発光レポーターガイド

セルベースアッセイ

最新のNanoLuc® ルシフェラーゼを用いたデュアルアッセイやHaloTag® を併用したBRETなど新たな発光アプリケーションや実験の手順などを説明

プロメガ株式会社 プロメガ株式会社 最新のレポーターテクノロジーとアプリケーション 第 1 章　レポーターアッセイとテクノロジー ● これまでとこれからのレポーター …………………………………………………………2 ● 最新鋭レポーター ̶ NanoLuc® ルシフェラーゼ ̶ ……………………………………4 ● デュアルレポーター & マルチアッセイ …………………………………………………6 ● リアルタイムアッセイ…………………………………………………………………………………8 第 2 章　レポーターアッセイでできること ● シグナルパスウェイ解析 ………………………………………………………………………… 10 ● タンパク質間相互作用（PPI 解析）………………………………………………………… 12 ● プロモーター解析 …………………………………………………………………………………… 14 ● 核内受容体解析 ……………………………………………………………………………………… 14 ● タンパク質安定性解析…………………………………………………………………………… 15 ● RNA 干渉解析 …………………………………………………………………………………………… 16 ● in vivo イメージング & ウイルスのマーキング…………………………………… 17 第 3 章　レポーターアッセイ試薬 & レポーターベクター ● レポーター実験の流れ…………………………………………………………………………… 18 ● アッセイ/ 検出試薬 ………………………………………………………………………………… 20 ● レポーターベクター・クローン・細胞………………………………………………… 26 ● 関連製品（トランスフェクション・マルチアッセイ・ルミノメーター）…… 30 発光レポーターガイド 最新鋭 NanoLuc® ルシフェラーゼが広げるレポーターの可能性！ 2 解析 析 （14 ページ） 解析 （10 ページ） 1985 Assay（定量） Imaging（定性） シングルアッセイ イメージング デュアルアッセイ（6, 21 ページ） 蛍光タグ（ ®） リアルタイムモニタリング レポーター酵素 （転写・発現調節） レポーター酵素変異体 （発光センサー） レポーター酵素融合体 （発光タグ） X100 レポーター成長期 Sensitivity X1 レポーター黎明期 Sensitivity ・cAMP モニタリング ・プロテアーゼ活性の定量・ モニタリング （9, 29 ページ） ・プロテアーゼ活性の定量・ ・タンパク質相互作用 ・タンパク質イメージング ・タンパク質安定性試験 ・RNA 干渉解析 ・タンパク質相互作用 （12 ページ） ・タンパク質イメージング （17 ページ） ・タンパク質安定性試験 （15 ページ） ・RNA 干渉解析 （16 ページ） 変異サイト 標的分子 標的タンパク質 B ク質 A FLuc NanoLuc® HaloTag® Cat / β -Gal GFP 2010 2015 ～ X10,000 レポー ター拡大期 Sensitivity 標的シグナル 標的配列 レポーターアッセイ た測定手法。当初は比色法の β-Gal 法の CAT が汎用される。 Glo テクノロジー（24 ハイスループット化を加速。 発光酵素ルシフェラーゼ ホタルルシフェラーゼは高感度、低バッ クグラウンドで高い S/N 比が得られる とももにその簡便性からレポーターアッ セイの代名詞に。 蛍光タンパク質 オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク 質がイメージングへ応用され、タンパク 質のイメージングが容易に。 HaloTag® （25, 28 ページ） 30 KDa のリガンド結合性タンパク質タ グ。標 識 リガ ンド の 付 替 え が 可 能。 BRET アクセプターとして最適な蛍光特 性をしめす Ligand も新たに開発。 デュアルアッセイ 同一サンプルより基質特異性の異なる ホタルとウミシイタケルシフェラーゼが 測定可能となり、内部補正がレポーター 実験の信頼性を向上。 NanoLuc® 誕生（4 ページ） 発光強度の飛躍的な増加と小さな分子 量により、新しいアプリケーションの広 がりとともにより生体レベルを反映した 実験が可能に。 pGL4 プラスミドベクターに本来存在するコン センサス配列（転写因子の結合サイト でプロモーターによる発現制御へ変則 的な影響をあたえる）を極力削ぎ取り、 目的のシグナルを明瞭化。 NanoBRET （25 ページ） NanoDual （21 ページ） 第 1章 レポーターアッセイとテクノロジー 近年、遺伝子やタンパク質発現解析技術・検出装置の急速な発展により、さまざまな状況下で目的分子の挙動を捉えることができるようになってきました。 さらに、生きた細胞を用いて生理現象を“ありのまま”観察したいというニーズも高まっており、これに応える技術や手法の開発も活発化しています。 一方で、個々の遺伝子の産物である mRNA、タンパク質はそれぞれ非常にユニークな性質を持つため、汎用的な解析手法が使えないことが多く、解決すべき 問題点となっています。たとえばタンパク質発現量を定量する場合、ウェスタンブロッティングや ELISA の検出感度は各タンパク質に対する抗体の性能に大き く依存するため、異なるタンパク質の発現量を比較するのは難しい場合が多くあります。 Reporter GUIDE 3 解析 析 （14 ページ） 解析 （10 ページ） 1985 Assay（定量） Imaging（定性） シングルアッセイ イメージング デュアルアッセイ（6, 21 ページ） 蛍光タグ（ ®） リアルタイムモニタリング レポーター酵素 （転写・発現調節） レポーター酵素変異体 （発光センサー） レポーター酵素融合体 （発光タグ） X100 レポーター成長期 Sensitivity X1 レポーター黎明期 Sensitivity ・cAMP モニタリング ・プロテアーゼ活性の定量・ モニタリング （9, 29 ページ） ・プロテアーゼ活性の定量・ ・タンパク質相互作用 ・タンパク質イメージング ・タンパク質安定性試験 ・RNA 干渉解析 ・タンパク質相互作用 （12 ページ） ・タンパク質イメージング （17 ページ） ・タンパク質安定性試験 （15 ページ） ・RNA 干渉解析 （16 ページ） 変異サイト 標的分子 標的タンパク質 B ク質 A FLuc NanoLuc® HaloTag® Cat / β -Gal GFP 2010 2015 ～ X10,000 レポー ター拡大期 Sensitivity 標的シグナル 標的配列 レポーターアッセイ た測定手法。当初は比色法の β-Gal 法の CAT が汎用される。 Glo テクノロジー（24 ハイスループット化を加速。 発光酵素ルシフェラーゼ ホタルルシフェラーゼは高感度、低バッ クグラウンドで高い S/N 比が得られる とももにその簡便性からレポーターアッ セイの代名詞に。 蛍光タンパク質 オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク 質がイメージングへ応用され、タンパク 質のイメージングが容易に。 HaloTag® （25, 28 ページ） 30 KDa のリガンド結合性タンパク質タ グ。標 識 リガ ンド の 付 替 え が 可 能。 BRET アクセプターとして最適な蛍光特 性をしめす Ligand も新たに開発。 デュアルアッセイ 同一サンプルより基質特異性の異なる ホタルとウミシイタケルシフェラーゼが 測定可能となり、内部補正がレポーター 実験の信頼性を向上。 NanoLuc® 誕生（4 ページ） 発光強度の飛躍的な増加と小さな分子 量により、新しいアプリケーションの広 がりとともにより生体レベルを反映した 実験が可能に。 pGL4 プラスミドベクターに本来存在するコン センサス配列（転写因子の結合サイト でプロモーターによる発現制御へ変則 的な影響をあたえる）を極力削ぎ取り、 目的のシグナルを明瞭化。 NanoBRET （25 ページ） NanoDual （21 ページ） レポーターアッセイとテクノロジー また mRNA を RT-PCR や DNA アレイで検出する場合にも、塩基配列の違いにより各遺伝子の定量性に差や偏りが出るこ とがあり、誤差の補正は容易ではありません。決定的なデメリットとしてどちらも生きた細胞をそのまま使うことはできず、 ライセートの調製や核酸の精製などの前処理があり手技や経験によって結果に影響を及ぼす可能性もあります。レポー ターアッセイは遺伝子発現実験には欠かせない手法として確立し、生きた細胞内の情報をより正確にレポーティングする 技術へと進化をつづけています。 レポーターアッセイとは原理的に、ある生体内の分子の作用・挙動を観察可能なパラメーター（レポーター活性）に変換 する手法です。同じレポーター遺伝子を使用することで、異なる遺伝子の発現量を同じ方法で、しかも非常に高感度に 比較できます。さらに生細胞でのアッセイもできるため、同一サンプルでの継時的な変化を調べることが可能になります。 また単にレポータータンパク質の発現量を調べるだけでなく、レポーターの改変・融合により様々なバイオセンサーも開 発されています。例えば生細胞内 cAMP 量や ATP 量の変化を検出するセンサーやプロテアーゼ活性のセンサー、さらに 低酸素や細胞周期など特定の状態にある細胞を検出するセンサーも開発されています。さらに新しく開発された NanoLuc® の強力な発光レベルは内在プロモーターによる遺伝子発現の検出やトランスフェクション効率の低い初代培養 細胞でのレポーターアッセイ、さらには細胞内における分子光源（例：BRET）としての可能性も有しています。 このガイドでは、最新の知見とともにレポーターアッセイについてご紹介します。 4 第 1章 レポーターアッセイとテクノロジー もっと明るく レポーターの進化 1 最新鋭レポーター ̶ NanoLuc® ルシフェラーゼ ̶ これまで発光酵素ルシフェラーゼは感度の高さからレポーター酵素で最も汎用されるようになりました。プロメガではさらに生命科学に有 効なツールとして高感度であると同時に分子量も小さい NanoLuc® を開発しました。 NanoLuc（® Nluc）は深海エビ（トゲオキヒオドシエビ［Oplophorus gracilirostris］）由来のルシフェラーゼで、発光レポーターとして最適なパフォー マンスを発揮するために改変された分子量の小さな発光酵素（19 kDa）です。このルシフェラーゼはホタルやウミシイタケのものより約 150 倍明るく、高レベルの発光を長時間維持するための新規な基質 furimazine を用いて測定します。発光反応は ATP 非依存性で、最大の感度 を得るためにバックグラウウンド発光が抑えられるようにデザインされています。 分子量が小さく、強い発光を示す特性の利点は、応用可能なアプリケーションが広がると同時に少ない分子数（実際の生体内発現レベルと 同等）で十分な発光シグナルが得られるため、より生体システムに近い細胞内環境で実験を行えることです。 NanoLuc ® の特性 NanoLuc® ルシフェラーゼの特性 ● 非常に小さい、単量体酵素（171 アミノ酸；513 bp） ● ATP 非依存性 ● 高い熱安定性（Tm = 60℃） ● 広範な pH 幅で活性を保持（pH 6–8） ● 翻訳後修飾、ジスルフィド結合がない ● 細胞内で均一に分布 ● 蛍光スペクトルが生物発光共鳴エネルギー転移 （BRET；λ max = 465 nm）に最適 3 種類ルシフェラーゼ酵素（50 attomoles）からの発光測定 10 10587MA 3 104 105 106 NanoLuc Firefly Renilla Luminescence (RLU) 150倍の比活性 不安定型 NIucP の高い応答性 NF- κ B 応答エレメントを含む各種コンストラクトを HEK293 に導入し rhTNF α で処理した。 10560MA NanoLuc® Luciferase-PEST NanoLuc® Luciferase 0 1 2 3 4 5 6 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 1 × 109 1 × 1010 Time (hours) Luminescence (RLU) Firefly Luciferase-PEST A. Firefly Luciferase Time (hours) 0 1 2 3 4 5 6 1 10 100 1,000 Fold Response B. 10560MA NanoLuc® Luciferase-PEST NanoLuc® Luciferase 0 1 2 3 4 5 6 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 1 × 109 1 × 1010 Time (hours) Luminescence (RLU) Firefly Luciferase-PEST A. Firefly Luciferase Time (hours) 0 1 2 3 4 5 6 1 10 100 1,000 Fold Response B. NanoLuc® およびホタルルシフェラーゼの化合物による阻害 各精製ルシフェラーゼ酵素を LOPAC ライブラリー（1,280 種類の化合物）とインベキュー ションし、Nano-Glo® および Bright-Glo™ で発光を測定した。 0 200 400 600 800 1000 1200 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 Sample # % activity NanoLuc® + Nano-Glo® Z’ = 0.951 Z = 0.917 0 200 400 600 800 1000 1200 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 Sample # % activity Luc2 + Bright-GloTM Z’ = 0.895 Z = 0.804 安定：活性阻害を受けにくく HTS にマッチ ! （36 kDa） Renilla （61 kDa） Fire Fly （19 kDa） NanoLuc® Reporter GUIDE 5 レポーターアッセイとテクノロジー 生物発光イメージングによる NanoLuc® 融合タンパク質の動態モニタリング HEK293 細胞に発現するプロテインキナーゼ C-NanoLuc® 融合タンパク質を PMA 処理後 にフリマジン（Furimazine）発光基質を加えてモニタリングした。イメージングには Olympus LV200 Bioluminescence Imager を使用した。 www.promega.co.jp/nanolucbli1/ NanoLuc ® ルシフェラーゼ 明るいからイメージングにも最適！ 細胞や動物個体での生物発光イメージングは NanoLuc® レ ポーターの明るさとバックグラウンドの低さが有効なアプ リケーションの 1 つで、高感度発光用顕微鏡があれば様々 な生体内イベントを観察することができます。NanoLuc® でラベルされたウイルスの感染や腫瘍増殖などのイメー ジングにも利用されています。NanoLuc® レポーターは発 光強度が高いため、露光時間を数秒にまで短縮できるの で生物発光イメージングに利用する発光タグとして理想的 です。また、分子量が小さいため、融合パートナーの正常 な生体システムや機能性への影響を最低限に抑えること ができます（17 ページ参照）。 新しいアプリケーションへの応用 発光強度の高く、分子量の小さな NanoLuc® ルシフェラー ゼはこれまでのレポーターアプリケーションに、これまで に無い感度を与えます。これまでは困難であった低発現 レベル（例：細胞の内在プロモーター、トランスフェク ション効率の低い初代培養細胞）でも確実にシグナルを 捉えることができます。また、分子量の小ささは従来の ホタルルシフェラーゼの分子量の大きさが問題となる場 合に有効です。例えば、ウイルスへのパッケージングや標 的タンパク質と融合させイメージングやセンサーの作成を 行う場合は分子量が小さいことが大きなメリットとなりま す。NanoLuc® は従来のレポーターアッセイのパフォーマン スを高めるだけでなく、その他の発光アプリケーション （タンパク質安定性の変動追跡、BRET によるタンパク質 相互作用検出、in vivo イメージング）などを高感度に行う ことができます。 ホタルルシフェラーゼと組み合わせた最新デュアル – ルシ フェラーゼアッセイシステムが発売されました（21 ページ 参照）。 内在レベルで観察できるから“ゲノム編集技術”との親和性も抜群です。 NanoLuc® はホタルやウミシイタケルシフェラーゼよりも約 100 倍明るいため 100 倍の感度を備えます。これはホタルやウミシイタケルシフェラーゼと 同等のシグナルを得るのに NanoLuc® ならば 1/100 の分子数で賄えることを意味します。低レベル発現での検出が可能となり、生理的レベルに近い 分子濃度でイベントが検出できる可能性を示唆しています。内在レベルで発現する NanoLuc® ルシフェラーゼ融合体でもハイスループットスクリーニン グに十分な発光が得られます。また、ゲノム編集技術を用いて、特定疾患パスウェイの研究標的となるタンパク質との NanoLuc® 融合体の作製も行わ れ、内在レベルの発現変化を感度良く測定することにも成功しています。さらに特定のタンパク質との NanoLuc® 融合体を発現する改変細胞株も市 販されています（X-MAN ™ NanoLuc™ Reporter Cell Lines, Horizon Discovery）。 RE Nluc Nluc Rec Nluc HT シグナル伝達 / 遺伝子調節 受容体相互作用 タンパク質間相互作用 Nluc HT Prot Y Prot X バイオセンサー A バイオセンサー B DEVD 例：カスパーゼ 3 ウイルスパッケージング BRET BRET BRET Nluc タンパク質動態 タンパク質安定性 NNlluucc Nluc Nluc Nluc HT BRET Prot Prot Prot 6 第 1章 レポーターアッセイとテクノロジー もっと多くの情報を レポーターの進化 2 デュアル レポーター &マルチアッセイ 1 つのプレートの各ウェル内で複数マーカーを同時に測定するマルチアッセイは、データの精度を向上させることができると同時に時間や 費用を節約することができます。現在、正確な生物学的情報を取得するために、レポーター活性に加えて生存性、アポトーシス、細胞毒性（ネ クローシス）などのパラメータについての測定が行われています。これらのパラメータのいくつかを統合あるいは多重化してアッセイするこ とにより、1 回の実験からより多くの情報を得ることができます。2 つの異なるレポーター酵素を測定するデュアル – ルシフェラーゼアッセ イシステムはプロメガで開発され、分子生物学から細胞生物学における幅広い分野で利用されています。プロメガでは、これまでに蓄積さ れた細胞ベースのアッセイ技術から同時多項目解析を可能にするマルチアッセイ技術の開発を行い、培養細胞を用いた優れたアッセイ系を 提案しています。 レポーターアッセイを実施するに当たり、一般的にレポーター活性を異なるコンストラクトのベクターや処理条件で比較します。この場合、細胞数や トランスフェクション効率などの変動によってレポーターの発現量も変動する可能性があるため、レポーターデータを標準化する必要があります。 レポーターデータの標準化には、総タンパク質含量、総 ATP 含量や細胞数に対する補正やコントロールレポーターベクターに対する補正など様々な 方法が用いられています。このうち、コントロールレポーターベクターによる補正はトランスフェクション効率とともに細胞数の補正も行えるため、 一過性のトランスフェクションでアッセイする場合に最も有用な方法です。 デュアルレポーターアッセイの有用性 デュアルアッセイによる内部補正の概要 コントロールレポーターベクターは恒常的な活性を持つプロモーターにより第 2 のレポータータンパク質を発現します。これまでは実験レポーターと してホタルルシフェラーゼを使うことが多かったため、多くの場合コントロールレポーターにウミシイタケルシフェラーゼが使用されてきました。ウミ シイタケルシフェラーゼとホタルルシフェラーゼは基質が異なるため、同一サンプルで連続してアッセイすることができます（22 ページ参照）。また、 発現量が低いプロモーター、あるいはトランスフェクション効率が低い細胞でもデュアルアッセイが可能な最新型のルシフェラーゼ NanoLuc® とホタ ルルシフェラーゼを組み合わせた Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System が発売されさらにアッセイの幅が広がっています（21 ページ参照）。 Nluc mRNA NanoLuc® Nluc Fluc mRNA + NanoLuc® Nluc RE Firefly Fluc tk Firefly Fluc tk NanoLuc® Nluc RE A 1. 標的とするプロモーター応答配列 (RE) を決定 2. ルシフェラーゼ遺伝子上流に 応答配列をクローニング RE Gene of Interest tk 6597MA 3. 細胞にコンストラクトを 　トランスフェクション 恒常発現 プロモーター 3. 細胞にコントロールベクターを 　トランスフェクション 4. 1st 測定試薬を添加し、 　実験ルシフェラーゼ活性を 　測定 5. 2nd 測定試薬を添加し、 　コントロールルシフェラーゼ活性を 　測定 　注意：ウェルAの低い発光は 　細胞毒性による可能性有り 1st ルシフェラーゼの発光値は 応答配列に制御された実験値 2nd ルシフェラーゼの発光値は 応答配列とは独立したコントロール値 Reporter GUIDE 7 6398MB 0 40 80 120 Single Reporter Dual Reporter Optimal Transfection Suboptimal Transfection Percent Optimal Transfection 6399MB 0 5 10 15 Single Reporter Dual Reporter Interwell Coefficient of Variation (%CV) レポーターアッセイとテクノロジー NanoLuc® Dual の優れたクエンチング効果 Firey Luciferase Activity：ONE-Glo™ EX Luciferase Assay Reagent（ホタルの基質を含む）の添加 によるホタルルシフェラーゼの発光。 Quenched Luminescence：Stop Reagent（消光効果を示すために NanoDLR ™ Stop & Glo® Reagent から NanoLuc® 基質を除いたもの）によりホタルの発光はほとんど消失する。 Background：バックグラウンドサンプルの発光。 デュアルアッセイにより バラツキの低減（低い CV%） トランスフェクション効率に起因する バラツキの低減 アッセイケミストリの違いによりレポーターアッセイに加え、その他の細胞ベースアッセイを同じ細胞サンプルで実施することにより、細胞応答に関 する情報を多く入手することができます。 例えば、薬剤による細胞内パスウェイへの影響を調べる場合に薬剤自体に細胞毒性があるとレポーターアッセイデータの解釈を困難にします。これ を回避するために細胞生存試験を並行して行う場合がありますが、そのために実験材料がその分多く必要となってしまいます。レポーターアッセイと 細胞生存性試験のマルチアッセイならば 1 度の実験で 2 つのパラメーターを測定できるため、実験の精度を高めると同時にコストの増加を押えます。 また、レポーターアッセイとアポトーシスの指標であるカスーパーゼ 3/7 や P450 活性なども同じサンプルセットより測定することもできます。レポー ターアッセイとのマルチアッセイに対応したシステムについては 31 ページをご覧ください。 マルチアッセイの有用性 7543MA Log10 [Ionomycin] M -7 -6 -5 -4 0 500 1000 1,500 CellTiter-Fluor™ Assay ONE-Glo™ Assay 0 5 × 105 10 × 105 15 × 105 Viability Fluorescence (RFU) Reporter Activity Luminescence (RLU) 細胞生存性試験とシングル – ルシフェラーゼアッセイのマルチアッセイ GloResponse™ NFAT-RE-luc2P HEK293（10,000 cells/well, 100 µl/well）を、 DMEM/10%FBS（ハイグロマイシン B と、NFAT 転写因子を活性化する PMA を含む）培地で希釈したイオノマイシンで処理をした。37℃で 6 時間処理後、CellTiter-Fluor™ および ONE-Glo™ を用いてアッセイを 行った。