(最新)がん研究実験法ガイド

癌研究

プロメガの発光テクノロジーや核酸精製・増幅技術がどのようにがん研究へ応用されているのか？がん研究の各テーマごとに最新の実験例をご紹介いたします。

Focused Support for Scientists Working for a Cancer-Free World 発光ルシフェラーゼ検出テクノロジー がん免疫研究に最適 ! 細胞毒性・傷害性試験への新しいアプローチ… ………（2） 細胞死からの回避 vs 制御 細胞死メカニズムの解析…………………………………（4） がん細胞・免疫細胞の代謝変化を追え ! 細胞内代謝変化をプレートリーダーで測定………………（6） タンパク質安定化および転写活性を定量化 がんと低酸素応答…………………………………………（8） タンパク質ケミカルノックダウン 標的タンパク質を分解… ………………………………（10） シグナルの変調① GPCR によるシグナルの異常… ………………………（12） シグナルの変調② キナーゼの無秩序なシグナル…………………………（14） エピジェネティック制御の変調 最新エピジェネティクス研究ツール……………………（16） 核酸精製 & 増幅テクノロジー バイオマーカー探索 分子マーカー探索………………………………………（20） 遺伝子検査・コンパニオン診断 ゲノム不安定性と核酸精製… …………………………（22） その細胞株、大丈夫ですか ? 細胞認証試験……………………………………………（24） プロメガ テクノロジー による 最新 がん研究実験法 2019 ノーベル賞 関連 2019 年 ノーベル生理学・医学賞 細胞の低酸素応答 ! 2019 8 ページ　低酸素応答研究ツールもご覧ください。 ノーベル賞 関連分野 プロメガ株式会社 DCP Cr51 DNA LDH HiBiT- HT HiBiT – HaloTag® CMV Luciferase HaloTag® Ligand Engineered Exogenous Marker Non engineered Endogenous Marker Cell Labeling 細胞内マーカーの漏出 導入レポーターの漏出 活性化 免疫細胞 Modalities 抗体医薬 抗体薬物複合体 （ADC） 腫瘍溶解性 ウイルス 低分子・中分子 遺伝子改変 / 編集を伴う HiBiT – HaloTag® 導入法 （HiBiT Reporter Target Cell Killing Assay） HaloTag® リガンド 標識後の漏出物を HaloTag® -NanoBiT®　　で検出 （NanoBiT ® Universal　　Cell Labeling Assay） がん免疫研究に最適 ! 細胞毒性・傷害性試験への新しいアプローチ HBT ターゲット細胞の細胞毒性応答検出（基礎研究に最適） 化合物や薬剤による細胞毒性あるいは免疫細胞による細胞傷害性を共培養により測定する方法は、初期スクリーニン グまたは動物実験の代替法として一般に用いられています。1960 年代より、Cr 51 を取り込ませた細胞が障害されると Cr 51 が放出される方法が開発されて、さまざまな細胞毒性試験に利用されましたが、放射性物質の危険性、廃棄コス トなどの問題から多くのアプリケーションでは細胞内在性の酵素や分子をマーカーとして測定する Non-RI 法へシフト してきました（LDH アッセイ、DNA 染色など）。その中でも LDH は安定性に優れた酵素であることに加えてこれまでに 多くの実績があり、細胞毒性のゴールデンスタンダードマーカーとして利用されています。近年では初代培養細胞や 3D 細胞など、より生体を反映した実験系が利用されるようになり、少数の細胞でも鋭敏に細胞死を検出できる高感 度なアッセイ方法が求められています。 プロメガの発光 LDH アッセイは従来の発色法、蛍 光法よりも非常に高感度なので、これまで差が見 えづらかった実験系や暴露時間の比較的長い実験 系にも対応する優れた細胞毒性試験試薬です。 複数の細胞種が混在する中で、標的細胞の細胞死 を検出する細胞傷害性試験は抗体医薬・バイオロ ジックスおよび細胞治療（例：CAR-T、CAR-NK 細胞） などの開発で利用されます。従来法ではバックグ ラウンドが高く、低感度でしたが、プロメガの発 光タグ技術を利用すればこれまでに無い高感度な 細胞傷害性試験を行うことができます。 < 用途 > – CAR-T/TCR-T mediated killing – ADCC mediated via PBMCs – T cell mediated killing via BiTEs – 3D 細胞、オルガノイド etc 細胞毒性アッセイ比較表 マーカー 製品名（製品番号） 前作業 検出 標的細胞死 感度 リアルタイム & カイネテック HaloTag® -HiBiT & NanoBiT® HTG HBT NBT NanoBiT® Universal Cell Labeling Assay （開発中） 細胞標識 発光 ◎ ◎ △ HiBiT Reporter Target Cell Killing assay K562-HiBiT Cell Line（CS3000A06 ※） 遺伝子導入 発光 /［蛍光］ （イメージ） Raji-HiBiT Cell Line（CS3000A02 ※） ○ Reporter（HaloTag® -HiBiT）Vector（CS1956B01※） LDH LDH-Glo™ （J2380） おすすめ ! なし （内在マーカーの検出） 発光 △ ◎ ○ CytoTox96® （G1780） 発色 △ × DNA CellTox™ Green（G8741） おすすめ ! 蛍光 ○ ○ DCP CytoTox-Fluor™ （G9260） × CytoTox-Glo™ （G9290） 発光 ◎ LDH: 乳酸脱水素酵素、DCP: Dead Cell Protease　　HaloTag® については 10 ページ、HiBiT 9 ページ、NanoBiT 12 ページをご覧ください。 ※ 製品番号が CS より始まるものは正式販売前の特別品です。製品の詳細については弊社テクニカルサービス部までお寄せください。 80000 60000 40000 20000 0 -4 -3 -2 -1 0 min 30 min 60 min 90 min 120 min 150 min 180 min 210 min 240 min 270 min 0 1 Rituximab conc（Log；µg/mL） RLU NanoBiT ® Universal Cell Labeling Assay によるリアルタイム ADCC アッセイ PBMC エフェクター細胞および HaloTag® リガンドで標識された Raji（CD20+）標的細胞を 共培 養し、表 示 濃 度の Rituximab（anti-CD20）で処理し、Vivazine™ Extended Live Cell Substrate を用いてアッセイを行った。30 分毎に GloMax® Discoverで発光を測定した。 基礎 ・ 創薬 ・ 品質管理 ターゲット細胞 の毒性検出 （がん細胞） 2 DCP Cr51 DNA LDH HiBiT- HT HiBiT – HaloTag® CMV Luciferase HaloTag® Ligand Engineered Exogenous Marker Non engineered Endogenous Marker Cell Labeling Co-Stimulatory receptor CAR-T Response Element (RE) or Promoter PD-1, CTLA-4 etc TCR ADCC/ADCP レポーター導入細胞 免疫チェックポイント （共刺激） 免疫チェックポイント （抑制） Ｔ- 細胞活性化 エフェクター細胞 の活性検出 （免疫細胞） 活性化 免疫細胞 二重特異性抗体 抗体医薬 抗体薬物複合体 （ADC） 腫瘍溶解性 ウイルス Fc receptor HaloTag® リガンド 標識後の漏出物を HaloTag® -NanoBiT®　　で検出 （NanoBiT ® Universal　　Cell Labeling Assay） 簡便性と正確性に優れるレポーターベースのエフェクター活性検出法（スクリーニグ・品質管理に最適） 抗体依存性細胞傷害（ADCC）、抗体依存性細胞食作用（ADCP）、免疫チェックポイント遮断などの作用機序を利用した抗体医薬の開発では、末梢血単核球 （PBMC）、NK 細胞、T 細胞などの初代細胞をエフェクター細胞、疾患組織由来細胞をターゲット細胞として使用していましたが、これらの初代細胞をベース としたアッセイは、ドナーの違いや細胞培養の要件などにより大きなバラツキがあり、開発研究はもとより厳密さが要求される品質管理試験のクライテリア を満たすことは極めて難しいものでした。プロメガのバイオアッセイシリーズは各作用機序を有し、エフェクター活性をレポーターをベースとした発光活性に 変換したシステムとして構築されており、より簡便、安定な測定データを得ることができます。また、製品には遺伝子改変されたエフェクター / ターゲット細 胞も付属するため初代培養細胞を用意する手間も省くことができます。T 細胞活性化に対する抗 PD-1 および抗 TIGIT 免疫チェックポイント遮断抗体の相乗効 果など（下グラフ参照）についても定量的に測定でき、ICH ガイドラインに従って設計された認定試験でも適切なアッセイ精度、正確さおよび直線性が 得られます。 がん免疫研究サポート製品 活性化対照 作用機序 製品名（製品番号） T 細胞活性化 T 細胞活性化 T Cell Activation（J1621, J1651） 免疫チェックポイント阻害 PD-1/PD-L1（J1250）, CTLA-4（JA3001）, TIGIT/CD155（J2201）, LAG-3/MHC-II（JA1111）, TIM-3/CD28（CS1978C07※）, BTLA/HVEM 他 免疫システムの活性化 4-1BB（JA2351）, GITR, CD40（JA2151）, OX40, CD27, Fc γ RIIb 他 コンビネーション PD-1+CTLA-4（CS1978D04 ※）, PD-1+TIGIT（J2211）, PD-1+LAG-3（CS1978B11※）, PD-1+4-1BB（CS1978I05 ※）, PD-1+OX40 遺伝子改変 T 細胞（CAR-T） T Cell Activation（J1631, J1601） NK 細胞活性化 ADCC（ヒト Fc γ RIII, マウス Fc γ RIII or Fc γ RIV） ヒト（V variant； G7014, G7015, G7010. F variant； G9790） マウス（Fc γ RIV； M1201, M1211. Fc γ RIII；お問合せ下さい） マクロファージ活性化 ADCP ADCP（Fc γ RIIa, H variant； G9901, G9991. R variant, Fc γ RI；お問合せ下さい） 免疫細胞各種 サイトカイン・成長因子 IL-1, IL-2（JA2201）, IL4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15（JA2011）, IL-17, IL-23, VEGF（GA2001）, RANKL, TGF- β , TNF α , INF, EPO ※ 製品番号が CS より始まるものは正式販売前の特別品です。製品の詳細については弊社テクニカルサービス部までお寄せください。 ※ その他リコンビナント細胞の作製受託サービスについては弊社までお問合せください。 75,000 50,000 25,000 0 Luminescence (RLU) WIL2-S, Jurkat/NFAT-luc + FcγRllla, rituximab NO WIL2-S, Jurkat/NFAT-luc + FcγRllla, rituximab WIL2-S, Jurkat-NFAT-luc (NO FcγRllla), rituximab WIL2-S, NO Jurkat/NFAT-luc + FcγRllla, rituximab WIL2-S, Jurkat/NFAT-luc + FcγRllla, NO rituximab WIL2-S, Jurkat/NFAT-luc + FcγRllla, trastuzumab Log10 [rituximab], g/ml 10487MA Target cells, eector cells and specic antibody No target cells No eector cells or no FcγRllla No antibody or nonspecic antibody { { –13 –12 –11 –10 –9 –8 –7 –6 –5 特異性の高い ADCC レポーターバイオアッセイ リツキシマブ、トラスツズマブ、コントロール培地（抗体なし） の段階希釈系列をエフェクター細胞とともにターゲット細 胞存在下あるいは非存在下で 37℃、6 時間インキュベート し、ルシフェラーゼ活性を定量した。 PD-1 + TIGIT 併用バイオアッセイによる抗 PD-1 および 抗 TIGIT 遮断抗体の相乗効果 PD-1 + TIGIT エフェクター細胞を、抗 PD-1、抗 TIGIT、または両方 の遮断抗体の存在下で PD-L1 + CD155 aAPC 細胞とインキュベー トし、ルシフェラーゼ活性を測定した。 13574MA Fold Induction Log10 [Test antibody], g/ml 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0 -9 -8 -7 -6 -5 -4 isotype control anti-PD-1 anti-TIGIT anti-PD-1 + anti-TIGIT promega.jp/adccmv 簡便操作のバイオアッセイ（ビデオ） より詳細については… 機能バイオアッセイ promega.jp/fcbioasy 3 がん細胞は増殖を阻害する腫瘍抑制経路を回避し、老化やアポトーシスからも逃れることによって増殖を続けます。そのため、研究者はがんを治療するた めにがん細胞の増殖を止めたりアポトーシスを起こさせてがん細胞を殺すための薬剤を探し続けています。また、オートファジーについてもがんの生存と の関連が報告されており、オートファジーを標的とした創薬なども行われています。培養細胞を用いたリアルタイムアッセイは細胞の生存性、細胞毒性あ るいはアポトーシスを継続的にモニタリングすることができるため、薬物治療で投与量や暴露時間を決定する上で大変役に立ちます。また、3D 培養系は 2D 培養系に比べて腫瘍の微小環境をより正確に反映するため、抗がん剤開発におけるモデルとして重要視されています。また、複数のアッセイを組み合 わせることで細胞死メカニズムに関する重要な情報を明らかにすることができます。例えば細胞がアポトーシスあるいはネクローシスのどちらにより死ぬ のかを明らかにしたり、細胞死と細胞増殖阻害を見分けることもできます。CellTox™ Green とエンドポイントカスパーゼアッセイ（CaspaseGlo® ）あるいはリアルタイムアポトーシスアッセイ（RealTime Glo™ Annexin V Apoptosis Assay）と組み合わせれば、観察された細胞毒性 がアポトーシスによるものかどうかを決定することができます。さらに、細胞毒性試験と発光または蛍光細胞生存試験との組み合 わせで細胞毒性と細胞増殖阻害を見分けることもできます。 