テックの一言コラム_2016年6月号 Cell based assay に求めるルミノメーターって

トランスフェクション の難しい細胞 あるいは不均一細胞など、発現量の 少ないルシフェラーゼの場合、感度 は重要です。感度が不十分な場合、 アッセイ法の見直しを迫られます。 ハードウエア的には、光を最大限検 出装置に集めるために、検出器を サンプルに近づける。これは、蛍光 とのマルチモードリーダーで蛍光・ 発光両光学系併用の場合、フィル ターやミラーがあり、どうしても検 出器がサンプルから遠くなります。 （図２）また NanoBRET を提供する 立場からすると、ルミノメーターで ありながら、光学フィルターを挟む 必要がありますが、フィルターによ る距離のロスが最小限にされている ことも重要です。 また、検出装置の前にアパチャー（マ スク）を備えている場合、これがピン ホールのように小さくなく、できるだ けウェルのサイズに近いことも、最大限光を集め、高感度化に重要になります。 ② ダイナミックレンジが広いこと これは感度と相反する機能でもあります。想定よりも発光が大きかった場合、 振り切れてしまいます。これを避けるために、アパチャーを絞る、あるいはゲ インを下げる等々の対策が装置にあります。しかし、少なくとも再度測定あ るいはサンプル調製する必要があります。これら変更でも対応できない場合 は、やはりアッセイ系の見直しに迫られてしまいます。 ゲインの設定は、予備測定をして最適なセッティングをすればよいのですが、 実験の再現性を含めた設定をしないと、そこで実際には振り切れてしまうと いうことにもなりかねません。 ③ クロストークの問題 1990 年代前半、フラッシュタイプの発光しかなかった頃は問題ありませんで したが、グロータイプの発光が可能になって、クロストークが問題になってき ました。測定しているウェルの周りのウェルの発光シグナルを拾ってしまうと いうものです。プレート内の発光によりプレートの上空間がぼんやりと明るく なります。そこで、測定ウェル だけのシグナルを検出することにより、より正 確な実験データを導きだすことが重要になります。 ④ 使いやすさ 発光アッセイを簡便にするためにも、使いやすい簡単な装置で あることも望まれます。 ソフトウエアが使いやすいこと。これは PC の発展が寄与してい ます。また、大量のサンプルをこなすために、十分な予備検討 ができる場合は別として、セッティングが簡単であることも重要 です。上述、アパチャーの選択、ゲインの設定は、装置のパフォー マンスを最大限利用するものですが、装置の最適化でもあるた め、少量サンプルの場合は、変動要因は少ない方が簡単です。 実際、蛍光と比較して励起、蛍光両波長選択をしなくてよいこ とも発光法のメリットですから。 試薬のみならず、上述のようなパフォーマンスの高い装置をご利 用いただけることが、発光を用いたアッセイで簡便に最大限の 結果を得るために寄与すると考えています。 詳しくは、プロメガクラブページまで www.promega.co.jp/promegaclub.html Cell based assay に求めるルミノメーターって ［Vol. 12］ 2016 年 6 月号 高感度のセルベースアッセイに蛍光と発光が多用されてきました。 そもそも、蛍光と発光を比較すると、その原理から利用上大きな違いがあり ます。蛍光は励起光を強くすることにより、高い輝度が得られますがその代 償として、サンプルの純度が低いと、混ざりものによる高いバックグラウンド の影響をうけます。一方発光は酵素あるいは化学反応を利用しており、蛍光 に比較して輝度は低くなりますが、自然発光するものはゼロに等しく、低い バックグランドにより高い S/B 比が得られます。したがって、サンプルに混ざ りものが多いほど、発光はその威力を発揮します。 セルベースアッセイの場合、細胞溶解の有無にかかわらず、細胞成分あるい は細胞が測定サンプルに含まれるため、発光のメリットが生きてきます。洗 浄しない Homogenious なアッセイ系では、評価化合物の自家蛍光も大きな問 題となります。 さて、Promega の得意とするレポーターアッセイ。蛍光タンパク質、あるいは ルシフェラーゼが多用されています。レポーターアッセイにも、タンパクの発 現を観察するものと、細胞内挙動を観察するものがあります。蛍光はバック が高く、定性的な局在を見るために有効な方法で、イメージングに向いてい ます。一方、発光はバックグランドが低く、高感度で定量性を求める実験に 向いているといえます。 セルベースアッセイをする実験環境でプレートリーダーが普及しています。 蛍光、発光の各専用装置、あるいはどちらも可能なマルチプレートリーダー があります。本来は、キュベットを用いた蛍光分光高度計あるいはチューブル ミノメーターが起源であることから、ウェル内部に均一にサンプルが存在す るものとして設計されており、顕微鏡のような焦点といった考え方は基本的 にはありません。 蛍光測定の場合、プレートリーダーはウェル内部の一部のみに励起光を照射、 従ってサンプルの一部のみを測定しています。また、レポータータンパクの 発現が十分に高くないと、高いバックグラウンドに埋もれ、シグナルを取る ことが難しくなります。実際、一般的な蛍光プレートリーダーで GFP の検出、 定量ができたケースは決して多くありません。もちろん、焦点をもつ顕微鏡 機能を備えた装置であれば別の話。一方、発光はバックが低い上に、ウェル 内全体を測定しますので、より定量に向いています。 さて、発光を利用した多種多様のセルベースアッセイを最大限利用するため に以下のようなパフォーマンスを持つ装置が望まれます（図 1）。 ① 高感度であること セルベースアッセイの観点からすると、レポーターアッセイが感度を求める典 型です。測定時におけるルシフェラーゼの発現が潤沢な場合は問題ないですが、 テクニカルの ひと こと コラム 図 1. 発光測定の概念 図 2. 蛍光測定の概念 Distance Distance PMT 96 / 384 well aperture Detection Loss PMT 96 well aperture PMT Luciferase Crosstalk Crosstalk Protection PMT：フォトマルチプライヤーチューブ Em filter Mirror Background Signal Excitation light PMT Distance GFP テクニカルサービス Tel. 03-3669-7980／Fax. 03-3669-7982 E-Mail : prometec@jp.promega.com プロメガ株式会社 本　　　社　〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982