イオノマイシン高濃度領域の NFAT 転写活性低下が細胞毒性に よるものであることが分かった。 1st アッセイ 2nd アッセイ 追加される情報 RealTime-Glo™ 発光 R ホタル E 細胞生存性（還元能） CellTox™ Green 蛍光 R ホタル、 ウミシイタケ、 NanoLuc® E 細胞毒性（漏出 DNA） CellTiter-Fluor™ 蛍光 E ホタル、 ウミシイタケ E 細胞生存性（プロテアーゼ） EnduRen™ / ViviRen™ 発光 R ホタル E ウミシイタケルシフェラーゼ （リアルタイム） MultiTox-Fluor™ 蛍光 E ホタル、 ウミシイタケ E 細胞生存性 & 細胞毒性 （プロテアーゼ） Apo-ONE® Caspase 3/7 蛍光 E ウミシイタケ ［EnduRen™］R アポトーシス活性 P450-Glo™ CYP induction 発光 E ホタル E P450 活性 E ＝ エンドポイント　　 R ＝ リアルタイム Firefly Luciferase Activity Quenched Luminescence Background 1 × 101 1 × 102 1 × 103 1 × 104 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 1 × 109 Luminescence (RLU) 12437MA 410,000,000 121 61 (7,000,000-fold quench) Reporter 1 p2A Reporter 2 Fluc Nluc True Hit Nluc Stabilization Fluc Stabilization Fluc Nluc Fluc Nluc Fluc Nluc 12519MA タンデムレポーターを用いた スクリーニングにおける偽陽性の 簡便な検出 タンデムレポーターベクターは、同じ mRNA 転写産物よりホタルルシフェ ラーゼと易分解性の NanoLuc® ルシ フェラーゼを発現する。2 つのレポー ターはリボソームスキップ機構を引き 起こす短い P2A 配列により 2 つの未 融合の可溶性ルシフェラーゼに分断 されるため、より正確な化合物プロ ファイルの作成が可能となる。 8 もっとリアルタイムに レポーターの進化 3 リアルタイムアッセイ 多くの細胞ベースのアッセイシステムは化合物添加後一定時間をおいたエンドポイントを測定する方式が汎用されていましたが、薬剤の濃 度に加え時間のパラメーターを付加することにより細胞内イベントへの理解は飛躍的に高まります。一般的なルシフェラーゼアッセイはシグ ナルを得るために細胞を破壊して基質を加えていましたが、細胞のタンパク質分泌機構を利用してレポーター酵素を細胞外に放出させる手 法やレポーター基質の細胞透過性を高める方法により継時的なアッセイが可能となりました。 第 1章 レポーターアッセイとテクノロジー 細胞ベースのアッセイでは細胞への影響を最小限に 抑えるように実験が行われていますが、ほとんどのレ ポーターアッセイでは正確で信頼性のある測定を行う ためにエンドポイントで細胞を完全に破砕する方法が 用いられてきました。ウミシイタケルシフェラーゼの 場合、基質である酸素およびセレンテラジンは毒性 が無く、細胞膜を容易に透過できるため生きた細胞 のままアッセイすることができます。しかし、これまで のセレンテラジンは水溶液中での安定性が低く、通常 の細胞培養条件下での使用は困難で不便な点があり ました。EnduRen™ および ViviRen™ Live CellSubstrate （25 ページ参照）はこれらの難問を解決するためにデ ザインされており、レポーター活性のリアルタイムモ ニタリングに最適です。 生きた細胞を用いた 24 時間以上のリアルタイム測定 cAMP response element（CRE）に制御された Rapid Response™ ウミシイタケルシフェラーゼ遺 伝子をトランジェントに HEK293 細胞へトランスフェクションし、EnduRen™ Live Cell Substrate で処理した。16 時間後、細胞を 6 µM イソプロテレノール（Calbiochem）で処理し、定期的に 発光を測定した。さらに約 20 時間後、10 µM フォルスコリン（Sigma）を加え、定期的な測定 を繰返した。細胞は測定しない時間はインキュベータに戻した。データは並行培養した未処 理の細胞に対する誘導倍率で示した。各データポイントは n = 6 で標準偏差も示した。 細胞透過性発光基質（ウミシイタケルシフェラーゼ） Luciferase mRNA + Rluc or N ul c Rluc or N ul c RE Time 1 Time 2 Time 3 Time 4 Luciferase Rluc or N ul c RE Luciferase Luciferase RE Gene of Interest 分泌 異なるタイムポイントで測定 1. 標的とするプロモーター応答配列（RE）を決定 2-A. IL6分泌シグナル付き 　　 NanoLuc® 遺伝子上流に 　応答配列をクローニング 2-B. Rluc ルシフェラーゼ遺伝子上流に 　応答配列をクローニング 3. 細胞にコンストラクトを 　トランスフェクション 4-A. 上澄を経時的に分取し、 　　 NanoLuc® 定量試薬で定量 4-B. EnduRenTM または ViviRenTM 試薬を 　　 細胞に添加し、経時的に定量 N N N O O O O O N H N N O O 透過 Reporter GUIDE 9 レポーターアッセイとテクノロジー GloSensor™ technology 生細胞リアルタイムセンサー レポーター発現量ではなく、レポーター活性そのものを変化させることが できれば、もっと迅速な反応を検出することができます。GloSensor™ は まさにこのような活性変化タイプのセンサーであり、簡便なプロトコールで 生細胞内のリアルタイムなターゲット分子検出が可能です。 cAMP と cGMP のセンサーが開発済みであり、プロテアーゼ活性のセンサー も開発中です。 GloSensor™ については 29 ページをご覧ください。 7708MA 1 × 105 1 × 104 1 × 103 Luminescence (RLU) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 MOD FSK ISO NA ISO PRO FSK Time (minutes) ：複数の薬剤で刺激 ：フォルスコリン ：イソプロテレノール ：未処理 アロステリック cAMP バイオセンサー 生細胞（37℃）におけるシグナルのカイネティクスとセンサーの可逆性。cAMP バイオ センサーを一過性に発現する HEK293 細胞を 10 µM イソプロテレノール（ISO）、10 µM プロプラノール（PRO）または 10 µM フォルスコリン（FSK）で連続的に処理した（n = 3）。Fan, F. et al.（2008）ACS Chem. Biol. 3, 346-51. より許可を得て転載した。 7707TA A. B. N C Open Open Closed N C Covalent N 234–544 4–233 C Noncovalent N FRB 4–547 FKBP C Allosteric N 359–544 RIIβB 4–355 C N C Closed N C N C C N N C N C Open Closed 分泌型のアッセイは同一サンプルプレートにおける経時的なアッセイやマルチアッセイなど利便性に優れますが、これまで自己発光によるバックグラ ウンドが大きな課題でした。NanoLuc® は他社の分泌型ルシフェラーゼに比べ自己発光が飛躍的に抑えられているため、高い S/N 比が得られます。 NanoLuc® 分泌型ルシフェラーゼ（secNluc）はレポーター遺伝子に IL-6 分泌シグナル配列が付加されており、培地中に分泌された NanoLuc® は細胞を 破壊することなく測定することができます。この分泌型 NanoLuc® を利用することにより、経時的なレポーターアッセイ、他の細胞マーカーとのマル チアッセイ、血中に分泌された NanoLuc® を利用した in vivo プロモーター活性測定などへの応用が可能です。NanoLuc® の定量試薬については 23 ペー ジ、分泌用ベクターについては 27, 28 ページをご覧ください。 分泌型ルシフェラーゼ（NanoLuc ® ） 他社分泌型ルシフェラーゼアッセイとの S/N 比の比較 100 101 102 103 104 105 106 107 108 Luminescence (RLU) A) autoluminescence background S) secreted luciferase 0.01 0.1 1 10 100 1000 Normalized S/N Ratio (%) Secreted luciferase 他社A (Flash) 他社Bb (Flash) 他社Bf+ 0%安定剤 (Flash) Nluc + NanoGlo (Glow) 他社Ad (Glow) Flash Type Glo Type Flash Type Glo Type 他社Bf + 10%安定剤 (Glow) 他社Bf + 16%安定剤 (Glow) 他社Bf + 20%安定剤 (Glow) A S A S A S A S A S A S A S A S 分泌型 NanoLuc® ルシフェラーゼによる経時的な測定 NanoLuc® ルシフェラーゼ（secNluc）の CRE 応答性発現を 6 時間フォルス コリン誘導あるいは DMSO コントロールの細胞で測定した。培地交換を t = 0 で行った。分泌アッセイフォーマットによりレポーターの活性化キネ ティクスを細胞溶解することなく測定できた。シグナルは GloMax® 96 Microplate Luminometer を用いて測定した。 10561MA –8 –7 –6 –5 –4 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 1 × 109 Log[Forskolin], M Luminescence (RLU) B. Time (hours) Luminescence (RLU) 0 1 2 3 4 5 6 1 × 104 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 DMSO Forskolin A. 10 生体内システムをしらべるための発光生物システム レポーター実験は、細胞内現象の変化を検出可能なシグナ ル（ルシフェラーゼ発光など）に変換し、検知するための 実験方法です。通常、細胞内イベントの変化に応答してレ ポーターの転写活性を調節する配列（例：プロモーター / エンハンサー、その他の転写因子結合配列など）をレポー ター遺伝子に接続したベクターを細胞内に導入します。薬 剤投与などの刺激により細胞内イベントが変化すると、そ れに応じてレポーター遺伝子が転写 / 翻訳されます。細胞 内に蓄積されたレポータータンパク質は容易に定量するこ とができます（右図参照）。ルシフェラーゼはバックグラウン ドが低く高感度な測定ができ、操作がシンプルであるため レポーターとして理想的です。また、翻訳後修飾をともな わずに活性を持つため、より直接的に転写活性をシグナル に変換することができます。 第 2 章 レポーターアッセイでできること External Stimuli Protein-Protein Interactions Vital Infection and Propagation Light Protein Folding Translation mRNA Processing Transcription luc Regulatory Sequences Transcription Factors Signal Transduction Receptor Ribozyme siRNA/Antisense RNA シグナルパスウェイ解析 GPCR パスウェイ ルシフェラーゼレポーターは、シグナル伝達経路の研究や GPCR などの受容体活性を制御する物質の探索に有効です。例えば、細胞内の cAMP レベ ルを調節している受容体の挙動は、一般に cAMP 応答配列（CRE）によってルシフェラーゼの転写と連動します。これらの応答配列を含むルシフェラー ゼレポーターを用いて、各種 GPCR パスウェイの解析が可能です。ホタルルシフェラーゼの内部に cAMP 結合タンパク質の一部を挿入し、cAMP レベ ルをモニタリングできる GloSensor™（cAMP センサー）については 9, 29 ページをご覧ください。 ルシフェラーゼレポーターを利用した GPCR シグナル伝達経路の解析 アゴニスト及びアンタゴニストの解析 pGL4-NFAT-luc2P と pF9A-M3R-hRluc-Neo を安定発現する HEK293 細胞に対し、各種因子を添加し 6 時間培養後、DualGlo™ Assay System（カタログ番号 E2920）で発光測定を行った。 ルシフェラーゼレポーターの利用 AC PLC Gαs Gαi Gαq Gα12/13 Gβγ 5257MA Plasma Membrane Nucleus CRE RE Luciferase SRE AP-1 NFAT-RE SRF-RE cAMP Ras DAG PIP2 RhoGEF RhoA SRF Actin dynamics IP3 PKC Ca2+ Calcineurin fos/jun Raf MEK-1 MAPK ELK-P PKA CREB-P ATP NFAT NFAT-P Modulator Modulator Modulator Modulator Rsk-2 Glo pF9A-M3R 38 Agonist Profile -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 10 20 30 carbachol Mcn-A-343 muscarine chloride pilocarpine HILLSLOPE EC50 carbachol 1.5 3.44e-008 Mcn-A-343 1.5 1.09e-006 MuCl2 1.5 7.99e-009 pilocarpine 1.6 1.61e-007 log [agonist], M Fold Induction 5922MA M3R-38 Antagonis t Profile (30nM Muscarine Chloride agonist) -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 50 100 atropine pirenzipine scopolamine telenzipine HILLSLOPE EC50 atropine -1.7 6.01e-009 pirenzipine -0.93 3.05e-007 scopolamine -2.2 1.13e-009 telenzipine -1.4 8.68e-009 log [antagonist], M % of control pF9A-M3R 38 Agonist Profile -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 10 20 30 carbachol Mcn-A-343 muscarine chloride pilocarpine HILLSLOPE EC50 carbachol 1.5 3.44e-008 Mcn-A-343 1.5 1.09e-006 MuCl2 1.5 7.99e-009 pilocarpine 1.6 1.61e-007 log [agonist], M Fold Induction 5922MA M3R-38 Antagonis t Profile (30nM Muscarine Chloride agonist) -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 50 100 atropine pirenzipine scopolamine telenzipine HILLSLOPE EC50 atropine -1.7 6.01e-009 pirenzipine -0.93 3.05e-007 scopolamine -2.2 1.13e-009 telenzipine -1.4 8.68e-009 log [antagonist], M % of control Reporter GUIDE 11 レポーターアッセイでできること ストレスシグナルパスウェイ 細胞は化学物質による毒性のほか、紫外線、放 射線、温度、物理的刺激など様々なストレスに 絶えずさらされています。これらのストレスには 細胞内のストレス応答機構が反応することが分 かっています。レポーターアッセイは、このよう なストレス応答機構を含め、細胞の広範なシグ ナル経路の解析ができます。プロメガでは種々 の細胞ストレスに対する応答エレメントを搭載し た、レポーターベクターシリーズを開発しました。 これらのベクターを用いたレポーターアッセイに より、細胞ストレスのシグナル伝達経路の特定、 各種細胞のストレス耐性の検討、ストレス化合 物の毒性評価などの解析が可能です。 各種シグナルパスウェイ プロメガでは様々な転写因子、シグナルパスウェイに対応する応答配列を含むルシフェラーゼ応答ベクターをご用意しています。がん研究、免疫学、 発生生物学、薬物代謝等様々な研究分野における主要なシグナルパスウェイの解析に応用できます。各種パスウェイ解析用ベクターについては 26, 27 ページをご覧ください。 12052M Thaw-and-Use A cells Traditional Method: Fresh from culture cells (~1-2 weeks) ‘Cells as reagents’: Frozen, thaw-and-use cells (3-24hr) Standard cells Cell culture Cell count, harvest, resuspend in assay buffer and plate for assay Assay and read plates Resuspend in assay buffer and plate for assay Assay and read plates ‘Cells as reagents’: Frozen, thaw-and-use cells (within 24 hours) 転写因子 応答エレメント シグナル経路 GPCR シグナル伝達経路 CREB CRE cAMP / PKA NFAT NFAT RE カルシウム / カルシニウリン ELK / SRF SRE MAP / ERK SRF SRF RE RhoA AP1 AP1 RE MAPK / JNK ストレスシグナル伝達経路 Nrf2 ARE 酸化ストレス p53 p53 RE DNA 損傷 ATF6 ATF6 RE 小胞体ストレス ATF4 ATF4 RE 小胞体ストレス MTF1 MRE 重金属ストレス HSF1 HSE 熱ショック Hif1 α HRE 低酸素 AhR XRE 生体異物ストレス AP1 AP1 RE MAPK / JNK 薬物代謝 3A4 シトクロム P450 / 薬物代謝 2B6 シトクロム P450 / 薬物代謝 各種シグナル伝達経路 NF- κ B NF- κ B RE NF- κ B STAT1：STAT2 ISRE INF- α STAT3：STAT3 SIE IL-6 SMAD3：SMAD4 SBE TGF- β LEF / TCF LEF-TCF RE Wnt STAT5：STAT5 STAT5 RE IL-3 GLI Gli RE ヘッジホッグ STAT1：STAT1 GAS RE JAK / STAT1 IFN- γ C / EBP RE 複数経路 TCF-LEF TCF-LEF RE Wnt STAT4 STAT4-RE JAK / STAT4 IL12 Myc：Max Myc Myc RBP-Jk RBP-JK-RE Notch NF- κ B hIL8 IL1 STAT1：STAT2 hIL8 T 細胞活性化 , IL1 STAT3：STAT3 hEGR1 NGF hID1 TGF- β / BMP PSA-long アンドロゲン活性化（前立腺がん） GCSF STAT3 4 3 2 1 0 -7 -6 -5 -4 log [CdCl2] (M) Fold Response 8 6 4 2 -8 -7 -6 -5 Fold Response log [tunicamycin](M) 0 5 4 3 2 0 -6 -5 -4 -3 Fold Response log [ZnSO4] (M) 1 25 20 15 10 5 -10 -9 -8 -7 Fold Response log [TCDD] (M) 0 p53 RE HRE AP1 RE ARE ERSE XRE HSE MRE Control NF-κB RE Cell-Titer Fluor HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs 4 3 2 1 0 -7 -6 -5 -4 log [CdCl2] (M) Fold Response 8 6 4 2 -8 -7 -6 -5 Fold Response log [tunicamycin](M) 0 5 4 3 2 0 -6 -5 -4 -3 Fold Response log [ZnSO4] (M) 1 25 20 15 10 5 -10 -9 -8 -7 Fold Response log [TCDD] (M) 0 p53 RE HRE AP1 RE ARE ERSE XRE HSE MRE Control NF-κB RE Cell-Titer Fluor HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs 4 3 2 1 0 -7 -6 -5 -4 log [CdCl2] (M) Fold Response 8 6 4 2 -8 -7 -6 -5 Fold Response log [tunicamycin](M) 0 5 4 3 2 0 -6 -5 -4 -3 Fold Response log [ZnSO4] (M) 1 25 20 15 10 5 -10 -9 -8 -7 Fold Response log [TCDD] (M) 0 p53 RE HRE AP1 RE ARE ERSE XRE HSE MRE Control NF-κB RE Cell-Titer Fluor HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs 4 3 2 1 0 -7 -6 -5 -4 log [CdCl2] (M) Fold Response 8 6 4 2 -8 -7 -6 -5 Fold Response log [tunicamycin](M) 0 5 4 3 2 0 -6 -5 -4 -3 Fold Response log [ZnSO4] (M) 1 25 20 15 10 5 -10 -9 -8 -7 Fold Response log [TCDD] (M) 0 p53 RE HRE AP1 RE ARE ERSE XRE HSE MRE Control NF-κB RE Cell-Titer Fluor HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs p53 RE HRE AP1 RE ARE ATF6RE XRE HSE MRE Control NF-κB RE Cell-Titer Fluor 4 3 2 1 0 -7 -6 -5 -4 log [CdCl2] (M) Fold Response HepG2 cells stimulated 6 hrs 8 6 4 2 -8 -7 -6 -5 Fold Response log [tunicamycin](M) 0 HepG2 cells stimulated 18 hrs 5 4 3 2 0 -6 -5 -4 -3 Fold Response log [ZnSO4] (M) 1 HepG2 cells stimulated 6 hrs 25 20 15 10 5 -10 -9 -8 -7 Fold Response log [TCDD] (M) 0 HepG2 cells stimulated 18 hrs 同一プレートでのストレス応答パネルに対する化合物プロファイリング HepG2 細胞に各ストレス応答配列を含む DNA をトランスフェクションした後、96 ウェルプレートに移し O/N でインキュベーションした。各化合物で処理し、CellTiter-Fluor™ で細胞生存性を蛍光で測定した後に ONEGlo™ でルシフェラーゼレポーターを測定した。 Cell as Reagent　細胞は検出試薬だ！ タンパク質や抗体など、バイオ医薬品の生物活性をモニター する方法はおおまかにセルフリーアッセイと細胞アッセイに分 けられます。