FLC 細胞生存試験による腫瘍残存（Tumor Persistence）の評価 CellTiter-Glo® は細胞内の ATP に比例した発光を測定することにより生存細胞を測定します。3D 細 胞用にファインチューニングされた CellTiter-Glo® 3D は細胞塊の中心にも試薬が浸透するための生 細胞量を正確に測定することができます。 NBT アポトーシス検出によるバイオロジクス試験 トラスツズマブエムタンシンは FDA に認可された乳がん治療に用いられる抗体薬物複合体（ADC） です。感受性がん細胞に過剰発現するヒト上皮成長因子 2（HER2）受容体に結合するモノクローナ ル抗体標的部位（トラスツズマブ）に毒性薬剤（エムタンシン）を搭載して細胞内に侵入して破壊し ます。以下のデータでは、SKBR3 HER2+ 細胞をトラスツズマブエムタンシンで処理し、RealTimeGlo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay を用いて用量および時間依存的なアポトーシスおよび 二次ネクローシスについて未処理コントロールと比較しています。薬剤投与 52 時間以上にわたり アポトーシスとネクローシスを高感度に検出することができます。（ベースとなる NanoBiT® について は 12 ページを参照） 100 50 0 -9 -8 -7 -6 Log（compound）, M % of Untre ated Control bortezomib paclitaxel Viable panobinostat HepG2 HCT-116 100 50 0 -9 -8 -7 -6 log（compound）, M % of Untre ated Control Viable bortezomib panobinostat CellTiter-Glo® 3D による残存するがん細胞の検出 薬剤暴露後 48 時間後に処理したスフェロイドに CellTiter-Glo® 3D 試薬を添加した。インキュベーション 10 分後に ATP に由 来する発光を測定した。パクリタキセルはボルテゾミブやパノビノスタットと同等の効力を示したがある程度の生細胞が残 存した（左：HepG2 細胞）。ボルテゾミブはパノビノスタットよりもより高い効力を示したが、完全な細胞毒性は示されなかっ た（右：HCT-116 細胞）。エンドポイントの細胞生存試験は細胞毒性の最大効果を明確にする上で有用。 RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay によるアポトーシスおよび二次ネクローシスの検出 SKBR3 HER2+ cells（10,000/well in 96-well plate）を抗体薬物複合体（トラスツズマブエムタンシン）で処理し、表示時間に アポトーシス［ホスファチジルセリン：アネキシン V 結合（パネル ］ A）およびネクローシス［細胞より漏出した DNA 蛍光染色］ （パネル B）を検出した。 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 –20 0 20 40 60 80 100 120 140 SKBR3 cells (HER2+) Kinetic RLU reads – PS:Anx V Binding A. B. % RLU increase over untreated controls trastuzumab emtansine [µg/ml] 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 0 1000 2000 3000 4000 SKBR3 cells (HER2+) Kinetic RLU reads – Membrane Integrity Fluorescence (RFU) trastuzumab emtansine [µg/ml] 4 hrs 7 hrs 24 hrs 30 hrs 48 hrs 52 hrs U2OS 細胞にスタウロスポリン（終濃度 1 µM）を添加し、 アポトーシスを誘導した。発光イメージングシステム LV200（Olympus）にてイメージングを行い、Annexin V の 発光（Blue）とネクローシスの蛍光（Green）の像を重ね あわせた。＜オリンパス社 のご厚意によりデータ提供＞ 創薬 ・ 基礎 Nec r o sis CASPASE-9 ATP ATP ATP LDH LDH LDH LDH CASPASE-8 CASPASE-8 CASPASE-8 PRO Early “Stress” – Cell-Cycle A rrest -La et C/ mo ti m det 細胞死からの回避 vs 制御 細胞死メカニズムの解析 〜マルチ・リアルタイム & 3D 〜 より詳細については… RealTime-Glo Annexin V のイメージング promega.co.jp/go?19001 4 NLC 3D 細胞・オルガノイドを用いた細胞増殖の検出 3D 細胞モデルの使用は疾患メカニズムの理解、薬剤治療の開発のために 徐々に増えています。そのプロセスには患者からのがんオルガノイドなどの 3D 培養から派生するものも含まれます。3D 培養は低分子薬剤のスクリー ニングに使用でき、疾患パスウェイの理解にも役立ちます。3D 細胞培養系 は 2D 培養系に比べてより正確に薬剤処理の有効性や毒性を予測すること ができます。プロメガの様々な細胞アッセイ試薬は 3D 細胞に対応できる 柔軟性を備えています。 RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay による患者 P2 由来大腸癌オルガノイドの 経時的な増殖 患者 P2 の 33,000 個癌細胞 / ウェルを 5 つの異なる培地（M1、M2、M3、M4 および M5）で 96 ウェルプレートに播種した。細胞生存率は、培養開始後 1、24、48 および 72 時間に RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay によってモニターした。RLU を M1 の 1 時間値に対して正 規化した。培地 M1、M2、および M4 は十分な成長を示したが、M3 および M5 は劣っていた。 製品名 サイズ カタログ番号 細胞生存性 RealTime-Glo™ MT Cell Viability 100 回分 G9711 CellTiter-Glo® 2.0 Assay（2D 細胞用） 10 ml G9241 CellTiter-Glo® 3D Cell Assay 10 ml G9681 細胞毒性 CellTox™ Green Cytotoxicity Assay 10 ml G8741 オートファジー Autophagy LC3 HiBiT Reporter Vector and Detection System 1 kit GA2550 細胞ベース生存性・毒性アッセイ試薬 製品名 サイズ カタログ番号 アポトーシス RealTime Glo™ Annexin V Apoptosis Assay 100 回分 JA1000 RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay 100 回分 JA1011 Caspase-Glo® 3/7 Assay 2.5 ml G8090 Caspase-Glo® 8 Assay 2.5 ml G8200 Caspase-Glo® 9 Assay 2.5 ml G8210 HBT HTG オートファジー細胞死研究を加速させる レポーターセンサー がんなど栄養制限によるストレスを受けた状態では、オルガネラを分解して これらの細胞成分を生合成あるいはエネルギー代謝にリサイクルするために オートファジーが誘導されます。オートファジーはがん細胞の様態に対して 逆の作用を与えることもあり、アポトーシスからがんを防御する生存機構と して働くことやアポトーシスを誘導してがん細胞を殺す場合もあります。 プロメガの Autophagy LC3 HiBiT System は、オートファジーマーカーである LC3 に HiBiT-HaloTag® モジュールを付加した融合タンパク質を発現させます。 発光法による定量測定、タンパク質ブロッティングの検出だけでなく、 HaloTag® 技術を利用した生細胞蛍光イメージングも行え、3D 培養にも対応 します。（HiBiT については 9 ページ、HaloTag® については 10 ページ参照） Autophagy LC3 HiBiT Reporter System の概要 Autophagy LC3 HiBiT Reporter には発光タグ HiBiT と蛍光リガンドと特異的に結合する HaloTag® が融合されているため、アッセイ、ゲル分析、蛍光イメージングなど様々な分析が可能 Autophagy Inhibition basal signal Increasing [inhibitor] vs. fixed[stimulator] Autophagy Stimulation Luminescence（RLU） [Compound] Halo Tag LC3 Autophagy LC3 HiBit Reporter HiBiT Targeting to autophagy pathway Reporter localization to autophagosomes HaloTag imaging assay format HibiT blotting assay format HiBiT-HaloTag-LC3-l HiBiT-HaloTag-LC3-ll Plate reader assay format Nec r o sis CASPASE-9 ATP ATP ATP LDH LDH LDH LDH CASPASE-8 CASPASE-8 CASPASE-8 PRO Early “Stress” – Cell-Cycle A rrest -La et C/ mo ti m det より詳細については… 3D 細胞培養入門 promega.jp/3dguide 5 腫瘍微小環境中の細胞はエネルギーを奪い合う中で、生存性・機能性を維持するために代謝様式を変化させ、うまく適応しなければなりません。このような 環境におけるがん細胞あるいは免疫細胞に関する代謝の要件や弱点を特定することは、より効果的な癌治療の開発に役立つ可能性があります。 プロメガは、以下の重要な細胞代謝経路をモニタリングするための発光代謝アッセイを開発しました。グルコースによる解糖および乳酸の検出、グルタミンお よびグルタミン酸測定によるグルタミノリシス、グリセロールとトリグリセリド測定による脂肪分解と脂質生成などを調べることができます。アッセイは共通 の NAD（P）H 生物発光検出技術を利用しており、細胞ライセート、培地、組織、血漿 / 血清など様々なサンプルタイプに適応します。感度が高いため極微量 のサンプルからでも測定でき、同じサンプルから複数種類の代謝物を測定することや、経時的な測定を行うことも可能です（培地を使用した残りの細胞も他の アッセイに使用することもできます）。 メタボローム解析受託 公益財団法人かずさ DNA 研究所を委託業務実施機関としたメタボローム解析受託 サービスを開始しました。ご興味のある方は弊社までお問合せください。 グリコリシスからグルタミノリシス がん細胞は成長のために酸素存在下でも主なエネルギー源として解糖系を利用する“好気的解糖”を使うように自身のエネルギー代謝系をリプログラミング します。グリコリシス（解糖）はがんにおけるグルコースの消費と乳酸の分泌を、グルタミノリシスはグルタミンおよびグルタミン酸レベルを生細胞で分析す ることによりモニタリングすることができます。休止から増殖への代謝変化は乳酸の分泌および酸素の消費をともなうグルコースおよびグルタミンの取込量 の増加で特徴づけられます。また、がん細胞では活性酸素種（ROS）を蓄積することで酸化ストレスレベルが増大します。 同じサンプルから複数の代謝物を測定 表示の時間に A549 細胞の培地より各代謝物を GlucoseGlo™ および Lactate-Glo™ （パネル A）、 Glutamine/ Glutamate-Glo™ （パネル B）Assay を用いて測定した。 Luminescence Time (hours) 0 8 24 48 72 1,800,000 15,000 cells/well 1,400,000 600,000 200,000 1,000,000 0 Glucose Consumption and Lactate Secretion Glucose-Glo™ Lactate-Glo™ Luminescence Time (hours) 0 800,000 400,000 200,000 600,000 0 8 24 48 72 15,000 cells/well Glutamine Glutamate-Glo™ Glutamine Consumption and Glutamate Secretion ホタルルシフェラーゼ発光反応ベースの高感度アッセイ プロメガはこれまでにルシフェラーゼ発光反応を構成するルシフェラーゼ発光酵素、 ルシフェリン、ATP を利用した生体分子の高感度アッセイを数多く開発してきました (CellTiter-Glo® 、ADP-Glo™ 、Proteasome-Glo™ など）。さらに、様々な酵素反応の補 酵素である NAD（P）H をルシフェリンと結びつけることで、高感度な代謝物アッセイ シリーズとして新たに加わりました。これらのアッセイ系は培地や細胞をサンプルとし て使用できる汎用性も備えています。 ※特注製品：開発中の特別注文品です。 ご興味のある方は弊社テクニカルサービス部までお問合せください。 • グルコース • 乳酸 • グルタミン酸 • グルタミン • トリグリセライド※ • グリセロール※ • コレステロール※ • コレステロールエステル※ • 分岐鎖アミノ酸［バリン、ロイシン、イソロイシン］※ • グリコーゲン※ NAD(P)H NAD(P) ルシフェリン前駆体 ルシフェリン ルシフェラーゼ ATP デヒドロゲナーゼ レダクターゼ Light Light FLC 創薬 ・ 基礎 がん細胞・免疫細胞の代謝変化を追え ! 細胞内代謝変化をプレートリーダーで測定 promega.co.jp/go?19017 6 T 細胞活性化とグリコリシスの誘導 プロメガの発光アッセイを用いて腫瘍細胞株および T 細胞の代謝活性を調 べることができます。グリコリシスへの切換えと乳酸分泌の経時的な増加 をモニタリングすることによって、in vitro での T 細胞活性化とそのエネルギー 源に関する研究に利用することができます。 