タンパク質機能総合解析ツール

タンパク質機能総合解析ツール

ペプチドルシフェラーゼ HiBiTなど最先端のNanoLucテクノロジーおよび多機能性HaloTagタグを利用した広範なタンパク質機能解析アプリケーション・ツールをご紹介！

イントロダクション 2 NanoLuc® アプリケーション 5 ・タンパク質の安定性 5 ・タンパク質間相互作用 6 ・タンパク質発現検出（HiBiT） 10 ・タンパク質-リガンド相互作用 12 HaloTag® アプリケーション 13 ・分子間相互作用 13 ・イメージング 16 ・タンパク質精製 21 タグ融合タンパク質の発現（How To） 23 Contents タンパク質レポーター テクノロジーガイド 生きた細胞で見るタンパク質ダイナミクス LgBiT (156aa) LgBiT LgBiT HiBiT (11aa) 高親和性 （自発的な結合） 用途：発光タグ 低親和性 （補助的な結合） 用途：タンパク質間相互作用 蛍光 蛍光 SmBiT (11aa) NanoLuc® Luciferase HaloLink™ Resin HaloTag® HiBiT 融合タンパク質 作製方法 ● ベクター構築＆トランス フェクション ● ゲノム編集 タンパク質：タンパク質 相互作用 タンパク質の安定性 タンパク質：リガンド 相互作用 タンパク質：タンパク質 相互作用 何らかの処理を行った後の タンパク質レベルの変化 HiBiT 融合タンパク質のプロセシング、 発現の変化、その他を LgBiT/HiBiT ブロッティングで確認 培養液中への分泌 NanoLuc® 融合タンパク質 作製方法 ● ベクター構築＆トランス フェクション ● ゲノム編集 HaloTag® 融合タンパク質 作製方法 ● ベクター構築＆トランス フェクション NanoBiT® Luciferase NanoBRET™ Tracer NanoBiT® PPI System NanoBRET™ Target Engagement Systems NanoBRET™ PPI System タンパク質：DNA 相互作用 クロマチン免疫沈降 タンパク質：タンパク質 相互作用 タンパク質精製 プルダウンアッセイ HaloTag® 融合 タンパク質 HiBiT 融合 細胞表面タンパク質 HiBiT 融合 分泌タンパク質 HiBiT 融合 細胞内タンパク質 HaloTag® 融合 NanoBRET™ 618 Ligand NanoLuc® 融合 タンパク質 NanoLuc® Luciferase Fusions NanoLuc® Binary Technologies HaloTag® 蛍光リガンド タンパク質の局在・動態 生細胞蛍光イメージング ● 蛍光タンパク質との マルチプレックス解析 ● 分解過程の可視化 ● パルスチェイス ● FACS HaloTag® Fusion Vectors NanoLuc® Fusion Vectors HaloTag® Protein Purification System HaloTag® Mammalian Pull-Down System NanoBRET™ Target Engagement Assay NanoBRET™ Nano-Glo® Detection System HaloTag® Ligands HaloCHIP™ System Extracellular Nano-Glo® HiBiT Detection System （細胞非溶解） Lytic Nano-Glo® HiBiT Detection System （細胞溶解） Nano-Glo® HiBiT Blotting System HaloTag® 融合タンパク質の 発現量、プロセシングなどの 変化を確認 蛍光 SDS-PAGE LgBiT Fusion Vectors SmBiT Fusion Vectors Nano-Glo® Luciferase Assay System 5 ページ 12 ページ 6 ページ 23ページ 13ページ 14ページ 21ページ 23ページ 23ページ 11ページ 10ページ 10ページ 16ページ VHL ＋ 通常酸素状態 （低発光値） Degradation 低酸素状態 （高発光値） HIF HIF HIF HIF VHL VHL Ub Ub Ub Ub Ub HIF NLuc HIF NLuc HIF NLuc HIF NLuc Nano-Glo® Live Cell Assay System 9 ページ 近年は分析手法の著しい進歩により生体分子を網羅的に解析する手法（オミックス解析）がより身近なものになり、生命現象を理解する ための新たなアプローチとなっています。一方でこれらの網羅的なデータから生物学的に意味のある解釈を導くには関連するタンパク質の 機能を知る必要がありますが、まだその多くが解明されていないのが現状です。そのギャップを埋めるための新たなタンパク質機能解析 法も数多く開発され、高度化された質量分析あるいは表面プラズモン共鳴法（SPR）などにより多くの知見が得られてきました。しかし、 その多くは細胞から取り出したタンパク質を解析する手法であり、より生体に近い生きた細胞内で真のタンパク質機能をとらえたいという 2 タンパク質のふるまいを、生きた細胞でありのままに 捉えるために LgBiT (156aa) LgBiT LgBiT HiBiT (11aa) 高親和性 （自発的な結合） 用途：発光タグ 低親和性 （補助的な結合） 用途：タンパク質間相互作用 蛍光 蛍光 SmBiT (11aa) NanoLuc® Luciferase HaloLink™ Resin HaloTag® HiBiT 融合タンパク質 作製方法 ● ベクター構築＆トランス フェクション ● ゲノム編集 タンパク質：タンパク質 相互作用 タンパク質の安定性 タンパク質：リガンド 相互作用 タンパク質：タンパク質 相互作用 何らかの処理を行った後の タンパク質レベルの変化 HiBiT 融合タンパク質のプロセシング、 発現の変化、その他を LgBiT/HiBiT ブロッティングで確認 培養液中への分泌 NanoLuc® 融合タンパク質 作製方法 ● ベクター構築＆トランス フェクション ● ゲノム編集 HaloTag® 融合タンパク質 作製方法 ● ベクター構築＆トランス フェクション NanoBiT® Luciferase NanoBRET™ Tracer NanoBiT® PPI System NanoBRET™ Target Engagement Systems NanoBRET™ PPI System タンパク質：DNA 相互作用 クロマチン免疫沈降 タンパク質：タンパク質 相互作用 タンパク質精製 プルダウンアッセイ HaloTag® 融合 タンパク質 HiBiT 融合 細胞表面タンパク質 HiBiT 融合 分泌タンパク質 HiBiT 融合 細胞内タンパク質 HaloTag® 融合 NanoBRET™ 618 Ligand NanoLuc® 融合 タンパク質 NanoLuc® Luciferase Fusions NanoLuc® Binary Technologies HaloTag® 蛍光リガンド タンパク質の局在・動態 生細胞蛍光イメージング ● 蛍光タンパク質との マルチプレックス解析 ● 分解過程の可視化 ● パルスチェイス ● FACS HaloTag® Fusion Vectors NanoLuc® Fusion Vectors HaloTag® Protein Purification System HaloTag® Mammalian Pull-Down System NanoBRET™ Target Engagement Assay NanoBRET™ Nano-Glo® Detection System HaloTag® Ligands HaloCHIP™ System Extracellular Nano-Glo® HiBiT Detection System （細胞非溶解） Lytic Nano-Glo® HiBiT Detection System （細胞溶解） Nano-Glo® HiBiT Blotting System HaloTag® 融合タンパク質の 発現量、プロセシングなどの 変化を確認 蛍光 SDS-PAGE LgBiT Fusion Vectors SmBiT Fusion Vectors Nano-Glo® Luciferase Assay System 5 ページ 12 ページ 6 ページ 23ページ 13ページ 14ページ 21ページ 23ページ 23ページ 11ページ 10ページ 10ページ 16ページ VHL ＋ 通常酸素状態 （低発光値） Degradation 低酸素状態 （高発光値） HIF HIF HIF HIF VHL VHL Ub Ub Ub Ub Ub NLuc NLuc NLuc NLuc Nano-Glo® Live Cell Assay System 9 ページ ニーズも高まっています。NanoLuc® および HaloTag® テクノロジーは生きた細胞内のタンパク質をより“ありのまま”に検出することを目的 に開発されたタグテクノロジーで、GFP や His タグといった従来のタグに比べ検出感度が高く（生体内レベルの分子数でも検出可能）、より 分子量の小さなタグ（HiBiT は 11 アミノ酸で標的タンパク質への影響は最小限）を利用することで本来のタンパク質機能を解析すること ができます。このガイドでは NanoLuc® および HaloTag® テクノロジーを基盤とした高感度タンパク質検出、ライブセルイメージングから CRISPR によるゲノムへの導入など多様なアプリケーションをご紹介します。 3 タンパク質のふるまいを、生きた細胞でありのままに 捉えるために 由来 深海エビ（トゲオキヒオドシエビ [Oplophorus gracilirostris]）由来 のルシフェラーゼであり、触媒活性のある19kDa のサブユニット を改変して作製。 ホタルやウミシイタケ由来のルシフェラーゼより約 100 倍以上明 るく、さらに本来の基質である Coelenterazine をもとに作製した Furimazine という新しい基質を用いることで発光強度と安定性を 高めました。この強力な発光により BRET の性能は飛躍的に高ま り、これを応用したバイオセンサーの作製も行われています。 2 分子相補システム（HiBiT システム、NanoBiT® アッ セイシステム） NanoLuc® ルシフェラーゼをわずか 11 アミノ酸のペプチド断片 （HiBiT または SmBiT）とそれに結合する相補的な約 18KDa の断 片（LgBiT）に分け、それらが 可 逆 的に結 合して活 性をもつ NanoLuc® を再構成することを利用した目的タンパク質の動態解 析を行うシステムです。LgBiT と最も親和性の高いペプチド断片 を HiBiT、親和性の低いペプチド断片を SmBiT と呼びます。これ らはタンパク質タグとして目的タンパク質と融合することで、目 的タンパク質の検出あるいはタンパク質間相互作用検出 （NanoBiT® ）が可能です。 由来 真性細菌 Rhodococcus rhodochrous 由来のハロアルカン脱ハロ ゲン酵素（DhaA）に改変を加えて作製。 活性中心付近でクロロアルキル鎖をもつ低分子リガンドと迅速・ 特異的に共有結合し、反応後リガンドは解離しません。蛍光種や 細胞透過性、スペーサーの長さ、担体などの異なる様々な機能性 リガンドを取り揃えており、コンストラクトを変えずに精製や生 細胞イメージングなど幅広いタンパク質解析が実施できます。 HiBiT Protein Detection PPI LgBiT SmBiT （11 a.a.） （17.6kDa） （11 a.a.） low af nity （11 a.a.） high af nity Asp106 Asp106 標的タンパク質 HaloTag® タンパク質 機能性 レポーター分子 共有結合 HaloLinkTM Resin HaloLinkTM Magnetic Beads TMR Ligand Oregon Green® Ligand Alexa Fluor® 488 Ligand Coumarin Ligand Biotin Ligand ■ イメージング用リガンド TEV Site ■ プルダウン・精製用リガンド Amine Ligand ■ 未標識リガンド ？ ？ Succinimidyl Ligand NanoLuc® Luciferase NanoBiT® PPI System HiBiT HaloTag® 概要 • 深海エビ由来ルシフェラーゼ • 19kDa • ホタルルシフェラーゼの 約 100 倍の明るさ • 大小のサブユニットに分かれた NanoLuc® • 17.6kDa + 11 アミノ酸 • ホタルルシフェラーゼの約 30 倍程度の明るさ • LgBiT との親和性の違いで用途が異なる • 微生物由来ハロアルカン 脱ハロゲン酵素 • 33kDa • 各種リガンドと共有結合 特長 高い定量性 包括的解析ツール 強力な BRET のシステムがバイオ センサーなどに応用可能 生細胞でのタンパク質間相互作用 がルミノメーターだけで測定可能 分子量が小さいためゲノム編集に 最適。内在遺伝子の発現レベル 解析に理想的。 コンストラクトを変えずに様々な 実験ができる。融合タンパク質は 可溶性が向上する。蛍光リガンド が頑健で褪色しづらい。 使用例 （文献事例 を含む） • BRET を利用した バイオセンサーの作製 • タンパク質とリガンドの相互作 用検出 • 発光イメージング • タンパク質間相互作用の リアルタイムモニタリング • 発現量の変動モニタリング など、融合タンパク質の 定量を重視する実験 • ウイルス感染、細胞融合 • 一分子蛍光イメージング • In vivo プルダウンアッセイに よるタンパク質複合体解析 • 結晶構造解析のための 膜タンパク質精製 19kDa SmBiT 11 アミノ酸 HiBiT 11 アミノ酸 低親和性 （Kd=190 µM） 高親和性 （Kd=700 pM） LgBiT 17.6kDa LgBiT 17.6kDa 4 NanoLuc® テクノロジー HaloTag® テクノロジー タンパク質の安定性：細胞溶解を伴う発光測定 発現量の測定：SDS-PAGE HIF1A Vector System、NRF2 Vector System HIF1A は低酸素、NRF2 は酸化ストレスに対する細胞の応答を仲 介するシグナルタンパク質です。HIF1A Vector Systemでは細胞内 HIF1A タンパク質レベルを、NRF2 Vector Systemでは細胞内 NRF2 タンパク質レベルを簡便に定量し、その動態を検討することが 可能です。 HIF1A タンパク質または NRF2 タンパク質は NanoLuc® を C 末端 に融合し、CMV プロモーター下で発現します。どちらのシステム にも細胞内での融合タンパク質の発現量を調節するための Transfection Carrier DNA が付属します。 ※ NRF2 Vector System にのみ、細胞内 NRF2 レベルを適切に制御するための pKEAP1 発現ベクターも含まれます。 NanoLuc® Stability Sensor ■ 細胞内の HIF1A、NRF2 タンパク質のターンオーバーを測定 タンパク質のターンオーバーのスピードは、発がんやストレス応答に関わる多くのシグナルタンパク質を制御しています。下流の転写イベン トが活性化した結果として細胞の状態が変化し、これに応答してタンパク質の安定化とそれに続く蓄積が起こります。NanoLuc® Stability Sensor は ready-to-use のベクターシステムであり、NanoLuc® ルシフェラーゼレポーターの特長を活かし、キーとなる 2 つのシグナルタン パク質 HIF1A と NRF2 の安定性の検討を可能にしました。 Nano-Glo® In-Gel Detection NanoLuc® NanoLuc® 製品名 サイズ カタログ番号 ベクター pNLF1-HIF1A ［CMV/neo］ Vector 20 µg N1381 pNLF1-NRF2 ［CMV/neo］ Vector 20 µg N1391 製品名 サイズ カタログ番号 Nano-Glo® In-Gel Detection System 100 ml N3020 製品名 サイズ カタログ番号 検出試薬 Nano-Glo® Luciferase Assay System 10 ml N1110 100 ml N1120 10 × 10 ml N1130 10 × 100 ml N1150 ■ ブロッティング不要、ゲルからダイレクトに検出 ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した NanoLuc® 融合タンパ ク質をイムノブロッティングを行わずに検出します。Nano-Glo® InGel Detection Reagent とインキュベーションした後に直接ゲルをイ メージングします。ネイティブ PAGE の場合、ゲルを検出試薬とと もにインキュベーションし、15 分以内にイメージを取得できます。 変性 SDS-PAGE の場合、検出前に SDS を除去して NanoLuc® ルシ フェラーゼをリフォールディングさせるために 25% イソプロパ ノールで 2 回洗浄し、次に水で 2 回洗浄します。 NanoLuc® ルシフェラーゼ の感度ならば、Nano-Glo® In-Gel Detection System で可視化するために過剰発現させる必要はありません。 250 150 100 75 50 37 25 20 kDa Carrier DNA NEK7 STK32A CAMKK2 RPS6KA5 STK10 NEK7 + CAMKK2 + STK10 STK32A + RPS6KA5 All constructs 250 150 100 75 50 37 25 20 15 kDa A. B. Carrier DNA NEK7 STK32A CAMKK2 RPS6KA5 STK10 NEK7 + CAMKK2 + STK10 STK32A + RPS6KA5 All constructs M M 14617MA Separate proteins in cell lysate using SDS-PAGE. Lyse cells expressing NanoLuc®-tagged proteins. Wash gel twice with 25% isopropanol and twice with water. Add Nano-Glo® In-Gel Detection Reagent. Image the gel. ライゼート SDS-PAGE ゲル洗浄、試薬添加 ゲルイメージング （NanoLuc® 基質を含む） Nano-Glo® In-Gel Detection System の作業フロー 細胞内における HIF1A レベルの検出システム 一過性発現のためトランスフェクションを行った HEK293 細胞の SDS-PAGE 5 種類の NanoLuc® 融 合タンパク質（NEK7, STK32A, CAMKK2, RPS6KA5, STK10）を HEK293 細胞で一過的に発現させた。