わずかなタンパク質構造 / 修飾の違いがもたらす Potency の違いを見分ける能力は細胞アッセイが圧倒的に優れ ています。その反面、細胞は培養の手間や品質がバラつくと いう欠点があります。 細胞を凍結ストックとして保存し用時に溶かしてそのまま使う Thaw and Use format は、細胞培養に起因するこの欠点をなく し、細胞の高性能と試薬の使いやすさをあわせた新しい使い 方です。 プロメガでは ADCC Reporter Bioassay でこの方式を採用してい ます。ぜひ Thaw and Use format を体験してください！（29 ペー ジ参照） 12 タンパク質間相互作用（PPI 解析） タンパク質 ̶ タンパク質相互作用を調べる方法には、多くの手法があります。その中でも生細胞でのネイティブな状態での相互作用を検出する方法 としてツーハイブリッド法および BRET 法があります。プロメガではこれらの手法をルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイで、より簡便に、正確 に、感度よくタンパク質間相互作用を測定するツールをご用意しております。 第 2 章 レポーターアッセイでできること ツーハイブリッドシステム（哺乳動物細胞） ツーハイブリッド法は、酵母を使用する系として開発された方法です。酵母細胞は取扱いが容易な反面、高等生物のモデルとして使うには限界があ ります。そこで、哺乳類細胞を用いたツーハイブリッド法（mammalian two hybrid；M2H）が開発されてきました。この方法は、基本原理は酵母ツーハ イブリッド法と同様で、転写因子が DNA 結合ドメインと転写活性ドメインに分離できるモジュール構造を利用するものです。哺乳類の培養細胞を用 いる実験系であるため次のような利点があります。 ● 目的に合った細胞株を利用することができます。 ● 酵母細胞の実験系では細胞に発現ベクターを導入してから結果の判定を行うのに 3 ̶ 4 日かかるのに対し、哺乳動物培養細胞を用いた場合トラン スフェクション後 1 ̶ 2 日で結果を得ることができます。 低分子 GTP 結合タンパク質 RAS と RAF の相互作用解析例 NIH3T3 細胞に pBIND-RAS Vector および pACT-Raf を導入し、24、 48、72 時間後、Dual-Luciferase® Reporter Assay System で発光 値を測定した。 2050MB GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 X Y VP16 Firefly Luciferase Firefly Luciferase Firefly Luciferase pGL4.31 (luc2P/GAL4UAS/Hygro) Vector TATA TATA TATA VP16 GAL4 Luciferase Expression + + +++++ 0% 20% 40% 60% 80% 100% 24 hours 48 hours 72 hours Relative Expression Ratio Post Transfection pBIND/pACT-Raf pBIND-Ras/pACT pBIND-Ras/pACT-Raf プロメガの CheckMate™ / Flexi® Vector Mammalian Two-Hybrid System は、2 つのタンパク質あるいはドメイン同士の相互作用をレポーターアッセイで 評価するためのシステムで、細胞ベースのアッセイを行うためのステイブルな細胞株構築にも使用できます。まず目的の哺乳動物タンパク質をコード する遺伝子をクローニングし、細胞に導入するとネイティブな細胞内環境でタンパク質の発現および翻訳後修飾が起こります。酵母のツーハイブリッ ドシステム同様に目的タンパク質の 1 つ（“Bait”）を DNA 結合ドメインと融合させ、もう片方のタンパク質（“Prey”）を転写活性ドメインと融合させる ように設計します。ツーハイブリッド用のベクターについては 29 ページをご覧ください。 アプリケーション：KeratinoSens KeratinoSens™（Givaudan 社が開発）は皮膚感作性を 調べるための in-vitro 試験法として化粧品・医薬部外品 の安全 性評価に活用されています。この手法の原理 は ARE 応答配列を利用したレポーターアッセイです。 従来はマウス等の動物を用いて皮膚感作性試験が行 われていましたが、近年、動物実験代替法としてこの ような in vitro の試験手法が一般化されつつあります。 Nrf2 Nrf2 Nrf2 皮膚感作 物質 ARE Keap1 ルシフェラーゼ 哺乳動物細胞におけるツーハイブリッドシステムの概要 Reporter GUIDE 13 レポーターアッセイでできること BRET（生物発光共鳴エネルギー移動） 生 物 発 光 共 鳴 エ ネ ル ギ ー 移 動（Bioluminescence resonance energy transfer）は、生細胞におけるタンパク間の直接的な相互作用を検出す る手法として幅 広く用いられています。類似の原 理である FRET （Fluorescence resonance energy transfer）を用いた手法に比べ、励起光 を当てる必要がないので、バックラウンドがきわめて低く、励起光によ る細胞へのダメージを最小限に抑えることができます。発光源にプロ メガが新しく開発したルシフェラーゼ NanoLuc® を用いた NanoBRET ™ system は従来のウミシイタケルシフェラーゼを用いた BRET に比べ、よ り高い発光値と安定性、強固性を持ち、生細胞でのリアルタイム解析、 及びハイスループットスクリーニングに最適です。 NanoBRET ™ の特徴 ドナー NanoLuc® アクセプター HaloTag® 618 ligand 基質 Furimazine ドナーエミッションピーク（nm） 460 アクセプターエミッションピーク（nm） 618 ストークシフト（nm） 158 HT Ac K NanoLuc fusuion NanoLuc Substrate NanoLuc BRET Histone H3 or H4 BRD4 BRET Ligand NanoLuc BRD4 H3 or H4 HT HaloTag fusion 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Frb-NLuc Frb-RLuc8 Rapamycin (nM) Signal-to-Background Ratio 12323MA 0.0001 0.01 1 100 10,000 NLuc HT NLuc FKBP FKBP HT FRB FRB 610nm BRET Rapamycin A. B. HT ligand BRET アッセイにおける NanoLuc® および ウミシイタケルシフェラーゼのパフォーマンス比較 パネル A：実験スキーム。FKBP12- ラパマイシン複合体はラパマイシン存 在下、mTOR の FRB（FKBP12-Rapamycin Binding）ドメインに直接結合した。 FKBP は HaloTag® と融合しており、HaloTag® を蛍光 NanoBRET ™ リガンド で標識した（共有結合）。FRB には NanoLuc® または Renilla ルシフェラーゼ を融合させた。 パネル B：ラパマイシン濃度を増加させながら FKBP と FRB の相互作用を BRET により検出した。 A. B. 12398MA milliBRET Ratio JQ1 [nM] CBP with Histone H3.3 9 8 7 6 0.01 1 100 10,000 1,000,000 10 IC50 = NA milliBRET Ratio JQ1 [nM] BRD4 with Histone H3.3 14 12 10 8 6 0.01 1 100 10,000 1,000,000 16 IC50 = 52nM A. B. 12398MA milliBRET Ratio JQ1 [nM] CBP with Histone H3.3 9 8 7 6 0.01 1 100 10,000 1,000,000 10 IC50 = NA milliBRET Ratio JQ1 [nM] BRD4 with Histone H3.3 14 12 10 8 6 0.01 1 100 10,000 1,000,000 16 IC50 = 52nM ヒストン -ブロモドメインの阻害実験例 ブロモドメインのアセチルリジン認識モチーフに拮抗的に結合する細胞膜 透過性低分子化合物（JQ1）による、ヒストン -ブロモドメインの阻害効果 を NanoBRET ™ により定量化した。 Pre-Designed NanoBRET ™ PPI Assays プロメガでは主要なタンパク間相互作用の組み合わせとして、ヒストン -ブロモド メイン、HDAC1-2、p53、Myc、EGFR 等の最適化済みベクターセットおよび試薬 のカスタム製品 Pre-Designed NanoBRET ™ PPI Assays をご用意しています。 詳細については 25 ページをご覧ください。 14 5456MAj Gal4UAS luc GAL4 DBD NR-LBD Glo Glo RE luc NR 核内受容体の リガンド結合ドメイン Gal4の DNA結合ドメイン 内在性あるいは 外来性の核内受容体 ・pBIND-ERα Vector ・pBIND-GR Vector ・pFN26A (BIND) hRluc-neo Flexi® Vector ・pGL4.35[luc2P/9XGAL4UAS/Hygro] Vector ・GloResponse™ 9XGAL4UAS-luc2P HEK293 Cell Line ・pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro] Vector リガンド A. B. プロモーター解析 ルシフェラーゼアッセイを用いたプロモーター解析は転写 制御の一般的な手法として、広範な分野で用いられていま す。ルシフェラーゼ遺伝子の上流に目的のプロモーターを 挿入することにより、そのプロモーターの活性を解析する ことができます。目的プロモーターの欠損体および変異体 を解析することにより、そのプロモーターで重要な働きを する領域および塩基を特定することができます。 第 2 章 レポーターアッセイでできること Upstream Region Luciferase critical region 0 50% Percent Maximum Luc/Ren 100% プロモーター欠損体を用いたルシフェラーゼアッセイ 核内受容体解析 核内受容体はステロイドやその他の分子が細胞内に存在す ることを感知するリガンド調節性転写因子の一種です。核 内受容体は通常細胞質中に局在し、レギュレータと会合し た複合体を形成するものもあります。受容体はリガンドと の結合が引き金となり核内に移行し、DNA 結合ドメインを 介してゲノム DNA の標的部位に結合します。DNA との結合 は、隣接する遺伝子を正の調節へと導き、リガンドの存在 に対する細胞内応答を誘導します。哺乳動物細胞における 核内受容体の細胞内活性研究に使用される方法の 1 つとし てルシフェラーゼレポーターアッセイを利用したワン – ハイ ブリッドシステムがあります。このシステムでは核内受容体 リガンド結合ドメイン（LBD）を酵母の GAL4 転写因子の DNA 結合ドメインに融合させます。ハイブリッド融合タンパ ク質である核内受容体はその後、GAL4 UAS（GAL4 Upstream Activator Sequence；1）の 9 回繰り返し配列により制御され る luc2P ルシフェラーゼレポーターの転写を活性化します。 核内受容体解析用ベクターについては 26, 29 ページをご覧 ください。 核内受容体によるシグナル解析のための 2 つのアプローチ 8055MA –12 –11 –10 –9 –8 –7 0 100,000 200,000 300,000 400,000 500,000 600,000 700,000 log [E2], M Luminescence (RLU) EC50 = 0.89 nM Fold Induction = 872 ワン – ハイブリッドシステムを利用したエストロゲンの定量解析 9XGAL4UAS-luc2P を安定発現する HEK293 細 胞 GloResponse™ 9XGAL4UAS-luc2P HEK293 cells に pBIND-ER-alpha Vector を導入し、各濃度の E2 エストラジオールを添 加した。添加 24 時間後にルシフェラーゼ活性を Dual-Glo™ Luciferase Assay System で定量した。 Reporter GUIDE 15 レポーターアッセイでできること タンパク質安定性解析 タンパク質のターンオーバーのスピードは、発がんやストレス応答に関 わる多くのシグナルタンパク質を制御しています。下流の転写イベント が活性化した結果として細胞の状態が変化し、これに応答してタンパ ク質の安定化とそれに続く蓄積が起こります。目的タンパク質とルシ フェラーゼの融合タンパク質を用いることにより、タンパク質の安定 性および蓄積を発光値として定量化できます。 レポーターアッセイはストレス応答メカニズムを解析する強力なツール として利用されてきました。転写応答はシグナルの終点で起こるため、 低分子モジュレーターに対する細胞の総体的な応答を測定する上で非 常に簡便であり、これまで薬剤のスクリーニング等に汎用されてきま した。一方で薬剤は転写活性化のはるか上流のシグナルイベントで作 用することが多く、分子標的を見つける上ではレポーターアッセイでは 困難な場合があります。NanoLuc® と調節タンパク質の融合体の細胞内 レベルをモニタリングすることでシグナル上流での変化を迅速にとら えることができ、従来のレポーターアッセイを補完する情報を得ること ができます。 NanoLuc® Stability Sensor（カタログ番号 N1381, N1391：28 ページ）は ready-to-use のベクターシステムであり、NanoLuc® luciferase reporter の 特長を活かし、キーとなる 2 つのシグナルタンパク質 HIF1A と NRF2 の安定性の検討を可能にしました。 NRF2 Vector System：NRF2 は酸化ストレスに対する細胞の応答を仲介 するシグナルタンパク質です。NRF2 Vector System では細胞内 NRF2 タンパク質レベルを簡便に定量し、その動態を検討することが可能で す。NanoLuc® を C 末端に融合した NRF2 タンパク質を CMV プロモー ターの下流にコードしたベクター、細胞内 NRF2 レベルを適切に制御す るための pKEAP1 発現ベクター、細胞内での融合タンパク質の発現量 を調節するための Transfection Carrier DNA を含むシステムです。 HIF1A Vector System：HIF1A は低酸素に対する細胞の応答を仲介する シグナルタンパク質です。HIF1A Vector System では細胞内 HIF1A タン パク質レベルを簡便に定量し、その動態を検討することが可能です。 NanoLuc® を C 末端に融合した HIF1A タンパク質を CMV プロモーター の下流にコードしたベクター、細胞内での融合タンパク質の発現量を 調節するための Transfection Carrier DNA を含むシステムです。 NRF2 タンパクの安定性試験 96 ウェルプレートで HCT-116 細胞に pNLF1-NRF2［CMV/neo］Vector およ び pKEAP1 DNA をトランジェントにトランスフェクションした。細胞は表示 の時間で異なる濃度の D. L スルフォラファンで刺激した後、Nano-Glo® Luciferase Assay Reagent および GloMax® 96 Microplate Luminometer を用い て NanoLuc® ルシフェラーゼを測定した。 A. B. 0 2 x 105 4 x 105 6 x 105 8 x 105 1 x 106 –8 –7 –6 –5 –4 2 hours 4 hours 6 hours Log [M] Phenanthroline Nano-Glo™ Luciferase (RLU) 12165MA Nano-Glo® Luciferase (RLU) –8 –7 –6 –5 –4 0 2 x 105 4 x 105 6 x 105 8 x 105 1 x 106 2 hours 4 hours 0 hours 1 hour 0.5 hours Log [M] D,L-Sulforaphane タンパク質ダイナミクスと遺伝子発現のデュアルアッセイ HEK293 細胞に pNLF1-HIF1A [CMV/neo] 融合タンパク質発現コンストラクトと低酸素応答エレメントを含む pGL4.42 [luc2P/HRE/Hygro] を1：1000 の割合でトランジェン トにトランスフェクションした。18 時間後に様々な濃度の 1,10-フェナントロリンで刺激し、ホタルルシフェラーゼ転写レポーターと Hif1a-NanoLuc® 融合タンパク質 を Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter（NanoDLR™）Assay で表示の時点で定量した。 主要シグナルパスウェイの調節タンパク質の パスウェイ活性化にともなう細胞内寿命の変化 標的タンパク質 通常時 T1/2（分） 誘導時 T1/2（分） 誘導剤 HIF1 α 50 200 ̶ 250 低酸素 IkB α 100 5 TNF α / その他の 炎症性サイトカイン p53 20 300 ̶ 400 遺伝毒性ストレス （UV / 化学物質 DNA 損傷 , etc.） Nrf2 10 ̶ 15 30 ̶ 40 酸化ストレス β -Catenin <60 >200 Wnt FOXO >300 <60 成長因子 PDCD4 300 <60 インシュリン / PI3K c-Jun <60 >200 ストレス c-Myc 20 300 ̶ 400 ストレス c/EBP <60 >300 LiCl Ub VHL HIF NLuc HIF1a NLuc HRE Luc2P VHL VHL HIF NLuc HIF NLuc NLuc HIF Luc2P Ub Ub Ub Ub 1,10-phenanthroline 12468MA HRE – luc2P HIF1a – Nluc Fold Response (log scale) Time (hours) 0 2 4 6 8 1 10 HRE プロモーター活性 HIF1A タンパク質レベル 16 MiCheck miRNA バイオセンサークローン MiCheck miRNA バイオセンサークローンは microRNA 標的配列（代表的なヒト 157 種、マウス 32 種）をプロメガの psiCHECK ™-2 Vector に挿 入した microRNA 評価用クローンです。各組織や未分化細胞で発現の高い microRNA そして疾患（主にがん）と関連性のある microRNA を選 抜しています。各 microRNA 標的配列は SV40 プロモーター制御下にあるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の停止コドンの下流、3′ 非翻訳 領域に挿入しています。このため、microRNA 標的配列を含んだウミシイタケルシフェラーゼ転写物が発現します。ウミシイタケルシフェラー ゼ転写物は検討対象の microRNA によってその翻訳が影響を受けるので、その結果を発光値として検出することができます。ルシフェラーゼ レポーターにより、細胞増殖・分化過程および様々な細胞処理条件（刺激条件、薬剤処理など）について、細胞培養ウェル内で直接、簡単 に機能性 microRNA を評価することができ、様々な細胞の活性型 microRNA のバイオセンサーとして使用できます。お見積り、注文方法等に ついては www.promega.co.jp/micheck/ をご覧ください。 リバーストランスフェクションで実験短縮 接着細胞はプレートに接着していないとトランスフェクションできない。そ う考えてはいませんか ? 実はそんなことはありません。懸濁状態の細胞に トランスフェクトするリバーストランスフェクションという手法があります。 やり方は簡単。通常プロトコールではプレート上の細胞に DNA：トランスフェ クション試薬複合体を添加しますが、リバーストランスフェクションではプ レート上の DNA：トランスフェクション試薬複合体に細胞懸濁液を添加す るだけです。 細胞をプレートに播種しておくというステップが不要なため、リバースト ランスフェクションすれば実験短縮できるのです。通常プロトコールより毒 性がでやすい、導入効率が低いなどの欠点もありますが、良い条件が見つ かれば実験がぐっと楽になります。 プロメガの試薬はすべてリバーストランスフェクションに対応しています。 あなたも試してみませんか ? http://www.promega.jp/resources/pubhub/reverse-transfection-using-fugene-6- and-fugene-hd/ 9 3 12 6 9 3 12 6 9 3 12 6 10447MA Standard Transfection Reverse Transfection Plate cells. Plate transfection reagent and pGL4.10[luc2] Vector. Add cells. Incubate overnight to 24 hours. Incubate 24 hours. Incubate 24 hours. Measure luminescence. Measure luminescence. Add transfection reagent and pGL4.10[luc2] Vector. + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + RNA 干渉解析 siRNA や microRNA などのノンコーディング RNA の機能解析は転写調節、細胞の発生、分化、増殖、がん化およびアポトーシスなどの細胞機能解析 において重要です。プロメガではこれらの RNA 干渉をルシフェラーゼアッセイにより解析するシステムをご用意しております。ルシフェラーゼの発光 を利用することにより、GFP やフラッグ – タグなど、その他の融合法によるアプローチと較べ、より便利、迅速に感度の高い定量が行えます。 psiCHECK ™-1 および psiCHECK ™-2 Vectors は、 RNA 干渉実験初期段階における最適化を定量的、迅速に行うためにデザインされています。標的遺 伝子と融合されたレポーター遺伝子の発現変化をモニタリングします。両ベクターとも第 1レポーター遺伝子としてウミシイタケルシフェラーゼが利 用されており、目的の遺伝子はマルチクローニング領域にクローニン グします。目的遺伝子に対する合成 siRNA または in vivo で発現した shRNA による RNA 干渉機構が開始されると、標的遺伝子とつながる ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子も切断、分解されます。これにと もなうウミシイタケルシフェラーゼ活性の減少を測定することによ り、簡便に RNA 干渉効果をモニタリングすることができます。RNA 干渉に関連するベクターについては 29 ページをご覧ください。 Active siRNA hRluc 第 2 章 レポーターアッセイでできること Reporter GUIDE 17 レポーターアッセイでできること In Vivo イメージング & ウイルスパッケージング ルシフェラーゼ発光を利用した高感度なアッセイ系は生体分子、生体活性を定量する上で非常に強力なツールとして認知されています。ホタルルシフェ ラ－ゼ反応で生じる光には生体を透過しやすい赤色側の光が含まれているため、個体を用いた in vivo イメージングにも応用されています。ルシフェ ラーゼ発光は生体に影響を及ぼす可能性のある励起光を必要とせず、生体内に透過する毒性の低い基質のみを必要とします。さらに、GFP によるイ メージングでは励起光の届かない生体深部のイメージングもルシフェラーゼでは可能です。また、生物発光イメージングは蛍光イメージングに比べ、 シグナル /ノイズ比と感度の高さが特長です。 最新の NanoLuc® レポーターは高い感度と低いバックグラウンドを特長 としています。表層組織でのイベントを中心としたイメージング事例が あります。また、基質の特異性を利用した NanoLuc® とホタルルシフェ ラーゼによるデュアルルシフェラーゼイメージングも可能です。腫瘍の 増殖やウイルスの複製・拡散イメージングなど様々なアプリケーション に応用されています。 ※ NanoLuc® ルシフェラーゼは短波長の波長となるため、深部でのイ メージングには注意が必要です。詳細については、テクニカルサー ビス部 (prometec@jp.promega.com) までお問い合わせください。 