テックの一言 瓦版 2015年7月21日号

テクニカルスタッフの ちょっと一言 創薬の中の High Throughput Screenig（HTS）というプロセスにおいては、 大量のサンプルの生理活性を調べるためにマイクロプレートを使っ たアッセイが必須となってきました。さらに、さまざまなプレートが 開発、発売されています。またプレートの高密度化が 384 ウェル、 1,536 ウェルへと進み、そもそもサンプルが混ざるのかどうか、 それどころかどうやって分注するのか、といった問題も生まれてき ますが、現在では専用の装置も開発、販売されています。 マイクロプレートには、透明、白、黒と色の工夫、また滅菌、細胞 の接着しやすい加工、最近では細胞を接着しにくくすることにより 細胞にスフェロイドを形成させるものなどが開発されています。プ ロメガでは、ルシフェラーゼを応用した発光法を主体として、蛍光、 吸光度を用いた試薬をご提供していますが、試薬を使用する上でと きどきお問合せいただくのが、プレートの色の選択です。発光、蛍 光それぞれのメカニズムを考えると悩む必要がありません。 励起範囲 発光測定 蛍光測定 プレート色の選択 白プレート 黒プレート 基本的に発光は白、蛍光は黒プレートを用います。発光は酵素反応 あるいは化学発光反応を利用しており、すべてのエネルギー源は サンプル中にあります。またサンプル中には発光する物質、バック グラウンドを上げるものは含まれていないため極力すべての光を検 出器に回収するために、光を反射する白プレートを用います。本来 は鏡のプレートがあればよいのかもしれません。一方、蛍光は外部 から与える励起光の量をコントロールすることにより、蛍光量をコン トロールすることができるので、光量に困ることはあまりありま せん。したがってバックグラウンドの上がらない黒プレートを用い るわけです。よって、一般的には発光法は白、蛍光法では黒を第一 選択とします。しかしながら、発光法において十分な発光量がある 場合は黒プレートの方がよい結果が得られることがありますし、蛍 光法においても、蛍光量が得られないときなどは、白プレートを用 いた方がよいこともあります。ただしこの場合は S/B ではなくて、 前回（Vol. 1）記述しました Z’で評価することが重要になります。 プレートの色が決まり、プレートの表面処理が決まると、プレート が決まります。 次に 96 ウェル以上の密度のプレートを用いたセルベースアッセイ になると、ぶつかる問題として、エッジエフェクトというものがあり ます。外側のウェルのシグナルが低いといった類の問題です。これ を非常に気にされる方は、外側のウェルをすべて使わないということ もあります。となるとせっかくの 96 ウェルプレートも、60 ウェルプ レートになってしまいます。さて、これを何とかできないかと、プレート がインキュベーター中の金属の棚に直接触れないようにするという 話も聞いたことがあります。 エッジエフェクト : 外側のウェルシグナルが低い そんな中、いまから 12 年も前ですが A Simple Technique for Reducing Edge Effect in Cell-Based Assays というタイトルで、ユニークな報告が ありました。エッジエフェクトを除く方法は至ってシンプル。細胞を 播種したあと、CO2 インキュベーターに入れるまえに室温に 1 時間 放置するだけです。さらにこのレポートでは、このエッジのウェル内 での細胞の生え方まで調べていて、ウェル内にもエッジエフェクト は起きていることを報告しています。 これはあくまでも報告ですが、もしもプロメガのセルベースアッ セイをご利用いただいていて（いただいていなくとも）、エッジ エフェクトが気になる方がいらっしゃいましたら、この報告 （J. Biomol. Screen. 2003; 8: 566-570）をご一読いただき、お試しく ださい。 これから創薬を始める方へ［Vol. 2］ ～ セルベースアッセイを始めるまえに ～ これから創薬を始める方へ［Vol. 1］ ～アッセイ評価指標のあれこれ～ アッセイ系のロバストネス / 頑強性 http://promega.co.jp/pclub/kawara1/ ライフサイエンスの実験手法、用語など、今さら聞けない トピックスをほたるんとエビビンがまんがで解説！ www.promega.co.jp/naninani/ プロメガクラブ瓦版のバックナンバー なになになーに？ プロメガクラブ：研究のボトルネック解消をお手伝い 6 つの会員特典あり、会員の声を反映しさらに進化を続けています。 会員特価 限定品 RentaMax 新製品トライアル イベント優先招待 ポイントプログラム まずは検索 プロメガクラブ 検 索 入会方法はとっても簡単！入会費・年会費はもちろん不要 プロメガクラブ 瓦版 2015 年 7月 21日号 瓦版は、クラブメールマガジンの 抜粋版となります。 メールマガジンをご希望の方は、 クラブにご登録ください。 創薬研究におすすめ製品ランキング ～ 培地に試薬を添加するだけ！製品特集 ～ 今なら会員限定特価！ ※注文時に会員 ID 番号を必ず明記ください。 