Glucose Glucose Secreted Glycolysis Lactate Lactate G6P = glucose-6-phosphate Ac-CoA = acetyl coenzyme A αKG = α-ketoglutarate G6P Pyruvate Pentose Phosphate and other pathways Nucleotides, Proteins, Lipids NADP+ NADPH Nonessential amino acid synthesis Glutamine Glutamine Glutamate Glutamate Glutamate Glutamate αKG Krebs cycle NAD+ NAD+ NAD+ Oxidative phosphorylation NADH NADH ADP ADP ATP ATP CO2 O2 Ac-CoA Reactive oxygen species Cystine Cystine Glycine Glutathione Glucose Uptake-Glo™ Assay Glucose-Glo™ Assay NADP/NADPH-Glo™ Assay NAD/NADH-Glo™ and CellTiter-Glo® 2.0 Assays Glutamate-Glo™ and Glutamine/Glutamate-Glo™ Assays Glutamate-Glo™ Assay GSH/GSSG-Glo™ and GSH-Glo™ Assays ROS-Glo™ Assay Lactate-Glo™ Assay CellTiter-Glo® 2.0 Assay NAD/NADH-Glo™ Assay 24h 48h 72h 96h 500,000 Glucose Utilization RLU 400,000 300,000 200,000 100,000 anti-CD3 anti-CD3/anti-CD28 0 24h 48h 72h 96h 500,000 Lactate Secretion RLU 600,000 400,000 200,000 anti-CD3 anti-CD3/anti-CD28 0 T 細胞活性化にともなう代謝変化の検出 ヒト末梢血 T 細胞（5 mM グルコースおよび +/- 2 mM グルタミンを含む培地 100 µl に懸濁した 細胞 250,000 個）を磁性体ビーズに固定した抗 CD3 および抗 CD28 抗体により活性化させた。 代謝経路阻害剤の迅速な解析 培地サンプルを表示時間に分取してグルコースおよび乳酸の測定に使用した。 代謝経路は環境の変化に応答あるいは、酵素阻害剤などの低分子化合物に よって変化します。以下の実験ではグルタミナーゼ阻害剤（BPTES）または グリコリシス経路の阻害剤（2DG） 添加によるグルタミンおよび乳酸の急激 な減少を検出しています。 がん細胞における化合物添加による代謝変化の追跡 SKOV-3 卵巣がん細胞を 384 プレートで化合物とともに 37℃ 1 時間インキュベートした後、各 ウェルに直接グルタミン酸および乳酸検出試薬を添加した。乳酸またはグルタミン酸の減少 は細胞生存性の低下（RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay）や検出試薬による干渉（グルタミン 酸または乳酸スタンダードで測定）によるものではなかった。 トリグリセライドの蓄積 トリグリセライドは細胞溶解した後にトリグリセライドを消化してグリセロー ルを放出させることで測定することができます。リパーゼを含む非有機性溶 解液を用いて 96 ウェルプレート中の細胞を直接溶解することができます。 RLU triglyceride（uM） 20,000,000 15,000,000 10,000,000 5,000,000 0 200 150 100 50 0 control +FA 肝がん細胞におけるトリグリセライドの蓄積 HepG2 細胞（20,000 個 / ウェル）を完全培地を 含む 96 ウェルプレートに播種した後、0.3 mM のリノール酸およびオレイン酸結合 BSA 含有 （赤色バー：+FA）または不含（青色バー：コン トロール）の血清フリー培地に交換した。オー バーナイトでインキュベーションし、培地を除去 した後に細胞を洗浄し、リパーゼを含む溶解液 でライセートを調製した。これをトリグリセラ イド検出アッセイで脂質の蓄積を測定した。 細胞ベース代謝アッセイ試薬 製品名 サイズ カタログ番号 Glucose Uptake-Glo™ Assay 5 ml J1341 Lactate-Glo™ Assay 5 ml J5021 Glucose–Glo™ Assay 5 ml J6021 Glutamate-Glo™ Assay 5 ml J7021 Glutamine/Glutamate-Glo™ Assay 5 ml J8021 BCAA-Glo™ Assay（分岐鎖アミノ酸） – CS306201※ Glycerol/Triglyceride-Glo – CS2061A01※ Cholesterol/Cholesterol ester Kit – CS2061A02 ※ ROS-Glo™ H2O2 Assay 10 ml G8820 GSH/GSSG-Glo™ Assay 10 ml V6611 GSH-Glo™ Glutathione Assay 10 ml V6911 NAD/NADH-Glo™ Assay 10 ml G9071 NADP/NADPH-Glo™ Assay 10 ml G9081 ※ 製品番号が CS より始まるものは正式販売前の特別品です。製品の詳細については 弊社テクニカルサービス部までお寄せください。 Cell Glutamate Detection System Viability 120 100 80 60 40 20 0 -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 Log（BPTES）, µM Cell Lactate Detection System Viability 120 100 80 60 40 20 0 -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 Log （2DG）, mM 乳酸 % コントロール グルタミン酸 % コントロール より詳細については… エネルギー代謝の変化 promega.jp/metab より詳細については… 発光代謝アッセイ（論文） promega.jp/lgggpd Activation Glycolysis Glucose Lactate 7 HILDPA ANKRD37 BNIP3 KLF10 OH 阻害剤 または 低酸素状態 標的遺伝子 発現 プロテアソームによる 分解 酸素正常状態 HRE 応答配列 OH HiBiT HIF1α HIF1α PHD PHD : プロリル水酸化酵素 HIF1α 固形がんに認められる低酸素環境はがんの悪性化などに関わることが明らかとなり、“環境標的治療”のターゲットとして有望視されています。中でも低酸素 誘導因子 1A（HIF1A）は、細胞の低酸素環境への応答を制御する転写因子であり、血管新生、細胞生存、転移、グルコース代謝など、腫瘍形成のさまざまな 側面に関与する遺伝子の発現を調節しています。また、その過剰発現または低酸素症による安定化は、がん患者の予後不良と関連付けられており、HIF1A とそ の関連経路はがん治療法において注目されています。HIF はヘテロダイマーとして機能する転写因子であり、αサブユニットである HIF- αは酸素濃度依存的に制 御されています。プロメガの発光レポーターテクノロジーにより細胞内における HIF- αタンパク質量の変化（タンパク質レポーター）や HRE 低酸素応答配列に よる転写活性（ジェネティックレポーター）をリアルタイムにモニタリングすることができます。特に NanoLuc® ルシフェラーゼをスプリットした HiBiT ペプチド（以 下の“HiBiT テクノロジー”参照）は 11 アミノ酸であるためゲノム編集による内在性の標的遺伝子へのノックインが容易で、発現ベクター導入による過剰発現に 比べてより生理的な応答性を得ることができます。 創薬 ・ 基礎 タンパク質安定化および転写活性を定量化 がんと低酸素応答 HBT HiBiT によるタンパク質安定化の定量化 低酸素誘導因子 -1A（HIF1A）のタンパク質レベルは、プロリン残基のヒドロ キシル化と VHL によるユビキチン化により、通常の基底状態では低く保た れます。低酸素条件または 1, 10-フェナントロリンなどの化合物によるプロ リルヒドロキシラーゼの阻害は、迅速に HIF1A タンパク質の蓄積を誘導しま す。HIF1A の蓄積は、一過性トランスフェクションを使用して CMV または PGK プロモーターを有するベクターから HIF1A-HiBiT 融合を発現させるか、 CRISPR/Cas9 遺伝子編集を使用して内因性 HIF1A 遺伝子座に HiBiT を挿入す ることで測定しました（右図）。フェナントロリン添加量の増加に従って、 HIF1A 量の用量反応性の増大が認められました。また、タンパク質発現レベ ルが低いほど蓄積の応答性が大きくなり、弱い PGK プロモーターからの発 現と CRISPR / Cas9 挿入後の内因性発現の両方で最大の倍率変化を示すこ とも観察されました。（HiBiT については 9 ページをご覧ください） 各発現コンストラクトによる HIF1A-HiBiT の応答性比較 HeLa 細胞に CMV または PGK プロモーターを含む HIF1A-HiBiT 発現コンスト ラクトを一過性にトランスフェクションまたは CRISPR/Cas9 により内在ロー カスに HiBiT を導入し、1, 10-フェナントロリンによる応答性を調べた。14287MA 1 10 100 50ng CMV/HIF1A-HiBiT 5ng CMV/HIF1A-HiBiT 0.5ng CMV/HIF1A-HiBiT 0.05ng CMV/HIF1A-HiBiT 5ng PGK/HIF1A-HiBiT Endogenous HIF1A-HiBiT clone Log10[1,10-phenanthroline], M 0 –7 –6 –5 HiBiT による HIF1 αおよび下流の各種 HIF1A 誘導タンパク質のリアルタイム蓄積アッセイ 内因性 HIF1A または各種 HIF1A 誘導タンパク質（BNIP3、ANKRD37、HILDPA、 KLF10 など）遺伝子のＣ末端に CRISPR を用いて HiBiT タグを導入し、HIF1A シグナル伝達経路に対するフェナントロリンの影響を観察しました。タンパ ク質融合体の存在量の変化は、発光をモニターすることによりリアルタイム で追跡することができました。予想どおり、フェナントロリンの添加は HIF1A の蓄積を誘発しましたが、HIF1A の下流のターゲットは、それぞれ異 なる応答性を示しました。このアッセイは、HIF1A のタンパク質レベルに対 する化合物誘導効果、および HIF1A 誘導発現パターンの変化をスクリーニン グすることができます。 HIF1 αおよび下流の各種 HIF1A 誘導タンパク質のリアルタイムアッセイ ゲノム編集により内在 HIF1 α あるいは各標的タンパク質ローカスに HiBiT を 組み込み、LgBiT を発現させるための BacMam-LgBiT も併せて HeLa 細胞に導 入した。フェナントロリンを添加した後に経時的に発光を測定した。 100 10 1 0.1 0 100 200 300 400 500 Time (min) Response HIF1α KLF10 HILDPA ANKRD37 BNIP3 HiBiT ベクター & 検出試薬 製品名 サイズ カタログ番号 HiBiT 発現ベクター pFC37K HiBiT CMV-neo Flexi® Vector 20 µg N2391 pFN38K HiBiT CMV-neo Flexi® Vector 20 µg N2401 pFN39K secHiBiT CMV-neo Flexi® Vector 20 µg N2411 検出試薬 Nano-Glo® HiBiT Blotting System 100 ml N2410 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System 100 ml N2421 ※ CRISPR/Cas9 ゲノム編集による HiBiT 発光タグのノックイン受託および細胞株については 弊社までお問合せください。 2019 ノーベル賞 関連分野 より詳細については… CRISPR による HiBiT 導入法 promega.jp/crsp1pd より詳細については… HiBiT のアプリケーション（文献） promega.co.jp/go?19002 8 HILDPA ANKRD37 BNIP3 KLF10 OH 阻害剤 または 低酸素状態 標的遺伝子 発現 プロテアソームによる 分解 酸素正常状態 HRE 応答配列 OH HiBiT HIF1α HIF1α PHD PHD : プロリル水酸化酵素 HIF1α マルチアッセイによる低酸素応答の解析 細胞のストレス応答では、重要な調節タンパク質の安定性の変 化、それに続く下流の転写調節をともないます。多くの応答経 路では、重要な転写因子の濃度および局在性は厳密に制御さ れています。Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System は NanoLuc® ルシフェラーゼ（Nluc）およびホタルルシフェラー ゼ（Fluc）を高感度に連続して測定することができるため標的 タンパク質存在量［NanoLuc®-HIF1A］および転写応答（HRE） を同一サンプルより測定することができます。さらに第 3 の細 胞情報として細胞生存マーカーも CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assayで測定することで化合物の毒性などを補正した分析が可 能になります。 iPS 由来細胞でのタンパク質安定性 センサー使用例 NanoLuc® ルシフェラーゼは、高度な細胞モデルにおけるタン パク質安定性センサーのアプリケーションも可能にします。 人工多能性幹細胞（iPSC）由来の心筋細胞は、虚血性疾患 における HIF1A シグナル伝達を研究するための魅力的な細 胞モデルです。HIF1A-NanoLuc® 融合タンパク質を一過性にト ランスフェクトした iCell® 心筋細胞で、HIF1A レベルの誘導 をモニターできます。IOX2、CoCl2、ML-228、1, 10-フェナン トロリンなどのプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤は、わずか 3 時間の刺激で HIF1A-NanoLuc® タンパク質の用量依存的な 増加をそれぞれ誘導しました。 フェナントロリンによる処理後の用量反応とタイムコース HEK293 細胞に pNLF1-HIF1A［CMV/neo］Vector（カタログ番号 N1381）および pGL4.42［luc2P/HRE/Hygro］Vector（カ タログ番号 E4001）をコトランスフェクションした。100 μＭフェナントロリンの添加後の経時的なレポーター測 定値（NanoDLR™ アッセイ（カタログ番号 N1610）を使用）を未処理細胞と比較した発光の倍率変化としてプロッ トした（パネルＡ）。細胞を CellTiter-Fluor™ 試薬（カタログ番号 G6080）とともにインキュベートし、NanoDLR™ アッセイを行う前に蛍光を測定することにより、NanoDLR™ に細胞生存率測定を追加したマルチプレックス アッセイを実施した（パネル B）。 iPS 由来心筋細胞における低酸素応答レポーターの化合物による影響 播種 3 ～ 5 日後 iCell® Cardiomyocyte に pNLF1-HIF1A [CMV/neo] Vector [ カタ ログ番号 N1381] を一過性にトランスフェクションした。トランスフェク ション 24 時間後に表示の化合物で 3 時間処理し、Nano-Glo® Luciferase Assay （カタログ番号 N1110）を用いて発光を測定した。 