ウイルスのマーキング ウイルスにレポーター遺伝子を導入する場合、ゲノムサイズが制限要因となることが多くあります。 NanoLuc® ルシフェラーゼは分子量が小さいため、この問題を解決できる可能性があります。近年、 NanoLuc® ルシフェラーゼによりインフルエンザおよびアルファウイルスレポーターの作製に成功したと いう論文が報告されています。 インフルエンザレポーターウイルスの作製は、ウイルスゲノムが小さく、しかも全ての遺伝子が感染に重 要であるため非常な困難を伴います。これまでのレポーター遺伝子は大きすぎるため、ウイルスの複製 や感染能力に影響を与えずに既存遺伝子との交換、挿入は困難であり、他のルシフェラーゼを用いたこ れまでの試みではウイルスの弱毒化やレポーター遺伝子の不安定化が認められていました。Tran ら （2013）は NanoLuc® ルシフェラーゼを用いて病原性を維持した安定なインフルエンザレポーターウイル スの作製に成功し、生きたマウスを用いた生物発光イメージングでは感染 2 日後でも発光が検出され、 プラークアッセイよりも高感度に検出されることを報告しています。明るい光は感染初期段階でも感度よく検出することができ、サイズの小ささは遺 伝子サイズが問題となる際のレポーターの構築に有利です。また、Sun ら（2014）は NanoLuc® やホタルルシフェラーゼなどを用いたアルファウイル スレポーターコンストラクトの有効性を比較しています。NanoLuc® およびホタルルシフェラーゼのコンストラクトを用いた場合、感染後 24 または 48 時間後のマウスの in vivo イメージングでは、ホタルでは注入部位にのみでシグナルが観察されたのに対して NanoLuc® では全身にシグナルが認められ 48 時間まで増加し続けたことにより、NanoLuc® の有用性が示された結果となりました。 1. Tran, V., Moser, L.A., Poole, D.S., and Mehle, A.（2013） Highly sensitive real-time in vivo imaging of an inuenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. J. Virol. 87 （24）, 13321-9. 2. Sun, C., Gardner, C.L., Watson, A.M., Ryman, K.D., and Klimstra, W.B.（2014） Stable, High-Level Expression of Reporter Proteins from Improved Alphavirus Expression Vectors To Track Replication and Dissemination during Encephalitic and Arthritogenic Disease. J. Virol. 88（4）, 2035-2046. ルシフェリンを用いたマウス個体の In Vivo イメージング In Vivo イメージング in vivo での動物個体イメージングで NanoLuc® と他のルシフェラーゼのパフォーマンスを比較し、in vivo でのホタルと NanoLuc® のデュアルイメージン グアッセイを実施した初めての論文をご紹介いたします。 本論文では新しい NanoLuc® ルシフェラーゼとホタルルシフェラーゼを用いて培養細胞およびマウスモデルにおける細胞内シグナリングイベントのイ メージングについて述べられています。著者らは 2 種類のルシフェラーゼを用いて TGF- β 1 シグナルパスウェイの中の異なるイベントをイメージング しています。このデータでは TGF- β シグナルの 2 つのポイント（受容体活性と転写）の活性化と阻害を定量化しています。ホタルルシフェラーゼレポー ターを TGF- β 1 受容体のキナーゼ活性検出用に、NanoLuc® ルシフェラーゼレポーターを TGF- β 依存的な転写活性検出用にそれぞれデザインし、 TGF- β または特異的阻害剤による影響のモニタリングに成功しています。このデュアルアッセイは細胞と動物個体で成功しています。 また、異なる実験では NanoLuc® だけを用いてマウスにおける腫瘍の増殖と進行をイメージングし、他の低分子ガウシアルシフェラーゼ（Gaussia）と 比較しています。さらに、著者らはホタルと NanoLuc® ルシフェラーゼを共発現するがん細胞を用いて組織表層部と深部の癌の進行モニタリングにつ いて比較しています。 1. Stacer, A.C., Nyati, S., Moudgil, P., Iyengar, R., Luker, K.E., Rehemtulla, A., and Luker, G.D.（2013）Mol. Imaging 12（7）, 1-13. 18 第 3 章 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター レポーターアッセイ実験の流れ ステップ 実験系選択 レポーター & ベクター選定 ベクター挿入配列選定 ベクター構築 プラスミド精製 細胞に導入 ルシフェラーゼ発光測定 選択肢 発現様式 ● 一過性発現／安定発現 レポーターの数 ● シングル／デュアル レポーター ● ホタル / ウミシイタケ / NanoLuc® ● 分解促進配列　有 / 無 薬剤選択マーカー ● Neo / Hygro / Puro ● プロモーター / 応答配列 / 3′ UTR ● 全長 / 一部 作　製 ● 自作 / 受託 購　入 ● 作製済みクローン ● 作製済みシグナル解析 ベクター ● 作製済みレポーター 安定発現株 ● トランスフェクション グレード / エンドトキシンフリー ● リポフェクション / エレクトロポレーション / ウイルスベクター 試　薬 ● フラッシュタイプ / Glo タイプ 機　器 ● プレートリーダー / シングルチューブ お勧めキット ● pGL4 ベクターシリーズ （26 ページ） ● pNL ベクターシリーズ （27 ページ） ● その他レポーターベクター （27 ページ） ● レポータークローン （27 ページ） ● レポーター導入細胞株 （29 ページ） ● カスタム製品 （27 ページ） ● PureYield ™ Plasmid Mini / Midi / Maxi kits （30 ページ） ● ViaFect™（30 ページ） ● デュルアッセイ （21 ～ 22 ページ） ● シングルアッセイ （23 ～ 25 ページ） ● マルチアッセイ（31 ページ） ● GloMax® マルチモード リーダー（32 ページ） 実験系選択 ベクターの選定とクローニング、クローン レポーター 実験レポーターは発光値が高いものを選び ましょう。一般に解析対象のプロモーターは 活性が弱くシグナルは低めです。高発光なら NanoLuc®、実績と種類の豊富さでホタルが お勧めです。 内部標準 レポーター 実験レポーターと基質や発光メカニズムが異 なるものを選びます。 NanoLuc® にはホタルを、ホタルには NanoLuc® かウミシイタケを選択します。 分解促進配列 シグナルへの迅速な応答が必要な場合は分 解促進配列付加タイプを選びます。NanoLuc® は NlucP、ホタルなら発光強度と応答性のバ ランスが取れた luc2P がお勧めです。 一過性発現 標的配列の選定や構築したベクターの評価、 配列を変更しながら解析する実験に適しま す。過剰発現系であるため、比較的高いシグ ナルが得られます。 安定発現 同じベクターを使う実験やスクリーニング、 トランスフェクション効率が悪い細胞に適し ます。細胞あたりのベクターコピー数が少な いため、一般に一過性発現よりシグナルが低 くなります。高発光の NanoLuc® はゲノムに 1 コピー挿入された場合でも検出できるため、 安定発現株でのアッセイに最適です。 レポーター の数 一過性発現の場合は実験レポーターのほか に内部標準レポーターが必要です。また実験 レポーターを 2 種類使うこともできます。レ ポーターを 2 種類使う場合は基質や発光メカ ニズムが異なる組合せを選び、デュアルアッ セイ試薬でアッセイします。 デュアルレポーターアッセイの有用性 （6 ページ） アプリケーション 実験レポーター 内部標準レポーター 全長プロモーター解析（一過性発現） ● pGL4.10［luc2］ ● pNL1.1［Nluc］ ● pGL4.74［hRluc/TK］、pNL-TK、pNL-PGK ● pGL4.53［luc2/PGK］、pGL4.54［luc2/TK］ TK プロモーター ：ウイルス由来 PGK プロモーター：ヒト由来、TK と同程度か少し弱い程度（細胞種に依存） シグナル解析（一過性発現） ● pGL4.23［luc2/minP］ ● pNL3.2［NlucP/minP］ シグナル解析（安定発現） ● pGL4.27［luc2P/minP/Hygro］ － ベクター挿入配列…標的遺伝子のプロモーター領域が不明の場合は、まず転写開始点から1 kb 程度上流まで（近位プロモーター）を選択します。5′ UTR の解 析ではレポーター開始コドンとの重複を避けるため、ATG 手前までを挿入します。シグナル応答配列の解析には最小プロモーター（minP） が必要です。シグナル応答配列とともにベクターに挿入するか、minP を持つベクターを使用します。 ベクター構築………ゲノムからのクローニング、人工遺伝子合成で得た配列をベクターに組み込みます。標的遺伝子の作製済みクローンやベクター、安定発現 株が市販されていれば、実験を早く立ち上げることができます。 ベクター（26 ページ）、クローン（27 ページ）、安定発現株（29 ページ）をご覧ください。 代表的なベクター組合せ Reporter GUIDE 19 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター ステップ 実験系選択 レポーター & ベクター選定 ベクター挿入配列選定 ベクター構築 プラスミド精製 細胞に導入 ルシフェラーゼ発光測定 選択肢 発現様式 ● 一過性発現／安定発現 レポーターの数 ● シングル／デュアル レポーター ● ホタル / ウミシイタケ / NanoLuc® ● 分解促進配列　有 / 無 薬剤選択マーカー ● Neo / Hygro / Puro ● プロモーター / 応答配列 / 3′ UTR ● 全長 / 一部 作　製 ● 自作 / 受託 購　入 ● 作製済みクローン ● 作製済みシグナル解析 ベクター ● 作製済みレポーター 安定発現株 ● トランスフェクション グレード / エンドトキシンフリー ● リポフェクション / エレクトロポレーション / ウイルスベクター 試　薬 ● フラッシュタイプ / Glo タイプ 機　器 ● プレートリーダー / シングルチューブ お勧めキット ● pGL4 ベクターシリーズ （26 ページ） ● pNL ベクターシリーズ （27 ページ） ● その他レポーターベクター （27 ページ） ● レポータークローン （27 ページ） ● レポーター導入細胞株 （29 ページ） ● カスタム製品 （27 ページ） ● PureYield ™ Plasmid Mini / Midi / Maxi kits （30 ページ） ● ViaFect™（30 ページ） ● デュルアッセイ （21 ～ 22 ページ） ● シングルアッセイ （23 ～ 25 ページ） ● マルチアッセイ（31 ページ） ● GloMax® マルチモード リーダー（32 ページ） プラスミド精製とトランスフェクションの重要性 ルシフェラーゼ発光測定 発光試薬 発光持続時間の違いでフラッシュタイプ、Glo タイプに分かれます。 フラッシュタイプは数分～十数分でシグナル が最高値の半分になります。プレートリー ダーで測定する場合はインジェクターが必要 です。 Glo タイプは 30 分～数時間シグナルが持続 します。サンプル数が多い場合は持続時間 が長い製品を使用します。プレート十数枚な ら1 ～ 2 時間程度で十分測定できます。 機器、 測定容器 発光測定にはルミノメーター、または発光測 定モードを持つマルチリーダーを使用しま す。蛍光リーダーは検出感度が低いため使用 できません。 プレートリーダーの場合は白色プレートを使 用します。透明プレートでは隣接ウェルから の発光漏れにより正確な測定ができません。 黒プレートではシグナルが約 1/10 に低下しま す。細胞培養と測定を同じプレートで行う場 合は底面が透明のクリアボトムプレートを使 用します。 シンブルチューブタイプの場合は機器に合っ たチューブを使用します。 一過性発現でレポーターアッセイを行う場合、トランスフェク ション効率は非常に重要な要因です。最適な導入条件や安定発 現株を得ることができれば、あとはデータを取るだけです。トラン スフェクション効率に影響する要因はいくつかあります。 プラスミド 精製度 エンドトキシン、塩、エタノールの混入はトラン スフェクション効率を著しく下げます。トラン スフェクショングレードの精製キットを使用 してください。プライマリー細胞など、エン ドトキシン感受性の高い細胞にはエンドト キシンフリーレベルの精製グレードが必要 です。 トランス フェクション法 操作の簡便さからリポフェクションが広く使 用されていますが、導入が難しい細胞にはエ レクトロポレーションやウイルスベクターが 使われています。 20 アッセイ / 検出試薬　選択ガイド 第 3 章 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター レポーター ベクター トランスフェクション 細胞 （1）エンドポイントアッセイ （2） リアルタイムアッセイ （経時的なモニタリング ） 基質 + 細胞溶解剤 基質 T＝1 T＝2 T＝3 ….. （4）In Vivo イメージング （3）Live Cell イメージング 細胞移植 基質 基質が細胞へ透過 ルシフェラーゼ活性の検出方法には 4 つのタイプがあ ります。 （1）一般的なエンドポイントアッセイでは、細胞を溶解 して内部のルシフェラーゼと基質が反応。 （2）リアルタイムアッセイでは、予め培地に加えられた 基質が細胞内に透過し、細胞内でルシフェラーゼ発光 反応が起る。細胞を破壊しないため、同じサンプルプ レートを経時的に測定することで、ルシフェラーゼ発 光をモニタリングすることができる。また他の細胞内 マーカーアッセイシステムと組み合せたマルチアッセイ も可能。 （3）Live Cell イメージングも同様に基質が細胞内に透 過し、細胞内でルシフェラーゼ発光反応が起る。これ を LV200 などの発光イメージングシステムで撮影する。 （4）In Vivo イメージングでは、ルシフェラーゼ遺伝子 を導入した細胞をマウスなどの動物個体に移植するこ とで、がん細胞の転移や薬物の影響などを経時的に観 察することができる。 ルシフェラーゼレポーターの測定またはイメージング アッセイ数 アッセイの タイミング アッセイ試薬 測定対象 （遺伝子） 感度 ホモジニアス※※※※ 発光持続時間 （測定可能時間） インジェクション （試薬の注入回数） ページ デュアル エンドポイント （細胞破壊） Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System ● ● ✔✔✔✔ ○ 2 時間 / 2 時間 2 21 Dual-Luciferase® Assay System ● ● ✔✔✔ × 15 分間 / 2 分間 2 22 Dual-Glo™ Assay System ● ● ✔✔ ○ 2 時間 / 2 時間 2 22 シングル ONE-Glo™ Assay System ● ✔✔ ○ 1 – 5 時間 1 24 Steady-Glo® Assay System ● ✔✔ ○ 5 時間 1 24 Bright-Glo™ Assay System ● ✔✔✔ ○ 30 分間 1 24 Renilla-Glo™ Assay System ● ✔✔ ○ 1 時間 1 24 Nano-Glo® Assay System ● ✔✔✔✔ ○ 2 時間 1※ 23 リアルタイム / Live Cell イメージング （生細胞） Nano-Glo® Live Cell Substrate and Vivazine™, Endurazine™ ● ✔✔✔✔ ○ （2 時間 / >72 時間 [V] / > 数日間 [E] ） 0 ※※ 23 ViviRen™ and EnduRen™ Cell Substrate ● （ V ）✔✔✔ （ E ）✔✔ ○ （>2 時間 [V] / >24 時間 [E] ） 0 ※※ 25 In Vivo イメージング （動物個体） VivoGlo™ Luciferin, In Vivo Grade ● ✔✔ ○ ̶ 0 ※※※ 25 EnduRen™ In Vivo Renilla Luciferase Substrate ● ✔✔ ○ ̶ 0 ※※※ 25 ViviRen™ In Vivo Renilla Luciferase Substrate ● ✔✔✔ ○ ̶ 0 ※※※ 25 ※ sec ベクター使用し、培地上澄を移してアッセイ。 ※※基質のみを細胞に加えればリアルタイムアッセイ/ Live Cell イメージングが可能。 ※※※試薬は予め培地に溶解。 ※※※※培地の除去、細胞の洗浄、細胞の溶解操作が不要で、培地を含む細胞に試薬を加えるだけの定量方法。 ● NanoLuc® ルシフェラーゼ　 ● ホタルルシフェラーゼ　 ● ウミシイタケルシフェラーゼ NEW Reporter GUIDE 21 製品名 サイズ カタログ番号 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System 10 ml N1610 100 ml N1620 10 × 10 ml N1630 10 × 100 ml N1650 ONE-Glo™ EX Luciferase Assay System 10 ml E8110 100 ml E8120 10 × 10 ml E8130 10 × 100 ml E8150 10 ml は 96 ウェルプレート 100 ～ 120 ウェル分に十分な試薬が含まれます。 ベクターについては 26-28 ページをご覧ください。 【 製品購入における注意点 】 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System の使用は非営利組織（大学、公的研究 機関など）、営利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容をご確認いただく必 要があります。ライセンスプログラムに関しては www.promega.co.jp/license/ をご覧くだ さい。 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System は最も高感度なデュアル – レポーターアッセイで、細胞内の微細な変化も検出することができます。 1 サンプルからホタルおよび NanoLuc® ルシフェラーゼ活性を連続測定することができます。新たなルシフェラーゼの組み合わせに最適化された新し い反応ケミストリによりデュアル – レポーターがより強力なツールとして生まれ変わります。 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System は 96/384/1536 ウェルフォーマットでのハイスループットフォーマットに対応するようにデザインされ ており、2 種類の試薬を順次加えるだけです。どちらの発光シグナルも半減期約 2 時間です。最初にホタルルシフェラーゼ用の試薬を培地中の細胞 に直接加えます（細胞の洗浄や溶解操作は不要）。次に NanoDLR™ Stop & Glo® Reagent を加えることによりホタルルシフェラーゼのシグナルを 1,000,000 分の 1 以下にまで減衰させると同時に NanoLuc® ルシフェラーゼの基質を供給します。 ● 低い発現レベルでも高感度にアッセイ 生体機能への影響を最小限に抑えながらより微細な変化をとらえる ことができます。最新型デュアルレポーターアッセイで最良のシグナ ル / バックグラウンド比がえられます。 ● より柔軟なアッセイデザインが可能 ホタルまたは NanoLuc® ルシフェラーゼのどちらも実験レポーターと して使用可能です。ホモジニアスアッセイでもライセートを用いたアッ セイでも選べます。 ● 試薬の安定性が向上 室温や 4℃での保存※も可能になり、ばらつきが抑制され、繰り返し の使用が簡便になります。また ONE-Glo™ EX も別売され、同じホタ ルアッセイ試薬をシングル、デュアルの両フォーマットで利用可能に なりました。 ※ ONE-Glo™ EX Reagent：室温（22℃）保存 約 18 時間、4℃保存約 3.5 日（10％活性 低下）、NanoDLR ™ Stop & Glo® Reagent：室温保存 約 32 時間、4℃保存 約 3.5 日（10％ 活性低下） ● コントロール DNA 量を抑え、より信頼性の高いデータ 発光量の高いレポーターならばコントロール DNA の使用量を低くお さえることにより、アーティファクトを最小限に抑えることができます。 ● アッセイパフォーマンスの向上 ホタルルシフェラーゼのクエンチング効率向上により、2 つのレポー ターのダイナミックスが広がり、より安定なデータが得られるように なります。 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター デュアルアッセイ（高感度タイプ）〈エンドポイント〉 Fire Fly NanoLuc® 12436MA GloMax® Discover System NanoLuc® ルシフェラーゼ発光の測定 ONE-Glo™ EX Luciferase Assay Reagent を添加 3分～2時間インキュベーション （20-25 ℃） 10分～2時間インキュベーション （20-25 ℃） ホタルルシフェラーゼ発光の測定 NanoDLR™ Stop & Glo® Reagent を添加 Nano-Glo® Dual-Luciferase® のアッセイの概要 12881MA 104 105 106 107 108 Relative Luminescence (RLU) Rluc in DLR Fluc in DLR Nluc in NanoDLR Fluc in NanoDLR Rluc in Dual-Glo Fluc in Dual-Glo Time After Reagent Addition (minutes) 0 20 40 60 80 100 120 NanoLuc is up to 1,000X brighter than Renilla luciferase when expressed o the same promoter. NanoDLR ™ アッセイのより明るく安定な発光特性 NanoDLR ™ アッセイのより明るく安定な発光特性 TK-Rluc（ウミシイタケ）： TK-Flu（c ホタル）：キャリア DNA または TK-Nluc（NanoLuc® ）：TK-Fluc：キャ リア DNA をそれぞれ 1：1：8 の割合で HEK293 細胞にトランスフェクション し、NanoDLR™、DLR ™ または Dual-Glo® Dual-Luciferase Assay System を 用いて測定した。同じプロモーターでルシフェラーゼを発現させた場合、 NanoDLR ™ Assay により測定した Nluc レポーターで最も明るい長時間発 光シグナルが得られ、Fluc レポーターも十分明るい長時間発光シグナルが 得られた。 各種ルシフェラーゼアッセイとの発光比較 22 デュアルアッセイ〈エンドポイント〉 第 3 章 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター Dual-Glo™ Luciferase Assay System Dual-Luciferase® Reporter Assay System Fire Fly Renilla デュアルアッセイにより、実験用レポーターのデータをコントロールレポーターのデータで補正し、実験間のバラツキを低減することができます。 Dual-Glo™ Luciferase Assay System および Dual-Luciferase® Reporter Assay System はホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を導入した哺乳動 物細胞から得られる 2 種類のルシフェラーゼ活性を、発光シグナルとして連続定量するための試薬です。Dual-Glo™ はシンプルなホモジニアスアッ セイ方式（添加→測光）を採用しており、培地の除去、細胞洗浄を行わずに試薬を加えるだけなので特に 96、384 プレートを用いた多検体のアッセ イに最適です。Dual-Luciferase® は細胞ライセートを調製する必要がありますが、Dual-Glo™ に比べ高い発光レベルを特長としています（各システム の発光値、発光半減期については 20 ページ参照）。 