テックの一言　 瓦版2015年9月28日号

テクニカルスタッフの ちょっと一言 これから創薬を始める方へ［Vol. 3］ ～ N エヌ =1 イチ の恐怖 ! ～ これから創薬を始める方へ［Vol. 2］ ～セルベースアッセイを始めるまえに～ www.promega.co.jp/pclub/kawara2/ ライフサイエンスの実験手法、用語など、今さら聞けない トピックスをほたるんとエビビンがまんがで解説！ www.promega.co.jp/naninani/ プロメガクラブ瓦版のバックナンバー なになになーに？ いわゆる High Throughput Screening（HTS）で行われるアッセイは通 常、1 サンプル（化合物）につき 1 wel（l N=1）で行います。N=2 あ るいは N=3 で行われることは極めて稀です。 アッセイの結果、Hit かどうかの判断をします。たとえば阻害剤探索 の場合、仮に Hit としてのクライテリア（判定基準）を 50% 阻害と 設定した場合、45% 阻害を示したものを捨ててしまってもいいのか。 もしかして N=3 でアッセイして平均したら 55%（45, 58, 62%）阻害 で、実は新規発見だったなんてことになるかもしれません。これぞ まさに、N エヌ =1 イチ の恐怖。 このようなことをできる限り少なくするために、ばらつきの少ない、Z’ の大きいアッセイ系であることが望ましいと考えられます。N=3 で アッセイした濃度依存性曲線から IC50 算出実験を 3 回行っての平均 …. とは対極です。 ばらつきの小さい実験を組み立てる一つの方法が、ホモジニアスな アッセイを作ること。ホモジニアスという言葉はあまり正確ではなく、 add-read あるいは mix and measure が正しいかもしれません。濾過、 洗浄といった分離操作の入らないアッセイ系です。 ホモジニアスなアッセイ系ですと、実験操作の観点からは、分注操 作のばらつきのみがアッセイ系のばらつきの主因ですので、ばらつ きが少ない系が構築できます。 ホモジニアスの他のメリットはアッセイ系のミニチュア化が容易にな り、簡便化とスピードアップが可能になることです。ミニチュア化の 最大のメリットは、一番貴重なサンプルを最低限にできるところに あります。こんな背景のもと、多くのホモジニアスなアッセイ手法 が確立されています。 ところが、ホモジニアスアッセイの選択肢が増えるに従い、ホモジ ニアスアッセイにおける注意事項が、忘れ去られていることがあり ます。たとえば、1990 年代前半には普通に使われていたラジオアイ ソトープを用いたフィルトレーション法。濾過操作により、検出の段 階ではサンプルは洗い流されていて存在しません。したがってサン プルは検出には影響を与えません。ところがホモジニアスなアッセ イ系では、検出のステップでもサンプルが存在します。そこで何が 起こりうるか、を知っていることが重要です。 蛍光法でのホモジニアスアッセイの場合。もっとも問題になるのが 化合物の自家蛍光です。蛍光法は感度が高い測定法ですが、これは 目的とする蛍光物質以外のもの、つまり、サンプル自体の蛍光にも 感度が高いことを意味します。阻害剤の場合、薬剤の入ったウェル のシグナルが、コントロールよりもはるかに高いといった結果にな ることさえあります。医薬品候補となる化合物は一般的に低波長に 吸収があり、蛍光も比較的波長が短いため長波長の蛍光物質を検 出に用いるのも自家蛍光を回避する一法です。この他蛍光の問題点 を工夫した技術もありますが、蛍光物質あるいは測定装置が特殊な ものになります。 次はクエンチングです。励起光が蛍光物質に届くまえに、あるいは 蛍光 / 発光が検出器に届くまえにサンプルが光を吸収してしまうい わゆるカラークエンチング。これは光吸収の問題で、吸光度測定が 蛍光に比較して感度が悪いのと同様、サンプルの濃度が高い場合 に影響を受けます。このカラークエンチングは測定前にウエルの色 を見ると予想がつくことがあります。 もう一つがケミカルクエンチング。検出反応系への影響（多くの場 合は阻害）です。たとえば検出反応に酵素を用いていれば、検出酵 素阻害剤の影響です。ある目的の酵素の阻害剤探しをする際、目的 の阻害剤が存在するのであれば、検出に用いる酵素の阻害剤がな いとは言い切れません。また検出系の反応時間等も長ければなが いほど、影響が出る可能性も高まります。こういった問題は、サン プルの濃度は当然のこと、ライブラリーの性格にも依存するかもし れません。 こうしたことによる偽陽性は、求める活性ではないことを確認できる カウンターアッセイにより排除されるわけですが、偽陰性を最低限に すべく、やはり少しでも優れたアッセイ系が望まれます。 冒頭の「N エヌ =1 イチ の恐怖！」