A. B.Luminescence (RLU) Log [M] Compound –12 –10 –8 –6 –4 –2 0 5 x 103 1 x 104 1.5 x 104 2 x 104 phenanthroline CoCl2 ML-228 IOX 2 12162MA Log [M] Compound Luminescence (RLU) phenanthroline CoCl2 ML-228 IOX 2 –12 –10 –8 –6 –4 –2 0 5 x 104 1 x 105 1.5 x 105 2 x 105 低酸素応答検出用レポーターシステム 製品名 サイズ カタログ番号 レポーターベクター pNLF1-HIF1a［CMV/neo］Vector System 20 µg N1381 pGL4.42［luc2P/HRE/Hygro］Vector 20 µg E4001 デュアルアッセイ試薬 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay 10 ml N1610 細胞生存試験 CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay 10 ml G6080 HiBiT テクノロジー 互いに親和性の高い LgBiT（17.6 kDa）と HiBiT（11 アミ ノ酸）の各サブユニットが会合することにより NanoLuc® 発光酵素が形成されて生じたシグナルをタンパク質の 検出に利用できます（右図参照）。特に HiBiT は分子量 が小さいため、タンパク質タグとして利便性が非常に高 く、ゲノム編集で内在遺伝子へ容易にノックインするこ ともできます。再会合した NanoLuc® はホタルルシフェ ラーゼの約 30 倍の発光強度を示すため、標的タンパク 質を高感度に検出することができます。 LgBiT + 基質 LgBiT + 基質 + 細胞溶解剤 LgBiT + 基質 + 基質 細胞 + 細胞/ウイルス （融合 / 感染） メンブレン 細胞 ライセート 細胞膜タンパク質、 分泌タンパク質の検出 細胞内タンパク質の 検出 ブロッティングメンブレン上の タンパク質検出 細胞内タンパク質会合による 細胞融合・ウイルス感染の検出 発現 発現 発現 発現 HiBiT HBT 13950MA Log10 [Phenanthroline] (M) HRE-luc2P HIF1A-Nluc HRE-luc2P HIF1A-Nluc CellTiter-Fluor HRE-luc2P HIF1A-Nluc A.RLU –7 –6 –5 –4 1,000,000 100,000 10,000 Log10 [Phenanthroline] (M) C. –7 –6 –5 –4 10 1 Time (hours) B. Fold Response Fold Response (log scale) 0 2 4 6 8 15 10 0 5 13950MA Log10 [Phenanthroline] (M) HRE-luc2P HIF1A-Nluc HRE-luc2P HIF1A-Nluc CellTiter-Fluor HRE-luc2P HIF1A-Nluc A.RLU –7 –6 –5 –4 1,000,000 100,000 10,000 Log10 [Phenanthroline] (M) C. –7 –6 –5 –4 10 1 Time (hours) B. Fold Response Fold Response (log scale) 0 2 4 6 8 15 10 0 5 A B 9 タンパク質分解過程の ? を解決 PROTAC は細胞内へ 透過するか？ 標的タンパク質は プロテアソームに リクルートされるか？ 標的タンパク質、 E3 リクルーターとの 3 重複合体を形成するか？ PROTACS ユビキチン -プロテアソーム系（UPS）はオートファジーと並んで代表的なタンパク質分解系として挙げられます。がん細胞ではタンパク質分解系を阻害して異 常タンパク質を蓄積させることにより細胞死を誘導することから、プロテアソーム阻害剤がすでに抗がん剤として使用されています。また最近は標的タンパク 質を強制的にユビキチン化し、分解促進する PROTAC などの標的タンパク質特異的分解誘導薬に注目が集まっており、創薬ターゲットとして今非常に注目され ています。しかし、細胞内で起こるタンパク質分解をハイスループットで、さらにはリアルタイムでモニターする優れたアッセイ系がありませんでした。プロメ ガの NanoLuc® テクノロジー（HiBiT や NanoBRET™ テクノロジーなど）は発光法や BRET 法により標的タンパク質の発現や分解、タンパク質相互作用を細胞内 で観察できる理想的なプラットフォームで、リアルタイムにタンパク質分解動態や分解プロセスを仲介する UPS に関連する細胞内相互作用の測定に使用するこ とができます。CRISPR ゲノム編集技術を用いて HiBiT（11 アミノ酸 発光タグ）を導入すれば、内在タンパク質の分解でも高感度に検出することができます。 HBT NBR HiBiT & NanoBRET™ PPI テクノロジーによる分解経路の解析 PROTAC の開発には細胞内で起こるタンパク質分解までのイベントを正確に定量できるツールが不可欠です。そ れは、タンパク質分解という最終結果を見るだけでは、ユビキチン -プロテアソーム経路のどの段階で失敗した のかが分からず効率的な開発が困難になるからです。プロメガのテクノロジーを用いれば、多段階にわたる各ス テップを定量的にとらえることができます。（HiBiT については 9 ページ、NanoBRET™ については本ページ下部 参照） 内在性 HiBiT-BRD4 のカイネティック分解アッセイ LgBiT を安定発現する HEK293 に内在 HiBiT-BRD4 が発現するように CRISPR/Cas9 を用いてゲノム編集を行い、プレー トに播種した。 Nano-Glo® Endurazine™ Substrate（カタログ番号 N2570）を含む CO2 非依存性培地で 2.5 時間培養し、 1 µM MZ1 PROTAC を加えた。各 PROTAC 濃度でのタンパク質分解を GloMax® Discoverで発光測定（パネル A）、Dmax（パ ネル B）を求めた。 A B 創薬 ・ 基礎 タンパク質ケミカルノックダウン 標的タンパク質を分解 〜阻害が無理なら消去 ! 〜 HiBiT-BRD4 の発光分解イメージング（動画） LgBiT 発現 HEK293 細胞の BBRD4 内在遺伝子に HiBiT タグ をゲノム編集にて導入し、1 µM MZ1 で 2 時間処理し、オリン パス社の LV200 で生物発光イメージングを行った。 Time（minutes） 0 15 30 60 120 HiBiT-BRD4 Bright Field 上記実験の関連製品については弊社までお問合せください。 NanoBRET™ / HaloTag® 　テクノロジー NanoBRET™ Assay は高レベル発光酵素 NanoLuc® ルシフェラーゼをエネルギー転移ドナー、HaloTag® NanoBRET™ 618 蛍光リガンドで標識された HaloTag® タンパク質をエネルギー転移アクセプターとして利用する BRET（生物発光共鳴エネルギー転移）ベースのアッセイで、生細胞内で 2 つのタン パク質の相互作用を測定することができます。従来の BRET に比べ優れたシグナル / バックグラウンド比が得られます。HaloTag® は低分子リガンドと 特異的に結合する受け皿タンパク質で、蛍光イメージングやタンパク質精製用のタグとしても使用できます。 タンパク質 A タンパク質 B LgBiT （17.6 kDa） SmBiT （11 amino acids） タンパク質 A タンパク質 B A. B. O O O O 構造的相補性による 発光シグナル BRET による蛍光シグナル BRET NanoLuc® HaloTag® ＋ 618 Ligand NanoBRET™ システムの原理 ベクターを導入した細胞内で発現した タンパク質 A：NanoLuc® （青色）融合タン パク質と HaloTag® （オレンジ色）に低分 子蛍光 618 リガンドが結合したタンパク 質 B：HaloTag® 融合タンパク質が近接す ると BRET が起こる。低分子蛍光 618 リ ガンドはタンパク質発現後に細胞へ添 加する細胞透過性の蛍光試薬。 Frb-NLuc/FKBP-HT Frb-RLuc/FKBP-YFP Signal-to-Background Ratio Rapamycin（nM） 0.0001 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0.01 1 100 10,000 従来の BRET アッセイと NanoBRET™ の パフォーマンス比較 HaloTag® 618 Ligand が結合した FKBP-HaloTag® と FRB-NanoLuc® 存在下でラパマイシンを 加えると 2 つの融合タンパク質が相互作 用を起こし、BRET を生じる。FKBP-YFP と FRB-Rluc8 による BRET システムとのデー タ比較 NBR HTG promega.co.jp/go?19003 10 標的タンパク質は プロテアソームに リクルートされるか？ 標的タンパク質は ユビキチン化されるか？ そして、 標的タンパク質は 分解されるか？ E3 リガーゼ（VHL）と化合物の結合を検出する NanoBRET™ ターゲットエンゲージメント（TE）アッセイ VHL-NanoLuc® 融合タンパク質を一過性に発現する HEK293 細胞を 96 ウェルプレートに播種し、様々な濃度のトレーサーで処理 した。細胞は飽和量の未標識の親化合物または非存在下でインキュベーションした（パネル A）。あるいは、未標識の親化合物の 希釈系列を作成し 2 時間インキュベーションし、NanoBRET™ Nano-Glo® Substrate plus Extracellular NanoLuc® Inhibitor を添加した （パネル B）。BRET は 450/80BP および 610/LP フィルターを含むルミノメーターで測定した。VHL-NanoLuc に対する推奨トレーサー 濃度はオレンジ色で示した（パネル B）。 ターゲットエンゲージメント（TE）アッセイの原理については 14 ページをご覧ください。 TE アッセイによる BRD4 ユビキチン化の経時的モニタリング LgBiT 安定発現 HEK293 細胞を HiBiT タグが付加された内在 BRD4 が発現するように CRISPR-Cas9 で改変し、6 ウェルプ レートに播取し、HaloTag® -Ubiquitin acceptor plasmid をトラン スフェクションした。HaloTag® NanoBRET™ 618 Ligand およ び Nano-Glo® Vivazine™ substrate を添加し、1 µM MZ1 また は 1 µM dBET1 で処理した後に BRET を観察した。 ゲノム編集「HiBiTノックイン」受託サービス（CRISPR/Cas9） HiBiT、NanoLuc® あるいは HaloTag® をゲノム編集により内在遺伝子に導入するサービスを開始しました。 ゲノム編集後の細胞プールあるいはシングルクローンとして提供可能です。すでに 300 種類以上のノッ クイン細胞を構築した実績と細胞種の選択などのコンサルティングにより成功率を高めます。詳細に ついては弊社テクニカルサービスまでお寄せください。 PROTAC 研究用 NanoBRET™ 関連製品 製品名 カタログ番号 NanoBRET™ BRD4/PSMD3 Interaction Assay お問合せ下さい NanoBRET™ cMyc/PSMD3 Interaction Assay NanoBRET™ β -catenin/PSMD3 Interaction Assay NanoBRET™ BRD4/Ub Interaction Assay NanoBRET™ β -catenin/Ub Interaction Assay NanoBRET™ BRD4/CRBN Interaction Assay NanoBRET™ BRD/VHL Interaction Assay NanoLuc® 融合ヒト E3 リガーゼクローン（約 300 種） HaloTag® 融合ヒト E3 リガーゼクローン（約 300 種） 上記以外についても弊社までお問合せください。 FLC 細胞内プロテアソーム活性高感度測定 培養細胞内プロテアソーム複合体に関連したキモトリプシン様、トリプシン様、力スパーゼ様プロテアーゼ活 性を測定するための発光ホモジニアスアッセイシステムで、生物学的関連性の高い結果を得ることができます。 これらのアッセイは阻害剤ライブラリーのスクリーニングやプロテアソームにより制御されたタンパク質分解の モニタリングを細胞ベースで行うことができます。Proteasome-Glo™ Cell-Based Assay は細胞への透過性、プロ テアソームおよびルシフェラーゼ活性に最適化されたバッファーと発光性のプロテアソーム基質（ルシフェリン 前駆体）が供給されます。“添加 – 混和 – 測定”フォーマットの Proteasome-Glo™ Cell-Based Reagent を細胞に 加えると、プロテアソームによる基質の切断が起こり、続いてルシフェラーゼ反応により発光シグナルが直ち に生じます。 プロテアソーム細胞ベースアッセイ試薬 製品名 サイズ カタログ番号 Proteasome-Glo™ 3-Substrate Cell-Based Assay System 10 ml G1180 Proteasome-Glo™ Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay 10 ml G8660 Proteasome-Glo™ Trypsin-Like Cell-Based Assay 10 ml G8760 Proteasome-Glo™ Caspase-Like Cell-Based Assay 10 ml G8860 プロテアソーム阻害剤を用 いたバイオアッセイ U266 細胞（5,000 個 / ウェ ル）を 384 ウェルプレート に 播 種し、37 °C、 5% CO2 で 2.5 時間平衡化した。エ ポキソミシンの希釈系列を 培地で調製して各ウェルに 添加し、2 時間インキュベー シ ョ ン し た。ProteasomeGlo™ Cell-Based Reagent を ウェルあたり 25 µl 添加し、 15 分後に発光を測定した。 0.01 0.1 1 10 100 1,000 10,000 Luminescence (RLU) Epoxomicin Concentration (nM) 0 4,000 8,000 12,000 16,000 Chymotrypsin-like activity Tryspin-like activity Caspase-like activity より詳細については… 標的タンパク質の分解 promega.jp/prodeg 11 G タンパク質共役型受容体（GPCR）は嗅覚、光感覚など様々な生体機能において重要な働きをしていおり、いくつかの GPCR ががん細胞に過剰発現して異常 なシグナルの伝達が細胞のがん化に関わっていることが報告されています。また、GPCR の多くは生理活性物質をリガンドとしているため GPCR は創薬の重要 な標的タンパク質となっています。現在まで開発された医薬品の中で 50% 程度は GPCR に作用する薬剤であり、これらのことから GPCR シグナルの調節機構 を明らかにすることは、がんやその他の病気の効果的な治療薬の開発にとって非常に重要です。 HBT NBR GPCR インターナリゼーション（HiBiT） GPCR- βアレスチン結合、GPCR 二量体化（NanoBRET™ / NanoBiT® ） GPCR は細胞外の分子を検出し、G タンパク質と結合することによって内部シグナル伝達経路を活性化します。