製品名 サイズ カタログ番号 Dual-Glo™ Luciferase Assay System 10 ml E2920 100 ml E2940 10 × 100 ml E2980 10 ml は 96 ウェルプレートで約 130 ウェル分に相当。 ベクター、組換え細胞については 26, 29 ページをご覧ください。 製品名 サイズ カタログ番号 Dual-Luciferase® Reporter Assay System 100 回分 E1910 Dual-Luciferase® Reporter Assay System 10-Pack 1000 回分 E1960 Dual-Luciferase® Reporter 1000 Assay System 1000 回分 E1980 サイズは 96 ウェルプレートに換算した回数。 ベクター、組換え細胞については 26, 29 ページをご覧ください。 デュアル – ルシフェラーゼ レポーターは 特異的および非特異的な細胞内反応を識別する Tet-Off プロモーターで制御されるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子およ び CMV プロモーターで制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子（pCI Vector+luc+）を、CHO 細胞に一過性にトランスフェクションし、様々な濃 度の特異的阻害剤ドキシサイクリン（テトラサイクリン誘導体）および全般 的阻害剤 G418 に暴露した。 パネル A（シングルレポーター）：実験用レポーターとしてのウミシイタケ ルシフェラーゼのみの値（阻害剤無添加の際の値を差し引いた）。その結 果、ウミシイタケルシフェラーゼ発光は、2 つの阻害剤により減少した。 パネル B（デュアルレポーター）：実験用レポーターとしてのウミシイタケ ルシフェラーゼの値を、コントロールとしてのホタルルシフェラーゼ発光 値で補正した。この結果、デュアル – レポーターを用いることにより、特 異的、非特異的細胞内反応を識別できることが示された。 0 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1,000 20 40 60 80 100 120 140 [Inhibitor] (ug/ml) A. B.Relative Renilla Luminescence (as % of no inhibitor) Relative Response Ratio Renilla/Firefly Luminescence (as % of no inhibitor) G148 Doxycycline G148 Doxycycline 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1,000 0 20 40 60 80 100 120 [Inhibitor] (ug/ml) 3649MA02_2A Reporter GUIDE 23 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター シングルアッセイ〈エンドポイント & リアルタイム［分泌アッセイ］〉 Live Cell イメージング Nano-Glo® Luciferase Assay Reagent は NanoLuc® Luciferase の検出用のアッセイシステムです。Nano-Glo® Luciferase Assay System は 1 種類の試薬を加 えるだけのシンプルな操作性を提供するホモジニアスフォーマットを採用しており、培地の除去や細胞の洗浄は不要です。一般的な培地で使用した 場合、半減期約 2 時間におよぶグロータイプの発光シグナルが得られます。試薬は Nano-Glo® Luciferase Assay Substrate と Nano-Glo® Luciferase Assay Buffer を混和するだけで調製できます。試薬には溶解バッファーが含まれており、NanoLuc® luciferase を発現する細胞あるいはルシフェラーゼが分泌 された培地に直接使用することができます（IL6 分泌シグナルを含む“secNluc”ベクターを用いた場合）。 Nano-Glo® Live Cell Assay System は生細胞のまま発光を測定する1 液添加方式の非細胞溶解性の試薬です。NanoLuc® および NanoBiT® の検出の他、 NanoBRET ™ や NanoLuc® 融合タンパク質の生細胞イメージングにも使用できます。Nano-Glo® Live Cell Substrate は付属の Dilution Buffer で希釈して Nano-Glo® Live Cell Reagent を調製し、培地中に直接添加することで、細胞生存性を損なわずに最長 2 時間まで連続した発光モニタリングが行えます。 Endurazine™、Vivazine™ は数時間から数日にわたる長時間発光モニタリングが可能であり、内在レベルのタンパク質測定も可能な感度を有します。 Nano-Glo® Luciferase Assay System Nano-Glo® Live Cell Assay, Endurazine™, Vivazine™ NanoLuc®、ホタルおよび ウミシイタケルシフェラーゼアッセイの感度の比較 Nano-Glo® Live Cell Assay System、Endurazine™、Vivazine™ の 発光カイネティクス比較 Log[luciferase], pM 10549MA Luminescence (RLU) –3 –2 –1 0 1 2 3 4 5 6 7 1 × 102 1 × 103 1 × 104 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 1 × 109 1 × 1010 Firefly Luciferase Renilla Luciferase NanoLuc® Luciferase NanoLuc® NanoLuc® 製品名 サイズ カタログ番号 Nano-Glo® Luciferase Assay System 10 ml N1110 100 ml N1120 10 × 10 ml N1130 10 × 100 ml N1150 10 ml は 96 ウェルプレート 100 ウェル分に十分な試薬が含まれます。 ベクターについては 27, 28 ページをご覧ください。 【 製品購入における注意点 】 Nano-Glo® Luciferase Assay System の使用は非営利組織（大学、公的研究機関など）、営 利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容をご確認いただく必要があります。 ライセンスプログラムに関しては www.promega.co.jp/license/ をご覧ください。 製品名 サイズ カタログ番号 Nano-Glo® Live Cell Assay System 100 回分 N2011 1,000 回分 N2012 10,00 回分 N2013 Nano-Glo® Vivazine™ Substrate 0.1 ml N2580 1 ml N2581 10 ml N2582 Nano-Glo® Endurazine™ Substrate 0.1 ml N2570 1 ml N2571 10 ml N2572 Nano-Glo® Extended Live Cell Substrate Trial Pack （Endurazine™ および Vivazine™　各 0.1 ml ） 0.2 ml N2590 【 製品購入における注意点 】 Nano-Glo® Live Cell の使用は非営利組織（大学、公的研究機関など）、営利組織にかか わらず、ライセンスプログラムの内容をご確認いただく必要があります。ライセンス プログラムに関しては www.promega.co.jp/license/ をご覧ください。 Vivazine™ substrate Endurazine™ substrate Nano-Glo® Live Cell Assay System 104 105 106 107 108 Luminescence (RLU) Time (hours) 0 5 10 15 20 25 ● ハイエンドなレポーターシステム 発光量の高い NanoLuc® レポーターはより感度が求められる難しい 実験用途に使用可能。 ● 最適化が容易 添加して測定するだけのシンプルな操作性により HTS への変更が 容易。 ● より明るく長い発光時間 バッチ操作あるいは連続操作に最適化。 ● 自己発光の低減 低いバックグラウンドを実現する試薬組成により感度が向上。 24 ONE-Glo™/ Bright-Glo™/ Steady-Glo® Luciferase Assay Systems シングルアッセイ〈エンドポイント〉 ONE-Glo™ Luciferase Assay System は、より高感度、頑健に哺乳動物細胞 で発現したルシフェラーゼを測定するためのホモジニアスアッセイシステム で、ハイスループット、ウルトラハイスループットアプリケーションに最適 です。ONE-Glo™ Assay には新しく開発されたルシフェラーゼの基質が含 まれているため、試薬の安定性、サンプルに含まれる成分に対する寛容性 が向上しました。また、標準的なルシフェラーゼアッセイ試薬よりも硫黄 臭が低減され、使いやすくなっています。これらの特長により、他のレポー ターアッセイを多検体で行う際の不便さを低減することができ、発光パ フォーマンスが確実に発揮されます。シングル – エンドポイントアッセイで 最も使いやすいシステムです。 Bright-Glo™ Reagent、Steady-Glo® Reagent は従来型のグロータイプのシン グルルシフェラーゼアッセイシステムで、それぞれ発光強度（Bright-Glo™ Reagent は Steady-Glo® Reagent の約 7 ～ 8 倍）、発光時間が異なります。 ONE-Glo™ Luciferase Assay System ● よりシンプルな最適化 頑健なパフォーマンス、硫黄臭の低減、保存条件の改善、大容 量サイズの設定などにより最適化が容易で効率的に行えるよう になりました。 ● 室温または 4℃保存も可能 室温または 4℃での安定性増加により、日々の使用にも簡便な 保存が可能になりました。 ● 定量精度の増加 ONE-Glo™ Reagent は混和や分注の条件に対して寛容であるた め、再現性が向上（384, 1536 ウェルプレートに最適）。 ● より明るく長いシグナル バッチおよび連続プロセスに最適化されており、長時間の高レ ベル発光は特に検出前に長時間のインキュベーションを要する 場合に有用です。 ● サンプルに含有する成分による影響を低減 ONE-Glo™ Assay の新しいケミストリーは他のルシフェラーゼ アッセイよりも培地、フェノールレッド、ルシフェラーゼ阻害剤 に寛容。 製品名 サイズ カタログ番号 ONE-Glo™ Luciferase Assay System 10 ml E6110 100 ml E6120 1 L E6130 10 ml は 96 ウェルプレートで約 100 ウェル分に相当。 ベクター、組換え細胞については 26, 29 ページをご覧ください。 製品名 サイズ カタログ番号 Bright-Glo™ Luciferase Assay System 10 ml E2610 100 ml E2620 10 × 100 ml E2650 10 ml は 96 ウェルプレートで約 100 ウェル分に相当。 ベクター、組換え細胞については 26, 29 ページをご覧ください。 製品名 サイズ カタログ番号 Steady-Glo® Luciferase Assay System 10 ml E2510 100 ml E2520 10 × 100 ml E2550 10 ml は 96 ウェルプレートで約 100 ウェル分に相当。 ベクター、組換え細胞については 26, 29 ページをご覧ください。 6837MA 0 20 40 60 80 100 120 Time (minutes) Luminescence (RLU) 1 × 105 1 × 106 1 × 107 Bright-Glo™ Reagent ONE-Glo™ Reagent Steady-Glo® Reagent 第 3 章 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター 長時間発光タイプのルシフェラーゼ試薬の発光比較 96 ウェルプレートに 1 ウェルあたり 50 µl 分注した精製ルシフェラー ゼを含むサンプルに各ルシフェラーゼアッセイ試薬 50 µl（14.9 ng/ml with 0.1% Prionex® ）を加えた。 Fire Fly Renilla-Glo™ Luciferase Assay System Renilla-Glo™ Luciferase Assay System は、1 種類の試薬を加えるだけでグ ロータイプのウミシイタケルシフェラーゼシグナルを測定することができま す。基質を再溶解した試薬をサンプルに加えると安定なシグナルを得るこ とができます（例：22℃、60 分以上の半減期）。また、この試薬には細胞を溶 解する作用もあり、セレンテラジン基質の自家発光も抑えられています。 製品名 サイズ カタログ番号 Renilla-Glo™ Luciferase Assay System 10 ml E2710 100 ml E2720 10 × 100 ml E2750 10 ml は 96 ウェルプレートで約 100 ウェル分に相当。 ベクターについては 26, 27 ページをご覧ください。 11126MA 0 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 0 20,000 40,000 60,000 80,000 –8 –7 –6 –5 –4 Renilla-Glo™ Luciferase Assay System (No CellTox™ Green Dye) Renilla-Glo™ Luciferase Assay System (With CellTox™ Green Dye) CellTox™ Green Dye Control Renilla-Glo™ Assay (With CellTox™ Green Dye) Renilla-Glo™ Assay (No CellTox™ Green Dye) Log[Ionomycin], M Luminescence (RLU) Fluorescence (RFU) IC50 (µM) 9.88–23.42 10.32–15.97 Renilla Renilla-Glo™ と CellTox™ Green とのマルチアッセイ Reporter GUIDE 25 EnduRen™/ ViviRen™/ VivoGlo™ Substrate シングルアッセイ〈リアルタイム〉& In Vivo イメージング EnduRen™ Live Cell Substrates は、生細胞を用いてウミシイタケルシフェ ラーゼ活性を経時的（>24 時間）に測定するための試薬です。 この EnduRen™ 基質は、酸化を受けるサイトがブロックされているた め、基質の分解および自家発光を最低限に抑えるとともに、野生型の セレンテラジンに較べ、最大 10 倍のシグナル / バックグラウンド比を 示します。従来のセレンテラジンにくらべ、自動化への適応性、より 高い感度、BRET のアプリケーションを与えます。 EnduRen™ 基質は標準的な培地に溶かすだけで、ほとんどの哺乳動物 細胞種で基質が細胞内に透過します。そのため、細胞培養後にアッセ イ試薬を新たに添加するステップが無いため、アッセイをより単純化で きます。EnduRen™ 基質が細胞内に透過すると、細胞内のエステラー ゼにより保護基が外れ、セレンテラジン h になります。これがウミシイ タケルシフェラーゼの基質となり発光が開始されます。 製品名 サイズ カタログ番号 ViviRen™ Live Cell［In Vivo］ Substrate 1 プレート分 （0.37 mg） E6491 ［P1231］ 10 プレート分 （3.7 mg） E6492 ［P1232］ 【 In Vivo 用基質（カタログ番号 P1111, P1112, P1231, P1232, P1041）における注意点 】 各種ベクターの使用は非営利組織（大学、公的研究機関など）、営利組織にかかわらず、 ライセンスプログラムの内容をご確認いただく必要があります。 ライセンスプログラムに関しては www.promega.co.jp/license/ をご覧ください。 製品名 サイズ カタログ番号 EnduRen™ Live Cell ［In Vivo］ Substrate 1 プレート分 （0.34 mg） E6481 ［P1111］ 10 プレート分 （3.4 mg） E6482 ［P1112］ 製品名 サイズ カタログ番号 VivoGlo™ Luciferin, In Vivo Grade 50 mg P1041 ViviRen™ Live Cell Substrate は野生型セレンテラジンよりも 3 ～ 5 倍の 発光レベルを示します。さらに、自家発光が極めて低く抑えられてい るため、セレンテラジンに比べて最大 100 倍のシグナル /ノイズ比を 実現できます。 T 4810MA ime (minutes) 0 10 20 30 40 50 60 Luminescence (RLU) ViviRen™ Substrate EnduRen™ Substrate 10 100 1,000 10,000 100,000 NanoBRET ™ Nano-Glo® Detection System は NanoBRET ™ アッセイ用試 薬であり、NanoLuc® 基質である Nano-Glo® Luciferase Assay Substrate と、HaloTag® 蛍光リガンドである HaloTag® NanoBRET ™ 618 Ligand の セットです。明るく低波長側にシフトした NanoLuc® ドナーと、近赤外 側にシフトした HaloTag® アクセプターにより最適なスペクトルオーバー ラップを実現し、従来の BRET に比べシグナルが増加し高い定量性を 示します。HaloTag® は 33 kDa のタグタンパク質で、特異的に HaloTag® リガンドと共有結合するため様々なタンパク質機能解析に利用するこ とができます。 製品名 サイズ カタログ番号 NanoBRET ™ Nano-Glo® Detection System 200 回分 N1661 1,000 回分 N1662 【 製品購入における注意点 】 NanoBRET ™ Nano-Glo® Detection System の使用は非営利組織（大学、公的研究機関な ど）、営利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容をご確認いただく必要があり ます。ライセンスプログラムに関しては www.promega.co.jp/license/ をご覧ください。 Pre-Designed NanoBRET ™ PPI Assays プロメガでは主要なタンパク間相互作用の組み合わせとして、ヒストン -ブロモドメイン、HDAC、p53、Myc、EGFR、Kras、RNA 結合タンパク 質等の最適化済みベクターセットおよび試薬の製品 Pre-Designed NanoBRET ™ PPI Assays をご用意しています。 NanoBRET ™ Nano-Glo® Detection System NanoBRET ™ をタンパク質相互作用アッセイの例 HEK293 細胞におけるヒストン H3.3 と BRD4 または CBP（完全長）との相 互作用に対する JQ1 阻害の特異性 A. B. 12398MA milliBRET Ratio JQ1 [nM] CBP with Histone H3.3 9 8 7 6 0.01 1 100 10,000 1,000,000 10 IC50 = NA milliBRET Ratio JQ1 [nM] BRD4 with Histone H3.3 14 12 10 8 6 0.01 1 100 10,000 1,000,000 16 IC50 = 52nM Pre-Designed NanoBRET ™ PPI Assays ラインナップ ● ブロモドメイン（例：BRD2 Histone, H3.3） ● その他のエピジェネティクス（例：HDAC1, HDAC2） ● 転写（例：P53, MDM2） ● シグナル伝達 / キナーゼ（例：GRB2, EGFR） ● 膜タンパク質（例：EGFR, EGFR） ● RNA 結合タンパク質（例：hnRNPA, hnRNPF） NanoBRET ™ 関連試薬 ※ NanoBRET ™ PPI Assay へのお問い合わせ、見積もり請求については弊社テクニカルサービス部までお寄せください。 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター Fire Fly Renilla HaloTag® NanoLuc® 26 製品名 マルチ クローニング サイト レポーター遺伝子用 プロモーター / 応答配列 レポーター 遺伝子 分解 / 分泌配列 動物細胞 選択マーカー カタログ 番号 NanoLuc® ルシフェラーゼ シグナル解析用ベクター pNL[NlucP/NFAT-RE/Puro] Vector （特注） No NFAT-RE Nluc hPEST Puro CS175401 pNL[NlucP/NFAT-RE/Hygro] Vector （特注） No NFAT-RE Nluc hPEST Hygro CS177602 pNL[NlucP/CRE/Hygro] Vector （特注） No CRE Nluc hPEST Hygro CS186804 pNL[NlucP/p53-RE/Hygro] Vector （特注） No p53-RE Nluc hPEST Hygro CS194102 pNL[NlucP/ATF6-RE/Hygro] Vector （特注） No ATF6-RE Nluc hPEST Hygro CS186805 pNL[NlucP/ATF4-RE/Hygro] Vector （特注） No ATF4-RE Nluc hPEST Hygro CS183701 pNL[NlucP/MRE/Hygro] Vector （特注） No MRE Nluc hPEST Hygro CS194106 pNL[NlucP/HRE/Hygro] Vector （特注） No HRE Nluc hPEST Hygro CS180901 pNL[NlucP/GAS-RE/Hygro] Vector （特注） No GAS-RE Nluc hPEST Hygro CS191901 pNL[NlucP/ISRE/Hygro] Vector （特注） No ISRE Nluc hPEST Hygro CS190901 pNL[NlucP/SIE/Hygro] Vector （特注） No SIE Nluc hPEST Hygro CS189701 pNL[NlucP/STAT5-RE/Hygro] Vector （特注） No STAT5-RE Nluc hPEST Hygro CS180903 pNL[NlucP/AP1-RE/Hygro] Vector （特注） No AP1-RE Nluc hPEST Hygro CS177603 pNL[NlucP/CEBP-RE/Hygro] Vector （特注） No CEBP-RE Nluc hPEST Hygro CS188003 pNL[NlucP/MycMax-RE/Hygro] Vector （特注） No MycMax-RE Nluc hPEST Hygro CS175201 pNL[NlucP/ARE/Hygro] Vector （特注） No ARE Nluc hPEST Hygro CS180902 pNL[NlucP/SRE/Hygro] Vector （特注） No SRE Nluc hPEST Hygro CS177601 pNL[NlucP/SRF/Hygro] Vector （特注） No SRF Nluc hPEST Hygro CS194101 pNL[NlucP/SBE/Hygro] Vector （特注） No SBE Nluc hPEST Hygro CS177101 pNL[NlucP/TCF/LEF-RE/Hygro] Vector （特注） No TCF-LEF-RE Nluc hPEST Hygro CS181801 pNL[NlucP/XRE/Hygro] Vector （特注） No XRE Nluc hPEST Hygro CS186808 pNL3.2.NF-κB-RE [NlucP/NF-κB-RE/Hygro]Vector No NF- κB-RE Nluc hPEST Hygro N1111 クローニングベクター pNL3.1[Nluc/minP]Vector Yes minP Nluc No No N1031 pNL3.2[NlucP/minP]Vector Yes minP Nluc