1 ATP 発光 10 分でサクッと簡単生存性測定 CellTiter-Glo® 2.0 Assay（Cat.no G9241） 10 ml 14,000 円 7,000 円 ※ 96 ウェルプレートの場合 100 ウェル分（100 µl/ ウェル使用時） 2 Caspase-3/7 発光 1 液加えるだけの簡単アポトーシス検出 Caspase-Glo® 3/7 Assay（Cat.no G8090） 2.5 ml 19,000 円 9,500 円 ※ 96 ウェルプレートの場合 25 ウェル分（100 µl/ ウェル使用時） 3 生細胞プロテアーゼ 蛍光 貴重なサンプルから最大限の情報を引き出す マルチアッセイに最適！ CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay（Cat.no G6080） 10 ml 16,000 円 8,000 円 ※ 96 ウェルプレートの場合 100 ウェル分（100 µl/ ウェル使用時） ポイント！ 簡単 & 高感度測定 だから、複数のパラメーター測定が可能 日本の創薬を加速させるために重要視され ているアカデミア創薬への取り組みはこの 数年で精力的に実行に移され、化合物ライ ブラリーやスクリーニング拠点も本格的に 動き出しています。創薬プロセスの中でも 薬物候補のスクリーニングは重要であり、アカデミア創薬の成功 の鍵はいかに効率よくスクリーニングし、優れたリードを見つ けるかにかかっています。 プロメガのスクリーニング用のアッセイ試薬はこれまで世界中 の製薬企業の HTS 部門で広く利用され、効率的なスクリーニング システム構築に大きく寄与しています。プロメガのアッセイ試薬 の特長は生物発光を利用した高感度でバックグラウンドの低い 定量を可能にする点です。酵素に対する阻害剤のスクリーニング など生化学的なアッセイではその高感度性によりミニチュア化 （マルチウェルプレート）を容易にするため、使用する酵素、化合 物のコストを低減することができます。また、培養細胞を用いた アッセイの場合、蛍光法では励起光をこの複雑な生体サンプル に照射するため、バックグラウンドが高くなる傾向にありますが、 発光法では実質的に目的のシグナルだけを高感度に検出する ことができます。またアッセイケミストリの改良により、多くの 試薬はステップ数の少ないホモジニアス（各ウェルに試薬を分注 して測定する簡便なフォーマット） & 長時間発光フォーマット であるため、ロボットによる自動化も容易です。 今回は創薬研究でも汎用性の高い細胞の増殖試験試薬 CellTiter® 2.0 / CellTiter-Fluor™ とアポトーシス検出用の CaspaseGlo® 3/7 をご紹介いたします。 CellTiter-Glo® 2.0 は最新型の細胞生存性試験で細胞由来の ATP を発光に変換し、細胞の生存性を測定します。培養細胞に 試薬を加えて 10 分後には測定でき、MTT などの発色法では困 難な細胞数のわずかな変動も検出できます。2.0 は溶液状態 （4℃～ 22℃）で保存できるので、従来品のように凍結保存 / 融 解の手間がなく、手軽にアッセイを行うことができます。冷蔵庫 から取り出してすぐにアッセイすることができます。 Caspase-Glo® 3/7 は発光による細胞内カスパーゼ 3/7 活性測 定試薬です。数多くのアポトーシス判定試薬の中でも最も簡便、 高感度であるため、多検体サンプルの処理に威力を発揮します。 CellTiter-Fluor™ とのマルチアッセイが可能で、1 ウェルから細胞 の生存性とアポトーシス（カスパーゼ 3/7 活性）の 2 つのパラ メーターを測定することができます。その他のカスパーゼ測定 については別途お問い合わせください。 CellTiter-Fluor™ は蛍光法による細胞生存性試験で、新規な細胞 生存マーカーである特定のプロテアーゼ活性を測定します。蛍光 および発光を検出できる装置があれば、同じサンプルウェルで CellTiter-Glo® 2.0、Caspase-Glo® やレポーター酵素の発光アッセイ を実施し、2 つのパラメーターを測定するマルチアッセイが可能 になります。 上記試薬は会員の皆様に特別価格でご提供しています。（下記参照） 6865MA –11 –10 –9 –8 –7 0 10,000 20,000 30,000 CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay Caspase-Glo® 3/7 Assay 0 2,000 4,000 6,000 log10[paclitaxel] M Luminescence (RLU) Fluorescence (RFU) CellTiter-Fluor ™ Assay と Caspase-Glo® 3/7 Assay のマルチアッセイ CellTiter-Fluor ™ Reagent をウェルに添加、37℃ 30 分インキュベー ション後、生存性を測定した。