CMV をプロモーターとする発現コンストラクト はキャリア DNA で希釈し、細胞にトランスフェクションする際に発現レベルを低下さ せた。一晩発現させた後、10 µl の細胞ライセートでゲル電気泳動を行った。パネル A. NanoLuc® 融合タンパク質を Nano-Glo® In-Gel Detection Systemで可視化した。試薬添加 後直ちに 30 秒露光し撮影を行った。パネル B. 同じゲルで Comassie® 染色を行った像。 VHL ＋ 通常酸素状態 （低発光値） Degradation 低酸素状態 （高発光値） HIF HIF HIF HIF VHL VHL Ub Ub Ub Ub Ub HIF NLuc HIF NLuc HIF NLuc HIF NLuc www.promega.co.jp/flexinanoclone/ NanoLuc® 融合タンパク質発現クローンについては以下を参照ください 5 アプリケーション タンパク質 – タンパク質相互作用の定量：BRET（生物発光共鳴エネルギー移動） NanoBRET™ ■ 生細胞リアルタイム PPI モニタリング 生物発光共鳴エネルギー移動（Bioluminescence resonance energy transfer）は、生細胞におけるタンパク間の直接的な相互作用を検出す る手法として幅広く用いられています。類似の原理である FRET（Fluorescence resonance energy transfer）を用いた手法に比べ、励起光を 当てる必要がないので、バックラウンドがきわめて低く、励起光による細胞へのダメージを最小限に抑えることができます。 発光源に高レベル発光酵素 NanoLuc® を用いた NanoBRET™ system は従来のウミシイタケルシフェラーゼを用いた BRET に比べ、より高 い発光値と安定性、強固性を持ち、また HaloTag® NanoBRET™ 618  uorescent Ligand で標識された HaloTag® タンパク質をエネルギー転 移アクセプターとして利用することで従来の BRET に比べ優れたシグナル / バックグラウンド比が得られます。生細胞でのリアルタイム解 析、及びハイスループットスクリーニングに最適です。 HaloTag® NanoLuc® 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Frb-NLuc/FKBP-HT Frb- RLuc8/FKBP-YFP Rapamycin (nM) Signal-to-Background Ratio 12323MA 0.0001 0.01 1 100 10,000 NLuc HT NLuc FKBP FKBP HT FRB FRB 610nm BRET Rapamycin A. B. HT ligand 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Frb-NLuc/FKBP-HT Frb- RLuc8/FKBP-YFP Rapamycin (nM) Signal-to-Background Ratio 12323MA 0.0001 0.01 1 100 10,000 NLuc HT NLuc FKBP FKBP HT FRB FRB 610nm BRET Rapamycin A. B. HT ligand 従来の BRET アッセイと NanoBRET™ のパフォーマンス比較 HaloTag® 618 Ligand が結合した FKBP-HaloTag® と FRB-NanoLuc® 存在下でラパマイ シンを加えると 2 つの融合タンパク質が相互作用を起こし、BRET を生じる（左図）。 FKBP-YFP と FRB-Rluc8 による BRET システムとのデータ比較 NanoLuc® HL O O HT Protein A Protein B HL: HaloTag HT: ® NanoBRET™ 618 Ligand HaloTag® protein Fluorescence + substrate A. B. 400 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 450 500 550 600 650 700 Wavelength (nm) Relative Intensity Acceptor signal Donor signal Acceptor 618nmEx Donor 460nmEm = Ratio 12749TB Background NanoBRET™ emission BRET energy transfer NanoLuc® luciferase BRET に最適なスペクトルの分離とシグナル強度 新しい発光酵素（NanoLuc® ：ピーク波長 460 nm）と蛍光リガンド（618 Ligand：ピーク 波長 618 nm）により、シグナルの増強とスペクトルの分離が大幅に改善され、従来 の FRET/BRET では得られなかったシグナル /ノイズ比を実現 タンパク質 A タンパク質 B LgBiT （17.6 kDa） SmBiT （11 amino acids） タンパク質 A タンパク質 B A. B. O O O O 構造的相補性による発光シグナル BRET による蛍光シグナル BRET NanoLuc® HaloTag® ＋ 618 Ligand LgBiT （17.6 kDa） SmBiT （11 amino acids） NanoBRET™ システムの原理 ベクターを導入した細胞内で発現したタンパク質 A：NanoLuc® （青色） 融合タンパク質と HaloTag® （オレンジ色）に低分子蛍光 618リガンドが 結合したタンパク質 B：HaloTag® 融合タンパク質が近接すると BRET が 起こる。低分子蛍光 618リガンドはタンパク質発現後に細胞へ添加する 細胞透過性の蛍光試薬。 Zeit (Sekunden) BRET (%) AVP (nM) BRET ratio (mBU) AVPR2 Vasopressin AVPR2 A B barr2-NL AVPR-HT barr2-NL AVPR-HT AVP NanoBRET™ による細胞イメージング アルギニンバソプレシン受容体 2 （AVPR2）とβ -アレスチンとの相互作用の BRET 解析 。（撮影は Olympus LV200を使用） 生細胞 アッセイ 6 NanoLuc®　正確な定量のために ■ NanoBRET™ を始めるには まず標的タンパク質に NanoLuc® と HaloTag® を付加しますが、最 も BRET Ratio の高いコンストラクトを得るために 8 種類のコンス トラクトを用意することを推奨します。 弊社 では NanoBRET™ コンストラクトの受託製造も承っており、確実なアッセイの実施 をサポートしています。 NanoBRET™ コンストラクション受託サービスの詳細については、 以下のサイト、または弊社までお問合せください。 ■ 推奨測定機器 GloMax® Discover NanoBRET™ の測定に完全対応のマルチモードリーダー（発光、 蛍光、吸光［UV/ 可視光］、BRET、FRET）です。フィルターによ る 2 色発光測定、カイネティクス測定にも対応します。 ① 遺伝子ペア選択 ② ウェブ申込み ③ コンストラクトセット作製 ④ 納品 ⑤ ベクターを細胞に導入 ⑥ NanoBRET™ 測定 受託製造 いたします 製品名 サイズ 納期 NanoBRET™ 検討用クローンセット 8 種類 約 1 カ月 ※本サービスはサブクローニングのみであり、発現チェック等は行っておりません。 予めご了承下さい。 受託サービスを利用する場合の NanoBRET™ 初期検討フロー Protein B HaloTag® NLuc HaloTag® NLuc NL B HT NL B NL B NL HT HT HT HT B NL B B HT NL A HT NL HT NL Protein A A A A A B A A B A •各コンストラクトを細胞に導入し、NanoBRET™を測定 •最も BRET Ratioの高いものを採用 N 末・C 末両方に付加 8 種類のコンストラクト 12756MA A-HT + NL-B HT-A + NL-B A-HT + B-NL HT-A + B-NL HT-B + A-NL HT-B + NL-A B-HT + A-NL B-HT + NL-A A-HT + NL-B HT-A + NL-B A-HT + B-NL HT-A + B-NL HT-B + A-NL HT-B + NL-A B-HT + A-NL B-HT + NL-A 8.1 5.0 14.3 9.1 2.3 3.0 5.7 7.2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 A-HT + NL-B HT-A + NL-B A-HT + B-NL HT-A + B-NL HT-B + A-NL HT-B + NL-A B-HT + A-NL B-HT + NL-A BRET Ratio (mBU) NanoBRET™ Ratios of PPI Combinations Tested 0 500,000 1,000,000 1,500,000 2,000,000 2,500,000 3,000,000 Luminescence (RLU) Luminescence (RLU) Raw 460nm Donor Values Raw 618nm Acceptor Values Ligand Control Ligand Control 0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 A. B. C. 製品名 サイズ カタログ番号 クローニングセット ご希望のをタンパク質遺伝子を、複数の制限酵素サイトより選択してクローニング する標準的な MCS システムと簡便な移し換えが可能な Flexi クローニングが可能な Flexi システムからお選びいただけます。 NanoBRET™ PPI MCS Starter System 1 セット N1811 NanoBRET™ PPI Flexi® Starter System 1 セット N1821 コントロール NanoLuc®-HaloTag® 融合タンパク質の発現ベクター Positive Control と p53-HaloTag® と NanoLuc®-MDM2 の各融合タンパク質を発現するベクターセット（PPI Control Pair ） NanoBRET™ Positive Control 2 × 20 µg N1581 NanoBRET™ PPI Control Pair （p53, MDM2） 2 × 20 µg N1641 検出試薬 ドナー側の NanoLuc 検出用の発光基質とアクセプター側の HaloTag® 検出用の蛍光 リガンドとのセット NanoBRET™ Nano-Glo® Detection System 200 回分 N1661 1000 回分 N1662 10000 回分 N1663 製品名 サイズ カタログ番号 ターゲットアッセイキット 各ターゲット融合タンパク質発現ベクターセットおよびコントロール発現ベクター セットおよび 2 種類の検出試薬を含むキット NanoBRET™ Interaction Assay BRD 4/Histone H3.3 1 システム N1830 BRD 9/Histone H3.3 1 システム N1840 BRPF1/Histone H3.3 1 システム N1860 cMyc/MAX 1 システム N1870 KRas/BRaf 1 システム N1880 BRD 4/Histone H4 1 システム N1890 BRD 9/Histone H4 1 システム N1900 BRPF1/Histone H4 1 システム N1910 製品名 サイズ カタログ番号 測定機器 GloMax® Discover System（本体） 1 台 GM3000 受託サービスで作製可能 www.promega.co.jp/nanoppiconst/ 7 NanoLuc®　正確な定量のために タンパク質 – タンパク質相互作用の定量：NanoLuc® 2 分子相補システム NanoBiT® ■ ルミノメーターでできる生細胞リアルタイム PPI モニタリング NanoLuc® Binary Technology （NanoBiT® ）は生細胞内でタンパク質間の相互作用を構造的な相補性を利用して検出します。NanoLuc® ルシ フェラーゼをベースに作成された Large BiT（LgBiT）および Small BiT（SmBiT）の各サブユニットは構造的な安定性を高め、親和性が低く なるように最適化されています。目的タンパク質と LgBiT または SmBiT との融合体を哺乳動物細胞内で発現させ、目的のタンパク質が 相互作用すると構造的相補性が促進され明るい発光酵素が形成されます。細胞透過性の基質を添加すると生細胞でタンパク質の動態を リアルタイムで観察することができます。 NanoBiT® 生細胞 アッセイ 100 75 50 25 0 0 20 40 60 NanoBiT（% signal decreas ）e Time（min） NanoBiT ISO PRO FSK NanoBiT® システムの原理 ベクターを導入した細胞内で発現したタンパク質 A：LgBiT （青色の大き な断片）融合タンパク質とタンパク質 B：SmBiT （オレンジ色の小さな断 片）融合タンパク質が結合すると発光酵素が再構成される。 3×105 8×103 6×103 4×103 2×103 0 2×105 RLU RLU ［Rapamycin］（nM） ［Rapamycin］（nM） NanoBiT Firefly 1×105 10-2 10-1 101 102 103 0.01 1 100 100 0 1.3×107 1.0×107 7.5×106 5.0×106 2.5×106 RLU ［FK506］（µM） NanoBiT Firefly 10-2 10-1 101 102 100 0 5×104 4×104 3×104 2×104 1×104 0 RLU ［Rapamycin］（nM） 0.01 0.1 1 10 100 NanoBiT® とスプリットホタルルシフェラーゼの応答性の比較 NanoBiT® タグまたはスプリットホタルルシフェラーゼタグを融合した FKBP および FRB を発現する HEK293 細胞にラパマイシン（上）または FK506（下）を添加した タンパク質間相互作用のダイナミクスをモニタリングできる NanoBiT® の 可逆性 SmBiT-CA:LgBiT-R2A （PKA 触媒サブユニットあるいは調節サブユニットと NanoBiT® 断片の融合タンパク質）を発現する HEK293細胞にイソプロ テレノール（ISO）、プロ プラノール（PRO）または フォルスコリン（FSK）で順次刺激してタンパク質間相互作用 を検出した 0 sec 100 sec 460 sec 820 sec 0 200 400 600 800 1000 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 time（sec） % relative response シングルセルレベルでの ADRBR-114 / β -アレスチン 相互作用の生物発光イメージング HeLa 細胞に PPI 検出用の発現ベクターを トランジェントにトランスフェクションし、 イソプロテレノールで処理した。グラフの 線は細胞 1個ごとに色分けした。 （撮影は Olympus LV200を使用） 製品名 サイズ カタログ番号 クローニングセット ご希望のタンパク質遺伝子を、複数の制限酵素サイトより選択してクローニングす る標準的な MCS システム、簡便な移し換えが可能な Flexi クローニング対応の Flexi システムからお選びいただけます。 NanoBiT® PPI MCS Starter System 1 セット N2014 NanoBiT® PPI Flexi® Starter System 1 セット N2015 コントロール FKBP, FRB の各融合タンパク質を発現するベクターセット NanoBiT® PPI Control Pair （FKBP, FRB） 2 × 20 µg N2016 検出試薬 NanoBiT® 検出用の発光基質試薬 Nano-Glo® Live Cell Assay System 100 回分 N2011 1,000 回分 N2012 10,000 回分 N2013 タンパク質 A タンパク質 B LgBiT SmBiT タンパク質 A タンパク質 B A. B. O O O O 構造的相補性による発光シグナル BRET による蛍光シグナル BRET NanoLuc® HaloTag® ＋ 618 Ligand 構造的相補性による発光シグナル 8 NanoLuc®　正確な定量のために Nano-Glo® Live Cell Assay System、Endurazine™、Vivazine™ の発光 カイネティクス比較 ■ NanoBiT® を始めるには 標的タンパク質に LgBiT と SmBiT を付加しますが、NanoBRET™ と同様に、アッセイに最適なコンストラクトを得るために 8 種類 のコンストラクトを用意することを推奨します（7 ページ参照）。 弊社では NanoBiT® コンストラクトの受託製造も承っており、確 実なアッセイの実施をサポートしています。 NanoBiT® コンストラクション受託サービスの詳細については 以下のサイト、または弊社までお問合せください。 製品名 サイズ カタログ番号 測定機器 GloMax® Navigator System（本体） 1 台 GM2000 製品名 サイズ 納期 NanoBiT® 検討用クローンセット 8 種類 約 1 カ月 ※サービスはサブクローニングのみであり、発現チェック等は行っておりません。 予めご了承下さい。 GloMax® Navigator（ルミノメーター） 超高感度、ワイドダイナミックレンジな発光測定専用機器です。 微弱な生物発光から強い発光までを検出でき、NanoBiT® をはじ めとした様々な生物発光アッセイのシグナルを確実に捉えます。 ■ NanoBiT® 推奨測定機器 NanoBiT® と NanoBRET™ の特性比較 特性 NanoBRET™ NanoBiT® 方式 生物発光共鳴エネルギー転移（BRET） 発光酵素断片の相補性 検出対象 近接度 直接的な相互作用 タグの大きさ 小さい 20 kDa（NanoLuc® ）と 30 kDa（HaloTag® ） 非常に小さい 11 アミノ酸（SmBiT）と 18 kDa（LgBiT） データ 2 波長の比率（低 %CV） RLU（相対発光強度） 試薬添加回数 2 1 検出機器 アッセイ BRET 対応ルミノメーター（適合フィルター要） ルミノメーター（フィルター不要） イメージング 発光イメージングシステム（Olympus LV200 など）： 相互作用前後を観察可能 発光イメージングシステム（Olympus LV200 など）： 複合体のみ観察可能 可逆性（キネティックアッセイ可） ◯ ◯ 製品形態 キット（100 種類以上）、クローニングベクター、検出試薬 クローニングベクター、検出試薬 ライセンス費用（企業を含む） その他 HaloTag® 側を使ったプルダウン ベクター構築サービスもございます。 試薬の購入のみ 局在解析：生細胞生物発光イメージングと長時間発光基質 Nano-Glo® Live Cell Assay, Endurazine™, Vivazine™ ■ 生細胞リアルタイムモニタリング用 NanoLuc® 基質 Nano-Glo Live Cell Assay System は生細胞のまま発光を測定する1 液添加方式の非細胞溶解性の試薬です。NanoLuc® および NanoBiT® の 検出の他、NanoBRET™ や NanoLuc® 融合タンパク質の生細胞イメージングにも使用できます。Nano-Glo® Live Cell Substrate は付属の Dilution Buffer で希釈して Nano-Glo® Live Cell Reagent を調製し、培地中に直接添加することで、細胞生存性を損なわずに最長 2 時間まで 連続した発光モニタリングが行えます。Endurazine™、Vivazine™ は数時間から数日にわたる長時間発光モニタリングが可能であり、内 在レベルのタンパク質測定も可能な感度を有します。 NanoLuc® 生細胞 アッセイ NanoBiT® Vivazine™ substrate Endurazine™ substrate Nano-Glo® Live Cell Assay System 104 105 106 107 108 Luminescence (RLU) Time (hours) 0 5 10 15 20 25 製品名 サイズ カタログ番号 Nano-Glo® Live Cell Assay System 100 回分 N2011 1,000 回分 N2012 10,000 回分 N2013 Nano-Glo® Vivazine™ Substrate 0.1 ml N2580 1 ml N2581 10 ml N2582 Nano-Glo® Endurazine™ Substrate 0.1 ml N2570 1 ml N2571 10 ml N2572 Nano-Glo® Extended Live Cell Substrate Trial Pack （Endurazine™ および Vivazine™　各 0.1 ml ） 0.2 ml N2590 www.promega.co.jp/nanoppiconst/ 9 NanoLuc®　正確な定量のために ■ 添加・混和・測定だけで細胞内の標的タンパク質を定量 Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System を用いれば、細胞ライセー ト中の HiBiT タグタンパク質を簡便な“添加 – 混和 – 測定”アッ セイで直接定量することができます。細胞を溶解すると同時に 発光に必要な LgBiT タンパク質および Frimazine 基質を供給する Nano-Glo® HiBiT Detection Reagent を HiBiT タグ タンパク質を発現 する細胞に加えます。 LgBiT タンパク質と HiBiT タグとの高親和性の相互作用により NanoBiT® 発光酵素が再構成されます。これにより標準的な抗体 を用いた検出法よりも少ない操作ステップでより定量的な測定結 果が得られます。 シグナル半減期：1 ～ 2.5 時間（サンプルと十分混和させた場合） ■ pg レベル以下のタンパク質を 5 分で検出 ゲルで分離してメンブレンに転写した HiBiT タグタンパク質を pg レベル以下の感度で可視化できます。LgBiT タンパク質およびフ リマジン基質を含むブロッティング試薬をメンブレンに直接添加 すれば、HiBiT 融合タンパク質から発光シグナルが生じます。 標準的なウエスタンブロッティングプロトコールでは数時間かか りますが、このシンプルな検出法なら最速 5 分でタンパク質を検 出できます。HiBiT が存在する場所のみが発光するため、バック グラウンドもほとんどありません。 シグナル半減期：60 分 検出感度：100fg ～ 100ng 以上 （露光時間はレンジによって最適化が必要） 14284MA HiBiT Lytic Detection System の作業フロー HiBiT Blotting System の作業フロー 用途 • 制御されたタンパク質発現　● 標的タンパク質の分解 • ウイルスの感染 • 遺伝子発現によるタンパク質レベルと RNA -seq 実験の確認 • プルダウンあるいは一過性トランスフェクション後のタンパク質定量 用途 • HiBiT タグタンパク質の分子量を確認　● スプライスバリアントの発現を同定 • 一過性のトランスフェクションまたは CRISPR/Cas9 によるノックインの 迅速なスクリーニング 様々な発現レベルの HiBiT 融合 HIF1A の定量 CRISPR/Cas9 ゲノム編集を用いれば HiBiT タグタンパク質を内在的に調節された条件 下で発現させることができるため、過剰発現によるアーティファクトを低減し、内在 性の結合パートナーや調節機構で適切な化学量論を維持することができる。 内在 GAPDH への HiBiT タギングの確認 発現レベルに関わらずにタンパク質存在量の変化を測定でき、タグタンパク質を広い ダイナミックレンジで正確に定量できる。内在レベルの低いタンパク質量でも定量で きる（検出限界 10–19 moles 以下）。 5 桁以上のシグナル直線性 発現量の測定：細胞溶解を伴う発光測定 発現量の測定：メンブレンにブロットしたタンパク質を発光検出 Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection Nano-Glo® HiBiT Blotting HiBiT HiBiT 14368MB Separate HiBiT-tagged proteins in cell lysate using SDS-PAGE. Transfer proteins from gel to nitrocellulose membrane. Add Nano-Glo® HiBiT Blotting System reagents to the membrane to detect HiBiT-tagged proteins. Image the membrane. Gel Membrane Membrane LgBiT SDS-PAGE ブロッティング メンブレンに試薬添加 発光検出 （LgBiT の添加） 14371MA –17 –16 –15 –14 –13 –12 –11 0 1 2 3 4 5 6 7 Log10HiBiT Control Protein (moles) Log10Background-Subtracted Band Intensity 74-minute exposure 2.4-minute exposure 14-second exposure 0 20 40 60 80 100 120 100 1,000 Time (minutes) Background-Subtracted Band Intensity 0 hours 21 hours at 4°C 1 hour at room temperature A. B. HiBiT タグタンパク質の 細胞内発現 Lytic reagent（LgBiT を含む） を添加 発光測定 10 NanoLuc®　正確な定量のために 用途 • 受容体のインターナリゼーション　● 受容体のリサイクリング • タンパク質またはサイトカインの分泌 • 表面タンパク質のトラフィッキング 発現量の測定、局在解析：細胞外タンパク質の発光検出 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection ■ 細胞表面で発現する HiBiT 融合タンパク質、または分泌型 HiBiT 融合タンパク質の定量 HiBiT 生細胞 アッセイ Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection Reagent を加え混和して発 光を測定するだけで、細胞外に発現した HiBiT 融合タンパク質量 を直接的に測定できます。構成品の Nano-Glo® HiBiT Detection Reagent には酵素基質と細胞膜非透過性の LgBiT ペプチドが含ま れます。細胞表面上あるいは培地中に分泌された発現 HiBiT タグ タンパク質だけが細胞外の LgBiT と相補し NanoBiT® 発光酵素と して再構成されます。 定量性の高い Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System は標 準的な抗体ベースの検出法に比べて操作ステップ数が飛躍的に 少なくなるため時間を節約でき、精度も改善されます。 LgBiT HiBiT NanoLuc® 基質 細胞を生かしたまま膜タンパク質・分泌タンパク質を定量 検出試薬に含まれる LgBiT は細胞膜非透過性なので、細胞表面のタンパク質 または細胞外への分泌タンパク質のみ検出できる。 *10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分に相当 **100ml は 10 ブロット分に相当 アゴニスト EC50 細胞表面受容体の残存率 Isoproterenol 50.9 nM 16% Salbutamol 161 nM 45% Salmeterol 1.04 nM 63% Formoterol 2.92 nM 16% ADRB2 アゴニスト + G P C R Gs ADRB2 HiBiT LgBiT LgBiT インターナリゼーション Isoproterenol Salbutamol Salmeterol Formoterol 製品名 サイズ カタログ番号 Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System 10 ml* N3030 100 ml N3040 10 × 100 ml N3050 Nano-Glo® HiBiT Blotting System 100 ml** N2410 製品名 サイズ カタログ番号 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System 10 ml* N2420 100 ml N2421 10 × 100 ml N2422 HiBiT Control protein 100 µl N3010 ELISA法 HiBiTシステム 2-10分 5-10分 2時間 1時間 1～30分 5-6時間 GPCRのN末端に タグをつけ、 細胞表面で発現 HiBiT Extracellular 検出試薬を添加、 インキュベート 細胞固定化、 ブロッキング 抗タグ抗体処理 洗浄、標識2次抗体処理 アゴニスト 処理 吸光度 読み取り 発光値 読み取り 洗浄、発色基質を 添加してインキュベート HiBiT システムと ELISA 法の比較 細胞表面に露出した GPCR を検出した事例。HiBiT システムは受容体のトラフィッキング （内在化およびリサイクリング）ELISA 法よりも高感度で迅速に、バラつき少なくモニ タリングできる。 β 2- adrenergic receptor（ADRB2）のエンドサイトーシス模式図（上図）と インタナリゼーション誘導における各アゴニストの力価と効果（下図、表） 4 種類の完全または部分的アゴニストに暴露した際の β 2-adrenergic receptor（ADRB2）の インターナリゼーション測定を行った。アッセイは数分で完了し、バラつきも低減できる。 11 NanoLuc®　正確な定量のために 発現量の測定：生細胞でリアルタイムに測定したい場合に タンパク質 – リガンド相互作用：BRET（生物発光共鳴エネルギー移動） HiBiT Intracellular Detection ■ 細胞融合、ウイルス感染リアルタイム検出などに応用可能 NanoBRET™ Target Engagement Assay HiBiT 生細胞 アッセイ 生細胞 アッセイ 細胞内に発現している HiBiT 融合タンパク質の検出を細胞を生か したまま行いたい場合、HiBiT のパートナーである LgBiT を過剰 に共発現させることで検出可能となります。検出には Nano-Glo® Live Cell Assay Reagent（9 ページ）を添加するだけです。 細胞融合やウイルス感染モニタリングの場合、2 種類の細胞あるい は細胞とウィルスなどの組み合わせで、それぞれの細胞に LgBiT、 HiBiT を発現させます。それらは融合すると自発的に会合し、 NanoGlo® Live Cell Assay Reagent を添加すれば発光定量が可能です。 融合、感染 ※本アプリケーションでは2つの細胞にそれぞれLgBiT、HiBiTを発現させる。 LgBiT HiBiT NanoLuc® 基質 用途 • ウイルス感染あるいは複製 （ 極小 HiBiT はウイルスゲノムへの挿入に好適） • 細胞融合 • アクセプター細胞への Exosome デリバリー • 生細胞での細胞内タンパク質の定量 製品名 サイズ カタログ番号 LgBiT/HiBiT コントロールベクター CMV LgBiT Vector CMV HaloTag お問合せください ®-LgBiT Vector CMV HaloTag®-HiBiT Vector LgBiT の安定発現 HEK293 株 HEK293 LgBiT Stable Cell Line お問合せください NanoLuc® テスト化合物の結合親和性と透過性の解析 NanoBRET™ TE Assay は、細胞内で NanoLuc® 融合タンパク質に可逆的に結合す る NanoBRET™ トレーサーによる競合的な置換によりテスト化合物の見かけ上 の結合親和性と透過性を分析する。テスト化合物が結合すると標的タンパク質 とトレーサーから生じる NanoBRET™ シグナルが失われる。 BRET 13693MA A. B. C. Tracer Concentration Unlabeled Compound Concentration BRET BRET Nluc BRET Nluc Nluc NanoLuc® luciferase Fluorescent tracer Target protein Test compound 製品名 サイズ カタログ番号 HDAC用 セット NanoBRET™ TE Intracellular HDAC Assay （検出試薬と NanoLuc® 融合 HDAC6 発現ベクター） 100 回分 N2080 1,000 回分 N2081 NanoBRET™ TE Intracellular HDAC Complete Kit （検出試薬と NanoLuc® 融合 HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC6, HDAC10 と HDAC6 CD2 発現ベクター） 1,000 回分 N2170 HDAC用 検出試薬 NanoBRET™ TE Intracellular HDAC Detection Reagents 10,000 回分 N2090 BET BRD用 セット NanoBRET™ TE Intracellular BET BRD Assay （検出試薬と NanoLuc® 融合 BRD4 発現ベクター） 100 回分 N2130 1,000 回分 N2131 NanoBRET™ TE Intracellular BET BRD Complete Kit （検出試薬と NanoLuc® 融合 HDAC1, BRD2, BRD3, BRDT, BRD4 と BRD2 BD1, BRD2 BD2, BRD4 BD1, BRD4 BD2 発現ベクター） 1,000 回分 N2180 BET BRD用 検出試薬 NanoBRET™ TE Intracellular BET BRD Detection Reagents 10,000 回分 N2140 キナーゼ用 検出試薬（ベクターは含みません） NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay, K-4 100 回分 N2520 1,000 回分 N2521 10,000 回分 N2540 NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay, K-5 100 回分 N2500 1,000 回分 N2501 10,000 回分 N2530 ■ 生細胞内でテスト化合物の親和性およびレジデン スタイムを直接測定 NanoBRET™ Target Engagement（TE） Assay はインタクトな細胞内 で標的タンパク質への化合物の結合をリアルタイムに測定しま す。このシステムは 4 つの要素、すなわち NanoLuc® 融合標的タン パク質、標的タンパク質特異的に結合する細胞膜透過性の蛍光 トレーサー、NanoLuc® ルシフェラーゼの基質、細胞膜非透過性 の NanoLuc® ルシフェラーゼ阻害剤からなります。 このアッセイは生細胞で分子の近接度を測定するためにデザ インされた NanoBRET™ System （6 ページ）がベースになってお り、化合物の結合親和性化合物－標的タンパク質のレジデンス タイムを直接測定できます。細胞に添加した化合物が細胞内の NanoLuc® 融合標的タンパク質と特異的に結合すれば BRET の発 光値は下がります。この結合を正確に評価するために、ハンドリン グ時に障害された細胞などから生じた細胞外 NanoLuc® のシグナ ルを NanoLuc® 阻害剤を用いて減じます。細胞内で発現している NanoLuc® ルシフェラーゼに影響することはありません。 NanoBRET™ Target Engagement Intracellular HDAC Assay HDAC とテスト化合物の親和性およびレジデンスタイムの直接的 な測定が可能です。完全長のタンパク質を用いたアッセイです。 NanoBRET™ Target Engagement Intracellular BET BRD Assay BET BRD とテスト化合物の親和性およびレジデンスタイムの直接 的な測定が可能です。