hPEST No N1041 pNL3.3[secNluc/minP]Vector Yes minP Nluc IL-6 No N1051 pNLCoI2[luc2-P2A-NlucP/minP/Hygro]Vector Yes minP Nluc/2A/luc2 hPEST Hygro N1471 pNL1.1[Nluc]Vector Yes No Nluc No No N1001 pNL1.2[NlucP]Vector Yes No Nluc hPEST No N1011 pNL1.3[secNluc]Vector Yes No Nluc IL-6 No N1021 pNL2.1[Nluc/Hygro]Vector Yes No Nluc No Hygro N1061 pNL2.2[NlucP/Hygro]Vector Yes No Nluc hPEST Hygro N1071 pNL2.3[secNluc/Hygro]Vector Yes No Nluc IL-6 Hygro N1081 pNLCoI1[luc2-P2A-NlucP/Hygro] Vector Yes No Nluc/2A/luc2 hPEST Hygro N1461 コントロール ベクター pNL1.1.PGK[Nluc/PGK]Vector No PGK Nluc No No N1441 pNLCoI4[luc2-P2A-NlucP/PGK/Hygro]Vector No PGK Nluc/2A/luc2 hPEST Hygro N1491 pNL1.1.TK[Nluc/TK]Vector No TK Nluc No No N1501 pNL1.1.CMV[Nluc/CMV]Vector No CMV Nluc No No N1091 pNL1.3.CMV[secNluc/CMV]Vector No CMV Nluc IL-6 No N1101 pNL3.2.CMV[NlucP/CMV]Vector No CMV Nluc hPEST Hygro N1411 pNLCoI3[luc2-P2A-NlucP/CMV/Hygro]Vector No CMV Nluc/2A/luc2 hPEST Hygro N1481 ウミシイタケルシフェラーゼ クローニングベクター pGL4.70[hRluc]Vector Yes No hRluc No No E6881 pGL4.71[hRlucP]Vector Yes No hRluc hPEST No E6891 pGL4.72[hRlucCP]Vector Yes No hRluc hCL1-hPEST No E6901 pGL4.76[hRluc/Hygro]Vector Yes No hRluc No Hygro E6941 pGL4.77[hRlucP/Hygro]Vector Yes No hRluc hPEST Hygro E6951 pGL4.78[hRlucCP/Hygro]Vector Yes No hRluc hCL1-hPEST Hygro E6961 pGL4.79[hRluc/Neo] Yes No hRluc No Neo E6971 pGL4.80[hRlucP/Neo] Yes No hRluc hPEST Neo E6981 pGL4.81[hRlucCP/Neo] Yes No hRluc hCL1-hPEST Neo E6991 pGL4.82[hRluc/Puro] Yes No hRluc No Puro E7501 pGL4.83[hRlucP/Puro] Yes No hRluc hPEST Puro E7511 pGL4.84[hRlucCP/Puro] Yes No hRluc hCL1-hPEST Puro E7521 ベクター ロール コント pGL4.73[hRluc/SV40]Vector No SV40 hRluc No No E6911 pGL4.74[hRluc/TK]Vector No HSV-TK hRluc No No E6921 pGL4.75[hRluc/CMV]Vector No CMV hRluc No No E6931 レポーターベクター 第 3 章 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター 特注：特別注文品のため専用の注文用紙が必要です。promega.formstack.com/forms/casorder よりお申込みください。 Reporter GUIDE 27 製品名 マルチ クローニング サイト レポーター遺伝子用 プロモーター / 応答配列 レポーター 遺伝子 分解 / 分泌配列 動物細胞 選択マーカー カタログ 番号 ホタルルシフェラーゼ シグナル解析用ベクター pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]Vector No CRE luc2 hPEST Hygro E8471 pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro]Vector No NFAT-RE luc2 hPEST Hygro E8481 pGL4.31[luc2P/Gal4 UAS/Hygro]Vector No GAL4 UAS luc2 hPEST Hygro C9351 pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]Vector No NF-KB-RE luc2 hPEST Hygro E8491 pGL4.33[luc2P/SRE/Hygro]Vector No SRE luc2 hPEST Hygro E1340 pGL4.34[luc2P/SRF-RE/Hygro]Vector No SRF-RE luc2 hPEST Hygro E1350 pGL4.35[luc2P/9XGal4 UAS/Hygro]Vector No 9XGAL4 UAS luc2 hPEST Hygro E1370 pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro]Vector No MMTV luc2 hPEST Hygro E1360 pGL4.37[luc2P/ARE/Hygro]Vector No ARE luc2 hPEST Hygro E3641 pGL4.38[luc2P/p53 RE/Hygro]Vector No p53 RE luc2 hPEST Hygro E3651 pGL4.39[luc2P/ATF6 RE/Hygro]Vector No ATF6 RE luc2 hPEST Hygro E3661 pGL4.40[luc2P/MRE/Hygro]Vector No MRE luc2 hPEST Hygro E4131 pGL4.41[luc2P/HSE/Hygro]Vector No HSE luc2 hPEST Hygro E3751 pGL4.42[luc2P/HRE/Hygro]Vector No HRE luc2 hPEST Hygro E4001 pGL4.43[luc2P/XRE/Hygro]Vector No XRE luc2 hPEST Hygro E4121 pGL4.44[luc2P/AP1 RE/Hygro]Vector No AP1 RE luc2 hPEST Hygro E4111 pGL4.45[luc2P/ISRE/Hygro]Vector No ISRE luc2 hPEST Hygro E4141 pGL4.47[luc2P/SIE/Hygro]Vector No SIE luc2 hPEST Hygro E4041 pGL4.48[luc2P/SBE/Hygro]Vector No SBE luc2 hPEST Hygro E3671 pGL4.49[luc2P/TCF-LEF RE/Hygro]Vector No TCF-LEF RE luc2 hPEST Hygro E4611 pGL4.52[luc2P/STAT5 RE/Hygro]Vector No STAT5 RE luc2 hPEST Hygro E4651 クローニングベクター pGL4.10[luc2]Vector Yes No luc2 No No E6651 pGL4.11[luc2P]Vector Yes No luc2 hPEST No E6661 pGL4.12[luc2CP]Vector Yes No luc2 hCL1-hPEST No E6671 pGL4.14[luc2/Hygro]Vector Yes No luc2 No Hygro E6691 pGL4.15[luc2P/Hygro]Vector Yes No luc2 hPEST Hygro E6701 pGL4.16[luc2CP/Hygro]Vector Yes No luc2 hCL1-hPEST Hygro E6711 pGL4.17[luc2/Neo] Yes No luc2 No Neo E6721 pGL4.18[luc2P/Neo] Yes No luc2 hPEST Neo E6731 pGL4.19[luc2CP/Neo] Yes No luc2 hCL1-hPEST Neo E6741 pGL4.20[luc2/Puro] Yes No luc2 No Puro E6751 pGL4.21[luc2P/Puro] Yes No luc2 hPEST Puro E6761 pGL4.22[luc2CP/Puro] Yes No luc2 hCL1-hPEST Puro E6771 pGL4.23[luc2/minP]Vector Yes minP luc2 No No E8411 pGL4.24[luc2P/minP]Vector Yes minP luc2 hPEST No E8421 pGL4.25[luc2CP/minP]Vector Yes minP luc2 hCL1-hPEST No E8431 pGL4.26[luc2/minP/Hygro]Vector Yes minP luc2 No Hygro E8441 pGL4.27[luc2P/minP/Hygro]Vector Yes minP luc2 hPEST Hygro E8451 pGL4.28[luc2CP/minP/Hygro]Vector Yes minP luc2 hCL1-hPEST Hygro E8461 コントロール ベクター pGL4.13[luc2/SV40]Vector No SV40 luc2 No No E6681 pGL4.50[luc2/CMV/Hygro]Vector No CMV luc2 No Hygro E1310 pGL4.51[luc2/CMV/Neo]Vector No CMV luc2 No Neo E1320 pGL4.53[luc2/PGK]Vector No PGK luc2 No No E5011 pGL4.54[luc2/TK]Vector No TK luc2 No No E5061 Hygro ＝ Hygromycin PGK ＝ Human phosphoglycerate kinase promoter hCL1 ＝ Degradation sequence derived from yeast Neo ＝ Neomycin HSV-TK ＝ Herpes simplex virus-thymidine kinase promoter hPEST ＝ Degradation sequence derived from mouse ornithine carboxylase Puro ＝ Puromycin SV40 ＝ Simian virus 40 promoter IL-6 ＝ IL-6 secretion signal CMV ＝ Cytomegalovirus promoter minP ＝ Minimal promoter P2A ＝ viral P2A peptide sequence 【 ベクター・細胞株 購入における注意点 】 各種ベクターの使用は非営利組織（大学、公的研究機関など）、営利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容をご確認いただく必要があります。 ライセンスプログラムに関しては www.promega.co.jp/license/ をご覧ください。 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター 28 製品名 マルチ クローニング サイト 発現用 プロモーター 融合遺伝子 （＋融合パートナー） 蛋白質分解 / 分泌配列 動物細胞選択 マーカー （大腸菌選択マーカー） カタログ 番号 NanoLuc® 融合タンパク質発現ベクター ベクター 標的融合 pNLF1-HIF1A[CMV/neo]Vector No CMV Nluc ＋ HIF1A No Neo N1381 pNLF1-NRF2[CMV/neo]Vector No CMV Nluc ＋ NRF2 No Neo N1391 クローニングベクター pFN31A Nluc CMV-Hygro Flexi® Vector Flexi® CMV Nluc No Hygro（Amp） N1311 pFN31K Nluc CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV Nluc No Neo（Kan） N1321 pFC32A Nluc CMV-Hygro Flexi® Vector Flexi® CMV Nluc No Hygro（Amp） N1331 pFC32K Nluc CMV-neo Flexi Vector Flexi® CMV Nluc No Neo（Kan） N1341 pNLF1-N[CMV/Hygro]Vector Yes CMV Nluc No Hygro N1351 pNLF1-C[CMV/Hygro]Vector Yes CMV Nluc No Hygro N1361 pNLF1-secN[CMV/Hygro]Vector Yes CMV Nluc IL-6 Hygro N1371 HaloTag® 融合タンパク質発現ベクター クローニングベクター pFC14A HaloTag® CMV Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （C 末端） No （Amp） G9651 pFC14K HaloTag® CMV Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （C 末端） No （Kan） G9661 pFC15A HaloTag® CMVd1 Flexi® Flexi® CMV d1（強） HaloTag® （C 末端） No （Amp） G1611 pFC15K HaloTag® CMVd1 Flexi® Flexi® CMV d1（強） HaloTag® （C 末端） No （Kan） G1601 pFC16A HaloTag® CMVd2 Flexi® Flexi® CMV d2（中） HaloTag® （C 末端） No （Amp） G1591 pFC16K HaloTag® CMVd2 Flexi® Flexi® CMV d2（中） HaloTag® （C 末端） No （Kan） G1571 pFC17A HaloTag® CMVd3 Flexi® Flexi® CMV d3（弱） HaloTag® （C 末端） No （Amp） G1551 pFC17K HaloTag® CMVd3 Flexi® Vector Flexi® CMV d3（弱） HaloTag® （C 末端） No （Kan） G1321 pFN21A HaloTag® Flexi® Flexi® CMV（最強） HaloTag® （N 末端） No （Amp） G2821 pFN21K HaloTag® Flexi® Flexi® CMV（最強） HaloTag® （N 末端） No （Kan） G2831 pFN22A HaloTag® CMVd1 Flexi® Flexi® CMV d1（強） HaloTag® （N 末端） No （Amp） G2841 pFN22K HaloTag® CMVd1 Flexi® Flexi® CMV d1（強） HaloTag® （N 末端） No （Kan） G2851 pFN23A HaloTag® CMVd2 Flexi® Flexi® CMV d2（中） HaloTag® （N 末端） No （Amp） G2861 pFN23K HaloTag® CMVd2 Flexi® Flexi® CMV d2（中） HaloTag® （N 末端） No （Kan） G2871 pFN24A HaloTag® CMVd3 Flexi® Flexi® CMV d3（弱） HaloTag® （N 末端） No （Amp） G2881 pFN24K HaloTag® CMVd3 Flexi® Flexi® CMV d3（弱） HaloTag® （N 末端） No （Kan） G2981 pFC27A HaloTag® CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （C 末端） No Neo（Amp） G8421 pFC27K HaloTag® CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （C 末端） No Neo（Kan） G8431 pFN28A HaloTag® CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （N 末端） No Neo（Amp） G8441 pFN28K HaloTag® CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （N 末端） No Neo（Kan） G8451 融合タンパク質発現ベクター ● HaloTag® 融合タンパク質発現クローンについては Flexi HaloTag® クローン（10,000 種以上）も併せてご覧ください。 www.promega.co.jp/exiclone/ Flexi® ＝ Flexi® Cloning System（3 つの制限酵素だけで簡単に ORF の移換えが可能なクローニングシステム） IL-6 ＝ IL-6 secretion signal 第 3 章 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター Reporter GUIDE 29 製品名 マルチ クローニング サイト 発現用 プロモーター 融合遺伝子 （＋融合パートナー） 蛋白質分解 / 分泌配列 動物細胞選択 マーカー （大腸菌選択マーカー） カタログ 番号 ツーハイブリッド / ワンハイブリッド用 GAL4 DNA 結合ドメイン融合タンパク質発現ベクター ベクター コントロール ポジティブ pBIND-ER α Vector No CMV Gal4 DBD ＋ ER-LBD （N 末端） No hRluc-neo（Amp） E1390 pBIND-GR Vector No CMV Gal4 DBD ＋ GR-LBD （N 末端） No hRluc-neo（Amp） E1581 クローニング ベクター pFN26A（BIND）hRluc-neo Flexi® Vector Flexi® CMV Gal4 DBD （N 末端） No hRluc-neo（Amp） E1380 pFN11A（BIND）Flexi® Vector Flexi® CMV Gal4 DBD （N 末端） No hRluc（Amp） C9341 VP16 転写活性化ドメイン融合タンパク質発現ベクター ベクター ニング クロー pFN10A（ACT）Flexi® Vector Flexi® CMV VP16 TAD （N 末端） No hRluc（Amp） C9331 ※ E1390, E1581, E1380 は pGL4.35［luc2P/9XGal4 UAS/Hygro］Vector （カタログ番号 E1370：26 ページ参照）とともに核内受容体解析用ワンハイブリッドシステムとして使用します。 ※ C9341, C9331 は pGL4.31［luc2P/Gal4 UAS/Hygro］Vector（カタログ番号 C9351：26 ページ参照）とともにタンパク質間相互作用解析用ツーハイブリッドシステムとして使用します。 RNAi 効果評価用ベクター クローニングベクター pmirGLO Dual-Luciferase® miRNA Target Expression Vector Yes PGK luc2（N 末端） No hRluc-neo（Amp） E1330 psiCHECK ™-1 Vector Yes SV40 hRluc（N 末端） No （Amp） C8011 psiCHECK ™-2 Vector Yes SV40 hRluc（N 末端） No hluc+（Amp） C8021 ※ psiCHECK ™-2 Vector をベースにしたヒト、マウス miRNA 標的配列クローニング済みクローンについては www.promega.co.jp/micheck/ をご覧ください。 製品名 バリアント カタログ番号 cAMP 結合ルシフェラーゼセンサー pGloSensor™-22F cAMP Plasmid 22F E2301 pGloSensor™-20F cAMP Plasmid 20F E1171 Caspase 3/7 認識配列導入ルシフェラーゼセンサー pGloSensor™-30F DEVDG Vector 30F CAS ※プロテアーゼセンサーの詳細については www.promega.co.jp/proteasesensor/ をご覧ください。 ※専用アッセイ試薬 GloSensor™ cAMP Reagent カタログ番号 E1290（25 mg）が必要です。大サイズについてはお問い合わせください。 センサータンパク質発現ベクター 製品名 細胞株 応答配列 レポーター遺伝子 蛋白質分解 / 分泌配列 カタログ番号 シグナル伝達解析用細胞センサー 応答配列＋レポーター遺伝子導入済細胞 GloResponse™ NF-κB-RE-luc2P HEK293 Cell Line HEK293 NF-κB-RE luc2 hPEST E8520 GloResponse™ CRE-luc2P HEK293 Cell Line HEK293 CRE luc2 hPEST E8500 GloResponse™ NFAT-RE-luc2P HEK293 Cell Line HEK293 NFAT-RE luc2 hPEST E8510 GloResponse™ 9XGAL4UAS-luc2P HEK293 Cell Line HEK293 9XGAL4UAS luc2 hPEST E8530 ● 各バイアルには 2 × 106 個の細胞が含まれる 製品名 細胞株 遺伝子改変内容 カタログ番号 cAMP モニタリング用細胞センサー GloSensor™ cAMP HEK293 Cell Line HEK293 cAMP 結合すると構造が変化して発光活性が回復する ルシフェラーゼを発現する細胞（バリアント 20F） E1261 ※専用アッセイ試薬 GloSensor™ cAMP Reagent カタログ番号 E1290（25 mg）が必要です。大サイズについてはお問い合わせください。 製品名 エフェクター細胞 ターゲット細胞 カタログ番号 ADCC 抗体依存性細胞傷害アッセイ用細胞センサーキット ADCC Reporter Bioassay, Complete Kit（WIL2-S） Jurkat （Fc RIIIa［V158 バリアント］発現、 NFAT-RE-luc2 レポーター導入細胞） WIL2-S（CD20 発現細胞） G7014 ADCC Reporter Bioassay, Complete Kit（Raji） Raji（CD20 発現細胞） G7015 ※上記製品には細胞の他にアッセイ試薬やコントロール抗体（Anti-CD20）などが含まれます。 ※その他のセンサータンパク質発現ベクター、細胞センサー（バイオアッセイ）については 弊社までお問合せください。 【 ベクター・細胞株 購入における注意点 】 各種ベクターの使用は非営利組織（大学、公的研究機関など）、営利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容をご確認いただく必要があります。 ライセンスプログラムに関しては www.promega.co.jp/license/ をご覧ください。 細胞センサー（安定発現細胞株） レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター 30 87 50 211 151 148 87 DNA Yield (µg) PureYield™ Maxiprep 350 300 250 200 150 100 50 0 31.2 61.8 111.4 79.7 28.7 0 20 40 60 80 100 120 140 DNA Yield (µg) PureYield™ Midiprep DNA Yield (µg) 他社Miniprep A 他社Miniprep B 他社Miniprep C 他社Midiprep A 他社Midiprep B 他社Midiprep C 他社Midiprep D 他社Maxiprep A 他社Maxiprep B 他社Maxiprep C 他社Maxiprep D 他社Maxiprep E PureYield™ Miniprep 5.7 2.7 7.3 7.6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ViaFect™ Transfection Reagent は一般的に使用される付着細胞だけでな く、浮遊細胞や幹細胞由来の細胞株などトランスフェクションが難し いとされる細胞でも優れたトランス フェクション効率を示します（細胞 によってはエレクトロポレーションによる導入と同等以上の結果が得 られています）。