの減少を防ぐことができるため、より正確なATP測定が可能です。このシステムで生じる発光 は、半減期の長い“グロータイプ”（5時間以上）なのでインジェクターを必要とせず、連続モードあるいはバッチモードの自動 化システム両方に適応します。 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） CellTiter-Glo® Assay CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay 10ml G7570 13,000 10X10ml G7571 55,000 100ml G7572 49,500 10X10ml G7573 418,000 ・10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 ・バルク注文については弊社までお問い合わせください。 プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/celltitglo.html 0 50 100 150 200 250 300 Activity (% RLU) Time (minutes) No Inhibitor Inhibitor 0 20 40 60 80 100 120 3422MA05_1A Luminescence (RLU) Cells per Well 0 100 200 300 400 0 10 20 0 200 400 600 800 1,000 1,200 1,400 1,600 1,800 0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 3171MB04_1A 細胞数と発光量の相関関係 CellTiter-Glo® Assay で測定した場合、発光量と細胞数には直接的な 相関関係が認められる。 CellTiter-Glo® Reagent による ATPase 活性の阻害 10% ウマ血清を含む DME/F-12 (1:1) に懸濁した L929 細胞 (1.5 × 105 cells/ml) から凍結 / 融解により調製したライセートを 2 つのプー ルに分けて、22℃でインキュベーションした。一方のプールには等 量の 50mM HEPES (pH 7.5;no inhibitor) を加え、もう片方には等量の CellTiter-Glo® Buffer (inhibitor) を添加した。60 分毎（計 5 回）に 100µl を分取し 5X CellTiter-Glo® Substrate を 20µl 添加し、混和した。各タイ ムポイントで測定したサンプル数は 4 つ 4146MA05_3A 0 1 3 10 1 3 10 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Relative Values (Percent) Cell Number (x 103) Absorbance Luminescence 3T3 Cells A-12 Cells CellTiter-Glo® Assay と従来法との比較 従来法は細胞内酵素によりテトラゾリウム塩 WST-1 から変換したホルマザ ン産物を測定。NIH3T3 および A-12（PARP-1 欠損）を表示量 96 ウェルプ レートに播種した（100µl）。CellTiter-Glo® Reagent (100µl) または WST-1 (10 µl) を添加、混和し、インキュベーションした後に発光または吸光度を測定 した。各測定は 4 ウェルずつ行い、細胞を含まないバックグランド値は差 し引かずに計算した。 ・ホモジニアス：ワン – ショットタイプ（添加→混合→測定）なので 他の ATP 測定システムに較べプレートのハンドリングが最小限。 ・迅 速：試薬添加 10 分後にデーターが得られます。 ・高感度：標準的な発色または蛍光定量法に較べ優れた感度 （細胞 10 個［384 プレート］、細胞 50 個［96 プレート］を検出）。 ・正確：発色法より正確な定量性 ・安定性：発光が非常に安定（5 時間以上）。 ・応用性：様々なマルチプレートに適応し、ルミノメーターある いは CCD Cell Based In Vitro Cell Based シグナル伝達ガイド 15 細胞メタボリズム CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay プロテアーゼマーカーによる新しい細胞毒性試験 CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay は、細胞集団中の死細胞数を測定するための発光アッセイシステムで、死細胞由来プロテアーゼ 活性を細胞毒性のマーカーとして使用します。発光性細胞非透過性ペプチド基質（AAF-aminoluciferin）は、細胞膜の完全性を 失った細胞から放出される死細胞由来プロテアーゼ活性を測定するために使用します。遊離したアミノルシフェリンは、アッセイ 試薬に含まれるUltra-Glo™ Recombinant Luciferaseにより生じる グロータイプの発光として測定されます。AAF-aminoluciferin substrateは、生細胞のインタクトな細胞膜は透過できないため、生細胞集団からシグナルは生じません（検出限界以下）。本製品 に添付される細胞溶解剤を加えることにより、各アッセイウェル内の総細胞数に応じた発光シグナルを得ることもできます。その ため、この総細胞数の発光値から死細胞の発光シグナルを差し引くことにより生存性を算出することもできます。CytoTox-Glo™ Assayは、細胞生存性を測定する他の方法と非常に良く相関します。 ･ 高感度：少数の死細胞を検出（10 個）できるため初期ネクロー シスも観察できます。 ･ デュアル アッセイ：同一サンプルから死細胞と生細胞を計測可 能（全溶解プロトコル）。生細胞の減少による裏付けにより、安 定で正確なデータを提示。 ･ 簡便＆迅速：細胞に試薬を加えて 15 分後に測定。 ･ 簡便：1 種類の試薬を添加するだけのホモジニアスな 添加 – 混 和 – 測定 プロトコル（全溶解プロトコルでは 2 液）。 ･ 発光法：安定な発光測定により蛍光物質による干渉問題が排除 され、擬陽性も低減。 6802MA Signal to Noise Ratio 0 500 1,000 1,500 2,000 2,500 0 2,500 5,000 7,500 10,000 Dead Cells/Well CytoTox-Glo™ Assay Fluorescent LDH Assay LDH 蛍光アッセイ法に較べ優れた CytoTox-Glo ™ Assay の感度、 ダイナミックレンジ 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） CytoTox-GloTM Assay CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay 10ml G9290 16,500 5X10ml G9291 67,000 2X50ml G9292 103,500 ・10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 ・バルク注文については弊社までお問い合わせください。 プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/cytotoxglo.html 全溶解プロトコルによる細胞毒性と生存性の測定例 6693MA 0 100,000 200,000 300,000 400,000 500,000 0 15 30 45 60 Time (minutes) Luminescence (RLU) 死細胞数 総細胞数 生存性100%コントロール 溶解剤の添加 細胞毒性と生存性の連続測定 Cell Based In Vitro Cell Based テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982 ● E-Mail : prometec@jp.promega.com 日本語 Web site：www.promega.co.jp プロメガ株式会社 本 社 〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所 〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2009年10月現在のものであり予告なしに変更することがあります。 PK0910-01 販売店： 関連製品 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 阻害剤 MEK Inhibitor U0126 5mg V1121 32,000 SB 203580 1mg V1161 20,000 PD 98059 5mg V1191 20,000 LY 294002 5mg V1201 20,000 Olomoucine (cdc2 Protein Kinase Inhibitor) 0.5mg V2372 9,000 Olomoucine (cdc2 Protein Kinase Inhibitor) 10mg V2373 36,000 cAMP-Dependent Protein Kinase Peptide Inhibitor 1mg V5681 24,000 Myristoylated Protein Kinase C Peptide Inhibitor 1mg V5691 10,000 InCELLect™ AKAP St-Ht31 Inhibitor Peptide 150μl V8211 45,000 InCELLect™ St-Ht31P Control Peptide 150μl V8221 45,000 活性剤 cGMP, 1mM 500μl V6411 6,000 cAMP, 1mM 500μl V6421 6,000 PMA 5mg V1171 20,000 4α-PMA 1mg V1181 15,000 基質 cdc2 Protein Kinase Peptide Substrate 1mg V2211 31,000 Kemptide (PKA) Peptide Substrate 1mg V5601 5,500 Neurogranin28-43 (PKC) Peptide Substrate 1mg V5611 20,000 Casein Kinase II Peptide Substrate 1mg V5661 23,000 DNA-Dependent Protein Kinase Peptide Substrate 1mg V5671 30,000 Casein Kinase I Peptide Substrate 1mg V7441 25,000 cGMP-Dependent Protein Kinase Peptide Substrate 1mg V7451 32,000 酵素 キナーゼ cAMP-Dependent Protein Kinase, Catalytic Subunit 2500U V5161 25,000 cGMP-Dependent Protein Kinase (α-Isozyme) 6000U V5171 25,000 Protein Kinase C 2×0.5µg V5261 68,000 EGF Receptor 10U V5551 