完全長のタンパク質を用いたアッセイです。 NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay 生細胞で標的キナーゼへの化合物の結合が検出できます。120 種類以上のキナーゼ融合ベクターから選択可能です。キナーゼの 種類によって 2 種類のトレーサー（K-4、K-5）のうちどちらかを 使用します。 ※ NanoLuc® 融合キナーゼ発現ベクター一覧については www.promega.co.jp/kinasevect/ をご覧ください。 12 NanoLuc®　正確な定量のために タンパク質 -DNA 相互作用：クロマチン免疫沈降様解析 HaloCHIP™ Assay HaloTag® ■ 抗体不要の ChIP 様解析 HaloCHIP™ System は、細胞内のタンパク質 /DNA 複合体を共有 結合により捕捉する新しい方法を採用した、クロマチン免疫沈降 法（ChIP）に替わるシステムです。抗体を使用しないため、従来 法よりも効率的で安定したデータが得られます。 細胞内で HaloTag® 融合体として発現し、DNA に結合した目的の タンパク質は、ホルムアルデヒドによりDNA と架橋され、融合タン パク質の HaloTag® 部位と高い特異性で共有結合する HaloLink™ Resin 上に捕捉されます。レジンとタンパク質 /DNA 複合体との 間に共有結合が形成されるため、強力な洗浄により非特異的に 結合したタンパク質や DNA を従来の ChIP 法よりも効率的に除去 することができます。その後、架橋を外して HaloLink™ Resin か ら精製 DNA 断片を回収します。 HaloCHIP™ は従来法（ChIP）で検出されるタンパク質：DNA 相互作用をよく再現する（参考文献より） HaloCHIP™、従来法で CREB:DNA プロモーター結合サイトの決定を行い、Nimblegen promoter tiling array により再現性を検討した。 HaloTag® protein HaloCHIP® Blocking Ligand Iranscription tactor HaloLink™ Resin 1–1.5 days TF HT HaloCHIP™ Blocking Ligand Sample DNA TF TF TF HT TF HT HT HT HT Transfection TF HT HaloTag® fusion construct HL HL HL HL TF HT HL HL HL HaloTag® 融合 タンパク質の発現 ホルムアルデヒドに よる架 橋、細胞 溶 解、超音波処理 ブロッキングリガン ド 添 加（ 対 照 実 験 サンプルのみ） HaloLink™ Resin で 複合体を捕捉 実験サンプル 洗浄 解析 解析 脱架橋 対照実験サンプル バックグラウンド DNA HaloCHIP™と従来法（ChIP）の比較 HaloCHIP™ 従来法（ChIP） • ベクターを使用 （融合タンパク質の発現） • タグを付加した組換えタンパク質 • 所要時間：1 ～ 1.5 日 • 共有結合でタンパク質：DNA 複合 体を捕捉 • 少ないステップ数、エラーが低減 • 低いバックグラウンド、高い S/B 比 • 抗体を使用 • 内在タンパク質 • 所要時間：4 ～ 5 日 • 抗体 / プロテイン A/G でタンパク質： DNA 複合体を捕捉 • 多くのステップ数、データの バラつき • 高いバックグラウンド、低い S/B 比 METTL4 NDC80 CRE half site CRE full site log2 ratio CREB enrichment 2,062 bp 4 3 2 1 0 CREB ChIP-chip enrichment CREB Halo-chip enrichment 9671MA ALS2 half site CRE full site 3 2 1 0 log2 ratio CREB enrichment 1,125 bp CREB ChIP-chip enrichment CREB Halo-chip enrichment 9670MA 参考文献 Hartzell, D. D.; Trinklein, N. D. et al（. 2009）A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays, BMC Genomics, 10: 497 本論文では、HaloCHIP™ System を用いた実験操作の基本的な手順、特 長を紹介している。HaloCHIP™ System と従来の ChIP 法と比べており、同 様のプロモーター領域が検出されることを示している。さらにこれらの データに基づき、プロモーターのオリゴ DNA マイクロアレイを組み合わせ ることでハイスループットなプロモーター解析を行っている。 製品名 サイズ カタログ番号 HaloCHIP™ System 20 回分 G9410 * 内　容： •HaloCHIP™ Blocking Ligand（30µl） •HaloLink™ Resin（2ml） •High Salt Wash Buffer（25ml） •Mammalian Lysis Buffer（40ml） •Nuclease-Free Water（150ml） •Reversal Buffer（8ml） 13 HaloTag® イメージングと捕捉のために タンパク質 – タンパク質相互作用：プルダウンアッセイ HaloTag® Pull-Down Assay ■ 発現量の少ないタンパク質も効率的に捕捉 標準的なプルダウンアッセイでは、担体に結合するベイト（bait）タンパク質濃度を高くするために大腸菌発現系が汎用され、アフィニティー タグである GST との組合わせが多く見られます。しかし、タンパク質間の相互作用には修飾やフォールディングなどが必要な場合があり、 大腸菌の発現系では相互作用を見逃してしまう場合があります。この点で哺乳動物の細胞や無細胞発現系を用いた相互作用は有用です が、大腸菌より発現量が比較的少ないため検出が困難な場合があります。 これを解消するのが HaloTag® の持つ高い親和性（共有結合：右中図参照）と迅速な結合速度です。発現量が少なくても、強力な洗浄が 可能であるためバックグラウンドを極めて低く抑えられ、検出感度が上がります。標準的なプルダウンアッセイでは、非特異的なタンパ ク質の結合による擬陽性が問題となりますが、HaloTag® と HaloLink™（担体）は強力な結合力を有し、HaloLink™ への非特異的結合が 最低限に抑えられているため擬陽性を著しく低減させることができます。これらの特性により無細胞発現タンパク質を bait/prey の両方 に用いたり、哺乳動物細胞内での相互作用を検出することも可能になります。プルダウンアッセイで検出された特異的結合パートナーは、 SDS-PAGE や質量分析により解析・同定することができます。 HaloTag® GST Resin 5612TA HaloLink™ pull-down GST pull-down GST-Fos – (prey) – Jun-HaloTag® Fusion (prey) Jun-HT (bait) Control GST-Fos (bait) Control HaloLinkTM Fos* GST* HT Jun prey bait Fos GST HT* Jun* prey bait * 35S 標識タンパク質 HaloTag® および HaloLink™ Resin を用いたプルダウン法と GST を用いた プルダウン法の比較 GST-c-Fos および c-Jun-HaloTag® 融合タンパク質を無細胞発現系で合成し、互いに bait（未標識）あるいは prey（³⁵［S］-メチオニン標識）として用いた。合成完了後、 未標識タンパク質および標識タンパク質パートナーからなる 2 組の反応液を混合し、 タンパク質を結合させた。HaloLink™ Resin（左パネル）または GST- 結合レジン（右 パネル）を用いて、タンパク質複合体をプルダウンした。左レーン : HaloLink™ また は GST レジンを用いた GST-c-Fos または c-Jun-HaloTag® タンパク質のプルダウン。右 レーン : HaloLink™ または GST レジンのみ。 5619TA 10min 24hr 10min 24hr HaloLinkTM supernatants GST Resin 10% input fusion Protein HaloLinkTM HT GST } 共有結合 GST Resin HT GST 弱い結合 HaloTag® 融合タンパク質の強固な結合 等量（25µl [ 沈殿状態 ]）の HaloLink™ Resin および GST 結合レジンを、それぞれ HaloTag®-GST 融合タンパク質 160µg と混合し、インキュベーションした。レジンを洗 浄し、PBS に再懸濁した。4℃で表示時間インキュベーション後、SDS-PAGE により上 清を分析した。最左のレーンでは、添加した HaloTag®-GST 融合タンパク質の 10% 量 を泳動した。HaloLink™ では 24 時間後に回収した上清でも HaloTag®-GST 融合タンパ ク質は検出されない。一方、GST Resin では、すでに 10 分後の上清で HaloTag®-GST 融合タンパク質が検出された。 プロテアーゼインヒビターカクテル 市販のプロテアーゼ阻害剤にしばしば含まれる AEBSF は、 HaloTag® タンパク質と HaloLink™ との結合を阻害すること が確認されています（蛍光リガンドに対しては影響が少ない です）。プロメガの Protease Inhibitor Cocktail は AEBSF を含 まず、異なる標的プロテアーゼを特異的に阻害する 6 種類 のプロテアーゼ阻害剤の混合液のため、幅広いプロテアー ゼを効率的に阻害します。このため HaloTag® テクノロジーに はもちろんのこと、様々なタンパク質融合タグ（His、GST、 Flag® など）を用いた実験にも有効です。 各種プロテアーゼ阻害剤が対応するプロテアーゼファミリー 公開されているでデータを基にした主要プロテアーゼファミリーに対する阻害。 © Omplete is a trademark of Hoffmann-La Roche. BaculoGold is a trademark of Becton, Dickinson and Company. Model Serine Cysteine Aspartate Metallo- Aminopepridases Promega ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ Roche-cOmplate™ ✓ ✓ ✓ BD-BaculoGold™ ✓ ✓ ✓ ✓ PMSF ✓ ✓ Aprotinin ✓ EDTA ✓ 10422MA ■ HaloTag® vs GST （bait/prey = 無細胞発現タンパク質） 同等の条件下で比較した HaloTag® および GST とそれぞれの親和 性レジンとの結合能力（右図）および実際のプルダウンアッセイ における検出感度（下図）とも HaloTag® が優れていました。 14 HaloTag® イメージングと捕捉のために ■ 哺乳細胞内（in vivo）で形成されたタンパク質間相互作用の検出（bait/prey = 哺乳動物細胞発現タンパク質） in vivo におけるタンパク質間相互作用の分析は、より生体内に近い状態で厳密な相互作用を再現できるため非常に重要です。HaloTag® Mammalian Pull-Down and Labeling System は、HaloTag® 融合タンパク質を哺乳動物細胞内で発現させ、細胞内に含まれる相互作用パート ナーやタンパク質複合体をプルダウンするためのシステムです。HaloTag® とレジンとが共有結合するため、一過性あるいは弱い相互作用 を形成するパートナーやより高次の細胞内タンパク質複合体を捕捉あるいは精製することができます。本システムには HaloTag® TMRDirect™ Ligand も含まれており、同じ遺伝子コンストラクトを用いて複合体形成との相関的な細胞内局在やリアルタイムイメージン グも観察でき、タンパク質機能全体像の理解に役立ちます。付属する HaloTag® Control Vector には CMV プロモーター、T7 や SP6 RNA ポ リメラーゼプロモーターが含まれており、哺乳動物細胞、大腸菌あるいは無細胞発現系で HaloTag® タンパク質を発現させることができ ます。このベクターは全ての HaloTag® 実験システムでコントロールとして使用することができます。 「HaloTag® を用いたタンパク質精製・プルダウンのコツ」 （22 ページ）もご覧ください。 HaloTag® Mammalian Pull-Down Assay と免疫共沈降法による プルダウンの比較 上図：HeLa 細胞で p65 の相互作用パートナーのプルダウンを行った後に電気泳動 – 銀染色により検出し、HaloTag® Mammalian Pull-Down Assay と免疫共沈降法を比較し た。HaloTag® Mammalian Pull-Down Assayでは免疫共沈降法の約 4 ～ 5 倍の感度が得 られた。上表：2 つの方法により確認された p65 パートナー。予想される相互作用パー トナーは質量分析により確認した。 9033MA HT POI HaloTag® 融合コンストラクト トランスフェクション または安定発現 HT POI HT POI HaloLink™ Resin POI HaloTag® 融合タンパク質の 発現とタンパク質複合体の形成 細胞溶解 HaloLink™ Resinで タンパク質複合体を捕捉 HaloLink™ Resinの洗浄 SDS buffer による 溶出またはTEV プロテアーゼ による消化（オプション） タンパク質分析 TEV による消化 SDS による溶出 HT POI 標的タンパク質 HaloTag® タンパク質 HaloTag 免疫共沈降 ® p65 Ab No Ab p65-HT HT Cont 予想されるパートナー 免疫共沈降 HaloTag® p105 ○ ○ p100 ○ Rel A ○ ○ Rel B ○ C-Rel ○ IκBα ○ ○ IκBb ○ ○ IκBe ○ ○ 製品名 サイズ カタログ番号 HaloTag® Mammalian Pull-Down and Labeling System 24 回分 G6500 HaloTag® Mammalian Pull-Down System 24 回分 G6504 HaloTag® Complete Pull-Down System 1 セット G6509 関連製品 HaloTag® Control Vector 20 µg G6591 Protease Inhibitor Cocktail, 50X 1 ml G6521 Mammalian Lysis Buffer 40 ml G9381 HaloLink™ Resin 10 ml G1914 内　容：G6500、G6504 •HaloLink™ Resin（5ml） •Protease Inhibitor Cocktail, 50X（1ml） •Mammalian Lysis Buffer（10ml） •10X TBS Buffer（25ml） •SDS Elution Buffer（1.3ml） レジン担体の単品販売もございます（22 ページ）。 bait タンパク質として HaloTag® 融合タンパク質を用いた HaloTag® Mammalian Pull-Down Assay の概要 15 HaloTag® イメージングと捕捉のために 局在解析：生細胞蛍光標識 HaloTag® リガンド ■ タンパク質の局在、動態、プロテインプールの分染 HaloTag® タンパク質の蛍光リガンドによる標識の特長の 1 つは、同じコンストラクトより発現したタンパク質を任意の蛍光色素で染める ことができる点です（GFP などの蛍光タンパク質では、異なる蛍光色で検出する場合には、コンストラクト自体を変える必要があります）。 そのため、時間差で異なる色素により標識することで、パルス – チェイス様の実験を行うことができます。細胞表面に提示されたタンパ ク質のみを染色できる細胞膜非透過性リガンドや任意の色素をご自身で合成して頂くために未標識のリガンドもあります。 標識プロトコルには短時間で標識し洗浄ステップを要する標準プロトコル、培地に添加したまま培養し洗浄なしで観察できる Non-Wash プロトコルがあり、それぞれに適した蛍光リガンドを用意しています。 生細胞 アッセイ HaloTag® ■ 標準プロトコルの例：生細胞における蛍光タンパク質とのマルチプレックス解析 蛍光タンパク質とは異なり、HaloTag® コンストラクトを構築すれば、第 2 あるいは第 3 の蛍光染色として自由に蛍光色を選択すること ができ、柔軟な多重染色が行えます。 Cells Ligands Wash Media replacement 15min 30min (24-48 hrs) 標準プロトコル 18-24 hrs Non-Wash プロトコル Labeling Labeling 4990TA A. C. E. B. D. F. 生細胞の核または細胞質を標的とした HaloTag® および hMGFP レポーター HaloTag®-（NLS）3 および hMGFP-a-tubulin（パネル A-D）または HaloTag®-a-tubulin および hMGFP-（NLS） （パネル 3 E、F）の各セットを HeLa 細胞にトランジェン トにトランスフェクションした。24 時間後、HaloTag®- （NLS）3 を発現する細胞は 25µM Coumarin Ligand（パ ネル A、B）または 5µM HaloTag® TMR Ligand（パネル C、D）で、HaloTag®-a-tubulin を発現する細胞は 5µM HaloTag® TMR Ligand（パネル E、F）でそれぞれ 15 分間インキュベーションした（37℃ /5% CO2）。細胞 は洗浄後、30 分間インキュベーションした。パネル A および B では、細胞をフィルターセット（Coumarin Ligand には #31000 DAPI、hMGFP には #41001 FITC Chroma Technology Corp）、Orca CCD カメラ（浜松ホ トニクス社）および environmental controls を装備し たオリンパス IX81 落射蛍光顕微鏡でイメージングし た。パネル C-F では、2レーザーシーケンシャルスキャ ニングおよび TMR と FITC の蛍光に適したフィルター で撮影した。 