から逃れるための一つの方法として、ホモジ ニアスアッセイをとりあげましたが、系を構築するにあたり、化合 物の影響を十分認識せずにアッセイ系を構築し、実際にスクリー ニングをはじめてからサンプルの影響に気がつくことがないように。 せめて、「N エヌ =1 イチ の不安」にしてスクリーニングを始めたいものです。 カラークエンチング カラークエンチング （励起光の吸収） （蛍光、発光の吸収） 自家蛍光 光源 シグナル ケミカルクエチング 光を吸収する化合物（着色物質） 自家蛍光物質 阻害物質 検出器 特集：生細胞内タンパク質間相互作用 2 ～ 3 ページ プロメガクラブ：研究のボトルネック解消をお手伝い 6 つの会員特典あり、会員の声を反映しさらに進化を続けています。 会 員 特 価 限 定 品 RentaMax 新製品トライアル イベント優先招待 ポイントプログラム まずは検索 プロメガクラブ 検 索 入会方法はとっても簡単！入会費・年会費はもちろん不要 プロメガクラブ 瓦版 2015 年 9 月 28 日号 瓦版は、クラブメールマガジンの抜粋版となります。 メールマガジンをご希望の方は、 クラブにご登録ください。 細胞内におけるタンパク質分子間相互作用（PPI：protein-protein interaction）は、細胞分裂から細胞外刺激への応答など、すべての重要なイベン トに関与しています。PPI をセルフリーの実験系で構築することが可能ですが、細胞内におけるタンパク質の環境とはかけ離れたものであり、やは り細胞内での PPI を観察することが重要になります。加えて近年、PPI は創薬の重要な標的として見直されており、細胞内 PPI の観察のニーズが高まっ てきました。 細胞内 PPI の観察のひとつにプルダウンアッセイが用いられてきましたが、細胞の溶解およ び洗浄操作により細胞環境が破壊されることが問題となります。また蛍光共鳴エネルギー転 移法（FRET：Fluorescence Resonance Energy Transfer）は、細胞内での PPI を観察することが できます。これはある組み合わせの二つの蛍光物質を利用して、ドナーが光励起により得た エネルギーを近接したアクセプターに転移することによりアクセプターが発光するというもの です。この FRET を利用して生細胞における PPI 検出が可能となりました。しかし、励起光に よる自家蛍光は高いバックグラウンドを引き起こすばかりでなく、評価化合物の自家蛍光、ま た励起光による光退色による感度の低下、あるいは光細胞毒性などの影響が問題になりまし た。Xi* らは、この FRET のドナーをルシフェラーゼに置き換えた生物発光共鳴エネルギー転 移法（BRET：Bioluminescence RET）法を発表しました。ドナーにルシフェラーゼを用いること により、励起光を用いることなく、ルシフェリン – ルシフェラーゼ反応により得られたエネル ギーを近接したアクセプターに転移します。しかしドナーとアクセプターのスペクトルのオー バーラップが大きい、発光が十分でない、アクセプターの特許および測定装置の特異性など の問題であまり使われることがありませんでした。 Promega では、BRET エネルギードナーとして独自の高発光ルシフェラーゼ NanoLuc® を、エ ネルギーアクセプター として NanoBRET™ 618 Ligand で標識された HaloTag® タンパク質を利 用した NanoBRET™ を開発しました。これにより本来の細胞内環境下で感度および再現性の 高いタンパク質間相互作用の検出を現実的なものにしました。完全長のタンパク質を低レベ ルで発現させることにより、真の細胞生理を反映するタンパク質相互作用のモニタリングや スクリーニングに利用することができます。さらに、NanoBRET™ を発展させて、タンパク質 – 低分子量間相互作用の検出にも応用し、Kinase、HDAC などのタンパク質に対する薬剤の結 合を細胞内で観察する Target Engagement assay を確立しました。これを利用することにより、 細胞内タンパクに結合した薬剤のレジデンスタイムの計測への応用も可能になりました。 * PNAS Vol. 96, 151–156 1999 化合物スクリーニングにおける一つの大きな問題点として、偽陽性があります。レポーターアッセイ においては、化合物がレポータールシフェラーゼの酵素活性あるいは細胞内安定性に影響を与えるこ とにより偽活性を示すことが知られています。そこで Fluc と Nluc をタンデムに並べたベクターを開 発、これを利用し、FLuc、NanoLuc® 活性を同時に測定することにより、Activator および Inhibitor 探索 において、効率的に Hit 化合物を同定することができます。Fluc と Nluc はリボソームスキップ機構を 引き起こす短い P2A 配列を挟んでおり、融合することなく、独立して発現します。 