プロメガ実験ノート vol.4 ViaFectによる正常二倍体細胞株hTERT RPE-1の活用向上例

プロメガ 実験ノート はじめに 　これまで難しかった正常二倍体細胞への遺伝子導入が、ViaFect でとても簡便になりました。これにより、従来なかった 研究の促進が期待できます。 　正常二倍体細胞はがん細胞と対極的な解析対象です。正常二倍体細胞には細胞増殖を積極的に止める仕組みが備わってい ます。よく知られるのは細胞や DNA に問題が生じた際作動するブレーキで、Rb やp53を始めこれまでにいろいろな段階の ブレーキが報告されています [1]。 　最近これに、一次線毛形成を介した細胞周期休止が新たに加わりました。一次線毛は正常二倍体細胞特有の構造物で、増殖 停止期に中心体より生じますが、これに細胞周期を積極的に停止させる作用のあることがわかってきました (Box 1)[1]。な かでも明快だったのが筆者らの培養正常二倍体細胞（hTERT RPE-1 細胞：Box 2）を用いた最近の報告です [2]（図１）。こ の線毛動態の分子基盤は、中心体に局在する「Trichoplein- オーロラ A 分裂期キナーゼ経路」が、一次線毛形成を抑えること で細胞増殖を保障するものでした。また、これが無くなるとスイッチが切り替わるように一次線毛が形成され、細胞増殖が休 止しました。この報告のインパクトは学術誌の表紙、紹介記事、論文評価サイト「F1000」でも取り上げられました [3,4]。 　そもそも中心体は、培養細胞の紡錘体極としてお馴染みですが、最近の遺伝学的知見の蓄積により、分化組織構築におけ る重要性も加えられつつあります。特に中心体より形成される一次線毛機能の変調は、嚢胞腎、四肢形成異常、網膜の異常 などを起こします [1]。その病理の一端は、細胞外からの分化・増殖シグナルの受容障害にあるとされます。しかし、中心 体疾患モデル動物は概して致死性が高く in vivo 解析が困難で、分子基盤に不明な点が多いのが現状です。 　筆者自身はこの hTERT RPE-1 細胞で見出した新たな特徴に、分化研究への橋渡し役を期待しています [1]（図１）。な ぜなら、一次線毛形成と細胞周期休止は、どちらも細胞分化にとって必要だと考えられているからです [1]。しかし、正常 二倍体細胞は遺伝子導入試薬が概して効きにくく、この２現象間の分子相関解析実験をもっと楽に進められるような、効率 の良い遺伝子導入試薬を探していました。幸い hTERT RPE-1 細胞では ViaFect が特に効果的で、さらに精度の高いゲノム 編集にも適用可能であることがわかりました。この効用は、もともと上皮分化に関わる筆者の研究 [4] のみならず、正常二 倍体細胞特性全般の萌芽的な研究促進につながると思われますので、ここで紹介させていただきます。 Box 1. 一次線毛：増殖休止期にある生体内の分化細胞や血清飢餓状態の正 常二倍体培養細胞において、中心体構成成分である母中心小体より形成さ れ細胞膜上に突出する、微小管骨格を軸とする構造物。その異常個体で起 こる嚢胞腎、四肢形成異常などは、メカノセンサー機能やソニックヘッジ ホッグシグナル受容の異常であることから、生体内の一次線毛機能は細胞 外シグナルを受容するアンテナと言われています。特にこれが細胞分化に 必要であるという知見が増えつつあります。一方培養細胞の一次線毛は動 的で、血清飢餓による増殖休止期に同調して生じることが知られていまし たが、細胞周期調節との上下関係は、決め手となる実験が無かったため最 近まで不明でした。詳細は参考文献１参照。 Box 2. hTERT RPE-1 細胞 (ATCC 細胞株　CRL-4000、住商ファーマイ ンターナショナル株式会社 )：ヒト網膜色素上皮 (RPE, Retinal Pigment Epithelial Cell) の初代培養細胞にヒトテロメラーゼ逆転写酵素 (hTERT, human TElomerase Reverse Transcriptase) を導入し不死化した、正常 二倍体に相当する染色体数（46 本）からなる細胞株。つまり、初代細胞の in vivo の性質を出来るだけ保ちながらも、細胞株のような増殖能を獲得し ている細胞株です。hTERT によるテロメア延長で細胞老化を防ぐことによ り、染色体やチェックポイント遺伝子の過剰な変異を避ける意図がありま す [5]。 