4883TA A B C D p65-HaloTag® タンパク質を発現し、HaloTag® TMR Ligand で標識した 細胞の固定後のイメージング HeLa 細胞で一過的に発現した p64-HaloTag® 融合タンパク質を、標準プロトコルに従 い TMR Ligand で標識した。3.7% パラホルムアルデヒドで固定 後、1µg/ml mouse Anti- β III Tubulin Antibody（カタログ番号 G7121）および Alexa Fluor®-488-conjugated goat-antimouse IgG (Molecular Probes) を用いて染色した。撮影にはオリンパス FV500 共焦点顕微鏡で行った。パネル A. TMR 蛍光。パネル B. Alexa Fluor®-488 蛍光。パネ ル C. Alexa Fluor®-488 および TMR 蛍光および透過光のオーバーレイ。パネル D. Alexa Fluor®-488 および TMR 蛍光のオーバーレイ。 “No-wash” 生細胞標識プロトコルでも示された高いシグナル / ノイズ比と 特異性 核移行シグナルを融合させた HaloTag® を安定に発現する U2OS 細胞を HaloTag® R110Direct™ Ligand で洗浄ステップを省略した方法で標識した。パネル A. 蛍光イ メージ。パネル B: 蛍光イメージと DIC イメージの重ね合わせ。 標準プロトコルと Non-Wash プロトコルの操作比較 ■ Non-Wash プロトコルの例：ハイコンテント分析 HaloTag® TMRDirect™ および R110Direct™ Ligand を用いたシンプ ル – プロトコル “Non-Wash プロトコル ” は、リガンドを低濃度に 抑え、長時間インキュベーションすることで標的 HaloTag® タンパ ク質を標識する方法で、洗浄操作を省くことができるため、ハイ コンテントスクリーニングの自動化などに最適です。低濃度の HaloTag® リガンドを長時間にわたり暴露しますが、毒性も無く、 多くのアプリケーションに適合します。 ■ 免疫細胞染色（ICC）とのマルチプレックス解析が可能 HaloTag® とリガンドは安定な共有結合を形成し、固定後も蛍光 特性を失わないので、固定細胞でもイメージング解析が行えます。 タンパク質自体が蛍光を有する GFP とは異なり、安定な蛍光分 子を使用するので、変性条件下でも褪色はおこりません。 16 HaloTag® イメージングと捕捉のために 5530MD Wavelength (nm) HaloTag® Ligand Excitation maximum (dotted lines) Emission maximum (solid lines) Janelia Fluor® 549 Janelia Fluor® 646 549nm 571nm 646nm 664nm 500 600 700 0 0.5 1.0 Normalized Fluorescence U2OS 細胞で発現する HaloTag® タンパク質のライブセルイメージング 核局在配列を含む HaloTag® 発現 U2OS 細胞 をガラスボトムチャンバースライドに付着 させ、200 nM の Janelia Fluor® 549 HaloTag® Ligand（パネル A）または Janelia Fluor® 646 HaloTag® Ligand （パネル B）で 15 分 間 標 識した。細 胞 は、Janelia Fluor® 549 HaloTag® Ligandでは561 nm、Janelia Fluor® 646 HaloTag® Ligandでは637 nmのレーザー で励起してイメージングを行った。 Janelia Fluor® HaloTag® Ligand の励起波長と蛍光波長 Janelia Fluor is a registered trademark of Howard Hughes Medical Institute. ■ タンパク質の分解過程を可視化、定量化 タンパク質の寿命や分解に関する研究は近年注目されています。これまでタンパク質の寿命を解析するには、［35S］Met を使ってタンパ ク質をラベルしたりタンパク質合成阻害剤を添加したりする必要がありました。しかし HaloTag® を使えば、細胞内で発現させたタンパ ク質を瞬間的に蛍光ラベルし、その後は蛍光を測定するだけでそのタンパク質の寿命が解析できます（下図参照）。また、蛍光ラベルし た HaloTag® タンパク質は蛍光顕微鏡で観察できるので、分解過程を可視化することができます。 もちろん分解過程だけでなく、瞬間的にラベルすることが出来るので、タンパク質の局在の変化の観察にも適しています（18 ページ参照）。 HaloTag® Biotin Ligand（カタログ番号 G8281）で標識し、その量の変化を解析している報告もあり、実験方法は多彩です。 ■ 高輝度 Janelia Fluor® リガンド により広がるアプリケーション （超解像顕微鏡イメージング、一分子イメージング、FACS） 新しい Janelia Fluor® リガンドは HaloTag® 蛍光標識リガンド の中で最も明るいため、より低レベルに発現するタンパク質でも検出するこ とが可能です。Janelia Fluor® 蛍光色素は優れた量子収量と光安定性を備えているため、HaloTag®融合タンパク質の高解像度の1分子イメー ジングなどにも使用することができます（以下の文献参照）。No-Wash プロトコルを利用できるため標識操作も簡便です。 Janelia Fluor® 549 や 646 蛍光リガンドは以下の文献で 超解像顕微鏡や 1 分子トラッキングなどに利用されています。 Grimm, J.B. et al. (2015) A general method to improve  uorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat. Methods 12, 244–50. A B Control TNF-α Lactacystin + TNF-α 0 30 60 120 0 20 40 60 80 100 0 30 60 90 120 Time (min) Percent of initial fluorescence signal Lactacystin + TNF- α Control TNF- α B 0 20 40 60 80 100 0 30 60 90 120 Time (min) Percent of initial fluorescence signal Lactacystin + TNF- α Control TNF- α Time (min) 0 30 60 120 TNF-α Lactacystin + TNF-α 180 240 0 30 60 120 180 240 72 kDa min min min min TNF- α依存的な I κ B-HaloTag® 融合タンパク質の分解 パネル A）I κ B-HaloTag® 融合タンパク質を HEK293 細 胞に一過的に発現させ、TMR リガンド（5 µM）で標識 した。TNF- α（10 ng/ml) で刺激後、10 分間隔で 3 時 間まで観察を行った（図では 0、30、60、120 分後の 画像を示した）。TNF- αの刺激の 30 分前より 10 µM の Lactacystinで処理することにより、分解が抑制された。 パネル B）細胞の平均的な蛍光強度をオリンパス FV500 ソフトウェアにより求め、時間 0 での蛍光強度 を 100 として示している。 A B 17 HaloTag® イメージングと捕捉のために ■ パルスチェイス実験 & 時間的 / 空間的なタンパク質プールの分離および SDS-PAGE でのタンパク質修飾解析 HaloTag® テクノロジーは、1 つのベクターコンストラクトを作製するだけで異なる波長の蛍光を HaloTag® レポータータンパク質に付帯さ せることができます。そのため、発現した時間の異なるタンパク質プールを異なる蛍光色で染色できます。 また、異なる細胞透過性を持つ蛍光 HaloTag® リガンドを使用することにより異なる領域（細胞膜 / 細胞内）の標的タンパク質を染め分 けることもできます。さらに、ゲル分析によるタンパク質の翻訳後修飾の解析にも利用することができます（下図 , パネル B: 細胞表面 の HaloTag®- インテグリン融合タンパク質はグリコシル化により修飾されるため高分子側にシフトされて観察されます［ グルカナ－ゼ処 理により確認済み］）。 ① ② ③ ④ A B パルス・チェイス多重染色の概念図 刺激 A（もしくは刺激なし）によって発現した HaloTag® タンパク質“①”を緑色蛍光リガンドで染色をすると、その時点で発現していた HaloTag® タンパク質は 緑色で検出できます“②”。その後、一定時間経過した後、同じ細胞に刺激 B を加えて“③”、赤色蛍光リガンドで染色すると、刺激 A で発現した HaloTag® タン パク質にはすでに緑色リガンドが結合しているため、刺激 B で新たに発現したものだけが赤色に染め分けられます“④”。 1 種類の蛍光リガンドとビオチンリガンドを組み合わせて単色でのパルス・チェイス染色を行うことでタンパク質の寿命を解析することも可能です。また細胞 膜非透過性リガンドと細胞膜透過性リガンドを使って細胞膜内・外を分けて染色することで細胞膜から細胞質へのタンパク質局在変化をパルスラベリング法 と組み合わせて解析することも可能です。 6347TA cell-impermeant cell-permeant A. B. C. D. 42 36 28 kDa 1 2 3 4 HaloTag® テクノロジーを用いた空間的または時間的なタンパク質の分離 パネル A. β 1 Integrin-HaloTag® タンパク質のパルス / チェイス標識法の概略図（パル スでは細胞表面の HaloTag® タンパク質を標識するために細胞非透過性の HaloTag® Alexa Fluor® 488 Ligand を使用し、チェイスでは細胞内の HaloTag® タンパク質を標識 するために細胞透過性の HaloTag® TMR Ligand を 使 用）。パネル B. β 1 IntegrinHaloTag® タンパク質を安定に発現する HEK293 細胞を HaloTag® TMR Ligand のみで標 識（レーン 2）、HaloTag® Alexa Fluor® 488 Ligand のみで標識（レーン 3）または、膜タン パク質標識のための HaloTag® Alexa Fluor® 488 Ligand によるパルスと細胞内タンパク 質標識のための HaloTag® TMR Ligand によるチェイス（レーン 4）。生細胞イメージン グの後、細胞を溶解して分子量マーカー（レーン 1）とともに SDS-PAGE に供し分析 した。パネル C. β 1 Integrin-HaloTag® タンパク質を一過性に発現する HeLa 細胞を HaloTag® Alexa Fluor® 488 Ligand でパルス（1µM、37℃、15 分）、HaloTag® TMR Ligand でチェイスし（5µM、37℃、15 分）、洗浄した後に Olympus FV500 共焦点顕微鏡（適 切なフィルターセットを用いたシーケンシャルモード）を用いてイメージングを行っ た。パネル D. 細胞標識 12 時間後のイメージング結果では、異なる標識を行ったタン パク質において細胞質から細胞膜へ移動したタンパク質や細胞膜から細胞内移行し たタンパク質が観察された。 7527TA FL1=R110, FL2=PI HaloTag® を発現し、標識された細胞の FACS® 解析 核移行シグナルを融合させた HaloTag® タンパク質を安定に発現する U2OS 細胞を HaloTag® R110Direct™ Ligand で標識（Non-Wash プロトコル）し、未標識細胞と混和 した後、既知数の標識細胞（1%, 10% または 100%）をソートした。R1 は R110 標識 細胞、R2 は死細胞（プロピジウムイオダイド）、R3 は非標識細胞。各グラフは約 20,000 個の細胞に相当。 ■ FACS® 分析 HaloTag® リガンドで標識した細胞は FACS® 分析を行うことができます。浮遊細胞 あるいは付着細胞で実施でき、ソートした細胞は顕微鏡によるイメージングや SDS-PAGE、さらに異なる蛍光色での標識（細胞内で新規に発現した HaloTag® タン パク質）なども行えます。標識操作はステップを簡略化した “Non-Wash プロトコ ル ” あるいは標準プロトコルでも実施できます（16 ページ参照）。 18 HaloTag® イメージングと捕捉のために 推奨されるイージング用の標準的なフィルタ―セット リガンド 推奨するフィルターセット HaloTag® Alexa Fluor® 660, Janelia Fluor ® 646 HaloTag® Ligand Cy® 5  lter set (~640nmEx/700nmEm) HaloTag® TMR, Janelia Fluor® 549 HaloTag® , TMRDirect™ Ligand TRITC  lter set (555nmEx/580nmEm) HaloTag® Alexa Fluor® 488, Oregon Green® , R110Direct™ Ligands FITC  lter set (488nmEx/520nmEm) HaloTag® Coumarin Ligand DAPI/AMCA  lter set (345nmEx/445nmEm) ライセンスについて HaloTag® Technology で使用するリガンドをプロメガ以外で作製・入手する場合、または研究用途以外（営利目的等）でご使用される場合、ライセンス契約の必要があります。 HaloTag® リガンドの価格表および励起 / 蛍光波長 製品名 励起波長（Ex） 蛍光波長（Em） サイズ カタログ番号 超解像顕微鏡対応蛍光リガンド Janelia Fluor® 549 HaloTag® Ligand 549 571 5 µg GA1110 3 x 5 µg GA1111 Janelia Fluor® 646 HaloTag® Ligand 646 664 5 µg GA1120 3 x 5 µg GA1121 蛍光リガンド（標準プロトコル用） HaloTag® Coumarin Ligand 362 460 15 µl G8582 30 µl G8581 HaloTag® Oregon Green® Ligand 492 520 15 µl G2802 30 µl G2801 HaloTag® diAcFAM Ligand 492 521 15 µl G8273 30 µl G8272 HaloTag® TMR Ligand 552 578 15 µl G8252 30 µl G8251 HaloTag® STELLA Fluor™ 650 Ligand 646 660 30 nmol GCKA308-01 60 nmol GCKA308-02 HaloTag® STELLA Fluor™ 700 Ligand 691 712 お問合せください HaloTag® STELLA Fluor™ 720 Ligand 721 740 お問合せください HaloTag® ICG Ligand 790 830 お問合せください HaloTag® Alexa Fluor® 488 Ligand（細胞膜非透過性） 499 518 2 × 20 µg G1002 30 µl G1001 HaloTag® Alexa Fluor® 660 Ligand（細胞膜非透過性） 654 690 15 µl G8472 30 µl G8471 蛍光リガンド（No-wash プロトコル用） HaloTag® R110Direct™ Ligand 498 528 30 µl G3221 HaloTag® TMRDirect™ Ligand 552 578 30 µl G2991 機能性蛍光リガンド HaloTag® AcidiFluor Orange（pH センサー） 520 565 30 nmol GCKGC310-01 60 nmol GCKGC310-02 HaloTag® HPF（ROS センサー） 490 515 お問合せください HaloTag® APF（ROS センサー） 490 515 お問合せください HaloTag® CaSiR（Ca センサー） 650 664 お問合せください ビオチンリガンド HaloTag® Biotin Ligand 15 µl G8282 30 µl G8281 HaloTag® PEG-Biotin Ligand（細胞膜非透過性） 15 µl G8592 30 µl G8591 未標識リガンド 研究目的に応じて、新たな蛍光リガンドを作成する場合などに利用できます。また固相にカップリングさせている例などもあります。反応法は、各製品シートをご覧ください。 O2 と O4 の違いは、反応基と HaloTag® 結合基の間のエーテル結合数の違いです。 HaloTag® Amine (O4) Ligand 5 mg P6741 HaloTag® Succinimidyl Ester (O4) Ligand 5 mg P6751 HaloTag® Iodoacetamide (O4) Ligand 5 mg P6771 HaloTag® Succinimidyl Ester (O2) Ligand 5 mg P1691 HaloTag® Amine (O2) Ligand 5 mg P6711 NEW NEW 19 HaloTag® イメージングと捕捉のために 蛍光リガンドによる迅速 SDS-PAGE HaloTag® Ligand（in vitro use） ■■ 蛍光標識 SDS-PAGE 解析 生細胞内で発現した HaloTag® タンパク質を蛍光リガンドで標識後、調製したライセートをそのまま SDS-PAGE に供し、迅速に融合タン パク質を蛍光検出することができます。HaloTag® タンパク質とリガンドの結合は強固（共有結合）であるため、SDS 共存下、95℃、5 分 間の処理を行っても解離することが無く、定量的に解析することができます。 HaloTag® r2 = 1.0 r2 = 0.98 0 2,000,000 4,000,000 6,000,000 8,000,000 0 0.5 1 1.5 2 pmol RFU GST-HaloTag® HaloTag® HaloTag® リガンドと Anti-HaloTag® pAb による HaloTag® 融合タンパク質 の標識 p65-HaloTag® コンストラクトを安定にトランスフェクションした HEK293 細胞を HaloTag® TMR Ligand で標識 後に固定した。