GPCR が活性化されると、β -アレスチンは細胞膜に移動して受容体に結合し、それを G タンパク質から切り離して内在化 を促進します。GPCR の内在化を測定するために一般的に使用される ELISA 法では固定をする必要があり、操作が 煩雑で GPCR の過剰発現も必要です。また、タグによる GPCR および関連タンパク質の動態研究も有用ですが、従 来法ではタグが大きすぎて受容体本来の機能を乱す可能性があり、十分なシグナルを得ることも難しい場合が多く ありました。 プロメガの高感度で非常に小さい（11 アミノ酸）HiBiT 発光タグを付加できれば、アッセイに固定または洗浄工程を 必要とせず、内在レベルの発現で十分なシグナルが得られ、タンパク質本来の機能を妨げる可能性は最低限です。 （HiBiT については 9 ページ、NanoBiT® は本ページ下部、NanoBRET™ は 10 ページをご覧ください。） b g Gαs/i β-arrestin β-arrestin β-arrestin β-arrestin β-arrestin AC PK ATP cAMP CRE PKA 活性化 • NanoBiT® レポーターアッセイ • NanoLuc® • FLuc cAMP モニタリング • GloSensor™ cAMP • cAMP-Glo™ 受容体の2量体化 • NanoBRET™ β-アレスチン の 結合 • NanoBRET™ • NanoBiT® 受容体のインター ナリゼーション • HiBiT • HaloTag® β-アレスチン の解離 • NanoBRET™ • NanoBiT® 0 10 20 30 40 50 0 5 10 15 20 Time (min) Fold vs. vehicle ADRB2/ARRB2-ISO (10 µM) AVPR2/ARRB2-AVP (100 nM) Injection 4 種のアゴニストによる HiBiT-ADRB2 受容体の インターナリゼーションの測定 4 種類の完全または部分的アゴニストに暴露した際のβ 2-adrenergic receptor（ADRB2）のインターナリゼーション測定 NanoBiT® による GPCR：β -アレスチンの相互作用モニタリング β -アドレナリン作動性受容体（ADRB2）およびアルギニンバソプレ シン受容体（AVPR2）に対する -アレスチン 2（ARRB2）の結合を NanoBiT® で観察した。ADRB2 アゴニストであるイソプロテレノール （ISO）および AVPR2 アゴニスト Arg8- バソプレシン（AVP）でそれぞ れを刺激前後の発光量を vehicle に対する比としてあらわした。 NanoBiT® テクノロジー 互いに親和性が極めて低い LgBiT と SmBiT の各サブユニットそれぞれに融 合したタンパク質 A またはタンパク質 B が相互作用することにより NanoLuc® 発光酵素（LgBiT + SmBiT）として再構 成されて生じたシグナルをタンパク質 間の相互作用検出に利用できます（右 図参照）。ベクターやゲノム編集により 細胞内に両サブユニットを導入して、 タンパク質相互作用を高感度に検出す ることができます。 NanoBiT® とスプリットホタルルシフェラーゼの応答性の比較 NanoBiT® タグまたはスプリットホタルルシフェラーゼタグを融合した FKBP お よび FRB を発現する HEK293 細胞にラパマイシンを添加した。 NanoBiT® システムの原理 ベクターを導入した細胞内で発現したタンパク質 A： LgBiT（青色の大きな断片）融合タンパク質とタンパク 質 B：SmBiT（青色の小さな断片）融合タンパク質が 結合すると発光酵素が再構成される。 タンパク質 A タンパク質 B LgBiT （17.6 kDa） SmBiT （11 amino acids） タンパク質 A タンパク質 B A. B. O O O O 構造的相補性による 発光シグナル BRET による蛍光シグナル BRET NanoLuc® HaloTag® ＋ 618 Ligand 3×105 8×103 6×103 4×103 2×103 0 2×105 RLU RLU ［Rapamycin］（nM） ［Rapamycin］（nM） NanoBiT Firefly 1×105 10-2 10-1 101 102 103 0.01 1 100 100 0 1.3×107 1.0×107 7.5×106 5.0×106 2.5×106 RLU ［FK506］（µM） NanoBiT Firefly 10-2 10-1 101 102 100 0 5×104 4×104 3×104 2×104 1×104 0 RLU ［Rapamycin］（nM） 0.01 0.1 1 10 100 Rapamycin Only Relative response Time (min) Inhibition by FK506 120 100 80 60 40 20 0 0 40 80 120 160 200 240 NBT 創薬 ・ 基礎 シグナルの変調① GPCR によるシグナルの異常 上記実験の関連製品については弊社までお問合せください。 12 cAMP センサー cAMP 結合ドメインを内蔵したルシフェラーゼ GloSensor™ cAMP を細胞内 に導入することにより、細胞内の cAMP 濃度のカイネティクスを観察するこ とができます。また、cAMP 増加にともなう PKA の活性化、すなわち PKA 触媒ドメイン（CA）からの調節ドメイン（R2A）の解離をタンパク質間相互 作用検出ツール NanoBiT® で測定することもできます。 b g Gαs/i β-arrestin β-arrestin β-arrestin β-arrestin β-arrestin AC PK ATP cAMP CRE PKA 活性化 • NanoBiT® レポーターアッセイ • NanoLuc® • FLuc cAMP モニタリング • GloSensor™ cAMP • cAMP-Glo™ 受容体の2量体化 • NanoBRET™ β-アレスチン の 結合 • NanoBRET™ • NanoBiT® 受容体のインター ナリゼーション • HiBiT • HaloTag® β-アレスチン の解離 • NanoBRET™ • NanoBiT® 各 cAMP センサーの概要 A）GloSensor™ ではルシフェラーゼに組み込まれた cAMP 結合ドメインに cAMP が結合すること により、構造が変化してルシフェラーゼ活性を獲得。B）NanoBiT® センサーでは PKA 触媒ドメイン （CA）-SmBiT およびタイプ 2 調節ドメイン（R2A）-LgBiT 複合体が形成され、細胞内 cAMP の増 加に伴い解離し、シグナルが低下（このアッセイ系は、NanoBiT® PPI Starter System のコントロー ルアッセイとして付属） cAMP 濃度変化のダイナミックスをモニタリングできる 2 種類のバイオセンサー β 2-アドレナリン作動性受容体発現細胞に、GloSensor™ cAMP あるいは NanoBiT® （SmBiT-CA および LgBiT-R2A）を発現させ、アゴニスト（イソプロテレノール；ISO）、アンタゴニスト（プ ロプラノール；PRO）、アデニル酸シクラーゼアクティベーター（フォルスコリン；FSK）を順次 添加した。NanoBiT® 反応の可逆性が観察されるとともに、GloSensor™ cAMP による細胞内 cAMP 濃度の変化と対称的なパターンを示した。 A 7707TA N 359–544 RIIβB 4–355 C N C N C B LgBiT Protein Kinase A SmBiT cAMP cAMP cAMP cAMP cAMP cAMP Regulatory （R2A） Catalytic （CA） 100 1000 100 10 1 75 50 25 0 0 0 20 40 60 Time (minutes) NanoBiT NanoBiT (% signal decrease) (fold signal increase) GloSensor cAMP 22F 13380MA Isoproterenol cAMP Forskolin cAMP Propranolol cAMP GloSensor cAMP 22F cAMP センサー & アッセイ 製品名 サイズ カタログ番号 pGloSensor™ -22F cAMP Plasmid 20 µg E2301 pGloSensor™ -20F cAMP Plasmid 20 µg E1171 GloSensor™ cAMP Reagent 25 mg E1290 NanoBiT® PPI MCS Starter System 1 システム N2014 cAMP-Glo™ Max Assay 2 プレート分 V1681 CellTox™ Green Cytotoxicity Assay 10 ml G8741 cAMP レベルと死細胞マルチアッセイ cAMP-Glo™ Max Assay は細胞内の cAMP を発光シグナルとして測定するホモ ジニアスなハイスループットアッセイシステムです。このアッセイの原理は、 cAMP がタンパク質キナーゼ A（PKA）ホロ酵素活性を刺激し、ルシフェラー ゼ反応に利用可能な ATP が減少することにより発光が抑えられることに基づ きます。CellTox™ Green Cytotoxicity Assay とのマルチアッセイを行うことで、 細胞毒性も同時に測定することができます。 NLC 転写活性検出： レポーターアッセイによる転写応答性の検出 レポーターアッセイは機能的なシグナル経路の変化を捉える簡便なインジ ケーターとして広く使用されます。NanoLuc® ルシフェラーゼはホタルルシフェ ラーゼの 100 倍の検出感度を誇り、従来のレポーター実験では検出できな かった微弱なシグナルを検出できる可能性があります。 cAMP と細胞毒性マルチアッセイ パネル A. 段階希釈したフォルスコリンを細胞に添加し、CellTox™ Green Dye 存在下または非存 在下で cAMP-Glo™ Max によりcAMP 活性化をテストした（EC50 値 4.20–5.45×107 ）。パネル B.死 細胞由来の漏出 DNA に結合した CellTox™ Green Dye の蛍光を cAMP-Glo™ Max 試薬添加前に 測定し、細胞溶解後にトータルの DNA レベルとして再度測定した（EC50 値 4.13–5.76 × 107 ）。 A B レポーターベクター 製品名 サイズ カタログ番号 pNL ［NlucP/CRE/Hygro］ Vector 20 µg CS186804 ※ pNL ［NlucP/SRE/Hygro］ Vector 20 µg CS177601※ pNL ［NlucP/AP1-RE/Hygro］ Vector 20 µg CS177603 ※ pNL ［NlucP/NFAT-RE/Hygro］ Vector 20 µg CS177602 ※ pNL ［NlucP/SRF/Hygro］ Vector 20 µg CS194101※ pNL3.2 NF-kB-RE ［NlucP/NF-kB-RE/Hygro］ 20 µg N1111 pNL［NlucP/TCF/LEF-RE/Hygro］ Vector 20 µg CS181801※ ※ カタログ番号“CS”からはじまるものは特注品です。 詳細については弊社までお問合せください。 より詳細については… GPCR 研究ツール promega.jp/gpcr 13 キナーゼはタンパク質や脂質のリン酸化を担う酵素で、細胞の増殖や機能の調節に深く関与しています。そのた めキナーゼに異常をきたすと過剰なリン酸化などが起こり細胞が無秩序に増殖して癌を引き起こす原因になる ことが報告されています。これまでにキナーゼを標的とした抗がん剤（分子標的薬）が数多く開発されています。 プロメガではあらゆるキナーゼ活性を in vitro で測定できるユニバーサルな ADP-Glo® アッセイや細胞内における 標的キナーゼとテスト化合物の結合性を調べたり、ELISA 法に代わる洗浄操作が不要のリン酸化タンパク質の定 量システムなどユニークなキナーゼ研究ツールを次々に開発しています。 NanoBRET™ Target Engagement 受託サービス キナーゼに関する創薬に特化したカルナバイオサイエンス社でプロメガの NanoBRET™ 技術を 利用したキナーゼ：阻害物質結合解析受託サービスを開始しました ! 詳細については… promega.co.jp/go?19004 低分子化合物 / キナーゼ相互作用アッセイ 製品名 サイズ カタログ番号 NanoBRET™ Target Engagement Intracellular Kinase Assay, K-4 1 システム N2520 NanoBRET™ Target Engagement Intracellular Kinase Assay, K-5 1 システム N2500 各トレーサーに対応する NanoLuc® 融合標的タンパク質発現ベクターが別途必要です （右の QR コードよりベクターリスト参照）。 Target Nluc Target Nluc Target Nluc NanoBRET™ tracer Compound BRET Target Nluc Target Nluc Equilibrium Binding Non-Equilibrium Competition キナーゼへの真の化合物結合性を明らかにする生細胞内での親和性および滞留時間の決定 NanoBRET™ TE ABL1 キナーゼアッセイと慢性骨髄性白血病（CML）を標的とした薬剤を使用した。第一世代 CML 薬イマチニブは ABL1 に対して第二世代薬（ダサチニブ）や第三世代薬（ポナチニブ） よりも弱い結合性と短い滞留時間を示した。ポナチニブはダサチニブと比べて同程度の親和性を有していたが、非常に長い滞留時間を示した。 NBR 細胞内キナーゼ：化合物相互作用検出（ターゲットエンゲージメント）： 細胞内での真の結合性 & 滞留時間 薬剤の標的キナーゼ酵素への結合の選択性と親和性を理解することは、薬剤を評価するうえで重要なポイントとなります。従来は精製した標的分子を用いた セルフリー系が用いられてきましたが、生体内での環境と大きく異なり、必ずしも薬剤の実際の効果を反映しているとは言えませんでした。NanoBRET™ Target Engagement Assay は細胞内に発現した NanoLuc® ルシフェラーゼ – キナーゼ融合タンパク質と可逆的に結合する NanoBRET™ トレーサーのテスト化合 物による競合的置換により見かけの親和性を測定することができます。（NanoBRET™ については 10 ページ参照） キナーゼ約 300 種に対応！ 創薬 ・ 基礎 シグナルの変調② キナーゼの無秩序なシグナル キナーゼ関連製品詳細については… キナーゼ製品 ラインナップ promega.jp/kinase2 NanoLuc® ベクターについては… Target Engagement 用 ベクター promega.jp/kinvect 14 リン酸化およびトータル 1 κB α 検出による NF- κB パスウェイ活性化の検出と シンプルなプロトコール MCF 細胞を TNF αで 0-30 分処理（ +/- MG132）した。プロテアソーム阻害剤により 1 κBαの 分解とリン酸化 1 κBαの蓄積が検出された。 NBT リン酸化検出： 新規な細胞ベースの発光イムノアッセイ（洗わない ELISA） 遺伝子発現、酵素活性、タンパク質合成・転移などの細胞内応答は多様な細胞内シグナル経路の活性化 を通じて調節されています。