Vol. 4 ViaFectによる正常二倍体細胞株hTERT RPE-1の活用向上例 愛知県がんセンター研究所　腫瘍医化学部　猪子 誠人 先生 図１：筆者の発見と正常二倍体細胞の学術的位置づけ 筆者らは、中心体への Trichoplein の局在が一次線毛 形成抑制による G1 期進行の保障に必要なことを正常 二倍体培養細胞 (hTERT RPE-1 細胞 ) で発見した [2]。 その消失（赤枠）では一次線毛形成が増殖休止を同期 させる点で、細胞周期研究から分化研究への新たな橋 渡しとも言える [1]。 １．実験デザイン 　hTERT RPE-1 細胞に対し、まず ViaFect を含む複数社の遺伝子導入試薬を用いて、プラスミドベクターの導入効率を GFP の発現量で比較しました。次いで最近のゲノム編集技術のひとつである TALEN のプラスミドベクター導入による切断 効率を比較し、その実験適用性の広さを探りました。 ２．ViaFect による遺伝子導入効率の向上 　まずは遺伝子導入効率を比較するため、ViaFect を含む大手３社の４製品の遺伝子導入試薬を市販の哺乳類用 GFP 発現 ベクターを用いて試しました。hTERT RPE-1 細胞への遺伝子導入は、それぞれメーカー指定にほぼ準ずる方法で行いまし た。ViaFectは試薬 :DNA比 3:1で用いました。回収したサンプルを蛍光顕微鏡とイムノブロッティングで二重判定した結果、 ViaFect が発現細胞数と発現量において総合的に最も良好な遺伝子導入効率を示しました ( 図２)。ViaFect は生存率におい ても良好で、他社の製品は程度の差はあるものの、細胞へのダメージにより細胞数の減少や形態変化を認める傾向にありま した。このように、hTERT RPE-1 細胞では ViaFect が最も良い相性を示しました。 ３．ViaFect によるゲノム編集効率の向上 　最近の人工ヌクレアーゼすなわち ZFN, TALEN, CRISPR の効用は、これまで非常に難しかった体細胞の正確で完全な標 的遺伝子二重鎖切断を可能にしました。特にCRISPR nickaseは、その切断特異性をさらに高めるものです [6]。しかもドナー DNA を用いることで、正確な点変異導入まで可能になっています。このようにゲノム編集技術は siRNA にはない精度の高 さを持っており、正常二倍体細胞へも適応向上が望まれます。それが ViaFect でも可能か、まずは確立された KIF2A ゲノ ムを標的とする TALEN のプラスミド発現ベクター [7] を導入して、ゲノム切断効率を比較検討しました。SURVEYOR 遺 伝子変異検出キット (Box 3) を用いた検討では、やはり GFP 発現で最も相性がよかった ViaFect が特にゲノム切断効率が 良い結果となりました ( 図３)。 図２：ViaFect との他社製品の hTERT RPE-1 細胞における GFP 発現効率比較 hTERT RPE-1 細胞に GFP 発現ベクターをほぼメーカー指定に準ずる条件で導入し、 サンプルチェックしました。(A) 蛍光顕微鏡写真。(B) イムノブロッティング。 図３：ViaFect と他社製品の hTERT RPE-1 細胞における TALEN 切断効率比較 hTERT RPE-1 細胞にほぼメーカー指定に準ずる条件で KIF2A を標的とする TALEN ベ クターを導入し、SURVEYOR assay にてゲノム切断効率をチェックしました。この電 気泳動では、矢印の断片量が TALEN による部位特異的ゲノム切断を反映します。原理 は Box 3 参照。 Box 3. SURVEYOR 遺伝子変異検出キット（Integrated DNA Technologies）: ゲノム編集効果を SURVEYOR assay で確認するキット。その原理として、ゲノム 編集で生じた標的二重鎖切断は、多様な Indel mutation として修復されます。そ のため標的部位を PCR 増幅するとミスマッチを含んだ増幅断片になります。これを DNA のミスマッチを認識して切断する特殊なヌクレアーゼで処理すれば、その切断 率に応じてゲノム編集効率を間接的に評価できます。そのための酵素を含むキット です。 