さらに Anti-HaloTag® pAb および Alexa Fluor® 488-conjugated anti-rabbit-IgG で標識した。パネル A. HaloTag® TMR Ligand 標識。 パネル B. Anti-HaloTag® pAb 標識。パネル C. 重ね合わせ像 ウエスタンブロッティングにおける HaloTag® Monoclonal Antibody の免疫反応性 EZH2-HaloTag® （～ 120kDa）を発現した HEK293Tライゼートでウエスタン 分析を行った。HaloTag® Monoclonal Antibody（1000 倍 希 釈 ）、AP 標 識 2 次抗体を用いてウエスタン分析を行った。 製品名 サイズ カタログ番号 HaloTag® 融合 GST HaloTag® Standard Protein 30 µg G4491 HaloTag® Ligand の価格については前ページ をご覧ください。 製品名 サイズ カタログ番号 ポリクローナル抗体 Anti-HaloTag® pAb 200 µg G9281 モノクローナル抗体 Anti-HaloTag® Monoclonal Antibody 200 µg G9211 10517TA M 1 2 220 120 100 80 60 50 kDa EZH2-HaloTag® fusion protein GST-HaloTag® 2600 pg 1300 pg 660 pg 330pg 170 pg 85 pg 40 pg 20 pg 10 pg 5 pg HaloTag® 62 kDa→ 33 kDa→ HaloTag® タンパク質のゲル分析 GST-HaloTag® タンパク質は FAM ligand で、HaloTag® タンパク質は TMR ligand で標識した。 標識タンパク質の直線的な標準曲線 免疫染色、ウエスタンブロッティング HaloTag® 抗体 HaloTag® ■ 従来法でも発現確認が可能 HaloTag® に対するモノクローナル抗体の Anti-HaloTag® Monoclonal Antibody（マウスモノクローナル抗体）はウエスタン分析に使用で き、HaloTag® 以外のタンパク質に対する交差反応性はほとんど ありません。 ポリクローナル抗体の Anti-HaloTag® pAb（精製ウサギポリクロー ナル抗体）は細胞免疫染色などその他の実験に使用できます。 HaloTag® タンパク質は哺乳動物、植物、大腸菌には内在しません が、大腸菌および哺乳動物細胞抽出液で低い交差性反応が認め られます。 20 HaloTag® イメージングと捕捉のために HaloTag® Puri cation System の簡便な操作ステップ 全ての HaloTag® ベクターにはリンカー配列として TEV プロテ アーゼ認識サイト [ENLYFQ↓G] をコードする配列が含まれる ため、タグを含まない標的タンパク質のみの精製が容易に行 えま す。His タグと同様の金属結合タグである HQ タグ （HQHQHQ）が付加された TEV プロテアーゼは、HisLink™ レ ジンにより除くことができます。 8064MA HaloTag® coding region POI HaloLink™ Resin HaloLink™ Resin上への HaloTag®-融合タンパク質 (POI: protein of interest) の固定 HQ-タグ付き TEV Protease によるPOI の遊離 POI HaloLink™ Resin POI HisLink™ Resinによる TEV Proteaseの除去 タグの無いPOI の回収 POI HisLink™ Resin TEV Protease Protein of interest Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 POI 0 20 40 60 80 HaloTag® Frequency of soluble proteins (%) high solubility medium solubility GST MBP His Activity of purified cPKA 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 cPKA activity (units/µg) Without correction Corrected for relative purity HaloTag® GST MBP His 発現融合タンパク質の可溶性比較 難溶性タンパク質を含む 100 種類のタンパク質の中で可溶性タンパク質として回収さ れた割合を示す。high solubility: >100µg/ml, medium solubility: <100µg/ml 発現融合タンパク質の活性比較（cPKA 活性） PKA の活性触媒領域（cPKA）を各タグに融合させたものを、大腸菌を用いて発現さ せた。各タグを用いてプルダウンにより精製したタンパク質の活性を測定した（オレン ジ）。それぞれ精製度が異なるため（HaloTag® ; 99%, GST; 77%, MBP; 50%, His; 98%）、 活性を精製度で補正した（赤）。HaloTag® 融合タンパク質は最も精製度が高く、なお かつ高い酵素活性があった。 製品名 サイズ カタログ番号 大腸菌からの精製システム HaloTag® Protein Puri cation System Sample Pack 50 ml culture 2.5 回分 G6270 HaloTag® Protein Puri cation System 50 ml culture 25 回分 G6280 関連製品 Single Step（KRX）Competent Cells, >10⁸ cfu/µg 20 × 50 µl L3002 ProTEV Plus 1,000 u V6101 8,000 u V6102 内　容：G6270 •HaloLink™ Resin（10ml [25% slurry]） •HisLink™ Protein Puri cation Resin（10ml [50% slurry]） •TEV Protease for use with HisLink™ Resin（200µl） タンパク質精製：タグフリーのタンパク質を取得 HaloTag® Protein Puri cation ■ 大腸菌からの HaloTag® 融合タンパク質精製 HaloTag® Protein Puri cation System は大腸菌で発現させた HaloTag® 融合タンパク質の精製用にデザインされています。HaloTag® は組換え タンパク質の発現量および可溶性を増加させ、目的のタンパク質を効率的、特異的、かつ共有結合により強力に捕捉することができます。 TEV プロテアーゼを用いることで HaloLink™ Resin より標的タンパク質を切り離すことができ、TEV プロテアーゼの N 末端には HQ タグ が付加されているので HisLink™ Resin を用いて容易にプロテアーゼを除去することもできます。HaloTag® タンパク質をコードし、大腸菌 での発現に適したベクターは、pFN18A HaloTag® T7 Flexi® Vector（カタログ番号 G2751）および pFN18K HaloTag® T7 Flexi® Vector（カタロ グ番号 G2681）です（キットには付属しません）。 HaloTag® 各種 機能性タグの比較 特長 HaloTag® GST MBP His GFP サイズ 33kDa 26kDa 40kDa 0.85kDa 27kDa 可溶性 高 高 高 中 － リガンド 親和性 高：リガンド 特異的な 共有結合 中：アフィニ ティー（グル タチオン） 中：アフィニ ティー（アミ ロース） 低：メタルア フィニティー （IMAC） － 検出 Coomassie、 ウエスタン、 蛍光リガンド Coomassie、 ウエスタン、 発色アッセイ Coomassie、 ウエスタン Coomassie、 ウエスタン、 ゲル内染色 Coomassie、 ウエスタン、 蛍光 その他の 用途 タンパク質間 相互作用、 細胞イメー ジング タンパク質間 相互作用 タンパク質間 相互作用 タンパク質間 相互作用 細胞 イメージング 21 HaloTag® イメージングと捕捉のために 9667TB HaloTag® FLAG® 3xFLAG® His6 tag HaloTag® FLAG® 3xFLAG® His6 tag PKCγ PI3Kγ kDa 150 75 50 37 86 60 52 31 88 40 58 33 % Recovery ≥95 74 77 34 ≥95 45 50 21 % Purity HaloTag® およびその他のタンパク質タグの精製効率の比較 2 つのタンパク質（PKC γ、PI3K γ）の精製において HaloTag® の回収率および純度は FLAG® タグおよび His タグよりも優れていた。また、HaloTag® で精製したキナーゼは 活性も有していた。 Ohana, R.F. et al. （2011） HaloTag-based purification of functional human kinases from mammalian cells. Protein Expr. Purif. Apr; 76（2）: 154-64. レジン担体と磁性体ビーズの特徴 製品名 サイズ カタログ番号 哺乳動物細胞からの精製システム HaloTag® Mammalian Protein Puri cation System 1 システム G6790 HaloTag® Mammalian Protein Detection and Puri cation System 1 システム G6795 HaloTag® Mammalian Protein Detection and Puri cation System Sample Pack 1 システム G6799 プロテアーゼ（タグの切除） HaloTEV Protease 200 µl G6601 800 µl G6602 9532MA HaloTag® protein POI POI HaloLink™ Resin HaloLink™ Resinへの HaloTag® 融合タンパク質 (POI)の共有結合 HaloLink™ Resinに 共有結合した状態の HaloTEV Proteaseが POI を切除 HaloLink™ Resin POI POI 精製された 目的タンパク質 の回収 HaloTEV Protease Protein of Interest HaloTag® Mammalian Protein Puri cation System の操作 HaloTag® を用いたタンパク質精製・プルダウンのコツ • HaloTag® はもともと酵素であり、SDS を含む溶解バッファーを用い るとリガンド結合能を失います。細胞溶解時はマニュアル記載の 溶解バッファーを使用し、リガンドと結合させるまでは変性条件に おかないでください。 • HaloTag® とリガンドは共有結合します。一旦 HaloTag® 融合タンパ ク質を担体に結合させると、SDS-PAGE 用のサンプルバッファーで ボイルしても外れません。担体から目的タンパク質を回収する際は、 TEV プロテアーゼ処理を行い HaloTag® を切り離す必要があります。 HaloLink™ Magnetic Beads: HaloTag® リガンドでコートした磁性体 粒子。 粒子サイズ : 10 ~125µm 結合容量：＞ 10mg/ml（沈殿ビーズ） HaloLink™ Resin: HaloTag® リガンドでコートしたセファ ロースレジン。 粒子サイズ : 45 ~165µm 結合容量：＞ 7mg/ml（沈殿レジン） 製品名 サイズ カタログ番号 捕捉・精製用レジン担体および磁性体ビーズ HaloLink™ Resin 1.25ml （5ml）* G1912 2.5ml （10ml）* G1913 10ml （40ml）* G1914 25ml （100ml）* G1915 Magne™ HaloTag® Beads 200µl （1ml）* G7281 1ml （5x1ml）* G7282 *（）内はレジンあるいはビーズを懸濁した場合の総ボリューム ■ 動物培養細胞からの HaloTag® 融合タンパク質精製 HaloTag® Mammalian Protein Puri cation System は、動物培養細胞で発現させた HaloTag® 融合タンパク質の精製用にデザインされています。 HaloTag® 融合タンパク質は HaloLink™ Resin と効率的、特異的に共有結合を形成し、哺乳動物培養細胞での発現レベルが低い場合でも 非常に高い純度、収率で精製することができます。HaloTag® Mammalian Protein Detection and Puri cation System（カタログ番号 G6795, G6799）には HaloTag® 染色用の HaloTag® TMRDirect™ Ligand が付属し、簡便に HaloTag® 融合タンパク質を蛍光検出できるため、発現・ 精製条件の最適化を迅速に行うことができます。システムに付属する HaloLink™ Resin の結合容量は HaloTag® 融合タンパク質 >7mg/ml （FLAG® の約 10 倍）で、回収率も通常 >75% です。非特異的な結合も非常に少なく（<0.1%）高純度のタンパク質を精製することができ ます。付属の HaloTEV Protease は HaloTag® 融合タンパク質から HaloTag® を切断するとともに HaloLink™ Resin と結合するため、回収した 目的タンパク質溶液からの除去は必要ありません。 22 HaloTag® イメージングと捕捉のために 安心国内受託サービス（かずさ DNA 研究所） ヒト ORF クローン販売・発現ベクター構築・安定発現株作製受託サービス ■ NanoLuc® ・HaloTag® 実験をすぐに始めたい方に、10,000 種以上のタグ融合済みヒト ORF クローン 長鎖に特化したかずさ cDNA コレクション（> 4,000 クローン）と 幅広いラインナップの OC（The ORFeome Collaboration）ORF コレ クションの 2 つのリソースをベースとした独自のクローンリソース を、NanoLuc® Flexi® ベクター（pFN31K または pFC32K）、HaloTag® Flexi® ベクター（pFN21A、25 ページ参照）に導入したクローンを 提供しています。10,000 種以上のヒト ORF から選択可能であり、 ORF は他の Flexi® Vector へ容易に移し換えできます。 • 購入時の面倒な書類記入は不要 • オンラインで見積り兼注文用紙を自動発行 • 大学、公的研究機関はもちろん、企業における面倒なライセンス 契約も不要 • かずさ DNA 研究所で製造、繊細な要望や相談も日本語で安心 製品名 サイズ カタログ番号 Flexi® HaloTag® Clone 1 クローン FHCxxxxx Flexi® NanoLuc® Clone 1 クローン FNCxxxxxN または C 大量調製 改変サービス 実験受託サービス 遺伝子の完全長化、修復 クローン クローン各種の標準容量は 100ngですが、10µg、50µg、100µg に増量するこ とができます。それ以上の増量についてもご相談いただけます。 タグの付け換え、遺伝子変異導入、他の Flexi® ベクターへの ORF 移し替え、 発現ベクター の構築及びその発現確認（動物細胞、大腸菌、In Vitro）など HaloTag® を利用した各種実験（タンパク質精製、プルダウン、発現解析）、ツー ルの提供など 公共データベースの最新情報をもとに 、既存の Flexi® ORF Clone に含まれる遺 伝子を完全長化し、アップデートされた ORF クローンとしてご提供いたします。 www.kazusa.or.jp/kop/dsearch/ クローン検索 クローンに伴う有料オプションサービス ■ NaoLuc® ・HaloTag® 融合標的遺伝子の安定発現株作製：ヒト染色体由来人工染色体（HAC）を導入した TrueSTABLE™ Cell ヒト人工染色体（HAC）に任意の ORF、タグ、プロモーターを挿 入し、目的の細胞株に導入することで安定発現株を作製します。 HAC は宿主の染色体とは独立して存在するためゲノムが傷つか ず、本来の染色体が持つ機能が保持されます。また、HAC に導 入される標的遺伝子はコピー数も 1コピーで安定的に長期間保た れます。 下記のような実験に特に有益です。 • 自然な状態に近い量のリコンビナントタンパク質の機能・PPI を調べ たい（過剰発現によるアーティファクトを極力排除したい） • 比較対象同士（野生型 vs 変異型 etc.）