細胞毒性もきわめて低く、健全な細胞状態を保つため、 レポーター実験に最適です。また、使用前に血清や培地を除く必要の ない（試薬 / DNA 複合体を導入した後）簡便なプロトコルで、リバース トランスフェクションにも対応します。 ViaFect ™ Transfection Reagent TF-1 浮遊細胞に pGL4.32［luc2P/NF- κ B-RE/Hygro］Vector（NF- κ B 応答配 列を含むルシフェラーゼレポーター）を ViaFect™ Transfection Reagent ま たは Amaxa Nuclefector® II（エレクトロポレーション）を用いてトランジェン トにトランスフェクションした。翌日に細胞を TNF α で 6 時間刺激し、応 答を Bio-Glo™ Luciferase Reagent を用いて測定した。 12105MA Luminescence (RLU) log[TNFα], ng/ml 0 –4 –2 0 2 20,000 40,000 60,000 80,000 ViaFect™ Transfection Reagent Amaxa T01 protocol トランスフェクション試薬 ベクターを細胞内に導入するレポーター実験を行う上で、トランスフェクションは非常に重要なステップで、効率の高い試薬を用いることでベクター 導入の困難な細胞でもレポーター実験を行うことが可能になる場合もあります。トランスフェクション試薬を評価する場合、導入効率もさることな がら細胞毒性にも注意を払う必要があります。導入効率が高い場合でも、死細胞や活性の低い細胞では細胞の応答を正しくとらえているとは言えま せん。通常のトランスフェクション試薬の評価系では GFP、β – ガラクトシダーゼなど導入細胞を可視化できる方法が汎用されますが、細胞毒性を含 めた正しい評価を得るには定量的なアッセイがかかせません。 製品名 サイズ カタログ番号 ViaFect™ Transfection Reagent 0.75 ml E4981 2 × 0.75 ml E4982 ViaFect™ 0.75 ml は 24 ウェルプレートで 500 ウェル分。 第 3 章 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター PureYield ™ Plasmid Prep System プラスミド精製 レポーターベクター / プラスミドはレポーター実験の重要な要素であり、簡便に高純度なベクターを調製することが望まれます。特に哺乳動物細胞 へのトランスフェクションにおいては細胞への影響が懸念されるエンドトキシンを最低限に抑えたトランスフェクショングレードのプラスミドが必要 です。 PureYield ™ Plasmid Miniprep System は高純度なプラスミド DNA を迅速 に精製するためのシステムです。プラスミドからタンパク質、RNA、エン ドトキシンを除去するためにデザインされたユニークな Endotoxin Removal Wash が組み込まれています。不純物の除去により、真核細胞 へのトランスフェクションをはじめとする繊細なアプリケーションにも 適応します。精製までの所要時間は Miniprep 約 10 分、Midiprep 約 30 分、 Maxiprep 約 60 分で、精製までのステップにイソプロパノール沈殿や多 くの遠心操作が無く、簡便、迅速に精製することができます。このシ ステムは遠心法または吸引法で簡単に操作することができます。 製品名 サイズ カタログ番号 PureYield ™ Plasmid Miniprep System 100 回分 A1223 250 回分 A1222 PureYield ™ Plasmid Midiprep System 25 回分 A2492 100 回分 A2495 PureYield ™ Plasmid Maxiprep System 10 回分 A2392 25 回分 A2393 ※ midi, maxiprep にはスイングローターの遠心機が必要です。 他社トランスフェクショングレードのプラスミド精製キットとの収量比較 Reporter GUIDE 31 RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay は細胞の還元力（代謝［MT］）を測定することにより培養中の生細胞数をリアルタイムに測定するための細 胞非溶解性の発光ホモジニアスアッセイ法です。アッセイでは予め培養細胞に NanoLuc® luciferase と細胞透過性の NanoLuc® 基質前駆体を添加する だけです。生存細胞はこの特殊な前駆体基質を還元し、NanoLuc® ルシフェラーゼの基質に変換します。この基質は細胞内から培地に拡散し、 NanoLuc® ルシフェラーゼにより迅速に消費され生存細胞数に相関する発光シグナルを生じます。細胞応答（還元能の増減）は数分以内に発光シグナ ルの変化として現れ、1 回の試薬供給で最大 72 時間生細胞のままモニタリングすることができます。 CellTox™ Green Cytotoxicity Assay は細胞死による細胞膜の完全性 の変化を測定します。生細胞からは排出され、死細胞由来の DNA を 選択的に染色する非対称のシアニン色素を用いています。細胞から遊 離した DNA にこの色素が結合すると蛍光特性が大幅に増強されます。 しかし、生細胞では蛍光の増加は検出されません。そのため、死細胞 の DNA に結合することで得られた蛍光シグナルは細胞毒性に比例しま す。CellTox™ Green Dye は細胞に対して毒性を示さず、72 時間後でも 安定したシグナルを維持するため、カイネティック測定あるいはエンド ポイント測定による毒性効果の決定に理想的です。 CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay は、細胞溶解を伴わずに生細胞 を測定する蛍光アッセイで、試薬を 1 種類加えるだけの簡便な方式を 採用しています。本アッセイでは、恒常的に発現する特定のプロテアー ゼをマーカーとして利用します。このプロテアーゼ活性は、インタクト な生細胞内に限定され、細胞透過性の蛍光性ペプチド基質がインタク トな細胞内に入ると、このプロテアーゼ活性により切断され、生細胞 数に比例した蛍光シグナルを生じます。 マルチアッセイ プロメガのセルベースアッセイにはマルチアッセイに対応する組合せが数多く存在しており、よりハイコンテントなデータを簡便に取得することがで きます。レポーターアッセイに対して（特にステイブル）、細胞の増減を同時に調べることはデータの解釈を容易にし、精度を高めます。細胞の生存性、 毒性試験についてはリアルタイムで経時的に測定できる新しい技術も開発されています。また、その他の細胞内マーカー（カスパーゼ活性、P450 活性、 他）を測定することにより多様なプロファイリングを取得することができます。 発光レポーターアッセイとのマルチアッセイには通常蛍光アッセイ法が用いられますが、タイミングやサンプルを分離することで発光×発光アッセイ を行うことも可能です。マルチアッセイの詳細については弊社テクニカルサービス部までお問い合わせください。 Multi-Assay Compatible Asssay Systems ONE-Glo™（ホタルレポーター）と CellTox™ Green（細胞毒性）のマルチアッセイ 発光シグナルは細胞死およびタンパク質合成低下により減少。細胞膜の損 傷により CellTox™ Green 蛍光色素が DNA に結合するため蛍光シグナルは 増加。ONE-Glo™ アッセイはホタルルシフェラーゼを恒常的に発現する HEK293 細胞で実施した。 P450 とルシフェラーゼレポーターのマルチアッセイ P450 は薬物の代謝 / 排泄に深く関与しており、薬剤による P450 の発現誘導（転 写活性の増加）および酵素阻害（代謝活性の低下）を調べることは薬剤の開発 を行う上で非常に重要です。3A4プロモーターを導入したルシフェラーゼベクター および PXR を恒常的に発現するベクターをトランスフェクションすることにより、 3A4 の転写活性と代謝活性を測定することも可能です（詳細についてはお問い合 わせください）。 inducible 3A4 luc PXR constitutive Luciferase Light Reporter Gene Assay + Drug PXR Drug RXR Light P450 Endogenous CYP3A gene(s) endogenous P450-GloTM Assay 2.5×107 2.0×107 1.5×107 1.0×107 5.0×106 0 0 20,000 40,000 60,000 80,000 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 ONE-Glo™ Assay (No CellTox™ Green Dye) ONE-Glo™ Assay (With CellTox™ Green Dye) CellTox™ Green Dye Control Log[terfenadine], M Luminescence (RLU) Fluorescence (RFU) 製品名 サイズ カタログ番号 RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay 100 回分 G9711 10 × 100 回分 G9712 CellTox™ Green Cytotoxicity Assay 10 ml G8741 5 × 10 ml G8742 CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay 10 ml G6080 5 × 10 ml G6081 MultiTox-Fluor Multiplex Cytotoxicity Assay 10 ml G9200 5 × 10 ml G9201 Apo-ONE ™ Homogeneous Caspase-3/7 10 ml G7790 100 ml G7791 P450-Glo™ CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA 10 ml V9001 50 ml V9002 P450-Glo™ CYP1A2 Induction/ Inhibition Assay 10 ml V8421 50 ml V8422 P450-Glo™ CYP2B6 Assay 10 ml V8321 50 ml V8322 100 回分および 10 ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分に相当（但し、P450-Glo™ については 10 ml は 96 ウェルプレートで 200 ウェル分に相当）。 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980／Fax. 03-3669-7982 ● E-Mail : prometec@jp.promega.com PK1906-03B 販売店 日本語 Web site：www.promega.jp プロメガ株式会社 本　　　社　〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所　〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2019年6月現在のものであり予告なしに変更することがあります。 GloMax® Discover System はプロメガのアッセイシステムに関する英知を結集してデザインした Ready-to-Use の多機能性マルチモードリーダー（発光、蛍光、 吸光［UV / 可視光］、BRET、FRET）で、フィルターによる 2 色発光測定やカイネティクス測定にも対応します。プリインストールされたプロメガ試薬のアッ セイプロトコルで直ぐに実験を開始することができ、ネットワークへのアクセスによりデータを望みのドライブに転送することができます。フィルターパド ルとフィルター自動切り替え機能によりマルチプレックスアッセイやカイネティクス実験にも対応します。プレートマスキングシステム（96 / 384 スイッチン グ）によりウェル間のクロストークを極限まで抑えた高感度測定が可能となり、ワイドなダイナミックレンジが得られます。新発売された GloMax® Explorer System は、検出機能を発光および蛍光に限定したスタートモデルで、初期投資を抑えることができます。また必要に応じてモジュール（可視吸光 / UV-可視吸光検出や BRET / FRET 測定機能）を追加して、段階的なアップグレードが可能になりました。 特長 ● 発光、蛍光、吸光［UV / 可視光］測定および BRET、FRET 対応 ● 9 桁以上のダイナミックレンジ（発光測定） ● 6 ～ 384 ウェルプレートおよび自動分注ロボットによる HTS にも対応 （ハイスピード測定：96 ウェル［1 分間］、384 ウェル［3 分間］） ● 撹拌機能 / 温度管理機能 ● 付属のタブレット PC によるタッチスクリーン操作、LAN 接続 ● スタートモデル GloMax® Explorer System は初期投資を低減 GloMax® Discover / Explorer System ルミノメーター ルミノメーターは生物発光を高感度に測定する装置で、ルシフェラーゼレポーターアッセイの普 及により一般的になり、現在では細胞ベースの様々なアッセイや生化学的測定にも使用されて います。プロメガのルミノメーターは、数多くの発光アッセイ試薬を開発しアッセイケミストリー を熟知した技術者のアイディアを反映させた、高感度で使いやすい測定装置です。 製品名 サイズ カタログ番号 GloMax® Discover System 1 台 GM3000 GloMax® Explorer System, Fully Loaded Model （発光 / 蛍光 / 可視吸光） 1 台 GM3500 GloMax® Explorer System, Luminescence and Fluorescence（発光 / 蛍光） 1 台 GM3510 NanoBRET ™ アッセイの例 阻害剤である Nutlin-3 の存在下・非存在下で p53 と Mdm2 の相互作用を検 出した。機器は GloMax® Discover System を使用した。エラーバーが小さく、 良好な Z’-factor が得られた。 1.71 0.49 No Drug Corrected mBU Nutlin-3 Z’=0.92 1.85 0.68 No Drug Corrected mBU Nutlin-3 Z’=0.71 1.71 0.49 No Drug Corrected mBU Nutlin-3 Z’=0.92 1.85 0.68 No Drug Corrected mBU Nutlin-3 Z’=0.71 96 ウェル プレート 384 ウェル プレート 生理的レベルのレポーター 融合タンパク質を発現する HCT-116 細胞の測定 GloMax® Discover と NanoLuc® テクノロジーにより非誘導時の生理的レベルの HIF1α-NanoLuc® 融合タンパク質の発現を細胞 2,500 個で検出した（NanoLuc® はゲノム編集技術により融合）。 12672MA 20K 10K 5K 2.5K 0 4 x 105 8 x 105 1.2 x 106 Luminescence (RLU) Cell Number ルミノメーターをお貸出しいたします！ www.promega.co.jp/rentamax/ Reporter GUIDE EXPLORER GloMax® Discover / Explorer System の装備比較 Model Lum Fluor. Vis Abs UV-Vis Abs BRET/FRET GloMax® Discover GM3000 ✓ ✓ ✓ ✓ GloMax® Explorer GM3500 ✓ ✓ ✓ Upgrade Upgrade GloMax® Explorer GM3510 ✓ ✓ Upgrade Upgrade Upgrade アップグレードについては弊社までお問い合わせください。 プロメガ株式会社 プロメガ株式会社 最新のレポーターテクノロジーとアプリケーション 第 1 章　レポーターアッセイとテクノロジー ● これまでとこれからのレポーター …………………………………………………………2 ● 最新鋭レポーター ̶ NanoLuc® ルシフェラーゼ ̶ ……………………………………4 ● デュアルレポーター & マルチアッセイ …………………………………………………6 ● リアルタイムアッセイ…………………………………………………………………………………8 第 2 章　レポーターアッセイでできること ● シグナルパスウェイ解析 ………………………………………………………………………… 10 ● タンパク質間相互作用（PPI 解析）………………………………………………………… 12 ● プロモーター解析 …………………………………………………………………………………… 14 ● 核内受容体解析 ……………………………………………………………………………………… 14 ● タンパク質安定性解析…………………………………………………………………………… 15 ● RNA 干渉解析 …………………………………………………………………………………………… 16 ● in vivo イメージング & ウイルスのマーキング…………………………………… 17 第 3 章　レポーターアッセイ試薬 & レポーターベクター ● レポーター実験の流れ…………………………………………………………………………… 18 ● アッセイ/ 検出試薬 ………………………………………………………………………………… 20 ● レポーターベクター・クローン・細胞………………………………………………… 26 ● 関連製品（トランスフェクション・マルチアッセイ・ルミノメーター）…… 30 発光レポーターガイド 最新鋭 NanoLuc® ルシフェラーゼが広げるレポーターの可能性！ 2 解析 析 （14 ページ） 解析 （10 ページ） 1985 Assay（定量） Imaging（定性） シングルアッセイ イメージング デュアルアッセイ（6, 21 ページ） 蛍光タグ（ ®） リアルタイムモニタリング レポーター酵素 （転写・発現調節） レポーター酵素変異体 （発光センサー） レポーター酵素融合体 （発光タグ） X100 レポーター成長期 Sensitivity X1 レポーター黎明期 Sensitivity ・cAMP モニタリング ・プロテアーゼ活性の定量・ モニタリング （9, 29 ページ） ・プロテアーゼ活性の定量・ ・タンパク質相互作用 ・タンパク質イメージング ・タンパク質安定性試験 ・RNA 干渉解析 ・タンパク質相互作用 （12 ページ） ・タンパク質イメージング （17 ページ） ・タンパク質安定性試験 （15 ページ） ・RNA 干渉解析 （16 ページ） 変異サイト 標的分子 標的タンパク質 B ク質 A FLuc NanoLuc® HaloTag® Cat / β -Gal GFP 2010 2015 ～ X10,000 レポー ター拡大期 Sensitivity 標的シグナル 標的配列 レポーターアッセイ た測定手法。当初は比色法の β-Gal 法の CAT が汎用される。 Glo テクノロジー（24 ハイスループット化を加速。 発光酵素ルシフェラーゼ ホタルルシフェラーゼは高感度、低バッ クグラウンドで高い S/N 比が得られる とももにその簡便性からレポーターアッ セイの代名詞に。 蛍光タンパク質 オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク 質がイメージングへ応用され、タンパク 質のイメージングが容易に。 HaloTag® （25, 28 ページ） 30 KDa のリガンド結合性タンパク質タ グ。標 識 リガ ンド の 付 替 え が 可 能。 BRET アクセプターとして最適な蛍光特 性をしめす Ligand も新たに開発。 デュアルアッセイ 同一サンプルより基質特異性の異なる ホタルとウミシイタケルシフェラーゼが 測定可能となり、内部補正がレポーター 実験の信頼性を向上。 NanoLuc® 誕生（4 ページ） 発光強度の飛躍的な増加と小さな分子 量により、新しいアプリケーションの広 がりとともにより生体レベルを反映した 実験が可能に。 pGL4 プラスミドベクターに本来存在するコン センサス配列（転写因子の結合サイト でプロモーターによる発現制御へ変則 的な影響をあたえる）を極力削ぎ取り、 目的のシグナルを明瞭化。 NanoBRET （25 ページ） NanoDual （21 ページ） 第 1章 レポーターアッセイとテクノロジー 近年、遺伝子やタンパク質発現解析技術・検出装置の急速な発展により、さまざまな状況下で目的分子の挙動を捉えることができるようになってきました。 さらに、生きた細胞を用いて生理現象を“ありのまま”観察したいというニーズも高まっており、これに応える技術や手法の開発も活発化しています。 一方で、個々の遺伝子の産物である mRNA、タンパク質はそれぞれ非常にユニークな性質を持つため、汎用的な解析手法が使えないことが多く、解決すべき 問題点となっています。たとえばタンパク質発現量を定量する場合、ウェスタンブロッティングや ELISA の検出感度は各タンパク質に対する抗体の性能に大き く依存するため、異なるタンパク質の発現量を比較するのは難しい場合が多くあります。 Reporter GUIDE 3 解析 析 （14 ページ） 解析 （10 ページ） 1985 Assay（定量） Imaging（定性） シングルアッセイ イメージング デュアルアッセイ（6, 21 ページ） 蛍光タグ（ ®） リアルタイムモニタリング レポーター酵素 （転写・発現調節） レポーター酵素変異体 （発光センサー） レポーター酵素融合体 （発光タグ） X100 レポーター成長期 Sensitivity X1 レポーター黎明期 Sensitivity ・cAMP モニタリング ・プロテアーゼ活性の定量・ モニタリング （9, 29 ページ） ・プロテアーゼ活性の定量・ ・タンパク質相互作用 ・タンパク質イメージング ・タンパク質安定性試験 ・RNA 干渉解析 ・タンパク質相互作用 （12 ページ） ・タンパク質イメージング （17 ページ） ・タンパク質安定性試験 （15 ページ） ・RNA 干渉解析 （16 ページ） 変異サイト 標的分子 標的タンパク質 B ク質 A FLuc NanoLuc® HaloTag® Cat / β -Gal GFP 2010 2015 ～ X10,000 レポー ター拡大期 Sensitivity 標的シグナル 標的配列 レポーターアッセイ た測定手法。当初は比色法の β-Gal 法の CAT が汎用される。 Glo テクノロジー（24 ハイスループット化を加速。 発光酵素ルシフェラーゼ ホタルルシフェラーゼは高感度、低バッ クグラウンドで高い S/N 比が得られる とももにその簡便性からレポーターアッ セイの代名詞に。 蛍光タンパク質 オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク 質がイメージングへ応用され、タンパク 質のイメージングが容易に。 HaloTag® （25, 28 ページ） 30 KDa のリガンド結合性タンパク質タ グ。標 識 リガ ンド の 付 替 え が 可 能。 BRET アクセプターとして最適な蛍光特 性をしめす Ligand も新たに開発。 デュアルアッセイ 同一サンプルより基質特異性の異なる ホタルとウミシイタケルシフェラーゼが 測定可能となり、内部補正がレポーター 実験の信頼性を向上。 NanoLuc® 誕生（4 ページ） 発光強度の飛躍的な増加と小さな分子 量により、新しいアプリケーションの広 がりとともにより生体レベルを反映した 実験が可能に。 pGL4 プラスミドベクターに本来存在するコン センサス配列（転写因子の結合サイト でプロモーターによる発現制御へ変則 的な影響をあたえる）を極力削ぎ取り、 目的のシグナルを明瞭化。 NanoBRET （25 ページ） NanoDual （21 ページ） レポーターアッセイとテクノロジー また mRNA を RT-PCR や DNA アレイで検出する場合にも、塩基配列の違いにより各遺伝子の定量性に差や偏りが出るこ とがあり、誤差の補正は容易ではありません。