その後 Caspase 3/7 試薬を添加し、 30 分インキュベーション後発光を測定（10,000 細胞 / ウェル） マルチアッセイとは … 同一ウェル内で複数のパラメーターを測定 創薬に向けたプロメガの取り組み マルチアッセイ例 創薬を加速させる次世代発光レポーター ～ NanoLuc® が未来を拓く ～ プログラム バイオルミネッセンスの基礎「これだけは知っておきたい発光アッセイ技術」 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 部長　工藤 勤 高次元細胞実験に対応した最新の生存性・毒性試験 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部　大田光徳 Ph.D. NanoLuc® ルシフェラーゼ：これまでで最高のレポーター 基礎編 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部　桃井道子 Ph.D. NanoLuc® ルシフェラーゼ：次世代の機能性レポーター 応用編 Promega Corporation Director of Research Innovative Biology Frank Fan. Ph.D. 日 時 9 / 8 火 東 京 秋葉原：富士ソフトアキバプラザ 14：00 開演予定 9 / 9 水 茨 城 つくば：つくば研究支援センター 13：30 開演予定 9 / 11 金 大 阪 千里：千里ライフサイエンスセンター 13：30 開演予定 事前登録 セミナー参加希望の方は以下のサイトより事前登録をお願いいたします。 http://promega.formstack.com/forms/jp_2015biolumseminar プロメガセミナー バイオルミネッセンス（生物発光）によるアッセイは蛍光法と比較し、感度が高く大きなダイナミックレンジを備えているため基礎研究から 創薬にいたる場面で様々な高感度・微量アッセイに利用されています。さらに近年では、生物学的関連性の高い有効なデータを得るために、 生体により近い生理条件下（in vitro よりも in vivo、継代培養細胞より初代培養細胞、強発現より内在発現）でのアッセイが強く望まれており バイオルミネッセンスが活躍する場面が増えてくると予想されます。 新しく開発された NanoLuc® は従来のルシフェラーゼよりも明るく（ホタルの 100 倍以上）、分子量が小さい（19 kDa）ため、少ない分子数でも 十分な感度が得られ、ゲノム編集技術などとの組み合わせで内在発現レベルでの変化も鋭敏に観察することができるようになります。 NanoLuc® は転写解析あるいは細胞内パスウェイ解析のためにより進歩したレポーター遺伝子としての利用はもちろんのこと、細胞内タンパク質 の挙動を調べるための高感度な発光タグとして（タンパク質の安定性 / 分解、タンパク質間相互作用［NanoBRET™ , NanoBiT］）あるいは試薬として （細胞増殖試験［RealTime-Glo™］）、基礎研究はもとより創薬研究を加速させる有効なツールとして利用することができます。 まだまだ知りたい方は、こちらのセミナーにご参加ください。 質問コーナーもあります！ セミナー終了後、弊社の技術スタッフが発光レポーター に関する質問を個別に承ります（事前登録が必須）。 NanoLuc® DLR キャンペーン 2015 年 12 月末日まで スターターセット で今なら直ぐに Nano DLR™ を スタート！ 内部標準 ベクター 定量 + 試薬 詳しくはこちらから　http://www.promega.co.jp/nanovspecial_starter.html 内部標準 ベクター 0 円 Nano DLR™ スターターセット： 39,000 円の定量試薬に内部標準ベクター（定価 68,000 円）を無償添付！ Hot News クラブ特価対象製品が追加！ Wizard 1000 回分 コスト削減に最適！ ● プラスミド精製 （Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System：A1465） ● ゲル & PCR 産物精製 （Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System：A9285） ReliaPrepRNA カラム単品 キットの試薬を余さず使用！ ● ReliaPrep™ RNA Cell/Tissue 用カラム （ReliaPrep RNA ミニカラム（with Collection Tube）：A207RM） RentaMAX !! 《会員のための機器貸出しプログラム》 血液・組織・細胞・FFPE・ウイルスからの 自動核酸精製装置 Maxwell®RSC 用 RNA / miRNA / DNA 精製各種キットが 30％ OFF！（2015 年 9 月末まで） 試薬をご購入いただければ、機器お貸し出し & スペシャリストが条件検討いたします。 ヒト細胞認証 ～論文投稿時に必要になるジャーナルが増えています！～ ● JCRB 細胞バンクによる細胞認証（認定書付） 今ならマイコプラズマ簡易検査がついてきます。（1 万円相当） 期間：2015 年 7 月 21日 ～ 12 月 20 日まで　　詳しくはこちらから　http://www.promega.co.jp/hca/ クラブ ニュース プロメガクラブ会員を対象としたキャンペーンおよびプログラムです。 