の条件をなるべく揃えたい（同 じ挿入部位・コピー数同士の比較が可能） • 長期間にわたる現象に関わるタンパク質機能を解析したい 遺伝子・細胞の種類 タグの種類 タグの位置 プロモーターの種類 評価系 安定発現株作製における選択肢（例） Flexi® ORF Clone & HEK293 cell HaloTag®、NanoLuc®、HiBiT N 末端、C 末端 CMV、EF-1 • ライゼートを用いたタグタンパク質の検出 • SDS-PAGE によるサイズ解析 • 細胞内局在（HaloTag® 使用の場合、または 一部の膜タンパク質と分泌型タンパク質） www.promega.co.jp/truestablecell/ 受託サービスの詳細、お見積り 23 タグ融合タンパク質の発現 Flexi® Vector、またはマルチクローニングサイトつきベクター 融合タンパク質発現ベクター ■ ベクター単品（容量はすべて 20 µg） 製品名 マルチ クローニング サイト 発現用 プロモーター 融合遺伝子 （＋融合パートナー） 蛋白質分解 / 分泌配列 動物細胞選択 マーカー （大腸菌選択マーカー） カタログ 番号 NanoLuc® 融合タンパク質発現ベクター 哺乳動物発現 pFN31A Nluc CMV-Hygro Flexi® Vector Flexi® CMV Nluc（N 末端） No Hygro（Amp） N1311 pFN31K Nluc CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV Nluc（N 末端） No Neo（Kan） N1321 pFC32A Nluc CMV-Hygro Flexi® Vector Flexi® CMV Nluc（C 末端） No Hygro（Amp） N1331 pFC32K Nluc CMV-neo Flexi Vector Flexi® CMV Nluc（C 末端） No Neo（Kan） N1341 pNLF1-N[CMV/Hygro]Vector Yes CMV Nluc（N 末端） No Hygro N1351 pNLF1-C[CMV/Hygro]Vector Yes CMV Nluc（C 末端） No Hygro N1361 pNLF1-secN[CMV/Hygro]Vector Yes CMV Nluc（N 末端） IL-6 Hygro N1371 HiBiT 融合タンパク質発現ベクター 哺乳動物細胞 pFC37K HiBiT CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV HiBiT No Neo（Kan） N2391 pFN38K HiBiT CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV HiBiT No Neo（Kan） N2401 pFN39K secHiBiT CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV HiBiT IL-6 Neo（Kan） N2411 pBiT3.1-N [CMV/HiBiT/Blast] Vector Yes CMV HiBiT No Neo（Kan） N2361 pBiT3.1-C [CMV/HiBiT/Blast] Vector Yes CMV HiBiT No Neo（Kan） N2371 pBiT3.1-secN [CMV/HiBiT/Blast] Vector Yes CMV HiBiT IL-6 Neo（Kan） N2381 HaloTag® 融合タンパク質発現ベクター※ 哺乳動物発現 pFC14A HaloTag® CMV Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （C 末端） No （Amp） G9651 pFC14K HaloTag® CMV Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （C 末端） No （Kan） G9661 pFC15A HaloTag® CMVd1 Flexi® Vector Flexi® CMV d1（強） HaloTag® （C 末端） No （Amp） G1611 pFC15K HaloTag® CMVd1 Flexi® Vector Flexi® CMV d1（強） HaloTag® （C 末端） No （Kan） G1601 pFC16A HaloTag® CMVd2 Flexi® Vector Flexi® CMV d2（中） HaloTag® （C 末端） No （Amp） G1591 pFC16K HaloTag® CMVd2 Flexi® Vector Flexi® CMV d2（中） HaloTag® （C 末端） No （Kan） G1571 pFC17A HaloTag® CMVd3 Flexi® Vector Flexi® CMV d3（弱） HaloTag® （C 末端） No （Amp） G1551 pFC17K HaloTag® CMVd3 Flexi® Vector Flexi® CMV d3（弱） HaloTag® （C 末端） No （Kan） G1321 pFN21A HaloTag® CMV Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （N 末端） No （Amp） G2821 pFN21K HaloTag® CMV Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （N 末端） No （Kan） G2831 pFN22A HaloTag® CMVd1 Flexi® Vector Flexi® CMV d1（強） HaloTag® （N 末端） No （Amp） G2841 pFN22K HaloTag® CMVd1 Flexi® Vector Flexi® CMV d1（強） HaloTag® （N 末端） No （Kan） G2851 pFN23A HaloTag® CMVd2 Flexi® Vector Flexi® CMV d2（中） HaloTag® （N 末端） No （Amp） G2861 pFN23K HaloTag® CMVd2 Flexi® Vector Flexi® CMV d2（中） HaloTag® （N 末端） No （Kan） G2871 pFN24A HaloTag® CMVd3 Flexi® Vector Flexi® CMV d3（弱） HaloTag® （N 末端） No （Amp） G2881 pFN24K HaloTag® CMVd3 Flexi® Vector Flexi® CMV d3（弱） HaloTag® （N 末端） No （Kan） G2981 pFC27A HaloTag® CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （C 末端） No Neo（Amp） G8421 pFC27K HaloTag® CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （C 末端） No Neo（Kan） G8431 pFN28A HaloTag® CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （N 末端） No Neo（Amp） G8441 pFN28K HaloTag® CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （N 末端） No Neo（Kan） G8451 pHTC HaloTag® CMV-neo Vector Yes CMV HaloTag® （C 末端） No Neo（Amp） G7711 pHTN HaloTag® CMV-neo Vector Yes CMV HaloTag® （N 末端） No Neo（Amp） G7721 大腸菌発現 pFN18K HaloTag® T7 Flexi® Vector Flexi® T7 HaloTag® （N 末端） No Kan G2681 pFN18A HaloTag® T7 Flexi® Vector Flexi® T7 HaloTag® （N 末端） No Amp G2751 pFN29K His6HaloTag® T7 Flexi® Vector Flexi® T7 HaloTag® , 6xHis（N 末端） No Kan G8331 pFN29A His6HaloTag® T7 Flexi® Vector Flexi® T7 HaloTag® , 6xHis（N 末端） No Amp G8261 pFC30K His6HaloTag® T7 Flexi® Vector Flexi® T7 HaloTag® , 6xHis（C 末端） No Kan G8381 pFC30A His6HaloTag® T7 Flexi® Vector Flexi® T7 HaloTag® , 6xHis（C 末端） No Amp G8321 pH6HTN His6HaloTag® T7 Vector Yes T7 HaloTag® , 6xHis（N 末端） No Amp G7971 pH6HTC His6HaloTag® T7 Vector Yes T7 HaloTag® , 6xHis（C 末端） No Amp G8031 無細胞発現 pFN19K HaloTag® T7 SP6 Flexi® Vector Flexi® T7, SP6 HaloTag® （N 末端） No Kan G1841 pFN19A HaloTag® T7 SP6 Flexi® Vector Flexi® T7, SP6 HaloTag® （N 末端） No Amp G1891 pFC20K HaloTag® T7 SP6 Flexi® Vector Flexi® T7, SP6 HaloTag® （C 末端） No Kan G1691 pFC20A HaloTag® T7 SP6 Flexi® Vector Flexi® T7, SP6 HaloTag® （C 末端） No Amp G1681 ※ HaloTag® 融合ベクターはリンカー部分に TEV プロテアーゼ認識サイトを含むため、タグの切除が可能です。 ● Flexi® システムについては 25 ページをご覧ください。 NanoBRET™ については 7 ページ、NanoBiT® については 8 ぺージの各 Starter System（ベクターセット）をご覧ください。 24 タグ融合タンパク質の発現 ■ HaloTag® ベクターセット CMV Deletion Series Sampke Pack（ カタログ番号 G3780）には、 pFC14K, pFC15K, pFC16K, pFC17K, pFN21A, pFN21K, pFN22K, pFN23K, pFN24K の各ベクターが 2 µg ずつ含まれます。 また、 G6050 には上記の G3780 および クローニング用の試薬 Flexi® System, Entry/Transfer （C8640）, Carboxy Flexi® Enzyme Blend （Sgf I and EcoICR I：R1901）が含まれます。 7549MA pFN21A (HaloTag®) CMV Flexi ® Vector (5064bp) Ampr ori SgfI PmeI cer SV40 late poly(A) signal Barnase T7 HaloTag® 7 Open Reading Frame TEV site CMV Enhancer/ Promoter intron 製品名 サイズ カタログ番号 HaloTag® Flexi® Vectors – CMV Deletion Series Sampke Pack 9 × 2 µg G3780 HaloTag® Cloning Starter System 1 システム G6050 HaloTag® 融合タンパク質発現ベクターの発現エレメント領域 7679MA 1,000 10,000 100,000 1,000,000 10,000,000 Firefly Luciferase Expression (RLU) CHO HEK293 U2OS NIH3T3 HeLa 10,000 100,000 1,000,000 10,000,000 100,000,000 Renilla Luciferase Expression (RLU) CMV CMVd1 CMVd2 CMVd3 CMV CMVd1 CMVd2 CMVd3 A. CMVB.プロモーターの段階的削除による発現レベルへの影響 ホタルルシフェラーゼ遺伝子を各ベクターに組み込み、その発現量を比較した。CHO 細胞以外では CMV プロモーター領域を段階的に削除することで発現量が抑制される ことが示された。発現レベルは CMV> CMV d1> CMV d2 > CMV d3。 7678MA pFC15, pFC16, pFC17 CMVd T7 SP6 ORF ORF Intron T7 SV40pA SV40pA pFC14 CMV HaloTag® 7 pFN21 pFN22, pFN23, pFN24 ORF ORF RBS RBS HaloTag® 7 HaloTag® 7 HaloTag® 7 SV40pA CMVd T7 SP6 SV40pA CMV Intron T7 NFκB SP1 SP1 T7 SP6 Cloned gene –116 –67 –59 CMVd1 CMVd2 CMVd3 TATA CREB Flexi® CMV Vectors Flexi® T7(SP6) Vectors CMV Promoter pFN19 ORF RBS pFN18 ORF RBS HaloTag® T7 7 A30 T7 ter HaloTag® T7 SP6 7 A30 T7 ter pFN20 ORF RBS HaloTag® T7 SP6 7 A30 T7 ter 7678MA pFC15, pFC16, pFC17 CMVd T7 SP6 ORF ORF Intron T7 SV40pA SV40pA pFC14 CMV HaloTag® 7 pFN21 pFN22, pFN23, pFN24 ORF ORF RBS RBS HaloTag® 7 HaloTag® 7 HaloTag® 7 SV40pA CMVd T7 SP6 SV40pA CMV Intron T7 NFκB SP1 SP1 T7 SP6 Cloned gene –116 –67 –59 CMVd1 CMVd2 CMVd3 TATA CREB Flexi® CMV Vectors Flexi® T7(SP6) Vectors CMV Promoter pFN19 ORF RBS pFN18 ORF RBS HaloTag® T7 7 A30 T7 ter HaloTag® T7 SP6 7 A30 T7 ter pFN20 ORF RBS HaloTag® T7 SP6 7 A30 T7 ter 7678MA pFC15, pFC16, pFC17 CMVd T7 SP6 ORF ORF Intron T7 SV40pA SV40pA pFC14 CMV HaloTag® 7 pFN21 pFN22, pFN23, pFN24 ORF ORF RBS RBS HaloTag® 7 HaloTag® 7 HaloTag® 7 SV40pA CMVd T7 SP6 SV40pA CMV Intron T7 NFκB SP1 SP1 T7 SP6 Cloned gene –116 –67 –59 CMVd1 CMVd2 CMVd3 TATA CREB Flexi® CMV Vectors Flexi® T7(SP6) Vectors CMV Promoter pFN19 ORF RBS pFN18 ORF RBS HaloTag® T7 7 A30 T7 ter HaloTag® T7 SP6 7 A30 T7 ter pFN20 ORF RBS HaloTag® T7 SP6 7 A30 T7 ter HaloTag® N Terminal Amp HT Amp HaloTag® C Terminal Barnase HT Kan Kan Amp Amp Kan Kan Target Gene 制限酵素消化 ライゲーション Kan によるセレクション Flexi® ベクターは、低頻度出現の制限酵素（レアカッター）Sgf I、 Pme I および EcoICRI を利用することでシンプルなダイレクショ ナルクローニングを可能にし、広範な機能性ベクターにより様々 なタンパク質機能解析に利用することができます。致死遺伝子 バーナーゼ（Barnase）および抗生物質耐性遺伝子（Amp-Kan） によるポジティブセレクションにより効率的なクローニングが行 えます。シンプルな工程で迅速にクローニングでき、正確性が 高くORF を移し換えた後の配列確認の必要もありません。 Flexi® システム：方向性、読み枠を維持したサブクローニング Flexi® ベクターシステムによる簡便な移し換え例（N 末融合→ C 末融合） この図では、N 末端側に HaloTag® が融合しているベクター（たとえば、Flexi HaloTag® クローン）から HaloTag® を C 末端側に融合するタイプへ変更する場合の移し換え例 を示しています。移し換える先の Flexi® ベクターには、Barnase 遺伝子（大腸菌に対 して毒性を持つ）が組み込まれており、この配列を含むプラスミドは大腸菌内では 増幅されません。Target Gene, Barnase を制限酵素で切り出した後、ベクター、断片 を精製せずに、両者を混合してライゲーションします。4 種類の組み合わせのプラス ミドができますが、アンピシリン（Amp）、カナマイシン（Kan）の選択マーカー、 Barnase の有無により、目的のプラスミドだけを選択して取得できます。 25 タグ融合タンパク質の発現 より詳細な情報 CRISPR / Cas9 ゲノム編集による HiBiT ノックインプロトコル 内在遺伝子への HiBiT 配列付加 HiBiT のクローニング ゲノム編集による HiBiTノックイン ■ 簡便な検出法でノックイン細胞のクローニングも効率的 HiBiT 配列は 33 塩基にコードされる極小のペプチドタグ（11 アミノ酸）であり、従来法のように HiBiT ベクターへ目的遺伝子をクローニング するだけでなく、ゲノム編集による内在遺伝子への付加にも最適です。CRISPR / Cas9 ゲノム編集技術を用いて内在ローカスに HiBiT 配列 を導入することにより、強力なプロモーターで一過的に過剰発現させる場合に比べ多くの場合応答性が向上し、ありのままのタンパク 質発現解析が可能になります。 人工合成した HiBiT 配列のクローニング HiBiT 配列は短いため人工遺伝子合成が低コストで実施でき、手持ちの標的遺伝子発現クローンに組み込む断片が容易に得られます。 配列の人工合成を行う前に、Web上で行う簡単な利用登録が必要です（上記ゲノム編集による HiBiTノックインの手順 1をご参照ください）。 ① ライセンス確認登録 www.promega.co.jp/nanobitsynthesis/ HiBiT 配列（33 bases）の利用には Web 上での簡単な利用者登 録（ライセンス内容の承認）が必要です。費用は一切かかり ません。ご登録後に塩基配列ならびにアミノ酸配列を記した メールをお送りします。 ② ゲノム上のターゲット配列確認 ③ crRNA のデザインおよびガイド RNA（crRNA + tracrRNA）の デザイン及び発注 例）Alt-R CRISPR-Cas9 System（ IDT 株式会社 ） ④ HiBiT Donor DNA template のデザインおよび発注 ⑤ RNP、ドナー DNA の細胞への導入 ⑥ゲノム編集効果の確認 培養に試薬（Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System）を添加す ると発光反応が始まり、ルミノメーターで容易に検出できます。 煩雑な確認作業（制限酵素処理や電気泳動など）は不要です。 手順 14511MA 5′ Exon Exon Exon 3′ UTR 3′ Single-Stranded Oligodeoxynucleotide ~80nt Homology Arm HiBiT Stop Codon Homology Arm 5′ 33nt HiBiT Sequence TGA ~80nt 3′ ※ Linker は考慮していない。 