その中でも特定のキナーゼによる標的タンパク質のリン酸化は重要なノード （結節点）となり、上流の活性化イベントが下流の細胞応答へと受け渡されます。細胞ベースでこれらの シグナルイベントをモニタリングすることは正常な細胞のふるまいと疾患ステイタスの理解に重要です。 現在、タンパク質の検出や翻訳後修飾（例 .リン酸化）分析では ELISA やウエスタンブロットなどのイム ノアッセイが汎用されていますが、これらの方法は洗浄操作など非常に煩雑でハイスループットスクリー ニングも困難です。プロメガの NanoBiT® 発光アッセイ技術を用いた SmBiT/LgBiT で標識された 1 次 /2 次抗体を用いれば、洗浄操作（B/F 分離）のいらない簡便で高感度なアッセイが行えます（NanoBiT® につ いて 12 ページ参照）。 P P P P P P P P ＜シンプルなプロトコール＞ 1 パスウェイの活性化 2 細胞溶解 3 抗体ミックス添加 4 90 分間インキュベート 5 Nano-Glo® 試薬添加 6 発光測定 一次抗体検出用 LgBiT/SmBiT 標識二次抗体 製品名 サイズ カタログ番号 NanoBiT® Cell based（DIY）immunoassay 100 assay CS1967A01※ ※ 一次抗体が別途必要です。 ※ カタログ番号 “CS” からはじまるものは特注品です。詳細については弊社までお問合せ ください。 In Vitro キナーゼアッセイ ADP-Glo™ Kinase Assay は、様々なキナーゼ反応で生成する ADP を発光 法により測定する高感度なキナーゼアッセイシステムです（右図参照）。 発光シグナルはキナーゼ活性と正の相関性を有します。このシステムは 広範な精製キナーゼの活性に対する化合物の影響を測定する際に有効 で、1 次スクリーニングおよびキナーゼ選択性のプロファイリングにも利 用することができます。また、ADP-Glo™ Kinase Assay は最大 1 mM ATP を使用して ADP を生成するあらゆる酵素（例 . キナーゼ、ATPase）の活 性をモニタリングすることができます。ADP-Glo™ Kinase Assay は広いダ イナミックレンジを有し、低い ATP/ADP 変換率においても高いシグナル を生じるため、成長因子受容体チロシンキナーゼなど活性の低いキナー ゼのスクリーニングにも最適です。 In Vitro 発光キナーゼアッセイ 製品名 サイズ カタログ番号 ADP-Glo™ Kinase Assay 400 回分 V6930 -1 0 1 2 0 9000 18000 27000 36000 45000 Lipid Kinase Phosphatidylinositol (lipid) Log10[PI3K p120γ], ng RLU EC50=2.8ng 9168MA -2 -1 0 1 2 3 0 7000 14000 21000 28000 35000 Tyrosine Kinase Poly Glu4-Tyr1(peptide) Log10[EGFR], ng RLU EC50=7.7ng 9171MA ADP-Glo™ System の測定原理 様々なキナーゼ活性を検出できるユニバーサルな ADP-Glo™ FLC キナーゼ 379 種（変異体 93 を含む）もご提供！（詳細については左ページの QR コード参照） スクリーニングやプロファイリングも簡便に行えます！ パスウェイの活性化 NanoBiT® 標識 二次抗体 一次抗体 ATP キナーゼ 細胞溶解 試薬の添加 トータルタンパク質の検出 Luminescence（RLU） Time（min） Time（min） Luminescence（RLU） 0 10 20 30 0 10 20 30 80000 Total 1κBα Total 1κBα + MG132 P-1κBα P-1κBα + MG132 60000 40000 20000 0 80000 60000 40000 20000 0 Anti-Rabbit Anti-Mouse Rabbit Rabbit Mouse リン酸化タンパク質の検出 発光 発光 and 15 がん細胞には遺伝子の異常だけでなくエピジェネティックな異常が存在し、この制御機構を解明することはがんの診断・治療につながると期待されます。 プロメガは、エピジェネティックス研究用に設計された試薬とアッセイのポートフォリオを提供しています。DNA 精製および定量キットからルシフェラーゼ ベースのアッセイやターゲットエンゲージメント用の BRET メソッドまで、プロメガの技術を駆使した新しいエピジェネティック研究ツールをお試しください。 DNA メチル化：バイサルファイト変換 MethylEdge® Bisulte Conversion System は DNA の断片化を最小限に抑えながら 2 時間以内にバイサルファイト変換を行える迅速で効率的な方法です（変換 + 精製）。迅速なプロトコールと完全な変換により下流のアッセイに適した変換 DNA を最小限の労力と時間で取得することができます。プロメガの精製技術に より MethylEdge® Bisulte Conversion System は良質なバイサルファイト変換 DNA を取得することができます。 Human Bisulte-Seq（NGS）解析受託については 21 ページへ クロマチン免疫沈降様アッセイ 製品名 サイズ カタログ番号 HaloCHIP™ System 20 反応分 G9410 Flexi® HaloTag® Clone（ヒト ORF） 1 クローン FHCxxxxx ※ 約 18,000 種のヒト ORF を揃えた HaloTag® 導入クローンライブラリーよりお選び いただけます。詳細については www.promega.co.jp/exiclone/ をご覧ください。 ChIP-Seq（NGS）解析受託については 21 ページへ HTG クロマチン免疫沈降様アッセイ HaloTag® リガンドと特異的に共有結合を形成する特殊な HaloTag® タンパク 質を利用した新しいクロマチン免疫沈降（ChIP）様のシステムです。抗体を 用いないため、従来法よりも効率的で安定したデータが得られます。ベク ターを導入した細胞内で HaloTag® 融合体として発現した目的のタンパク質 は、ホルムアルデヒドで DNA と架橋され、HaloTag® 部位と高い特異性で共 有結合する HaloLink™ Resin 上に捕捉されます。強力な洗浄により非特異的 に結合したタンパク質や DNA を除去した後、加熱処理によりDNA と融合タン パク質間の架橋を外し、DNA 断片を回収します。 HaloCHIP™ システムの概要 バイサルファイト変換 製品名 サイズ カタログ番号 MethylEdge® Bisulte Conversion System 50 回分 N1301 Methylated Human Control 5 µg N1231 Converted Methylated Human Control 1 µg N1221 創薬 ・ 基礎 エピジェネティック制御の変調 最新エピジェネティクス研究ツール 〜 DNA メチル化からヒストン修飾 〜 HaloLink™ Resin HaloTag® より詳細については… 抗体を用いない ChIP 様解析（動画） promega.co.jp/go?19006 より詳細については… 簡単！ バイサルファイト変換（動画） promega.co.jp/go?19005 16 NBR 細胞内ブロモドメイン：ヒストン相互作用 ブロモドメイン（BRD）を含むタンパク質は核内タンパク質複合体の構成要素で、クロマチン修飾 酵素のリクルートやアセチル化クロマチンの転写調節に関与しています。BRD を含むタンパク質と アセチル化ヒストンとのタンパク質間相互作用（PPI）は細胞の健全性や分化に関連するエピジェネ ティックな調節に重要な役割を果たし、BRD の調節不全は疾患形成におけるイベントに関与するた め薬剤標的として注目されています。 NanoBRET™ Bromodomain Interaction Assay は、生細胞内のクロマチンにおいて BRD を含むタンパク 質と完全長のヒストンの相互作用研究を行うことができます。完全長の BRD タンパク質に加えて BRD 断片（BRD4、 BRD9 および BRPF1）も含まれており、ドメインのみの相互作用も理解することが できます。 BRD/ ヒストン相互作用アッセイ 製品名 サイズ カタログ番号 NanoBRET™ BRD/Histone Interaction Assay 各種 1 システム （例）N1830 BRD4、 BRD9、 BRPF1 と Histon H3.3 または H4 の組み合わせよりお選びいただけます。 詳細およびカスタム品情報については promega.jp/nbretbrom をご覧ください。 FLC 細胞内 HDAC 活性の測定 HDAC-Glo™ Assay は、1 回の試薬添加だけで操作が完了するホモジニアス な発光アッセイシステムで、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）クラス I/II、 IIa およびクラス I 酵素 2 の相対的な酵素活性を細胞、抽出液、精製酵素な どのサンプルソースより測定することができます。生細胞透過性の発光性 アセチル化ペプチド基質を使用し、これが HDAC 活性により脱アセチル化 され、試薬に含まれるプロテアーゼ消化で遊離したアミノルシフェリンを定 量するための Ultra-Glo™ 組換えホタルルシフェラーゼによる発光反応の連 動により測定することができます。 発光 HDAC アッセイ 製品名 サイズ カタログ番号 HDAC-Glo™ I/II Assay 10 ml G6420 HDAC-Glo™ I/II Screen System 10 ml G6430 HDAC-Glo™ Class IIa Assay 10 ml G9560 HDAC-Glo™ 2 Assay 10 ml G9590 12907MA 0 200 400 600 800 1,000 0 50 100 Acceptor-to-Donor Ratio 0 200 400 600 800 1,000 0 50 100 Acceptor-to-Donor Ratio Percent of Maximum BRET Ratio Percent of Maximum BRET Ratio HaloTag®-Histone H3.3 fusion and NanoLuc®-BRD9 FL fusion HaloTag®-Histone H3.3 fusion and NanoLuc® protein NanoLuc®-BRD9 BD fusion and HaloTag®-Histone H3.3 fusion NanoLuc®-BRD9 BD fusion and HaloTag® protein A. B. ヒストン H3.3 と BRD9 FL タンパク質相互作用検出のための Donor Saturation Assay（DSA） アクセプター：ドナー（A：D）比率を変えるために一定量の NanoLuc® DNA（ドナー）とヒストン H3.3-HaloTag® Fusion Vector（ア クセプター）を増量しながら HEK293 細胞にトランスフェクション した。完全長（FL）BRD9 とヒストン 3.3 の相互作用を示した。ネ ガティブコントロールは NanoLuc® のみを含むサンプルセット NBR 細胞内低分子化合物：HDAC/BET BRD 相互作用（バインディングアッセイ） NanoBRET™ Target Engagement（TE）Assay は生細胞内における標的タンパク質へのテスト化合物の結合を測定します。NanoBRET™ テクノ ロジーがベースとなっており、細胞内に発現した NanoLuc® – 標的タンパク質融合体に可逆的に結合した NanoBRET™ トレーサー（蛍光標識体） に対する競合的置換によりテスト化合物の見かけの親和性を分析します。標的タンパク質ごとに NanoLuc® 融合体およびトレーサーのセット をお選びいただけます。（NanoBRET™ については 10 ページ参照） HDAC1-NanoLuc® 融合タンパク質を一過性に発現する HeLa 細胞における化合物のレジデンスタイム（滞留時間）の解析 HDAC1-NanoLuc® FL 融合タンパク質を発現する細胞を 10 µM SAHA また は 10 µM モセチノスタット存在下で 2 時間インキュベートした。化合物 を除去した後に 96 ウェルプレートに播種し、各 NanoBRET™ 試薬を添 加した後、GloMax® Discoverで BRET を測定した。 Target Target Target Drug Tracer Luc Luc Luc 低分子化合物 /HDAC/BET/BRD 相互作用アッセイ 製品名 サイズ カタログ番号 NanoBRET™ Target Engagement HDAC Assay 各種 1 システム （例）N2080 アッセイ試薬、各種 HDAC 発現ベクターの組み合わせなどがございます。詳細およびカスタム 品情報については promega.jp/nbrettehd をご覧ください。 NanoBRET™ Target Engagement BET BRD Assay 各種 1 システム （例）N2130 アッセイ試薬、各種 BET BRD 発現ベクターの組み合わせなどがございます。詳細およびカス タム品情報については promega.jp/nbrettebb をご覧ください。 細胞内 BRD タンパク質分解アッセイについては 11 ページへ エピジェネティック制御の変調 最新エピジェネティクス研究ツール 〜 DNA メチル化からヒストン修飾 〜 In Vitro メチル基転移酵素・脱メチル化酵素アッセイ MTase-Glo™ Methyltransferase Assay は、メチルトランスフェラーゼ反応 により生じた S-アデノシルホモシステイン（SAH）を ATP に変換し、ルシ フェラーゼ反応からの光を測定します。実質的にあらゆるメチル基転移 酵素で使用可能で、基質を修飾する必要もありません。 Succinate-Glo™ JmjC Demethylase/Hydroxylase Assay は JumonjiC ヒストン 脱メチル化酵素および Fe(II)/ α – ケトグルタル酸依存性デオキシゲナーゼ反応より生成するコハク酸を迅速に検出します。本アッセイでは反応産物のコ ハク酸を ATP に変換することでルシフェラーゼ反応による発光を生じ、この発光シグナルは基になる脱メチル化酵素 / 水酸化酵素活性に比例します。 FLC 発光 メチル基転移酵素・脱メチル化酵素アッセイ 製品名 サイズ カタログ番号 MTase-Glo™ Methyltransferase Assay 400 回分 V7601 Succinate-Glo™ JmjC Demethylase/Hydroxylase Assay 1000 回分 V7990 17 最高のアッセイにふさわしい測定装置 GloMax® プレートリーダーで測定できる主な検出シグナルとして、発光、蛍光、および吸光が挙げられ、プロメガは生体分子の挙動をより正確にとらえるため の測定法として最も高感度な発光法にこだわっています。例えば、酵素活性を測定する場合、検出感度が低いと生体内での濃度をはるかに超えた量 の基質酵素または触媒を用いる必要があります。細胞アッセイでは検出感度に合わせて標的遺伝子を過剰発現させてその挙動を観察する場合、関わ り合う生体分子間の存在比率を大きく逸脱し、正確に生理現象をとらえていることが困難になります。