部位特異的ゲノム切断を 反映する断片 ネガコン ViaFect R 社9 L社 X L社3 DNAマーカー (bp) 400 300 100 200 ViaFect R社9 L社X L社3 ViaFect R社9 L社X L社3 GFP GAPDH ViaFect R社9 L社X L社3 GFP GAPDH ViaFect R社9 L社X L社3 (A) (B) ネガコン ViaFect R社9 L社X L社3 DNA マーカー ４．ViaFectの効用 　正常二倍体細胞は、がん細胞に比べて遺伝子導入やゲノム改変が難しい傾向にあります。これは、自然な生物学的特性で すが、生体への成果還元を意識した研究、特に分化・再生研究にとっては大きな障壁となります。このような障壁を乗り越 えるためには高価な電気穿孔装置や、やや扱いに煩雑なレンチウイルスベクターが効果的ですが、現状ではやや汎用的でな い印象があります。今回紹介した ViaFect は一例ではありますが、正常二倍体細胞で生存率と遺伝子導入効率の両立を簡便・ 短時間に実現し、ゲノム編集の一端を垣間見た点で、費用対効果の高い試薬ではないかと思います。今後もドナー DNA と の人工ヌクレアーゼの併用次第では、点変異導入や時限ノックアウトなどのより高度なゲノム編集と、それによる高度な分 子基盤解析が期待できます。 　これにより、中心体や一次線毛研究のみならず、正常二倍体細胞に特有な現象全般の萌芽的な研究促進につながるのでは ないかと思います。例えば、細胞周期のブレーキやその病理であるがんの研究、また分化同様に増殖休止に付随する老化や 幹細胞の研究 [1] にも効用が期待できるのではないかと思います。 ５．最後に 　医学還元を目指す研究では、培養系以上に外因にさらされる生体組織を用いて、再現性やさらなる高次現象に挑戦するこ とが必要になってくるでしょう。生体の分化細胞への遺伝子導入は培養不死化細胞以上に難易度の高いことで知られていま す。今後も開発されるであろう新しい遺伝子導入試薬が、ベンチトップの集合知によって、人々のさらなる幸せに貢献する ことを期待します。 　最後に、実績のある TALEN ベクター [7] をポジティブコントロールとして快くご提供くださいました広島大学原爆放射 線医科学研究所の宮本達雄講師・松浦伸也教授の善意に深くお礼申し上げます。 参考文献 1. 猪子誠人 , 稲垣昌樹 : 一次線毛動態による新たな細胞増殖制御機構～トリコプレイン―オーロラ A キナーゼ経路～ , 化 学と生物（日本農芸化学学会誌）Vol.51, No.8, 524-533. 2013 2. Inoko A, Matsuyama M, Goto H, Ohmuro-Matsuyama Y, Hayashi Y, Enomoto M, Ibi M, Urano T, Yonemura S, Kiyono T, Izawa I, Inagaki M. Trichoplein and Aurora A block aberrant primary cilia assembly in proliferating cells. J Cell Biol. 197(3):391-405. 2012 3. Ben Short. In Focus: Trichoplein keeps primary cilia silent. J Cell Biol. 197:341, 2012（文献２の紹介記事） 4. Web サイト「猪子 誠人 – 研究者 – researchmap」にもまとめてあります。http://researchmap.jp/read0164677/ 5. Kiyono T. Molecular mechanisms of cellular senescence and immortalization of human cells. Expert Opin Ther Targets. 11(12):1623-37. 2007 6. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8(11):2281-308. 2013 7. Miyamoto T, Hosoba K, Ochiai H, Royba E, Izumi H, Sakuma T, Yamamoto T, Dynlacht BD, Matsuura S. The Microtubule-Depolymerizing Activity of a Mitotic Kinesin Protein KIF2A Drives Primary Cilia Disassembly Coupled with Cell Proliferation. Cell Rep. 10:664-673. 