制限酵素配列 HiBiT 配列 制限酵素配列 Forward ：NNNNNXXXXXXNNNNNNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXNNNNNNXXXXXXNNNNN Reverse ：NNNNNXXXXXXNNNNNNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXNNNNNNXXXXXXNNNNN 各発現コンストラクトによる応答性の違い HeLa 細胞に CMV または PGK プロモーターを含む HIF1A-HiBiT 発現コンストラクトを 一過的にトランスフェクションまたは CRISPR/Cas9 により内在ローカスに HiBiT を導 入し、1,10-フェナントロリンによる応答性を調べた。 14287MA 1 10 100 Normalized Luminescence (RLU) 50ng CMV/HIF1A-HiBiT 5ng CMV/HIF1A-HiBiT 0.5ng CMV/HIF1A-HiBiT 0.05ng CMV/HIF1A-HiBiT 5ng PGK/HIF1A-HiBiT Endogenous HIF1A-HiBiT clone Log10[1,10-phenanthroline], M 0 –7 –6 –5 oligo のデザイン例 www.promega.co.jp/pdf/ hibitquick_guide.pdf より詳細な情報 HiBiT 実験クイックスタートガイド www.promega.co.jp/hibitcrispr/ 試薬添加 発光値測定 4-10 min LgBiT HiBiT 26 タグ融合タンパク質の発現 トランスフェクション試薬 ViaFect™ Transfection Reagent ■ 血清・抗生物質存在下でも導入可能、動物由来成分不含 ViaFect™ Transfection Reagent は細胞の生存性を損なうことなく幅広い細胞タイプのトランスフェションを高効率で行うことができます。 細胞を健全な状態に保ち、代謝活性も損ないません。 汎用される付着細胞や細胞内シグナリング研究で重要な浮遊細胞だけでなく、 幹細胞から分化した細胞を用いる場合でも生物システムに近いアッセイをデザインすることができます。使用前に血清や培地を除く必 要のない簡便なプロトコルであり、試薬 /DNA複合体を導入した後も洗浄や培地交換は不要です。最小限の最適化で非常に優れたパフォー マンスを提供し、ご自身が研究する生物システムのモデルとなる最適な細胞で、適切なアッセイをデザインすることができます。 エレクトロポレーションと ViaFect™ を用いたレポーターアッセイの比較： TF-1 細胞（造血細胞モデル）に pGL4.32［luc2P/NF- κ B-RE/Hygro］ Vector（NF- κ B 応答配 列を含むルシフェラーゼレポーター）を ViaFect™ Transfection Reagent または Amaxa Nuclefector® II（エレクトロポレーション）を用いてトランジェントにトランスフェク ションした。TNF αで 6 時間 刺激した後に応答を Bio-Glo™ Luciferase Reagent を用い て測定した。 12105MA Luminescence (RLU) log[TNFα], ng/ml 0 –4 –2 0 2 20,000 40,000 60,000 80,000 ViaFect™ Transfection Reagent Amaxa T01 protocol 12645TA A. B. C. ViaFect™ によるヒト iPS 細胞への効率的なトランスフェクション Cellular Dynamics 社の iCell® ヒト組織細胞を 96 ウェルプレートに播種したものを用い て実験を行った。A. iCell® 肝細胞に ViaFect™ を用いて試薬：DNA 比 6:1 で GFP レポー タープラスミドをトランスフェクションし、トランスフェクション 1 日後に GFP の発現 をイメージングした。B. iCell® 心筋細胞に ViaFect™ を用いて試薬：DNA 比 2:1 で GFP レポータープラスミドをトランスフェクションし、トランスフェクション 1 日後に GFP の発現をイメージングした。C. iCell® ドーパミン作動性神経細胞に ViaFect™ を用いて 試薬：DNA 比 4:1 で GFP レポータープラスミドをトランスフェクションし、トランスフェ クション 3 日後に GFP の 発 現をイメージングした。デー タは Cellular Dynamics International のご厚意により掲載。 製品名 サイズ カタログ番号 ViaFect™ Transfection Rreagent 0.75ml E4981 2 × 0.75ml E4982 ※ 0.75ml は 24 ウェルプレートで約 500 ウェル分のトランスフェクションに十分な量です。 初代培養細胞での実績 初代培養細胞 動物種 文献 臍帯静脈血管内皮細胞 （HUVEC） ヒト Yokota, Y. et al. (2015) Endothelial Ca2+ oscillations re ect VEGFR signaling-regulated angiogenic capacity in vivo. eLife 4, e08817. ケラチノサイト ヒト Nakmura, T. et al. (2014) Epipro n orchestrates epidermal keratinocyte proliferation and differentiation. J. Cell Sci. 127, 5261–72. 腎近位 尿細管 上皮細胞 ヒト Bethge, T. et al. (2015) Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. J. Virol. 89, 3396–411. 線維芽細胞 ヒト Takahasi, M. et al. (2015) Normalization of overexpressed α -synuclein causing Parkinson’s disease by a moderate gene silencing with RNA interference. Mol. Ther. Nucleic Acids 12, e241. 栄養膜細胞 ヒト Straka, E. et al. (2016) Mercury toxicokinetics of the healthy human term placenta involve amino acid transporters and ABC transporters. Toxicology 340, 34–42. 皮質ニューロン マウス Egusa, S.F. et al. (2016) Classic cadherin expressions balance postnatal neuronal positioning and dendrite dynamics to elaborate the speci c cytoarchitecture of the mouse cortical area. Neurosci. Res. 105, 49–64. 胎児線維芽細胞 マウス Peng, Y. et al. (2016) AGE-RAGE signal generates a speci c NF- κ B RelA “barcode” that directs collagen I expression. Sci. Rep. 6, 18822. 骨髄由来マクロファージ マウス Naujoks, J. et al. (2016) IFNs modify the proteome of Legionella-containing vacuoles and restrict infection via 肺胞マクロファージ IRG1-derived itaconic acid. PLoS Pathogens 12, e1005408. 生殖系列幹細胞 マウス Huang, Y. et al. (2015) Speci c tandem 3’UTR patterns and gene expression pro les in mouse Thy1+ 内皮線維芽細胞 germline stem cells. PLoS One 10, e0145417. 大動脈平滑筋細胞 ラット Horita, H. et al. (2016) Nuclear PTEN functions as an essential regulator of SRF-dependent transcription to control smooth muscle differentiation. Nat. Comm. 7, 10830. 27 タグ融合タンパク質の発現 内容 使用製品 掲載ページ 文献著者・タイトル タンパク質の安定性 NanoLuc® Stability Sensors for Cell Signaling 5 Hall, M.P., et al. (2012) Engineered luciferase reporter from a Deep Sea Shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem. Biol. 7, 1848-57. Narvaez, A.J., et al. (2017) Modulating protein-protein interaction of the mitotic Polo-like kinases to target mutant KRAS. Cell Chem. Biol. 24, 1017-28. タンパク質 – タンパク質相互作用 NanoBRET™ 6 Machleidt, T., et al. (2015) NanoBRET–A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interaction. ACS Chem. Biol. 10, 1797-804. Miyakawa, K., et al. (2017) The tumour suppressor APC promotes HIV-1 assembly via interaction with Gag precursor protein. Nature Comm. 8, 14259. タンパク質 – タンパク質相互作用 NanoBiT® 8 Dixon, A.S., et al. (2016) NanoLuc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chem. Biol. 11, 400-8. BRET ベースバイオセンサー Nano-Glo® Luciferase Assay Substrate 9 Yoshida, T., Kakizuka, A. and Imamura, H. (2016) BTeam, a novel BRET-based biosensor for the accurate quantication of ATP concentration within living cells. Sci. Reports 6, 39618. Yang, J. et al. (2016) Coupling optogenetic stimulation with NanoLuc-based luminescence (BRET) Ca++ sensing. Nature Comm. 7, 13268. ウイルス粒子の侵入と 放出の定量 Nano-Glo® HiBiT Blotting System 10 Sasaki M., et al (2018) Development of a rapid and quantitative method for the analysis of viral entry and release using a NanoLuc luciferase complementation assay. Virus Res. 243, 69-74. RNA ウイルスゲノムへの HiBiT 挿入 Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System 10 Tamura, T., et al (2018) Characterization of Recombinant Flaviviridae Viruses Possessing a Small Reporter Tag. J Virol. 92, e01582-17. ゲノム編集による HiBiT の ノックイン Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System 11 Oh-Hashi, K., et al (2017) Application of a novel HiBiT peptide tag for monitoring ATF4 protein expression in Neuro2a cells. Biochem Biophys Rep. 12, 40-45. タンパク質 – リガンド相互作用 （細胞内） NanoBRET™ Target Engatement Assay 12 Robers, M.B., et al. (2015) Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Comm. 6, 10091. タンパク質 – リガンド相互作用 （細胞表面） NanoBRET™ Target Engatement Assay 12 Stoddart, L.A., et al. (2015) Application of BRET to monitor ligand binding to GPCRs. Nature Meth. 12, 661-3. Robers, M. B., et al. (2015) A luminescent assay for real-time measurements of receptor endocytosis in living cells. Anal. Biochem. 489, 1-8. 生細胞でのキナーゼ プロファイリング NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay 12 Vasta, J.D., et al. (2018) Quantitative, wide-spectrum kinase proling in live cells for assessing the effect of cellular ATP on target engagement. Cell Chem. Biol. 25, 206-214. タンパク質 – DNA 相互作用 HaloCHIP™ System 13 Hartzell, D. D., et al. （2009）A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays, BMC Genomics, 10, 497 タンパク質 – タンパク質相互作用 HaloTag® Pull-Down System, NanoBRET™ 14 Moriya, C., et al. (2018) PRDM14 directly interacts with heat shock proteins HSP90 α and glucose-regulated protein 78. Cancer Sci. 109, 373-383. 1 分子ライブセルイメージング HaloTag® TMR Ligand 19 Miyanaga, Y., et al（. 2009）Single-Molecule Imaging Techniques to Visualize Chemotactic Signaling Events on the Membrane of Living Dictyostelium Cells. Methods in Molecular Biology 571, 417-435. 膜タンパク質の精製 HaloTag® Mammalian Protein Purication System 21 Toyosima, C., et al. (2013) Crystal structures of the calcium pump and sarcolipin in the Mg2+-bound E1 state. Nature 495, 260-4. タンパク質に結合する RNA の網羅的解析 HaloTag® Mammalian Protein Purication System 21 Yokoshi, M., et al. (2014) Direct binding of Ataxin-2 to distinct elements in 3’UTRs promotes mRNA stability and protein expression. Molecular Cell 55, 186-198. 高発現株の選抜、精製、 活性測定 HaloTag® Mammalian Protein Purication System 21 Ohana, R. F., et al. (2011) HaloTag-based purication of functional human kinases from mammalian cells. Protein Expr Purif. 76, 154-64. ゲノムワイド転写因子結合部位の マッピング（DAP-Seq） Magne™ HaloTag® Beads 22 Bartlett, A., et al. （2017）Mapping genome-wide transcription-factor binding sites using DAP-seq. Nat Protoc. 12, 1659-1672. かずさ cDNA コレクション Flexi® HaloTag® Clone 23 Nagase, T., et al（. 2008）Exploration of human ORFeome: high-throughput preparation of ORF clones and efcient characterization of their protein products. DNA Res. 15, 137-149. 参考文献 テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982　● E-Mail : prometec@jp.promega.com PK1811-01B 販売店 日本語 Web site：www.promega.jp プロメガ株式会社 本　　　社　〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所　〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2018年11月現在のものであり予告なしに変更することがあります。