ハイエンド – ルシフェラーゼレポーター NanoLuc™ Luciferase Technology

NanoLuc™ Luciferase Technology • 高レベル発光：ホタルルシフェラーゼ（luc2）よりも 80 倍～ 240 倍のシグナル • 低分子ルシフェラーゼ：遺伝子やタンパク質サイズに制約がある用途にも対応 （例：発光タグとしてのタンパク質との融合、ウイルスパッケージング） • 長時間発光：半減期約 2 時間の長時間発光タイプ • 安定：物理的な安定性が高く、スクリーニングにおける偽陽性が最低限 • 分泌アッセイにも対応：ベクターにより分泌型アッセイと細胞内型（標準型）アッセイを選択可能 • 多様なアプリケーション：標準的なレポーターアッセイはもちろん 発光タグとしてイメージングや BRET など幅広い用途に使用可能 ハイエンド – ルシフェラーゼレポーター プロメガ株式会社 ルシフェラーゼテクノロジー、次なる展開へ… 小さく、 明るく、 より多才に。 10559MA N H N N O + O2 N N NH O O + CO2 + Light NanoLuc™ Luciferase O Furimazine Furimazmide Log[luciferase], pM 10549MA Luminescence (RLU) –3 –2 –1 0 1 2 3 4 5 6 7 1 × 102 1 × 103 1 × 104 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 1 × 109 1 × 1010 Firefly Luciferase Renilla Luciferase NanoLuc™ Luciferase NanoLuc™（Nluc）はトゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）由来のルシフェラーゼで、発光レポーターとして最適なパフォー マンスを発揮するために改変された分子量の小さな発光酵素（19.1kDa）です。このルシフェラーゼはホタルやウミシイタケのものよ り約 150 倍明るく、高レベルの発光を長時間維持するための新規な基質 furimazine を用いて測定します。発光反応は ATP 非依存性で、 最大の感度を得るためにバックグラウウンド発光が抑えられるようにデザインされています。 NanoLuc™ ルシフェラーゼ遺伝子を含むレポーターベクターは複数のタイプを用意しており、実験目的に合うように構成されています。 発光値は Nano-Glo™ Luciferase Assay Reagent で測定した場合、6 桁以上のダイナミックレンジを有しており、シグナルの半減期は 2 時間以上です。 NanoLuc™ ルシフェラーゼの特性 • 非常に小さい、単量体酵素（171 アミノ酸 ; 513bp） • ATP 非依存性 • 高い熱安定性（Tm = 60℃） • 広範な pH 幅で活性を保持（pH 6 – 8） • 翻訳後修飾、ジスルフィド結合がない • 細胞内で均一に分布 • 蛍光スペクトルが生物発光共鳴エネルギー転移 （BRET ; λmax = 465 nm）に最適 NanoLucTM 、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ アッセイの感度の比較 NanoLucTM およびホタルルシフェラーゼの化合物による阻害 各精製ルシフェラーゼ酵素 を1280 種類の化合物とインキュベーションし、 Nano-GloTM および Bright-GloTM で発光を測定した。 NanoLucTM ルシフェラーゼの発光反応 NanoLucTM （19.1kDa） ホタル （61kDa） ウミシイタケ （36kDa） 10 10587MA 3 104 105 106 NanoLuc Firefly Renilla Luminescence (RLU) 150倍の比活性 NanoLucTM テクノロジー 3 種類ルシフェラーゼ酵素（50 attomoles）からの 発光測定 高発光：チャレンジングな実験に最適！ 低分子量：小さいほうが断然有利 安定：活性阻害を受けにくくHTS にマッチ ! 0 200 400 600 800 1000 1200 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 Sample # % activity NanoLucTM+ Nano-GloTM Z’ = 0.951 Z = 0.917 0 200 400 600 800 1000 1200 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 Sample # % activity Luc2 + Bright-GloTM Z’ = 0.895 Z = 0.80 Z 4 NanoLuc™ Luciferase Technology NanoLuc™ は小さな発光酵素なので融合タンパク質の作成あるいはウイルスへのパッケージングを容易にし、イメージング、センサーの 開発などにも応用することができます。