製品名 サイズ カタログ番号 プロメガ会員特価 pNLCoI1 [luc2-P2A-NlucP/Hygro] Vector 20 µg N1461 95,000 円 66,500 円 pNLCoI2 [luc2-P2A-NlucP/minP/Hygro] Vector 20 µg N1471 pNLCoI3 [luc2-P2A-NlucP/CMV/Hygro] Vector 20 µg N1481 pNLCoI4 [luc2-P2A-NlucP/PGK/Hygro] Vector 20 µg N1491 ※ご注文の際は、必ず会員 ID 番号を明記ください。 Promoter Fluc 2A Nluc transcription Firefly（Fluc） NanoLuc® True Hit Activator Inhibitor False positive/negative Control Fluc NanoLuc Fluc & Nluc のタンデムベクター NanoLuc® レポーターアッセイをもっと高品質に！ スクリーニングをされている方におすすめ！ アクチベーター・インヒビター探索で偽陽性を見逃したくない方へ ● 生細胞内でのタンパク質間相互作用を高感度に検出 ● プレデザイン NanoBRET™ 製品キットですぐ開始 ● 薬剤評価スクリーニングに最適 製品名 カタログ番号 プロメガ会員特価 プレデザインキット NanoBRET™ KRas/BRaf Interaction Assay N1880 750,000 円 525,000 円 NanoBRET™ cMyc/MAX Interaction Assay N1870 NanoBRET™ BRD 4/Histone H3.3 Interaction Assay N1830 NanoBRET™ BRD 4/Histone H4 Interaction Assay N1890 NanoBRET™ BRD 9/Histone H3.3 Interaction Assay N1840 NanoBRET™ BRD 9/Histone H4 Interaction Assay N1900 NanoBRET™ BRPF1/Histone H3.3 Interaction Assay N1860 NanoBRET™ BRPF1/Histone H4 Interaction Assay N1910 NanoBRET™ CBP/Histone H3.3 Interaction Assay N1850 スターターキット NanoBRET™ PPI MCS Starter System N1811 180,000 円 126,000 円 NanoBRET™ PPI Flexi ® Starter System N1821 150,000 円 105,000 円 * 上記すべての製品に p53/MDM2 が positive control として含まれます。 ※ご注文の際は、必ず会員 ID 番号を明記ください。 NanoBRET™ には Discover がおすすめ !! 機器のない方は、無料機器貸出しサービス RentaMAX をご利用ください。 詳しくはこちらから www.promega.co.jp/rentamax/ 左記以外の組み合わせも多数！ シグナル伝達関連・膜タンパク質・RNA 結合タンパク質・その他エピジェネクス 関連等。ご興味のある方は、弊社テク ニカルサービス（03-3669-7980）まで お問合せください。※キャンペーン対象外 NanoBRET™ Assay 生体内に近い創薬スクリーニング・ 阻害剤スクリーニングを実現 がん研究・エピジェネティクス研究 ご自身で目的の相互作用ペアを作製 できる Starter kit もご用意。 今なら 30% OFF NanoBRET™ プレデザインキット のここがおすすめ !! NanoLuc® 12292MA HN O O HT Protein X Protein Y HN：NanoBRET™ Ligand HT：HaloTag® Fluorescence + substrate 13002MA HaloTag® fusion H3 or H4 Histone H3 or H4 NanoBRET™ 618 Ligand BRET NanoLuc NanoBRET™ Nano-Glo® Substrate Measure emissions and calculate ratio HT NanoLuc® fusion NanoLuc BRD4 HT BRD4 Ac K 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Frb-NLuc/FKBP-HT Frb- RLuc8/FKBP-YFP Rapamycin (nM) Signal-to-Background Ratio 12323MA 0.0001 