テックの一言瓦版 2015年6月1日号

プロメガクラブ：研究のボトルネック解消をお手伝い 6 つの会員特典あり、会員の声を反映しさらに進化を続けています。会員特価限定品 RentaMax 新製品トライアルイベント優先招待ポイントプログラムまずは検索プロメガクラブ検索入会方法はとっても簡単！入会費・年会費はもちろん不要図 1 は、どちらも CV=10% でばらついている場合を想定して、Control と Negative Control を多数とった時のばらつきの分布を正規分布として示しています。図 2 は極端な場合を示しています（S/B=10 は CV=20%、S/B=2 では CV=1%）。図 1 の場合は、明らかに S/B=10 の方がロバストですが、図 2 の場合は、S/B=10 の方がロバストと言えるでしょうか。図 2 の S/B=2 なんて実際にはありえないと思われるかもしれません。しかしこれは極端な例ではありますが、これを客観的に見ようというのが Z’です。先の計算式で平均値に標準偏差の 3 倍を加算あるいは減算するということは、Control として、あるいは Negative control として統計的にかなりありえない（確率 0.14％以下）ところを意味します。したがって図 3 で示しました Negative control よりも大きく、Control よりも小さい Assay window が全体の何パーセントを占めるか、を意味しているのが Z’であるということになります。ここで Z’を図 1, 2 の場合に当てはめてみると、表 1 のようになります。レポーターアッセイガイド新発行のお知らせ弊社ホームページよりご覧いただけます。冊子版もご用意しております。ご利用の販売店または弊社ホームページよりご請求ください。プロメガ株式会社最新のレポーターテクノロジーとアプリケーション第 1 章　レポーターアッセイとテクノロジー ● これまでとこれからのレポーター …………………………………………………………2 ● 最新鋭レポーター ̶ NanoLuc® ルシフェラーゼ ̶ …………………………………4 ● デュアルレポーター & マルチアッセイ…………………………………………………6 ● リアルタイムアッセイ ………………………………………………………………………………8 第 2 章　レポーターアッセイでできること ● シグナルパスウェイ解析………………………………………………………………………… 10 ● タンパク質間相互作用（PPI 解析）………………………………………………………… 12 ● プロモーター解析 …………………………………………………………………………………… 14 ● 核内受容体解析 ……………………………………………………………………………………… 14 ● タンパク質安定性解析…………………………………………………………………………… 15 ● RNA 干渉解析 ………………………………………………………………………………………… 16 ● in vivo イメージング & ウイルスのマーキング………………………………… 17 第 3 章　レポーターアッセイ試薬 & レポーターベクター ● レポーター実験の流れ…………………………………………………………………………… 18 ● アッセイ / 検出試薬………………………………………………………………………………… 20 ● レポーターベクター・クローン・細胞 ……………………………………………… 26 ● 関連製品（トランスフェクション・マルチアッセイ・ルミノメーター）…… 30 発光レポーターガイド最新鋭 NanoLuc® ルシフェラーゼが広げるレポーターの可能性！レポーターアッセイの進化の歴史や実験の流れ～最新アプリケーションまで盛りだくさんの 1 冊 !! www.promega.co.jp/pdf/reporter_guide_2015.pdf ● レポーターアッセイが初めての方に ● 最新のレポーターアッセイを知りたい方にテクニカルスタッフのちょっと一言～アッセイ評価指標のあれこれ～アッセイ系のロバストネス / 頑強性プロメガで取り扱っているセルベースアッセイあるいは酵素アッセイなどが評価系として良いものかどうか示す指標として、Z’という値がごく普通に使われるようになりました。この Z’という値、以下の計算式で算出されます。ところでこの式の意味するところを考えたことがありますか。 Z’= （S-3SDS）（- B+3SDB） S-B S； Positive control の平均値 B； Negative control の平均値 SDS Positive control の標準偏差 SDB Negative control の標準偏差この Z’は、各アッセイ系特有のばらつきすべてを考慮している点が重要なポイントとなります。このばらつきを引き起こす原因は様々で、反応系そのものの問題、手技、測定装置、測定法などであり、セルベースアッセイはそれだけでセルフリー系よりもばらつきが大きくなるのが一般的です。この評価方法が提案されるまでは、S/B が使われていました（ここで S はアッセイ系での Control の平均値、B は Negative control の平均値で 100% および 0% control の基準値）。なぜこの S/B では系の評価には不十分なのでしょう。たとえば S/B が 10 の系と 2 の系があってこれを比較した場合、S/B が 2 の系の多くの場合は評価系として成り立ちにくいアッセイ系と考えられます。ただしそれが必ずしもそうとは限らない。 9/8 秋葉原〈東京〉富士ソフトアキバプラザ 9/11 千里〈大阪〉千里ライフサイエンスセンター 9/9 つくば〈茨城〉つくば研究支援センター発光アッセイセミナー開催決定 ! Advanced Cellular Analysis ～ NanoLuc® が未来を拓く～（仮）詳細は Web から www.promega.co.jp/2015biolumseminar/ 図 1 の S/B が 10 の場合は Assay window が 63% あり、図 2 の S/B が 2 の場合は Assay window が 91% ある、ということになります。一般的なアッセイ法で一般的な値、吸光度やカウントなどの場合は特に必要はないかもしれませんが、ratio metric なアッセイなどアウトプットに慣れていない数字であった場合などに役立ちます。またアッセイで background（たとえば吸光度でバッファーだけの値）を引くということをしなくとも、系の評価をすることができます。簡単に言えば、S/B にばらつきを加味した指標、ということになります。この評価方法、実は 15 年も前に発表されたもの * であり、そこでは Z’ が 0.5 以上、すなわち Assay window が 50% 以上あればロバストな系であるといっています。日常使われるアッセイ系でも Z’を計算し、体感している系のロバストの感覚と Z’と照らし合わせて把握しておくと、経験のないアッセイ方法の場合であっても、自分の感覚として把握することができます。もちろん ratio metric assay などの場合は、単に ratio のみならず、生データも日頃から見るということも重要です。＊） J Biomol Screen 1999 4（2） 67-73 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 frequency Signal S/B=10 Control Negative 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 frequency Signal S/B=2 図 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 frequency Signal S/B=10 Control Negative 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 frequency Signal S/B=2 図 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 frequency Signal S/B=10 Control Negative 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 frequency Signal S/B=2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 frequency Signal S/B=10 Control Negative 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 frequency Signal S/B=2 図 3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 frequency Signal +3SDB – 3SDS Assay Window S – B 表 1 S/B CV% Z’ 図 1 2 10 0.10 10 10 0.63 図 2 2 1 0.91 10 20 0.27 発光レポーターガイドプロメガクラブ瓦版 2015 年 6 月 1日号瓦版は、クラブメールマガジンの抜粋版となります。メールマガジンをご希望の方は、クラブにご登録ください。