レポーターアッセイでは通常レポーター酵素単体の活性を調べてその発現量の変化を調べるため 大きさはそれほど問題になりません。しかし、ウイルスへのパッケージングや標的タンパク質と融合させイメージングやセンサーの作 成を行う場合は分子量が小さいことに大きなメリットがあり、さらに発光量が高ければ標識タンパク質やセンサータンパク質の分子数 を抑え、生体機能に与える影響を最小限にとどめることができます。万能タグである HaloTag®* と NanoLuc™を組み合せた幅広いアプ リケーションも考案されています。イメージング用の基質についてはお問合せください。 RE Nluc イメージング用の基質についてはお問合せください。 Nluc Nluc Rec Nluc HT シグナル伝達 / 遺伝子調節 受容体相互作用 タンパク質間相互作用 Nluc HT Prot Y Prot X バイオセンサー A バイオセンサー B DEVD 例：カスパーゼ 3 ウイルスパッケージング BRET BRET BRET Nluc タンパク質動態 タンパク質安定性 Nluc Nluc Nluc バイオセンサー B Nluc HT Nluc HT BRET Prot Prot Prot Nluc タンパク質動態 *HaloTag® は低分子リガンドと特異的に共有結合するため、蛍光リガンドやリガンドをコーティングした担体を用いてイメージングや精製など幅広いアプリケーションに用いるこ とができます。HaloTag® 蛍光リガンド、担体、キット、ヒト ORF クローンなど HaloTag® テクノロジーの詳細については www.promega.co.jp/halotag/ をご覧ください。 NanoLuc™ レポーター 発光ドナー（BRET） 発光タグ センサー HaloTag® 蛍光アクセプター（BRET） 蛍光タグ 捕捉・固定用タグ 100 101 102 103 104 105 106 107 108 Luminescence (RLU) A) autoluminescence background S) secreted luciferase 0.01 0.1 1 10 100 1000 Normalized S/N Ratio (%) Secreted luciferase 他社A (Flash) 他社Bb (Flash) 他社Bf+ 0%安定剤 (Flash) Nluc + NanoGlo (Glow) 他社Ad (Glow) Flash Type Glo Type Flash Type Glo Type 他社Bf + 10%安定剤 (Glow) 他社Bf + 16%安定剤 (Glow) 他社Bf + 20%安定剤 (Glow) A S A S A S A S A S A S A S A S 他社分泌型ルシフェラーゼアッセイとの S/N 比の比較 NanoLucTM は他社の分泌型ルシフェラーゼに比べ自己発光が飛躍的に抑えられているため、高い S/N 比が得られます。分泌型のアッ セイは同一サンプルプレートにおける経時的なアッセイやマルチアッセイなど利便性に優れますが、これまで自己発光によるバックグ ラウンドが大きな課題でした。NanoLucTM はグロータイプの発光（長時間発光）を示しますが、他社のフラッシュタイプの光と同等の 高い発光レベルを示すとともに、バックグラウンドが最小限に抑えられているため、分泌型の利点を最大限発揮させることができます。 T=1 T=2 T=3 . . 分泌 NanoLucTM アッセイ 細胞内分子アッセイ （ATP, カスパーゼ , etc） 培地 + Nano-GloTM Reagent 細胞溶解液 + 標的分子の アッセイ試薬 高い S/N 比が得られる真の分泌型アッセイ レポーターアッセイだけではありません！ 典型的な分泌型 NanoLucTM アッセイの概要 テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982 ● E-Mail : prometec@jp.promega.com 最新情報については www.promega.co.jp/nanoluc/ をご覧ください。 PK1206-01 プロメガ株式会社 本 社 〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 URL：www.promega.co.jp テクニカルサービス Tel. 03-3669-7980／Fax. 03-3669-7982 e-mail：prometec@jp.promega.com ※製品の仕様、価格については2012年6月現在のものであり予告なしに変更することがあります。 