0.01 1 100 10,000 NLuc HT NLuc FKBP FKBP HT FRB FRB 610nm BRET Rapamycin A. B. HT ligand 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Frb-NLuc/FKBP-HT Frb- RLuc8/FKBP-YFP Rapamycin (nM) Signal-to-Background Ratio 12323MA 0.0001 0.01 1 100 10,000 NLuc HT NLuc FKBP FKBP HT FRB FRB 610nm BRET Rapamycin A. B. HT ligand NanoBRET™と BRET1 のパフォーマンス比較 細胞内タンパク質間相互作用 NanoBRET™ 概要 GloMax ® Discover 最新 NanoLuc 技術だからできた 生細胞内タンパク質分子間相互作用とは ? BRET 期間：2015.9.28 ～12.20 期間：2015.9.28 ～12.20 会員限定 ! 今なら 750,000 円 525,000 円 プレデザインキット NanoBiT 新規な 2 分子相補システムを用いた 細胞内タンパク質分子間相互作用のモニタリング 演者：Brock F. Binkowski, Ph.D. （Promega Corporation, Sr. Research Scientist） BMB2015 ランチョンセミナー 生細胞内タンパク質分子間相互作用研究に新技術登場！ 本セミナーは、BMB2015（第 38 回日本分子生物学会年会・第 88 回日本生化学会大会合同大会）のランチョンセミナーです。 発表日 ：12 月 2 日（水）12：45 ～ 13：45（ランチョンセミナー） 会場 ：第 3 会場（神戸ポートピアホテル本館 B1F 偕楽 2） プログラム No.：2LS3 細胞内 PPI 最新情報をさらに知りたい方はこちら プロメガセミナー & 交流会 招待状 Promega Dynamic Connection ～ 高次元細胞アッセイ技術の展望 ～ 日時：2015 年 12 月 2 日 16：30 ～（予定） 場所：神戸ポートアイランド内会場 お申込みはこちらから↓ 毎年 BMB/ 分子生物学会期間に開催している年に一度 のセミナー & 交流会 Promega Dynamic Connection、 今年は神戸にて開催いたします。 Promega Dynamic Connection…異分野の先生方同士の共同 研究推進を目的とした会として始まり、今年で 6 回目とな ります。毎年様々な分野の先生方 60 名ほどが参加され、 先生同士・弊社本社スタッフも交え活発な交流が交わされ ています。実際に、共同研究という形で多数の有益な繋が りが生まれています。今年も有益な時が過ごせますよう、 企画しておりますので、ご興味のある方は、ぜひ左記 URL よりお申込みください。 タンパク質間相互作用（PPI）は細胞内のシグナル伝達ネットワークの必須要素です。In vitro で PPI をモニタリングする方法は数多くありま すが、細胞内で検出する方法はそれほど多くありません。我々は NanoLuc® ルシフェラーゼをベースにした 2 つのサブユニットシステム で 細胞内での PPI 検出を可能にする NanoLuc® 2 分子テクノロジー（NanoBiT：NanoLuc® Binary Technology）を開発しました。Large BiT（LgBiT; 18 kDa）および Small BiT（SmBiT; 11 アミノ酸ペプチド）のサブユニットをそれぞれ標的タンパク質との融合体として発現させると、PPI が 起こりサブユニットの相補性が促進され、発光酵素として明るい光を生じます。同様のアプローチであるシンプルに分割された酵素やタン パク質（スプリット系）とは異なり、LgBiT は単独のサブユニットとして構造安定性を最適化し、SmBiT は PPI 用の特別なペプチドライブ ラリーより選別しました。結果として、従来のスプリット系と比べて大幅な活性低下を示さず、かつ親和性の低いサブユニットペアが得ら れました。多くのスプリット系とは対照的に LgBiT：SmBiT の相互作用は可逆的でタンパク質間の迅速な解離も検出することができました。 細胞透過性の NanoLuc 基質（フリマジン）を含む非細胞溶解性の検出試薬 Nano-Glo® Live Cell Assay System を用いてリアルタイムで生細 胞内での PPI ダイナミクスを追跡することができます。スプリット系に対する利点としては、より優れた感度（生理レベルに近い発現でも 観察可能）、可逆性、片側の融合物がペプチド・低分子である点、構造安定性の高いタンパク質ドメイン、非細胞溶解アッセイフォーマッ トによるリアルタイム測定、自己会合を防ぐために低減されたサブユニットの親和性などが挙げられます。