66,000 Casein Kinase II 100U V5621 22,000 Casein Kinase I 100U V5631 22,000 DNA-Dependent Protein Kinase 2500U V5811 23,000 ホスファターゼ Protein Phosphatase-2A 25U V6311 59,000 Protein Phosphatase-2B 10U V6361 20,000 抗体 Anti-ACTIVE® MAPK pAb, Rabbit, (pTEpY) 40μl V8031 65,000 Anti-pT183 MAPK pAb, Rabbit 50μl V8081 65,000 Anti-ERK 1/2 pAb, Rabbit 40μl V1141 35,000 Anti-ACTIVE® JNK pAb, Rabbit, (pTPpY) 40μl V7931 65,000 120μl V7932 130,000 Anti-ACTIVE® p38 pAb, Rabbit, (pTGpY) 100μl V1211 65,000 Anti-ACTIVE® MAPK Family Sampler 1 セット V3281 46,000 Anti-ACTIVE® CaM KII pAb, Rabbit, (pT286) 40μl V1111 65,000 Anti-pS473 Akt pAb 40μl G7441 45,000 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） キナ－ゼ＆ホスファターゼ アッセイシステム キナーゼアッセイ（蛍光） ProFluor® PKA Assay 4 プレート分 V1240 127,000 8 プレート分 V1241 220,000 ProFluor® Src-Family Kinase Assay 4 プレート分 V1270 127,000 8 プレート分 V1271 220,000 PepTag® Non-Radioactive PKC Assay 120 回分 V5330 53,000 PepTag® Non-Radioactive cAMP-Dependent Protein Kinase Assay 120 回分 V5340 53,000 キナーゼアッセイ（RI） SignaTECT® cdc2 Protein Kinase Assay System 96 回分 V6430 50,000 SignaTECT® Protein Tyrosine Kinase (PTK) Assay System 96 回分 V6480 59,000 SignaTECT® Protein Kinase C (PKC) Assay System 96 回分 V7470 50,000 SignaTECT® cAMP-Dependent Protein Kinase (PKA) Assay System 96 回分 V7480 50,000 SignaTECT® DNA-Dependent Protein Kinase Assay System 96 回分 V7870 50,000 SignaTECT® Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase (CaM KII) Assay System 96 回分 V8161 50,000 ホスファターゼアッセイ（蛍光） ProFluor® Tyrosine Phosphatase Assay 4 プレート分 V1280 127,000 8 プレート分 V1281 220,000 ProFluor® Ser/Thr Phosphatase Assay 4 プレート分 V1260 127,000 8 プレート分 V1261 220,000 ホスファターゼアッセイ（発色） Serine/Threonine Phosphatase Assay System 96 回分 V2460 52,000 Tyrosine Phosphatase Assay System 96 回分 V2471 52,000 プロテアーゼアッセイ プロテアーゼアッセイ（蛍光） Protease-Glo™ Assay 10 回分 G9451 180,000 Calpain-Glo™ Protease Assay 10ml G8501 60,500 50ml G8502 247,500 DPPIV-Glo™ Protease Assay （ジペプチジルペプチダーゼ IV） 10ml G8350 60,500 50ml G8351 247,500 成長因子 Brain-Derived Neurotrophic Factor (rhBDNF) 5µg G1491 54,000 Neurotrophin-3 (rhNT-3) 5µg G1501 54,000 Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (rhGDNF) 5µg G2781 54,000 Epidermal Growth Factor (rhEGF) 100µg G5021 22,000 Fibroblast Growth Factor, Basic (rhFGF, Basic) 25µg G5071 42,000 Insulin-Like Growth Factor-I (rhIGF-I) 25µg G5111 43,000 Nerve Growth Factor, 2.5S (mNGF, 2.5S) 100µg G5141 49,500 Tumor Necrosis Factor-α (rhTNFα) 10µg G5241 44,000 Interleukin-4 (rhIL-4) 5µg G5591 32,000 Signaling シグナル伝達研究サポート製品