2015 製品名 サイズ カタログ番号 価格（¥） ViaFect ™ Transfection Reagent 0.75 ml E4981 55,000 2 x 0.75 ml E4982 88,000 0.75 ml は 24 ウェルプレートで約 500 ウェル分のトランスフェクションに十分な量です。 関連製品 テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982 ● E-Mail : prometec@jp.promega.com PKS1506-01 販売店 日本語 Web site：www.promega.co.jp プロメガ株式会社 本　　　社　〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所　〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2015年6月現在のものであり予告なしに変更することがあります。 　細胞は細胞膜に存在する膜蛋白質を通じ、情報の伝達や栄養分等の取り込み・排出などを行ないます。今後の医薬 品の標的の大半は哺乳類由来の膜蛋白質であるとされ、哺乳類膜由来膜蛋白質を高純度で大量に精製する技術が学術・ 社会的に求められています。最近我々は、変異アデノウィルス / 哺乳類培養細胞系を用いた大量発現と HaloTag® に よる精製を組み合わせ、ウサギ由来のカルシウムポンプ蛋白質 SERCA1a（分子量約 110k）の大量発現・精製に成 功しました。培養液 1L 当たり約 4 mg と驚異的な発現量を達成しています。また、結晶化にも成功し、X 線結晶構 造解析の結果を最近 Nature 誌（参考文献）に発表しました。我々の研究室では、本手法を用いて他の多数の膜蛋白 質の発現・精製にも成功しております。本手法は今後の膜蛋白質の機能・構造解析にも有用なツールの 1 つとなる と思われますので、ここで紹介をさせて頂きたいと思います。 　RNA 結合蛋白質は、転写、スプライシングなどの修飾、RNA の安定性制御、翻訳など、RNA の代謝を様々なレ ベルで調節しています。また、蛋白質をコードした mRNA のみならず、non-coding RNA の発現や機能調節にも関 与しています。最近の報告 (Castello et al, Trends in Genetics, 2013) によれば、我々ヒトの体には 1,500 個もの RNA 結合蛋白質が存在している可能性が示唆されていますが、具体的な機能が特定できているものは限られていま す。このため、各 RNA 結合蛋白質の標的を網羅的に同定することが、機能を明らかにする上でも重要です。蛋白質 に結合する RNA の回収には、従来 RIP (RNA immunoprecipitation) 法が用いられてきました。これは、原理的に は DNA を標的とした ChIP (Chromatin immunoprecipitation) 法と同じで簡便ではありますが、RNA を抽出する までに弱く結合した RNA を相当量失ってしまうことや、非特異的に結合した RNA が混入してしまうなど弱点も多 いのが実情です。このため、これらの諸問題を解決するべく、CLIP (UV crosslinking and immunoprecipitation) 法やその改変法である PAR (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced)-CLIP 法 (Hafner et al, Cell, 2010) な どが開発されてきました。 　我々の研究室では、HaloTag® を利用した PAR-CLIP 法の確立に取り組んできました。その結果、これまで具体的 な機能が特定できていなかった Ataxin-2 の標的と機能を明らかにすることに成功し、最近 Molecular Cell 誌 ( 参考 文献 ) に発表しました。本手法は、今後の RNA 研究に欠かせないツールの１つとなることが期待されますので、こ こで紹介させていただきます。 　マイクロ RNA(miRNA) は、約 21~25 ヌクレオチド鎖長の機能性小分子 RNA です。その miRNA をコードする 遺伝子はゲノム上に数百から数千種類存在し ( ヒトゲノム上には 2,588 種類の miRNA が存在しています *)、主に RNA ポリメラーゼ II によって転写されています。