本セミナーでは NanoBiT テクノ ロジーの開発や数多くの PPI への応用についてご紹介いたします。 事前申込み開始！ お申込みはこちらから↓ 講演内容 発 光 クラブ ニュース プロメガクラブ会員を対象としたキャンペーンおよびプログラムです。 ご利用になる際は、ホームページよりプロメガクラブにご登録し、 プロメガクラブ ID 番号を取得してください。 会員特典を利用する場合は、必ず ID 番号を明記ください。 クラブ会員の方に プロメガ社員がオススメする今注目の製品 ! ゲノムの 90% 以上の遺伝子座を増幅でき、ゲノムカバー率が最も 優れています。 秋のキャンペーン情報 期間：～ 2015.12.20 まで RentaMAX ありがとうキャンペーン お待たせしました！ Flexi ® クローン特別キャンペーン ● 大人気 核酸精製 定量 増幅製品 が、30% OFF ～ ● 1 細胞からの全ゲノム DNA 増幅法 ～ MALBAC Single Cell WGA Kit ～ 50 回分（Cat.no JYGYK001B）210,000 円 ● 自動核酸精製装置 Maxwell ® を購入すると、 今なら連続作業に便利なカセットラックが もう１台付いてくる ● ルミノメーター・マルチプレートリーダーを購入すると、 今なら ルミノメーター性能判定用ライトプレートが付いてくる 今なら 10 回分 が付いてくる！ 会員特典 会員はさらにお得 会員はさらにお得 全ユーザー対象 NanoDual Reporter Assay スターターセット ✔ 内部標準をより安定にしたい！ ✔ 最高の感度・応答性を求めたい 全ユーザー対象 STOP! 細胞誤認 全ユーザー対象 13～15万円 相当 血漿からのセルフリー DNA 自動精製システム Maxwell ® RSC ccfDNA Plasma Kit 新製品 No.1 ● 高純度で精製可能 ● 圧倒的に簡便（前処理不要でダイレクトイン） ● カスタムで 4 mL 血漿にも対応 シングルセルからの全ゲノム DNA 増幅法 MALBAC Single Cell WGA Kit 新製品 No.2 ● シングルセルからの全ゲノム DNA 配列を均等に増幅 ● 簡便・迅速な操作性 （1 チューブ、3 ステップ、4 時間で完了） ● 単一細胞からの増幅成功率は約 95% がん研究者・診断検査分野ですでに大評判！ 次世代シークエンサー（NGS）を用いた SNP 解析に！ 機器をお貸しいたします （RentaMax プログラム） 機器をお持ちでない方 機器のご購入を検討中の方 詳しくは、こちらから www.promega.co.jp/nanovspecial_starter.html 詳しくは、こちらから www.promega.co.jp/hca/ 詳しくは、こちらから www.promega.co.jp/clones/ 詳しくは、こちらから www.promega.co.jp/rentamax_arigato 詳しくは、こちらから www.promega.co.jp/cellcamp/ 詳しくは、こちらから www.promega.co.jp/waukwaku_camp ヒト細胞認証 ～ JCRB 細胞バンクによる細胞認証！ 多くのジャーナルで論文投稿時に必要になっています。 今ならマイコプラズマ簡易検査が付いてきます！ （機器無料貸し出しサービス） 秋 冬 わくわくキャンペーン わくわく 今なら 内部標準 ベクター ＋定量試薬 39,000 円 こんな方に おすすめ！ ● Flexi ® ORF、Flexi ® HaloTag®、Flexi ® NanoLuc® クローンが 20 ～ 30%OFF ● 新しい pH センサーを含む HaloTag® 蛍光リガンドもキャンペーン 細胞アッセイ試薬年末キャンペーン ● 細胞の生死、代謝アッセイ試薬からレポーターアッセイ用 ベクター、定量試薬まで ● 室温保存可能な使い易い細胞生存試験 CellTitier-Glo® 2.0 も対象 今なら5検体で 10%OFF テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982　● E-Mail : prometec@jp.promega.com PK1509-05 販売店 プロメガクラブウェブサイト：http://www.promega.co.jp/promegaclub.html プロメガ株式会社 本 社 〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所 〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2015年9月現在のものであり予告なしに変更することがあります。