テックの一言コラム_2017年7月号発光プレートリーダーでのプレートの選択を考える

結果考察記載のプレートを用いて、200 µL、あるいは 40 µL 分注という条件で実施している。したがって、容量を変更する、あるいはプレートの型番、メーカー、さらには測定装置を変更することにより、結果は異なるものの、傾向は同様と考えられる。 384 well 黒 plate では白シールと黒シールで cross-talk（%）に 2 倍程度の違いとなっているが、カウントが低いため大きな差が認められなかったと考えられる。発光プレートリーダーでのプレートの選択を考える［Vol. 14］ 2017年7月号プレート・シール：すべて Corning 社 96 ウエルクリアボトムプレート白プレート；cat # 3917 クリアボトム白プレート；cat # 3610 黒プレート；cat # 3916 クリアボトム黒プレート；cat # 3603 384 ウエルクリアポトムプレートクリアボトム白プレート；cat # 3707 クリアボトム黒プレート；cat # 3712 プレートシール白プレートシール；cat # 38446 黒プレートシール；cat # 38496 サンプル調製 96 ウエルプレート Bactiter™ Glo （Promega Cat. # G8231）の取り扱い説明書に従い、適当な濃度の ATP 溶液に Bactiter™ Glo を等量混和し 1 well あたり 200 µL 分注。周りのウエルには精製水を 200 µL 分注。 384 ウエルプレート Luciferase Assay System （Promega cat# E1500）の取り扱い説明書に従い、適当な濃度の Beetle Luciferin（Promega cat# E1601）溶液に Luciferase Assay System を１：５の割合で混和し1 well あたり 25 µL 分注。クリアボトムプレートは測定後、ボトムに白あるいは黒シールを貼り付けた後に測定。測定装置 GloMax Discover （Promega） 0.3sec/well 設定データ処理 Sample を囲むウエルのクロストークを下記式に従い、算出。テクニカルのひとことコラム発光アッセイでマイクロプレートはどうすればよいかマルチプレートリーダーで利用できるプレートの種類は多種多様で、最適なものを選べる半面、測定の観点から、望ましくないものを使ってしまう恐れもあります。弊社で扱っているキットは主にルシフェラーゼを利用した長時間発光技術を用いています。本来ルシフェラーゼはフラッシュタイプのシグナルでしたが、長時間発光の基質の開発により、扱いが便利になった反面、隣のウエルの光の漏れこみ、いわいるクロストークが起き、これをいかに押さえ込むかという点が問題になります。今回は細胞を扱った実験で多く使われている底が透明なプレートについて考察をします。クリアボトムのプレートを用いた場合、４種のクロストークが考えら得ます。（右　模式図） A ; プレートトップと PMT の距離（装置の構造、あるいは蓋をしたままの測定など） B；プレートの材質、色、厚さなど C ; クリアボトムプレートは多くの場合透明なポリスチレンの板であり、その中を走る光 D；プレートボトムを通して拡散した光今回以下の測定を行いました。結論プレートを白から黒にすることにより、カウントは 1/10 ～ 1/20 に低下する。（ボトムがクリアか否かにかかわらず。） 96, 384 両フォーマットにおいて、クリアボトム白プレートに白シールを貼ると、カウントは 50 ～ 70% 増加するものの、クロストークは 5 倍程度増加した。一方、黒シールを貼ると、カウントは最大 10% 程度減少するが、クロストークは 1/3 程度低減する。 96, 384 両フォーマットにおいて、クリアボトム黒プレートに白シールを貼ると、カウントは増加し、クロストークは最大 40 倍程度減少する。一方、黒シールを貼ると、カウントは 10 ～ 20% 程度減少するが、クロストークは 1/20 ～ 1/200 に低減した。発光試験において顕微鏡観察のためクリアボトムのプレートを用いる際は、補正（カウント、クロストーク）する目的と、用いるクリアープレートの色に応じて、シールの選択が考えられる。クロストーク補正を優先する場合は、黒シールが第一選択と考えられる。（blank 補正はしていません。） Crosstalk（%）＝（a+b+c+d+e+f+g+h） 8 × 100 A count a d f b A g c e h format Plate color bottom color Corrected count（CPS）# Recovery（%） Crosstalk（%） 96 白白 268,250,000 ー 0.0070 クリア 92,617,267 100 0.094 クリア / 白シール 161,029,913 174 0.40 クリア / 黒シール 89,699,356 97 0.033 黒黒 10,474,142 ー 0.00044 クリア 9,773,454 100 0.074 クリア / 白シール 12,775,906 131 0.0020 クリア / 黒シール 10,163,200 104 0.00040 384 白白 266,456,321 ー 0.34 クリア 106,943,776 100 0.18 クリア / 白シール 156,059,016 146 1.2 クリア / 黒シール 97,276,787 91 0.13 黒黒 5,750,520 ー 0.0010 クリア 6,646,168 100 0.067 クリア / 白シール 7,716,353 116 0.061 クリア / 黒シール 6,350,681 96 0.0026 # corrected count：測定時間による発光の減衰等を補正した値。白シール黒シールカウントクロストークカウントクロストーククリアボトム白プレートクリアボトム黒プレート A B C D PMT plate bottomplate wall（white or black）テクニカルサービス Tel. 03-3669-7980／Fax. 03-3669-7982 E-Mail : prometec@jp.promega.com プロメガ株式会社本　　　社　〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982