初期 miRNA 転写産物 (primary miRNA: pri-miRNA) は、核内 でプロセッシングをうけステム・ループ構造を持った miRNA 前駆体 (precursor miRNA: pre-miRNA) になります。 その後、pre-miRNA は細胞質に移動し、Dicer のプロセッシングを受けて二本鎖の miRNA になり RNA-induced silencing complex (RISC) に取り込まれます。最終的には片方の一本鎖 miRNA が RISC に残り、その塩基配列 に基づく遺伝子発現抑制が惹起されます。発現抑制は miRNA と相補的または一部相補的なメッセンジャー RNA （mRNA）に対して起こります。そのため、１種類の miRNA が複数の遺伝子の発現調節に関わっています。このユ ニークな遺伝子発現調節はさまざまな生命現象・生命機能に関わり、さらに病気にも関連しています。したがって、 miRNA の発現状況や活性状態はそれらとの関係を調べるうえで重要な情報となります。 （* 2014 年 11 月 28 日現在） プロメガ株式会社 0L&KHFN PL51$バイオセンサークローンを用いた PL51$が関わる遺伝子発現抑制の網羅的解析 はじめに マイクロ51$PL51$は、約fヌクレオチド鎖長の機能性小分子51$です。そのPL51$をコードする遺伝子はゲノム上に数百から 数千種類存在しヒトゲノム上には種類のPL51$が存在しています、主に51$ポリメラーゼ,,によって転写されています。初期 PL51$転写産物SULPDU\ PL51$ SULPL51$は、核内でプロセッシングをうけステム・ループ構造を持ったPL51$前駆体SUHFXUVRU PL51$ SUHPL51$になります。その後、SUHPL51$は細胞質に移動し、’LFHUのプロセッシングを受けて二本鎖のPL51$になり51$ LQGXFHG VLOHQFLQJ FRPSOH[ 5,6&に取り込まれます。最終的には片方の一本鎖PL51$が5,6&に残り、その塩基配列に基づく遺伝子発 現抑制が惹起されます。発現抑制はPL51$と相補的または一部相補的なメッセンジャー51$（P51$）に対して起こります。そのため、 １種類のPL51$が複数の遺伝子の発現調節に関わっています。このユニークな遺伝子発現調節はさまざまな生命現象・生命機能に関わり、 さらに病気にも関連しています。したがって、PL51$の発現状況や活性状態はそれらとの関係を調べるうえで重要な情報となります。 （ 年月日現在） コンストラクトの設計 PL51$が関与する遺伝子発現調節を簡単に調べるために、PL51$のターゲットとなるリポーター遺伝子の構築を行いました。解析対象 となるPL51$の相補配列を’1$合成し（二本鎖のオリゴ’1$にする）、それをSVL&+(&.™ベクターがコードするウミシイタケルシ フェラーゼ遺伝子の’非翻訳領域’875に挿入してPL51$バイオセンサークローンを構築しました。’875にPL51$の相補配列を挿 入することでアミノ酸コドンフレームを気にすることなく、つまり、ルシフェラーゼのアミノ酸コードを変えることなくPL51$のター ゲットレポーター遺伝子を構築することができます。この方法で種類のPL51$バイオセンサークローンを構築しました。 PL51$バイオセンサークローンのウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子’875に はPL51$と結合する相補配列が存在します。解析対象のPL51$が5,6&に取込まれ 機能性小分子51$として働いている場合、その相補配列をもったルシフェラーゼ遺 伝子は配列特異的な転写後抑制を受けます［51$ LQWHUIHUHQFH 51$Lと同じ発現 抑制］。その結果、ウミシイタケルシフェラーゼ（タンパク質）の発現が下がり、 そして酵素活性が低下します。したがって、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を調 べることで、5,6&に取込まれ実際に機能しているPL51$の発現抑制活性を調べる ことができます（図）。 