ご利用になる際は、ホームページよりプロメガクラブにご登録し、 プロメガクラブ ID 番号を取得してください。 会員特典を利用する場合は、必ず ID 番号を明記ください。 特価期間 2015. 7. 21～ 9. 30 クラブ会員だけの期間限定キャンペーン 今月のおすすめ特価情報 室温保存特集 実験の手間を解消！ ● 取扱いが簡単！室温保存 Proteinase K Proteinase K（PK）Solution 4 mL（cat no.MC5005） 17,000 円 ● ゲル電気泳動後の染色に！ ～ エチジウムブロマイドより安心で高感度！ ～ Diamond™ Nucleic Acid Dye 500 µl（cat no.H1181） * 1 万倍希釈にて使用 19,000 円 高感度なため、マーカーやサンプル量が抑えられ、コストの削減につながります。 ※ 最長 90 日までは室温保存可能。長期保存の場合は、-20℃でご使用ください。 ※ UV トランスイルミネーター・ゲルイメージャーなどの標準的なイメージングシステムに対応 ● 電気泳動マーカー ～ 室温保存 BenchTop シリーズ ～　もちろんローディングダイ添加済み！ 製品名 定価 BenchTop φ x174 DNA / Hae III Markers（cat no.G7511） ［72 bp ～ 1,353 bp］：50 レーン分 21,000 円 BenchTop PCR Markers（cat no.G7531） ［50、150、300、500、750、and 1,000 bp］：50 レーン分 19,000 円 BenchTop 1 kb DNA Ladder（cat no.G7541） ［250、500、750、1,000 ～ 6,000、8,000、and 10,000 bp］：100 レーン分 20,000 円 BenchTop 100 bp DNA Ladder （cat no.G8291） ［100 ～ 1,000、and 1,500 bp］：50 レーン分 16,000 円 135,000 円 50 個入り 12,000 円 135,000 円 – 1,353 bp – 1,078 – 872 – 603 – 310 – 281/271 – 234 – 194 – 118 – 72 2% agarose – 2,645 bp – 1,605 – 1,198 – 676 2% agarose – 517 – 460 – 396 – 350 – 222 – 179 – 126 – 75/65 [51,36] 蛍光試薬 EtBr Diamond ™ 他社製品 SG 細胞 認定書 付き 詳しくは『STOP! 細胞誤認』をご覧ください。 プロメガホームページから http://www.promega.co.jp/pdf/naninani_ninsho_vol3.pdf Nature も投稿規定改訂！ 投稿時に細胞認証が必要になるジャーナルが増えています ヒト細胞認証試験 お手持ちの培養細胞について、細胞誤認の有無を検査いたします。 受託サービス 1 世界有数の細胞バンク JCRB 細胞バンクによる信頼性の高い分析報告書（細胞認定書）を発行 2 16 ローカスの STR 分析データと明確な判定結果 3 DNA 抽出の必要なし！ FTA カードに培養細胞をたらし、封筒に入れて送るだけ（常温 OK！） 通常 10 検体で 10% 引き 5 検体で 10％ OFF! 1 2 今なら検査お申込みの全検体に マイコプラズマ汚染検査を無料実施 ＊1 万円相当の検査です。 ＊通常 JCRB 細胞バンクで行っているマイコプラズマ検査とは異なる簡易版検査です。 【納期】 2 週間　　【価格】 ¥45,000 /1 検体 細胞バンクの 細胞認証 キャンペーン期間 受注分まで 2015 年7月21日 ～12月20日 お申込み・詳細は www.promega.co.jp/hca/ をご覧ください 細胞認証はどうして必要？ 実際どうするの？ 実験開始前に！ 論文投稿時に！ 細胞を譲渡するときに！ 検査は市販キット品を用いて行います。 【使用キット】 Lonza 社　MycoAlert™ マイコプラズマ検出キット （カタログ番号 LT07-118） すべてはうまくいっていた。 HeLa 細胞株から発現した Y 染色体マーカーに気づくまでは… 推奨! STOP! 細胞誤認 プロメガ株式会社 O P E N 10,000 円 均一 詳しくはこちらから↓ ※ 注文方法：専用注文用紙でご注文ください。（クラブウェブページから入手）注文時に会員 ID 番号を必ず明記ください。 テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982　● E-Mail : prometec@jp.promega.com PK1507-03 販売店 プロメガクラブウェブサイト：http://www.promega.co.jp/promegaclub.html プロメガ株式会社 本　　　社　〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所　〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2015年7月現在のものであり予告なしに変更することがあります。