販売店 NanoLucTM ベクター Nano-GloTM アッセイ試薬 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） pNL1.1 [Nluc] Vector 20µg N1001 64,000 pNL1.2 [NlucP] Vector 20µg N1011 64,000 pNL1.3 [secNluc] Vector 20µg N1021 64,000 pNL3.1 [Nluc/minP] Vector 20µg N1031 64,000 pNL3.2 [NlucP/minP] Vector 20µg N1041 64,000 pNL3.3 [secNluc/minP] Vector 20µg N1051 64,000 pNL2.1 [Nluc/Hygro] Vector 20µg N1061 64,000 pNL2.2 [NlucP/Hygro] Vector 20µg N1071 64,000 pNL2.3 [secNluc/Hygro] Vector 20µg N1081 64,000 pNL1.1.CMV [Nluc/CMV] Vector 20µg N1091 64,000 pNL1.3.CMV [secNluc/CMV] Vector 20µg N1101 64,000 pNL3.2.NF-κB-RE [NlucP/NF-κB-RE/Hygro] Vector 20µg N1111 64,000 NanoLuc™ ルシフェラーゼはレポーターアッセイで使用するためにデザインされた 様々な構成の NanoLuc™ 遺伝子（標準型 Nluc［ pNL x.1: 細胞内でのタンパク質半 減期＞ 6 時間 ］、不安定型 NlucP［ pNL x.2: 細胞内でのタンパク質半減期 約 10-30 分 ］、分泌型 secNluc［ pNL x.3: 培地中でのタンパク質半減期 ＞ 4 日 ］）がご利用 いただけます。pNL は最大の発光量が得られます。NlucP には PEST タンパク質不 安定化ドメインが付加されているため、迅速で応答性の高いレポーター実験が可能 です（右図参照）。secNluc には IL-6 分泌シグナル配列が付加されおり、培地中に分 泌された NanoLuc™は細胞を破壊することなく測定することができます。 Nano-Glo™ Luciferase Assay Reagent は NanoLuc™ ルシフェラーゼ専用のアッセイシステムです。 Nano-Glo™ Luciferase Assay System は細胞溶解剤を含む 1 種類 の試薬を加えるだけのホモジニアスアッセイ法を採用しており、 一般的な培地で使用した場合、半減期約 2 時間におよぶグロータ イプの発光シグナルが得られます。NanoLuc™ ルシフェラーゼを 発現する細胞あるいは NanoLuc™ ルシフェラーゼが分泌された培 地に直接使用することができます。 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） Nano-Glo™ Luciferase Assay System 10ml N1110 19,500 100ml N1120 124,000 10x10ml N1130 148,000 10x100ml N1150 お問い合わ せください 不安定型 NlucP の高い応答性 NF-κB 応答エレメントを含む各種コンストラクトを HEK293 に導入し rhTNFα で処理した。 pNL ベクターシリーズは pGL4 の基本骨格を用いているため既存 の pGL4 ベクターからのサブクローニングが容易です。この骨格は 数多くの転写因子結合サイトやその他の潜在的な調節エレメントを 除去することにより変則的な発現を低減するようデザインされてい ます。Nluc 遺伝子はコドンの最適化が行われ、多くの潜在的な調 節エレメント、その他の不要な配列（例：一般的な制限酵素サイト） が除かれています。 ※ベクター購入における注意点： NanoLucTM Vector (pNL) の使用は非営利組織（大学、公的研究機関など）、営利組織にか かわらず、ライセンスプログラムの内容をご確認いただく必要があります。ライセンス プログラムに関しては www.promega.co.jp/license/ をご覧下さい。 10560MA NanoLuc™ Luciferase-PEST NanoLuc™ Luciferase Firefly Luciferase-PEST Firefly Luciferase Time (hours) 0 1 2 3 4 5 6 1 10 100 1,000 Fold Response 各 pNL ベクターの用途 • pNL 1.x.： プロモーター領域のクローニング • pNL 2.x.： プロモーター領域のクローニング + 安定細胞株の構築 （ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むベクター） • pNL 3.x.： 応答エレメントや結合サイトのクローニング （最小限プロモーター（minP）を含むベクター） • 標準型および分泌型 Nluc 用のコントロールプラスミドも用意 （pNL1.1.CMV, pNL1.3.CMV）