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター 神経研究所 神経薬理研究部 北條浩彦 先生 Vol. 3 図１：0L&KHFN PL51$バイオセンサークローンの作用機序 各 PLFUR51$ 標的配列は69 プロモーター制御下にあるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝 子の停止コドンの下流、 非翻訳領域に挿入しています。このため、PLFUR51$ 標的配列を含ん だウミシイタケルシフェラーゼ転写物が発現します。ウミシイタケルシフェラーゼ転写物は検討 対象のPLFUR51$ によってその翻訳が影響を受けるので、その結果を発光値として検出するこ とができます。 熱ストレスとPL51$が関わる遺伝子発現制御 PL51$が関わる遺伝子発現制御が熱ストレス下で影響を受けるか否かについて0L&KHFN PL51$バイオセンサークローンを用いて調べ ました。+H/D細胞に種類の0L&KHFN PL51$バイオセンサークローンとコントロールのSVL&+(&.™ベクター（PL51$のターゲット 配列を持たない）をトランスフェクションし、時間後、℃の熱処理を行いました。熱処理後、デュアル・ルシフェラーゼアッセイを 行い、ウミシイタケルシフェラーゼの活性（ターゲット）をホタルルシフェラーゼの活性（コントロール）で正常化し、さらに SVL&+(&.™ベクター（PL51$のターゲット配列を持たない：抑制を受けない）を導入した細胞から得られた正常化ウミシイタケルシ フェラーゼの値を基にそれぞれの発現抑制値を算出しました。得られた℃の発現抑制値を通常の℃培養で得られた発現抑制値と比較 したところ、多くのPL51$が関わる遺伝子発現抑制が熱処理後に亢進しているように観察されました（図）。おもしろいことに’1$ チップを用いたPL51$の発現解析の結果、熱処理をしてもPL51$の発現に大きな変化が表れていないことが示されました。PL51$が関わ る遺伝子発現抑制の亢進にはPL51$の発現量は関与していないと考えられます。 0L&KHFN PL51$バイオセンサーの作用機序 プロメガ株式会社 +DOR7DJ®を用いた 蛋白質に結合する51$の網羅的解析 コンストラクトの設計 S)1$ベクターをベースにした、+DOR7DJの1末端融合型ヒト$WD[LQ発現ベクターを、プロメガ社から購入しました )OH[L® 25) &ORQH。これをテンプレートにして、様々な変異体も作成しました。蛋白質の発現量にもよりますが、3$5&/,3法では細胞が大量に必要 となるため FPプレートで〜枚、これらのベクターを哺乳類培養細胞に導入し、安定発現細胞株を樹立しました。 3$5&/,3法によるサンプル調整 図に、3$5&/,3法の流れを示します。実験ステップが多いの で、51$を失ったり、分解してしまわないように細心の注意を払う 必要があります。はじめに、細胞を回収する前夜に、培養液中に チオウリジン 68を添加し、これをウリジンの代わりに51$に 取り込ませます。68を含む51$は、長波長紫外線照射によって、 蛋白質と強力に架橋します。次に&HOO O\VLV EXIIHU プロメガを用 いてFHOO O\VDWHを回収し、0DPPDOLDQ 3URWHLQ 3XULILFDWLRQ 6\VWHP プロメガを用いて、+DOR$WD[LQ複合体をビーズに結 合させます。ビーズ上で、次世代シーケンサーで読める程度に51$ を短くし、放射線でラベルをします。（裏面へ続く） 大阪大学大学院医学系研究科 神経遺伝学講座 河原 行郎 先生 Vol. 2 +DOR7DJ®を選んだ理由 免疫沈降が可能なタグには)/$*をはじめとして複数あります。これらは、抗体を使った沈降法ですが、+DOR7DJは、ビーズと共有結 合するため抗体を必要とせず、結合力が高い点も魅力でした。抗体の性状に左右されないため、一旦手法を確立すれば、他の蛋白質への 汎用性が高いことも魅力でした。また3$5&/,3法では、ビーズに51$蛋白質複合体が結合した状態で、リンカーの付加や放射線による ラベリングなど様々な酵素反応を行う必要があります。このとき、バッファーに高濃度の’77が含まれていることがあり、抗体への影響 が懸念されますが、+DOR7DJならその影響を最小限に抑えられます。一方で、共有結合であるため、蛋白質をビーズから再度外すこと は難しく、沈降した蛋白質は、+DOR7(9 3URWHDVHプロメガを用いて+DOR7DJを切断し抽出します。このため、タグに非特異的に結 合してしまう蛋白質や51$の混入リスクも軽減することが可能です。 