実際、CMV プロモーターでタンパク質を過剰発 現させるのに対して、ゲノム編集を行い内在プロモーターを利用することで生理レベルの発現が得られ、より応答性が高く生物学的に関連性のあるデー タが得られる実例もあります（下グラフ参照）。一方、ウェル間のクロストークは隣接する強シグナルのウエルから低 / 無シグナルのウェルへの光の漏 れ込みにより正しい測定値の差がマスクされてしまいます。 プロメガの発光アッセイ試薬は非常に高感度で広いダイナミックレンジを有しているために細胞数の減少、転写レベルの低下、分子間相互作用などの より微妙な変化を捉えることができます。試薬のパフォーマンスを十分に発揮させるには、それに適応する検出装置を使用することが重要です。プロ メガの GloMax® は優れた検出器とデュアルマスキングシステムなどが発光測定に最適化されており、最高の“感度”と最小限の“クロストーク”で 最高のアッセイをお約束いたします。 GloMax® システムおよびその他市販のプレートリーダーの発光検出感度の比較 各検出装置の感度テストを行うために Bio-Glo™ Luciferase Assay System を使用し、検出 限界（LOD）を算出した。GloMax® Discover および Navigator は最も低い検出限界（<10-19 moles ルシフェラーゼ）を示した。 0 1 × 107 1 × 106 1 × 105 1 × 104 1 × 103 1 × 102 Luminescence (RLU) –7 –6 –5 強制発現 Hif1A -HiBiT （ CMV ベクター） 低レベル発現 Hif1A -HiBiT （PGK ベクター） 内在性 Hif1A + HiBiT （ゲノム編集によるタギング） これまでの検出 強制的に発現させて、 低い応答性（変化量）をなんとか検出 重要な変化を見落としがち プロメガの 超高感度検出システム （試薬 + 検出装置）なら 生体内と同等の低レベルで発現させて、 高い応答性（変化量）をしっかり検出 重要な変化をキャッチ フェナントロリンによる HIF1 α -HiBiT の安定性評価 CMV あるいは TK プロモーターを利用して HIF1 α -HiBiT を細胞内に一過性発現にあるいはゲノム編集に よる内在性 HIF1 への HiBiT タグ付けにより発現させ、 フェナントロリン によるタンパク安定性を発光検出に より評価した。ゲノム編集により本来の遺伝子ローカ スに発光タグ（HiBiT）を導入することで、過剰発現さ せた場合よりも薬剤による応答性が飛躍的に向上し ました。これは細胞内のタンパク質と内在性レベルで 発現するタグ付加タンパク質が適切な化学量論的比 率で維持されるいるのが一因であると推察されます。 GloMax® Discover GloMax レンタルサービスもご利用ください！ 「機器がないから…」大丈夫です、ご相談ください！ RentaMAX / MAX れんたるは、プロメガのルミノメーター / 核酸自動精製装置 を無償 / 有償で一定期間お貸出しするプログラムで、試薬 / 機器の両面からの サポート・コンサルティングも行います。 ※ アプリケーションによっては機器で使用する試薬を予めご購入いただく必要がございます。 また、本サービスのご利用にはプロメガクラブ（無償）へのご入会が必要です。 創薬 ・ 基礎 TC 社 BG 社 BT 社 PE 社 より詳細については… RentaMAX のお申込みはこちら promega.co.jp/rentamax/ 18 ルミノメーター関連試薬・機器ガイド GloMax® Protocol Guide 門外不出の GloMax ユーザー専用ガイド。好評によりプレートリーダー ご利用のすべて研究者におとどけいたします。各種アッセイ法・試薬をご 紹介し、簡略化したプロトコルやアッセイの特長が記載され、アッセイの 流れや概要を理解するために最適の 1 冊。 *OR0D[® 3URWRFRO *XLGH Ver. 1.0 *OR0D[® ユーザーのためのプロトコルガイド (/,6$ 1DQR/XF® Reporter BRET 077 'XDO/XFLIHUDVH® ᵦᶇᵠᶇᵲ &D 33, &HOO%DVHG$VVD\ $'&& T-Cell Activation ,QIODPPDWLRQ 会員番号： クラブ 0$; 会員の登録はこちら ZZZSURPHJDFRMSNLNLFOXE プロメガ株式会社 機器カタログ 発光アッセイ試薬の性能を最大限に引き出すルミノメーターと、難しい サンプルからでもゲノム DNA、セルフリー DNA、Total RNA、miRNA などを 抽出できる自動精製装置のカタログ。試薬と機器をトータルでサポート。 自動核酸抽出機 page 4 Maxwell® RSC 小型フルオロメーター page 5 Quantus™ Fluorometer Maxwell® RSC 用セットアッパー page 6 Maxprep™ マルチモードプレートリーダー （発光・蛍光・吸光） page 10 GloMax® Discover page 10 GloMax® Explorer 発光プレートリーダー page 12 GloMax® Navigator シングルチューブ発光リーダー page 13 GloMax® 20/20 プロメガ 2018-2019 機器カタログ INTEGRATED SOLUTIONS プロメガ株式会社 発光レポーターガイド 最新の NanoLuc® ルシフェラーゼを用いたデュアルアッセイなどレポー ター遺伝子を利用した発光アプリケーションや実験の手順などを説明。 プロメガ株式会社 最新のレポーターテクノロジーとアプリケーション 第 1 章　レポーターアッセイとテクノロジー ● これまでとこれからのレポーター …………………………………………………………2 ● 最新鋭レポーター ̶ NanoLuc® ルシフェラーゼ ̶ ……………………………………4 ● デュアルレポーター & マルチアッセイ …………………………………………………6 ● リアルタイムアッセイ…………………………………………………………………………………8 第 2 章　レポーターアッセイでできること ● シグナルパスウェイ解析 ………………………………………………………………………… 10 ● タンパク質間相互作用（PPI 解析）………………………………………………………… 12 ● プロモーター解析 …………………………………………………………………………………… 14 ● 核内受容体解析 ……………………………………………………………………………………… 14 ● タンパク質安定性解析…………………………………………………………………………… 15 ● RNA 干渉解析 …………………………………………………………………………………………… 16 ● in vivo イメージング & ウイルスのマーキング…………………………………… 17 第 3 章　レポーターアッセイ試薬 & レポーターベクター ● レポーター実験の流れ…………………………………………………………………………… 18 ● アッセイ/ 検出試薬 ………………………………………………………………………………… 20 ● レポーターベクター・クローン・細胞………………………………………………… 26 ● 関連製品（トランスフェクション・マルチアッセイ・ルミノメーター）…… 30 発光レポーターガイド 最新鋭 NanoLuc® ルシフェラーゼが広げるレポーターの可能性！ promega.co.jp/go?19012 promega.co.jp/go?19009 promega.co.jp/go?19011 Cell Based Assay Guide 培養細胞を用いたアッセイシステムに関するプロダクトガイド。細胞増殖 / 毒性試験、アポトーシスアッセイ、細胞の状態（レドックス、エネルギー 代謝、薬剤代謝）等を高感度に測定する発光アッセイ試薬をご紹介。 ・イントロダクション 2 ・細胞ベースアッセイ選択ガイド 5 ・細胞生存性 & 細胞毒性試験 6 ・アポトーシス・パイロトーシスアッセイ 14 ・酸化ストレスアッセイ 17 ・エネルギー代謝アッセイ 19 ・オートファジー、プロテアソームアッセイ 21 ・シグナル伝達アッセイ（cAMP） 23 ・その他（HDAC、P450） 25 ・レポーターアッセイ（概要） 27 ・マルチプレートリーダー 28 Contents Cell Based Assay Guide 高次元の細胞実験ガイド NEW promega.co.jp/go?19008 タンパク質レポーターテクノロジーガイド ペプチドルシフェラーゼ HiBiT など最先端の NanoLuc® テクノロジーおよ び多機能性 HaloTag® タグを利用した広範なタンパク質機能解析アプリ ケーション・ツールをご紹介！ イントロダクション 2 NanoLuc® アプリケーション 5 ・タンパク質の安定性 5 ・タンパク質間相互作用 6 ・タンパク質発現検出（HiBiT） 10 ・タンパク質-リガンド相互作用 12 HaloTag® アプリケーション 13 ・分子間相互作用 13 ・イメージング 16 ・タンパク質精製 21 タグ融合タンパク質の発現（How To） 23 Contents タンパク質レポーター テクノロジーガイド 生きた細胞で見るタンパク質ダイナミクス promega.co.jp/go?19010 19 バイオマーカーはがんのリスクや組織内に存在する腫瘍の存在を検知するために使用されます。それらは腫瘍の増殖を助長する分子メカニズムを反映している ため、治療方針の決定に利用することも可能です。中でも血液や尿など低侵襲なサンプルから診断を行うリキッドバイオプシーは有望であり、含まれる標的分 子には miRNA、ccfDNA、エクソソーム、タンパク質、代謝産物などがあります。また、近年では腸内フローラ（細菌叢）と病気との関連が明らかになってきて おり、がんにおいてもバイオマーカーとして診断への応用が期待されています。遺伝子発現研究、特に次世代シーケンシングの進歩によってマーカー探索研究 は加速しています。癌の早期発見を助け、個別化された治療法の選択肢について予測できる診断アッセイの開発が進められています。 PM miRNA 自動精製 Maxwell® RSC miRNA Tissue Kit および miRNA Plasma and Serum Kit はどちらも Maxwell® RSC および RSC 48 自動精製装置で使用できます（Maxwell® RSC Instrument は 1 ～ 16 サンプルを、Maxwell® RSC 48 は 1 ～ 48 サンプルを一 度に処理することができます）。Tissue Kit は哺乳動物組織から、Plasma and Serum Kit は血漿、血清または濃縮エクソソームからの miRNA を含む Total RNA を精製します。 抽出された RNA は非常に濃縮されているためバイオマーカー検出、遺伝子 発現などの実験で利用される RT-qPCR や RNA シークエンシングやその他の 用途にそのまま使用することができます。 miRNA Kit Serum/Plasma 血漿からの miRNA 自動精製 Maxwell® RSC miRNA Plasma and Serum Kit または他社 miRNA 精製キット（Q 社）を用いて、血 漿 200 µl より精製した miR-21 収量を比較した。 miRNA-Seq（NGS）解析受託については右ページへ PM ccfDNA 自動精製 循環セルフリー DNA（ccfDNA）はサンプル中に低濃度にしか含まれておらず、高度に断片化されているため精製は非常に困難です。さらに、サンプルの種類に 起因する含有量の変動、および高レベルの gDNA 混入により微量成分である ccfDNA から低レベルの変異を検出することはさらに難しいチャレンジです。 Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit は Maxwell® RSC Instrument を用いてヒト血漿サンプルより ccfDNA を効率的に自動精製するための試薬カートリッジを含むキット です。精製装置は 0.2 - 1 ml の血漿サンプルを約 70 分で処理することができ、精製した DNA は PCR など様々な用途にそのまま使用することができます。また、 ProNex® サイズ選択的精製システム（マニュアル法）などの磁気ビーズに基づくサイズ選択方法を使用して、サンプル中の ccfDNA 成分を濃縮することができバッ クグラウンドを効果的に減少させることができます。 自動核酸精製装置 Maxwell® 用試薬カートリッジ 製品名 サイズ カタログ番号 ccfDNA 精製 Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit 48 回分 AS1480 Maxwell RSC LV ccfDNA kit, Custom 48 回分 AX1115 ProNex® Size-Selective Purication System 10 ml NG2001 miRNA 精製 Maxwell® RSC miRNA Tissue Kit 48 回分 AS1460 Maxwell® RSC miRNA Plasma and Serum Kit 48 回分 AS1680 細菌叢からの核酸精製 Maxwell® RSC PureFood GMO and Authentication Kit 48 回分 AS1600 EZ-Beads 50 本 AMR76813M Maxwell® RSC 48（カタログ番号 AS8500） 卓上に設置できるパーソナル自動核酸精 製装置です。磁性体ビーズのムービングプ ログラム、バッファーなどは容易に多検体 処理装置に適応させることができます。 （23 ページ参照） 診断 ・ 基礎 バイオマーカー探索 分子マーカー探索 〜 miRNA、 ccfDNA、 エクソソーム〜 より詳細については… バイオマーカー探索 promega.jp/biomarker より詳細については… ccfDNA 濃縮 promega.jp/pronexss 20 体液 ccf DNA / miRNA 精製 エクソソーム / タンパク質 糞便 細菌叢（DNA） （フローラ） DIA プロテオミクス受託解析（タンパク質バイオマーカー） 定量性に優れた DIA プロテオミクス技術と最新鋭の質量分析計で測定することにより、最大 8000 種類 のタンパク質を同定・比較定量（サンプル種に依存）が可能になり、より詳細なマーカー探索を支援い たします。エクソソームタンパク質の解析などの実績もございます。 NGS 受託解析（核酸バイオマーカー） 次世代シーケンサー（NGS）を使用した変異解析や発現解析などの各種受託解析を承っております。解 析用途に合わせたライブラリー作製の工程のみの受託、あるいは作製されたライブラリーをお預かりし てシーケンスのみの受託にも対応しています。標準的なゲノム解析はもとより、miRNA-Seq、Human Bisulte-Seq、ChIP-Seq なども承ります。 Maxwell® パーティクルムーバー マグネットロッドにより磁性体ビーズを移動させる核酸精製方式を採用しており、しっ かりとした洗浄操作が行えるので不純物が多いあるいは粘性が高いといった精製の困 難なサンプルでも柔軟に対応することができます。人の手技によらない再現性の高い 安定した収量が得られるため、遺伝子検査など広く利用されています。 ※ 1 サンプルを 1 カートリッジで処理 サンプルの混和 ビーズの捕捉 核酸の結合 ビーズの洗浄 核酸の溶出 Sample Mixing Particle Capture Nucleic Acid Binding Particle Washing Nucleic Acid Elution 1 2 3 4 5 6 7 12624MB Plunger Sample 1 2 3 4 5 6 7 Magnet 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Sample Mixing Particle Capture Nucleic Acid Binding Particle Washing Nucleic Acid Elution 1 2 3 4 5 6 7 12624MB Plunger Sample 1 2 3 4 5 6 7 Magnet 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Sample Mixing Particle Capture Nucleic Acid Binding Particle Washing Nucleic Acid Elution 1 2 3 4 5 6 7 12624MB Plunger Sample 1 2 3 4 5 6 7 Magnet 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Sample Mixing Particle Capture Nucleic Acid Binding Particle Washing Nucleic Acid Elution 1 2 3 4 5 6 7 12624MB Plunger Sample 1 2 3 4 5 6 7 Magnet 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Sample Mixing Particle Capture Nucleic Acid Binding Particle Washing Nucleic Acid Elution 1 2 3 4 5 6 7 12624MB Plunger Sample 1 2 3 4 5 6 7 Magnet 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 promega.co.jp/go?19015 Maxwell® RSC 稼働ムービー PM その他血液に含まれる タンパク質、代謝産物など エクソソーム ccfDNA （cell free DNA） バイオマーカー探索 分子マーカー探索 〜 miRNA、 ccfDNA、 エクソソーム〜 より詳細については… ＮＧＳ受託 promega.co.jp/NGS/ より詳細については… プロテオーム受託 promega.co.jp/go?19014 21 MSI Discovered (1993) MSI Markers Verified (1997) Bethesda Criteria Published (1997) BETHESDA CRITERIA BAT26 BAT25 NR21 MONO27 NR24 MSI MSI Discovered (1993) MSI Markers Verified (1997) Bethesda Criteria Published (1997) BETHESDA CRITERIA BAT26 BAT25 NR21 MONO27 NR24 MSI Revised Bethesda Guidelines Published (2004) First Commercial MSI Reagents Launched (2004) FDA Approves First Cancer Treatment for Tumors with dMMR/MSI-H (2017) REVISED BETHESDA GUIDELINES FDA APPROVED MSI 発見 （1993） MSI マーカーの検証 （1997） 改定ベセスダ ガイドラインの発表 マイクロサテライト不安定性検出（MSI） （2004） ① 1993 年以来の遺伝性癌リスク （リンチ症候群）のバイオマーカー ② 免疫療法（キイトルーダ ® ）に 対するがんの反応バイオマーカー 歴史的に MSI はリンチ症候群、優性遺伝性癌傾向のスクリーニングに使用されてきました。最近、MSI の状態は免疫療法反応のバイオマーカーとして再発見 され、MSI の状態は遺伝学および免疫腫瘍学においてますます重要なツールとなっています。 DNA ミスマッチ修復（MMR）の欠陥は、遺伝性、生殖細胞系の突然変異またはメチル化によるサイレンシングによって引き起こされる可能性があります。い ずれのメカニズムも機能的な MMR タンパク質の発現を抑制し、転写エラーがゲノム全体に蓄積することで引き起こされます。全体的なゲノム変異は正常な細 胞機能を破壊し、制御不能な増殖および癌を誘導しますが、同時に変異を生じた新規タンパク質も産生します。これらの「外来」タンパク質は免疫原性を有 する可能性があり、その組織に対して免疫エフェクター細胞が補充されるため MSI-H 状態は、免疫チェックポイント遮断阻害剤などの免疫療法に対する陽性 反応の予測因子であると考えられています。 CTLA-4 および PD-1 経路に関する初期の研究以来、多くの免疫チェックポイントシグナル伝達経路が同定さ れており、新しい薬物標的の機会を創出していま す。MSI 分析は、これらの治療戦略に対応する癌の特定に役立ち、最も効果的な治療法が適切な腫瘍に使用され、最良の結果が得られる可能性があります。 プロメガは、1 回のマルチプレックス PCR 反応で 5 つのモノヌクレオチドリピートマーカーを増幅し、MSI-high（MSI-H）を決定するための研究用試薬キット MSI Analysis System、 Version 1.2 を販売しています。このシステムには MSI-high（MSI-H）表現型分析用の 7 つのマーカーを同時に増幅する蛍光標識プライマー （マーカーパネル）が含まれています。その中には 5 つのモノヌクレオチドリピートマーカー（BAT-25、 BAT-26、 MONO-27、 NR-21、 NR-24）および 2 つの多型性 の高いペンタヌクレオチドリピートマーカー（PentaC および PentaD）が含まれます。増幅された断片は、スペクトルキャリブレーションを行った後、ABIPRISM® 310、3100、3100-Avant、3130、3130xl、3100GeneticAnalyzerで検出することができます。 がん免疫に関する細胞ベースの研究ツールについては 2 ページへ 正常およびがんサンプルを用いた MSI 分析 製品名 サイズ カタログ番号 MSI Analysis System, Version 1.2 1 セット MD1641 上記製品は研究用の MSI キットです。 ※ コンパニオン診断を目的としたキットあるいはサービスについては ファルコバイオシステムズ URL（www.falco-dx.com/msi/）をご覧ください 診断 ・ 検査 遺伝子検査・コンパニオン診断 ゲノム不安定性と核酸精製 より詳細については… MSI ステイタスの重要性 promega.jp/msistatus1 より詳細については… 研究用 MSI 検査受託サービス promega.co.jp/go?19016 22 Revised Bethesda Guidelines Published (2004) First Commercial MSI Reagents Launched (2004) FDA Approves First Cancer Treatment for Tumors with dMMR/MSI-H (2017) REVISED BETHESDA GUIDELINES FDA APPROVED Revised Bethesda Guidelines Published (2004) First Commercial MSI Reagents Launched (2004) FDA Approves First Cancer Treatment for Tumors with dMMR/MSI-H (2017) REVISED BETHESDA GUIDELINES FDA APPROVED Revised Bethesda Guidelines Published (2004) First Commercial MSI Reagents Launched (2004) FDA Approves First Cancer Treatment for Tumors with dMMR/MSI-H (2017) REVISED BETHESDA GUIDELINES FDA APPROVED 研究用 MSI 検出試薬 販売開始 ［プロメガ］ （2004） FDA が dMMR/MSI-H 判定を承認 （2017） 体外診断用 MSI 検査キット 販売開始 ［ファルコバイオ］ （2018） PM FFPE、血液からの自動核酸精製 Maxwell® RSC Instrument は予め精製に必要な試薬が分注されたカートリッジ を使用するため、簡便性と利便性を最大限に発揮した精製が可能になります。 また、キシレンのような有害な有機溶剤は不要なため、より安全にご使用い ただけます。精製された核酸は、PCR ベースの検出など様々なアプリケー ションに使用することができます。 体外診断向けの高品質で信頼性の高い部材、試薬の提供 体外診断薬の部材あるいは臨床診断ラボで使用する試薬は、高品質で一貫した製品が安定して供 給されることが重要です。プロメガは厳格な品質管理プログラムの下で試薬を製造しており、ISO 9001 および ISO 13485 の認証の維持、ならびに cGMP 製造のための設備とシステムを通じて、最高 品質基準で製品を製造しています。逆転写 / 増幅用の酵素あるいは核酸精製用の磁性体ビーズなど、 臨床検査室や IVD メーカーのニーズを満たすためのソリューションとしてカスタマイズにも柔軟に対 応します。さらに各種発光テクノロジーを利用した高感度 / ハイスループット向けイムノアッセイ用 の技術・材料提供も行っています。 自動核酸精製装置 製品名 サイズ カタログ番号 Maxwell® RSC （16 サンプル用） 1 台 AS4500 Maxwell® RSC 48 （48 サンプル用） 1 台 AS8500 Maxprep™ Liquid Handler 1 台 AS9100 自動核酸精製キット 製品名 サイズ カタログ番号 Maxwell® RSC DNA FFPE Kit 48 回分 AS1450 Maxwell® RSC RNA FFPE Kit 48 回分 AS1440 Maxwell® RSC Blood DNA Kit 48 回分 AS1400 Maxwell® RSC simplyRNA Blood Kit 48 回分 AS1380 プロメガパネルを採用した 抗 PD-1 抗体キイトルーダ ® （ペムブロリズマブ）の コンパニオン診断薬で世界で 初めての癌種横断的な診断薬 感度が高く、遺伝子多型の影響を 受けにくい 1 塩基繰り返しの 5 マーカーを採用（プロメガパネル） 自動核酸精製装置 Maxwell® RSC 48 とリキッドハンドラー Maxprep™ 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Maxwell ® RSC QIAcube Ampliable yield (ng) Human Colon 3 curls 1 curl NanoDrop QuantiFluor® 0 1 2 3 4 5 6 Sample 1 Sample 2 Sample 1 Sample 2 Maxwell QIAcube ® RSC Yield (µg) per 100µl Input FFPE 組織切片より各自動精製装置を用いて 得られた DNA 収量の比較 収量は定量 PCR により決定し、ヒト結腸の FFPE のトリプリケートサンプルの平均およ び標準偏差として示した。 全血より各自動精製装置を用いて得られた RNA 収量の比較 血液 1 ml あたりの RNA 収量を各ドナーおよび 条件ごとに 4 回の反復サンプルの平均および 標準偏差として示した。また、RNA は NanoDrop® および Quantus™ で定量した。 遺伝子検査・コンパニオン診断 ゲノム不安定性と核酸精製 より詳細については… 多検体からの核酸精製 promega.jp/maxwellht より詳細については… カスタム製造 promega.jp/custom 23 FFPE 血液 DNA / RNA 精製 図 3. 従来の安定発現細胞株と QuEstHAC™ Cell の比較 図 2. HAC への目的遺伝子の部位特異的組換え 細胞株の誤認が問題になっています ! 近年、ヒト培養細胞株でクロスコンタミネーションが多発していることが問題になっており、実験室で取り扱われている細胞株の認証は今後、研究成果の信頼 性を高める上で必要不可欠な要素になることが予想され、実際にがん関連の学術誌の多くで投稿時に細胞認証を求めるケースが増えています。さらに、韓国 では再生医療等製品に該当する医薬品で起こった細胞のクロスコンタミが大きな問題となっています（bit.ly/31hRRv9）。プロメガ株式会社は国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 JCRB 細胞バンクとヒト細胞株の認証試験受託についての業務提携を行い、オンラインで簡単にお申込みいただけるサービスを提 供しています。本サービスでは、プロメガの STR（ショートタンデムリピート）解析システムと JCRB 細胞バンクで構築された STR データベースによってヒト培 養細胞に関するクロスコンタミネーションの可能性の有無についてご報告いたします。 細胞バンクに登録されている実験用の細胞株だけでなく再生医療、細胞治療などで 使用する患者由来細胞の確認試験などについてもお問合せください。 下記のような条件を満たせば受付可能です！ ・ 倫理委員会の承認サンプル ・ サンプル名を匿名化（患者様のお名前で依頼は厳禁） ・ 患者由来の親細胞と実験対象細胞の 2 検体分で依頼のこと ・ 不活化細胞であること（弊社輸送形態が FTA カードを使用する為問題無し） 特長： • 世界の STR データベースと照合 世界中の細胞バンク（JCRB、ATCC、DSMZ、RCB*）の登録データ約 5000 との 照合結果をご提供 • 信頼の細胞認証 世界有数の細胞バンクJCRB 細胞バンクによる信頼性の高い分析報告書（細胞認証書） • PowerPlex® 16 STR システムを採用 個人識別にも用いられる高品質で高い識別能力を有す PowerPlex® 16 STR System を 採用 • 簡単 & 短時間 Web で注文でき、面倒なサンプル調製不要（FTA カード使用）で約 2 週間で結果が 得られます。 その細胞株、大丈夫ですか ? 細胞認証試験 〜 実験室だけでなく医薬品製造現場にも忍び寄る恐怖！ 〜 まんがで解説 !（PDF） 細胞認証試験とは？ promega.co.jp/go?19007 オンライン注文については… ヒト細胞認証試験 promega.co.jp/hca/ テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982　● E-Mail : prometec@jp.promega.com PK1911-02B 販売店 日本語 Web site：www.promega.jp プロメガ株式会社 本　　　社　〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所　〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2019年11月現在のものであり予告なしに変更することがあります。