図 ：PAR-CLIP法による蛋白質に結合するRNAの回収方法の概略 細胞培養液に68添加 長波長89照射による 51$蛋白質架橋 +DOR7DJ®による 51$蛋白質複合体沈降 51DVHによる結合51$の 断片化 5. 3’アダプター付加、 5’末端放射線ラベル 6’63$*(電気泳動 51$蛋白質複合体の 切り出し 51$断片の回収 9. 5’アダプター付加 573&5 網羅的シーケンス HaloTag® RBP 沈降 架橋 はじめに 51$結合蛋白質は、転写、スプライシングなどの修飾、51$の安定性制御、翻訳な ど、51$の代謝を様々なレベルで調節しています。また、蛋白質をコードしたP51$ のみならず、QRQFRGLQJ 51$の発現や機能調節にも関与しています。最近の報告 &DVWHOOR HW DO 7UHQGV LQ *HQHWLFV によれば、我々ヒトの体には個も の51$結合蛋白質が存在している可能性が示唆されていますが、具体的な機能が特定 できているものは限られています。このため、各51$結合蛋白質の標的を網羅的に同 定することが、機能を明らかにする上でも重要です。蛋白質に結合する51$の回収に は、従来5,3 51$ LPPXQRSUHFLSLWDWLRQ法が用いられてきました。これは、原理的 には’1$を標的とした&K,3 &KURPDWLQ LPPXQRSUHFLSLWDWLRQ法と同じで簡便では ありますが、51$を抽出するまでに弱く結合した51$を相当量失ってしまうことや、 非特異的に結合した51$が混入してしまうなど弱点も多いのが実情です。このため、 これらの諸問題を解決するべく、&/,3 89 FURVVOLQNLQJ DQG LPPXQRSUHFLSLWDWLRQ 法やその改変法である3$5 3KRWRDFWLYDWDEOH5LERQXFOHRVLGH(QKDQFHG&/,3法 +DIQHU HWDO&HOOなどが開発されてきました。 我々の研究室では、+DOR7DJを利用した3$5&/,3法の確立に取り組んできました。その結果、これまで具体的な機能が特定できてい なかった$WD[LQの標的と機能を明らかにすることに成功し、最近0ROHFXODU&HOO誌 参考文献に発表しました。本手法は、今後の51$ 研究に欠かせないツールの１つとなることが期待されますので、ここで紹介させていただきます。 51$断片の標識、回収、 逆転写、シーケンス 4SU 4SU 4SU 89照射 プロメガ株式会社 +DOR7DJ®による膜蛋白質の大量精製例 はじめに 細胞は細胞膜に存在する膜蛋白質を通じ、情報の伝達や栄養分等の取り込み・排出などを行ないます。今後の医薬品の標的の大半は哺 乳類由来の膜蛋白質であるとされ、哺乳類膜由来膜蛋白質を高純度で大量に精製する技術が学術・社会的に求められています。最近我々 は、 変異アデノウィルス哺乳類培養細胞系を用いた大量発現と+DOR7DJ®による精製を組み合わせ、ウサギ由来のカルシウムポンプ蛋白 質6(5&$D（分子量約N）の大量発現・精製に成功しました。培養液/当たり約 PJと驚異的な発現量を達成しています。また、結 晶化にも成功し、;線結晶構造解析の結果を最近1DWXUH誌（参考文献）に発表しました。我々の研究室では、本手法を用いて他の多数の膜 蛋白質の発現・精製にも成功しております。本手法は今後の膜蛋白質の機能・構造解析にも有用なツールのつとなると思われますので、 ここで紹介をさせて頂きたいと思います。 コンストラクトの設計 膜蛋白質のアミノ酸1末端や&末端には、その蛋白質の機能調節に必須な 部位がある場合も多いです。また、膜蛋白質の場合1末端には膜透過のため のシグナルペプチドを持つ場合も多く、これに対する配慮も必要でしょう。 我々は、蛋白質の特性をわきまえ、1末端への融合にはS)1.を、&末端 にはS)&.を用いています。両プラスミドは&09プロモーター下流にク ローニングサイトを持つので、哺乳類培養細胞へのトランスフェクション により目的蛋白質の一過的発現が可能です。通常我々は、まず一過的発現 を行うことで、発現蛋白質の安定性のチェックを行ないます。その後、 +DOR7DJ®を融合させた遺伝子を最終的にアデノウィルス作成のためのシャ トルベクターへ組み込み、変異アデノウィルスの作成を行っています。 発現した膜蛋白質の局在・発現量のチェック まずは、発現した膜蛋白質が細胞内の期待される場所に局在しているか を調べます。それには蛍光+DOR7DJ®リガンドを利用します。我々は +DOR7DJ® 705リガンドと+DOR7DJ® $OH[D )OXRU® リガンドの種類 を主に使用しています。705リガンドは細胞膜を透過する性質を持つため、 6(5&$Dのような小胞体膜等に局在する膜蛋白質を容易にラベル可能です。 一方、$OH[D )OXRU® リガンドは細胞膜を透過しないため、細胞外に局 在する+DOR7DJ®のみをラベルします。蛍光ラベル後に共焦点レーザー顕微 鏡を用いることで、目的膜蛋白質の局在を簡便に調べることが可能です （図左）。発現のチェックには、通常の抗+DOR7DJ®蛋白質を用いたウェ スタンブロッティング法も良いですが、+DOR7DJ®蛋白質の特性を生かした 簡便な系である、蛍光+DOR7DJ®リガンドを用いた検出法をお薦めします。 操作の簡素化が計れ、実験の時間短縮が望めます（図中、右）。 図１：使用ベクター +DOR7DJ®蛋白質の1末端への融合にはS)1.を、&末端の融合に はS)&.を用いています。 東京大学分子細胞生物学研究所 高難度蛋白質立体構造解析センター 小川 治夫 先生 Vol. 1 +DOR7DJ®を選んだ理由 発現蛋白質の精製用のタグ代表的なもののつに+LVタグがありますが、6(5&$Dのような.もある大きな膜蛋白質の精製には不向 きな場合も多いです。一方、+DOR7DJ®は+DOR7DJ®リガンドとの間で共有結合を形成することから、発現量が少なくても精製を効率よく 行えるのではないかという期待がありました。また蛍光リガンドも豊富に用意されており、共焦点レーザー顕微鏡などで発現蛋白質の局在 を調べることや、発現した蛋白量を蛍光により定量的に直接測定できるのではないかという期待があったためです。+DOR7DJ®のように商 品として流通しており、精製と蛍光ラベルの両者を簡便に行なうことが可能なタグは現在のところ存在しないのではないかと思われます。 図２ ：発現した蛋白質の局在と蛍光による発現の確認 （左）6(5&$Dを発現した細胞に+DOR7DJ® 705リガンドを反応さ せ、共焦点レーザー顕微鏡で観察を行ないました。発現6(5&$Dの 小胞体膜への局在が分かります。（中、右）発現した6(5&$Dを蛍 光+DOR7DJ®リガンドでラベルし、電気泳動を行なった結果です。 $OH[D )OXRU® リガンド（中）と705リガンド（右）を利用しま した。蛍光撮影装置（後述）により、発現蛋白質を簡便に検出でき ます。 蛍光ラベルを行なったサンプルの電気泳動後の検出には、高価な蛍光ゲルスキャナ（約千万円）の利 用が常識でした。我々の研究室では、そのように目的も限られている上に高価な器機は持ち合わせてい なく、実験開始当時は苦心しました。幸い$OH[D )OXRU® は励起波長が*)3と近いため、*)3の蛍光 撮影用に購入していた蛍光撮影装置（リライオン社製：約万円）を用いることで高感度の観察・撮影 が可能でしたが（図中）、705用の簡便に観察・撮影可能な装置がありませんでした。実際+DOR7DJ® 705リガンドは細胞膜を透過する性質を持つため、細胞に直接試薬を加えることで6(5&$Dのように小 胞体膜に局在する膜蛋白質も容易にラベル可能です。従って、$OH[D )OXRU® リガンドに比べ利点が 大きいと言えます。そこで、リライオン社に相談したところ、光源部分（緑色）を約万円で作成して 下さり、現在では図右のようなイメージを容易にかつ高感度で得ることが可能になりました。 励起用光源部（青色） （リライオン社製） これを使いました ～蛍光撮影装置～ 大阪大学大学院医学系研究科　神経遺伝学講座　 河原 行郎 先生 東京大学分子細胞生物学研究所　高難度蛋白質立体構造解析センター　小川 治夫 先生 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター　神経研究所　神経薬理研究部　北條 浩彦 先生 HaloTag® による膜蛋白質の大量精製例 HaloTag® を用いた蛋白質に結合する RNA の網羅的解析 MiCheck miRNA バイオセンサークローンを用いた miRNA が関わる遺伝子発現抑制の網羅的解析 全文は弊社 Web サイトでご覧いただけます プロメガ実験ノート バックナンバー www.promega.co.jp/jp/prometec_J/ Vol. 1 Vol. 2 Vol. 3