決定的なデメリットとしてどちらも生きた細胞をそのまま使うことはできず、 ライセートの調製や核酸の精製などの前処理があり手技や経験によって結果に影響を及ぼす可能性もあります。レポー ターアッセイは遺伝子発現実験には欠かせない手法として確立し、生きた細胞内の情報をより正確にレポーティングする 技術へと進化をつづけています。 レポーターアッセイとは原理的に、ある生体内の分子の作用・挙動を観察可能なパラメーター（レポーター活性）に変換 する手法です。同じレポーター遺伝子を使用することで、異なる遺伝子の発現量を同じ方法で、しかも非常に高感度に 比較できます。さらに生細胞でのアッセイもできるため、同一サンプルでの継時的な変化を調べることが可能になります。 また単にレポータータンパク質の発現量を調べるだけでなく、レポーターの改変・融合により様々なバイオセンサーも開 発されています。例えば生細胞内 cAMP 量や ATP 量の変化を検出するセンサーやプロテアーゼ活性のセンサー、さらに 低酸素や細胞周期など特定の状態にある細胞を検出するセンサーも開発されています。さらに新しく開発された NanoLuc® の強力な発光レベルは内在プロモーターによる遺伝子発現の検出やトランスフェクション効率の低い初代培養 細胞でのレポーターアッセイ、さらには細胞内における分子光源（例：BRET）としての可能性も有しています。 このガイドでは、最新の知見とともにレポーターアッセイについてご紹介します。 4 第 1章 レポーターアッセイとテクノロジー もっと明るく レポーターの進化 1 最新鋭レポーター ̶ NanoLuc® ルシフェラーゼ ̶ これまで発光酵素ルシフェラーゼは感度の高さからレポーター酵素で最も汎用されるようになりました。プロメガではさらに生命科学に有 効なツールとして高感度であると同時に分子量も小さい NanoLuc® を開発しました。 NanoLuc（® Nluc）は深海エビ（トゲオキヒオドシエビ［Oplophorus gracilirostris］）由来のルシフェラーゼで、発光レポーターとして最適なパフォー マンスを発揮するために改変された分子量の小さな発光酵素（19 kDa）です。このルシフェラーゼはホタルやウミシイタケのものより約 150 倍明るく、高レベルの発光を長時間維持するための新規な基質 furimazine を用いて測定します。発光反応は ATP 非依存性で、最大の感度 を得るためにバックグラウウンド発光が抑えられるようにデザインされています。 分子量が小さく、強い発光を示す特性の利点は、応用可能なアプリケーションが広がると同時に少ない分子数（実際の生体内発現レベルと 同等）で十分な発光シグナルが得られるため、より生体システムに近い細胞内環境で実験を行えることです。 NanoLuc ® の特性 NanoLuc® ルシフェラーゼの特性 ● 非常に小さい、単量体酵素（171 アミノ酸；513 bp） ● ATP 非依存性 ● 高い熱安定性（Tm = 60℃） ● 広範な pH 幅で活性を保持（pH 6–8） ● 翻訳後修飾、ジスルフィド結合がない ● 細胞内で均一に分布 ● 蛍光スペクトルが生物発光共鳴エネルギー転移 （BRET；λ max = 465 nm）に最適 3 種類ルシフェラーゼ酵素（50 attomoles）からの発光測定 10 10587MA 3 104 105 106 NanoLuc Firefly Renilla Luminescence (RLU) 150倍の比活性 不安定型 NIucP の高い応答性 NF- κ B 応答エレメントを含む各種コンストラクトを HEK293 に導入し rhTNF α で処理した。 10560MA NanoLuc® Luciferase-PEST NanoLuc® Luciferase 0 1 2 3 4 5 6 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 1 × 109 1 × 1010 Time (hours) Luminescence (RLU) Firefly Luciferase-PEST A. Firefly Luciferase Time (hours) 0 1 2 3 4 5 6 1 10 100 1,000 Fold Response B. 10560MA NanoLuc® Luciferase-PEST NanoLuc® Luciferase 0 1 2 3 4 5 6 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 1 × 109 1 × 1010 Time (hours) Luminescence (RLU) Firefly Luciferase-PEST A. Firefly Luciferase Time (hours) 0 1 2 3 4 5 6 1 10 100 1,000 Fold Response B. NanoLuc® およびホタルルシフェラーゼの化合物による阻害 各精製ルシフェラーゼ酵素を LOPAC ライブラリー（1,280 種類の化合物）とインベキュー ションし、Nano-Glo® および Bright-Glo™ で発光を測定した。 0 200 400 600 800 1000 1200 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 Sample # % activity NanoLuc® + Nano-Glo® Z’ = 0.951 Z = 0.917 0 200 400 600 800 1000 1200 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 Sample # % activity Luc2 + Bright-GloTM Z’ = 0.895 Z = 0.804 安定：活性阻害を受けにくく HTS にマッチ ! （36 kDa） Renilla （61 kDa） Fire Fly （19 kDa） NanoLuc® Reporter GUIDE 5 レポーターアッセイとテクノロジー 生物発光イメージングによる NanoLuc® 融合タンパク質の動態モニタリング HEK293 細胞に発現するプロテインキナーゼ C-NanoLuc® 融合タンパク質を PMA 処理後 にフリマジン（Furimazine）発光基質を加えてモニタリングした。イメージングには Olympus LV200 Bioluminescence Imager を使用した。 www.promega.co.jp/nanolucbli1/ NanoLuc ® ルシフェラーゼ 明るいからイメージングにも最適！ 細胞や動物個体での生物発光イメージングは NanoLuc® レ ポーターの明るさとバックグラウンドの低さが有効なアプ リケーションの 1 つで、高感度発光用顕微鏡があれば様々 な生体内イベントを観察することができます。NanoLuc® でラベルされたウイルスの感染や腫瘍増殖などのイメー ジングにも利用されています。NanoLuc® レポーターは発 光強度が高いため、露光時間を数秒にまで短縮できるの で生物発光イメージングに利用する発光タグとして理想的 です。また、分子量が小さいため、融合パートナーの正常 な生体システムや機能性への影響を最低限に抑えること ができます（17 ページ参照）。 新しいアプリケーションへの応用 発光強度の高く、分子量の小さな NanoLuc® ルシフェラー ゼはこれまでのレポーターアプリケーションに、これまで に無い感度を与えます。これまでは困難であった低発現 レベル（例：細胞の内在プロモーター、トランスフェク ション効率の低い初代培養細胞）でも確実にシグナルを 捉えることができます。また、分子量の小ささは従来の ホタルルシフェラーゼの分子量の大きさが問題となる場 合に有効です。例えば、ウイルスへのパッケージングや標 的タンパク質と融合させイメージングやセンサーの作成を 行う場合は分子量が小さいことが大きなメリットとなりま す。NanoLuc® は従来のレポーターアッセイのパフォーマン スを高めるだけでなく、その他の発光アプリケーション （タンパク質安定性の変動追跡、BRET によるタンパク質 相互作用検出、in vivo イメージング）などを高感度に行う ことができます。 ホタルルシフェラーゼと組み合わせた最新デュアル – ルシ フェラーゼアッセイシステムが発売されました（21 ページ 参照）。 内在レベルで観察できるから“ゲノム編集技術”との親和性も抜群です。 NanoLuc® はホタルやウミシイタケルシフェラーゼよりも約 100 倍明るいため 100 倍の感度を備えます。これはホタルやウミシイタケルシフェラーゼと 同等のシグナルを得るのに NanoLuc® ならば 1/100 の分子数で賄えることを意味します。低レベル発現での検出が可能となり、生理的レベルに近い 分子濃度でイベントが検出できる可能性を示唆しています。内在レベルで発現する NanoLuc® ルシフェラーゼ融合体でもハイスループットスクリーニン グに十分な発光が得られます。また、ゲノム編集技術を用いて、特定疾患パスウェイの研究標的となるタンパク質との NanoLuc® 融合体の作製も行わ れ、内在レベルの発現変化を感度良く測定することにも成功しています。さらに特定のタンパク質との NanoLuc® 融合体を発現する改変細胞株も市 販されています（X-MAN ™ NanoLuc™ Reporter Cell Lines, Horizon Discovery）。 RE Nluc Nluc Rec Nluc HT シグナル伝達 / 遺伝子調節 受容体相互作用 タンパク質間相互作用 Nluc HT Prot Y Prot X バイオセンサー A バイオセンサー B DEVD 例：カスパーゼ 3 ウイルスパッケージング BRET BRET BRET Nluc タンパク質動態 タンパク質安定性 NNlluucc Nluc Nluc Nluc HT BRET Prot Prot Prot 6 第 1章 レポーターアッセイとテクノロジー もっと多くの情報を レポーターの進化 2 デュアル レポーター &マルチアッセイ 1 つのプレートの各ウェル内で複数マーカーを同時に測定するマルチアッセイは、データの精度を向上させることができると同時に時間や 費用を節約することができます。現在、正確な生物学的情報を取得するために、レポーター活性に加えて生存性、アポトーシス、細胞毒性（ネ クローシス）などのパラメータについての測定が行われています。これらのパラメータのいくつかを統合あるいは多重化してアッセイするこ とにより、1 回の実験からより多くの情報を得ることができます。2 つの異なるレポーター酵素を測定するデュアル – ルシフェラーゼアッセ イシステムはプロメガで開発され、分子生物学から細胞生物学における幅広い分野で利用されています。プロメガでは、これまでに蓄積さ れた細胞ベースのアッセイ技術から同時多項目解析を可能にするマルチアッセイ技術の開発を行い、培養細胞を用いた優れたアッセイ系を 提案しています。 レポーターアッセイを実施するに当たり、一般的にレポーター活性を異なるコンストラクトのベクターや処理条件で比較します。この場合、細胞数や トランスフェクション効率などの変動によってレポーターの発現量も変動する可能性があるため、レポーターデータを標準化する必要があります。 レポーターデータの標準化には、総タンパク質含量、総 ATP 含量や細胞数に対する補正やコントロールレポーターベクターに対する補正など様々な 方法が用いられています。このうち、コントロールレポーターベクターによる補正はトランスフェクション効率とともに細胞数の補正も行えるため、 一過性のトランスフェクションでアッセイする場合に最も有用な方法です。 デュアルレポーターアッセイの有用性 デュアルアッセイによる内部補正の概要 コントロールレポーターベクターは恒常的な活性を持つプロモーターにより第 2 のレポータータンパク質を発現します。これまでは実験レポーターと してホタルルシフェラーゼを使うことが多かったため、多くの場合コントロールレポーターにウミシイタケルシフェラーゼが使用されてきました。ウミ シイタケルシフェラーゼとホタルルシフェラーゼは基質が異なるため、同一サンプルで連続してアッセイすることができます（22 ページ参照）。また、 発現量が低いプロモーター、あるいはトランスフェクション効率が低い細胞でもデュアルアッセイが可能な最新型のルシフェラーゼ NanoLuc® とホタ ルルシフェラーゼを組み合わせた Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System が発売されさらにアッセイの幅が広がっています（21 ページ参照）。 Nluc mRNA NanoLuc® Nluc Fluc mRNA + NanoLuc® Nluc RE Firefly Fluc tk Firefly Fluc tk NanoLuc® Nluc RE A 1. 標的とするプロモーター応答配列 (RE) を決定 2. ルシフェラーゼ遺伝子上流に 応答配列をクローニング RE Gene of Interest tk 6597MA 3. 細胞にコンストラクトを 　トランスフェクション 恒常発現 プロモーター 3. 細胞にコントロールベクターを 　トランスフェクション 4. 1st 測定試薬を添加し、 　実験ルシフェラーゼ活性を 　測定 5. 2nd 測定試薬を添加し、 　コントロールルシフェラーゼ活性を 　測定 　注意：ウェルAの低い発光は 　細胞毒性による可能性有り 1st ルシフェラーゼの発光値は 応答配列に制御された実験値 2nd ルシフェラーゼの発光値は 応答配列とは独立したコントロール値 Reporter GUIDE 7 6398MB 0 40 80 120 Single Reporter Dual Reporter Optimal Transfection Suboptimal Transfection Percent Optimal Transfection 6399MB 0 5 10 15 Single Reporter Dual Reporter Interwell Coefficient of Variation (%CV) レポーターアッセイとテクノロジー NanoLuc® Dual の優れたクエンチング効果 Firey Luciferase Activity：ONE-Glo™ EX Luciferase Assay Reagent（ホタルの基質を含む）の添加 によるホタルルシフェラーゼの発光。 Quenched Luminescence：Stop Reagent（消光効果を示すために NanoDLR ™ Stop & Glo® Reagent から NanoLuc® 基質を除いたもの）によりホタルの発光はほとんど消失する。 Background：バックグラウンドサンプルの発光。 デュアルアッセイにより バラツキの低減（低い CV%） トランスフェクション効率に起因する バラツキの低減 アッセイケミストリの違いによりレポーターアッセイに加え、その他の細胞ベースアッセイを同じ細胞サンプルで実施することにより、細胞応答に関 する情報を多く入手することができます。 例えば、薬剤による細胞内パスウェイへの影響を調べる場合に薬剤自体に細胞毒性があるとレポーターアッセイデータの解釈を困難にします。これ を回避するために細胞生存試験を並行して行う場合がありますが、そのために実験材料がその分多く必要となってしまいます。レポーターアッセイと 細胞生存性試験のマルチアッセイならば 1 度の実験で 2 つのパラメーターを測定できるため、実験の精度を高めると同時にコストの増加を押えます。 また、レポーターアッセイとアポトーシスの指標であるカスーパーゼ 3/7 や P450 活性なども同じサンプルセットより測定することもできます。レポー ターアッセイとのマルチアッセイに対応したシステムについては 31 ページをご覧ください。 マルチアッセイの有用性 7543MA Log10 [Ionomycin] M -7 -6 -5 -4 0 500 1000 1,500 CellTiter-Fluor™ Assay ONE-Glo™ Assay 0 5 × 105 10 × 105 15 × 105 Viability Fluorescence (RFU) Reporter Activity Luminescence (RLU) 細胞生存性試験とシングル – ルシフェラーゼアッセイのマルチアッセイ GloResponse™ NFAT-RE-luc2P HEK293（10,000 cells/well, 100 µl/well）を、 DMEM/10%FBS（ハイグロマイシン B と、NFAT 転写因子を活性化する PMA を含む）培地で希釈したイオノマイシンで処理をした。37℃で 6 時間処理後、CellTiter-Fluor™ および ONE-Glo™ を用いてアッセイを 行った。イオノマイシン高濃度領域の NFAT 転写活性低下が細胞毒性に よるものであることが分かった。 1st アッセイ 2nd アッセイ 追加される情報 RealTime-Glo™ 発光 R ホタル E 細胞生存性（還元能） CellTox™ Green 蛍光 R ホタル、 ウミシイタケ、 NanoLuc® E 細胞毒性（漏出 DNA） CellTiter-Fluor™ 蛍光 E ホタル、 ウミシイタケ E 細胞生存性（プロテアーゼ） EnduRen™ / ViviRen™ 発光 R ホタル E ウミシイタケルシフェラーゼ （リアルタイム） MultiTox-Fluor™ 蛍光 E ホタル、 ウミシイタケ E 細胞生存性 & 細胞毒性 （プロテアーゼ） Apo-ONE® Caspase 3/7 蛍光 E ウミシイタケ ［EnduRen™］R アポトーシス活性 P450-Glo™ CYP induction 発光 E ホタル E P450 活性 E ＝ エンドポイント　　 R ＝ リアルタイム Firefly Luciferase Activity Quenched Luminescence Background 1 × 101 1 × 102 1 × 103 1 × 104 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 1 × 109 Luminescence (RLU) 12437MA 410,000,000 121 61 (7,000,000-fold quench) Reporter 1 p2A Reporter 2 Fluc Nluc True Hit Nluc Stabilization Fluc Stabilization Fluc Nluc Fluc Nluc Fluc Nluc 12519MA タンデムレポーターを用いた スクリーニングにおける偽陽性の 簡便な検出 タンデムレポーターベクターは、同じ mRNA 転写産物よりホタルルシフェ ラーゼと易分解性の NanoLuc® ルシ フェラーゼを発現する。2 つのレポー ターはリボソームスキップ機構を引き 起こす短い P2A 配列により 2 つの未 融合の可溶性ルシフェラーゼに分断 されるため、より正確な化合物プロ ファイルの作成が可能となる。 8 もっとリアルタイムに レポーターの進化 3 リアルタイムアッセイ 多くの細胞ベースのアッセイシステムは化合物添加後一定時間をおいたエンドポイントを測定する方式が汎用されていましたが、薬剤の濃 度に加え時間のパラメーターを付加することにより細胞内イベントへの理解は飛躍的に高まります。一般的なルシフェラーゼアッセイはシグ ナルを得るために細胞を破壊して基質を加えていましたが、細胞のタンパク質分泌機構を利用してレポーター酵素を細胞外に放出させる手 法やレポーター基質の細胞透過性を高める方法により継時的なアッセイが可能となりました。 第 1章 レポーターアッセイとテクノロジー 細胞ベースのアッセイでは細胞への影響を最小限に 抑えるように実験が行われていますが、ほとんどのレ ポーターアッセイでは正確で信頼性のある測定を行う ためにエンドポイントで細胞を完全に破砕する方法が 用いられてきました。ウミシイタケルシフェラーゼの 場合、基質である酸素およびセレンテラジンは毒性 が無く、細胞膜を容易に透過できるため生きた細胞 のままアッセイすることができます。しかし、これまで のセレンテラジンは水溶液中での安定性が低く、通常 の細胞培養条件下での使用は困難で不便な点があり ました。EnduRen™ および ViviRen™ Live CellSubstrate （25 ページ参照）はこれらの難問を解決するためにデ ザインされており、レポーター活性のリアルタイムモ ニタリングに最適です。 生きた細胞を用いた 24 時間以上のリアルタイム測定 cAMP response element（CRE）に制御された Rapid Response™ ウミシイタケルシフェラーゼ遺 伝子をトランジェントに HEK293 細胞へトランスフェクションし、EnduRen™ Live Cell Substrate で処理した。16 時間後、細胞を 6 µM イソプロテレノール（Calbiochem）で処理し、定期的に 発光を測定した。さらに約 20 時間後、10 µM フォルスコリン（Sigma）を加え、定期的な測定 を繰返した。細胞は測定しない時間はインキュベータに戻した。データは並行培養した未処 理の細胞に対する誘導倍率で示した。各データポイントは n = 6 で標準偏差も示した。 細胞透過性発光基質（ウミシイタケルシフェラーゼ） Luciferase mRNA + Rluc or N ul c Rluc or N ul c RE Time 1 Time 2 Time 3 Time 4 Luciferase Rluc or N ul c RE Luciferase Luciferase RE Gene of Interest 分泌 異なるタイムポイントで測定 1. 標的とするプロモーター応答配列（RE）を決定 2-A. IL6分泌シグナル付き 　　 NanoLuc® 遺伝子上流に 　応答配列をクローニング 2-B. Rluc ルシフェラーゼ遺伝子上流に 　応答配列をクローニング 3. 細胞にコンストラクトを 　トランスフェクション 4-A. 上澄を経時的に分取し、 　　 NanoLuc® 定量試薬で定量 4-B. EnduRenTM または ViviRenTM 試薬を 　　 細胞に添加し、経時的に定量 N N N O O O O O N H N N O O 透過 Reporter GUIDE 9 レポーターアッセイとテクノロジー GloSensor™ technology 生細胞リアルタイムセンサー レポーター発現量ではなく、レポーター活性そのものを変化させることが できれば、もっと迅速な反応を検出することができます。GloSensor™ は まさにこのような活性変化タイプのセンサーであり、簡便なプロトコールで 生細胞内のリアルタイムなターゲット分子検出が可能です。 cAMP と cGMP のセンサーが開発済みであり、プロテアーゼ活性のセンサー も開発中です。 GloSensor™ については 29 ページをご覧ください。 7708MA 1 × 105 1 × 104 1 × 103 Luminescence (RLU) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 MOD FSK ISO NA ISO PRO FSK Time (minutes) ：複数の薬剤で刺激 ：フォルスコリン ：イソプロテレノール ：未処理 アロステリック cAMP バイオセンサー 生細胞（37℃）におけるシグナルのカイネティクスとセンサーの可逆性。cAMP バイオ センサーを一過性に発現する HEK293 細胞を 10 µM イソプロテレノール（ISO）、10 µM プロプラノール（PRO）または 10 µM フォルスコリン（FSK）で連続的に処理した（n = 3）。Fan, F. et al.（2008）ACS Chem. Biol. 3, 346-51. より許可を得て転載した。 7707TA A. B. N C Open Open Closed N C Covalent N 234–544 4–233 C Noncovalent N FRB 4–547 FKBP C Allosteric N 359–544 RIIβB 4–355 C N C Closed N C N C C N N C N C Open Closed 分泌型のアッセイは同一サンプルプレートにおける経時的なアッセイやマルチアッセイなど利便性に優れますが、これまで自己発光によるバックグラ ウンドが大きな課題でした。NanoLuc® は他社の分泌型ルシフェラーゼに比べ自己発光が飛躍的に抑えられているため、高い S/N 比が得られます。 NanoLuc® 分泌型ルシフェラーゼ（secNluc）はレポーター遺伝子に IL-6 分泌シグナル配列が付加されており、培地中に分泌された NanoLuc® は細胞を 破壊することなく測定することができます。この分泌型 NanoLuc® を利用することにより、経時的なレポーターアッセイ、他の細胞マーカーとのマル チアッセイ、血中に分泌された NanoLuc® を利用した in vivo プロモーター活性測定などへの応用が可能です。NanoLuc® の定量試薬については 23 ペー ジ、分泌用ベクターについては 27, 28 ページをご覧ください。 分泌型ルシフェラーゼ（NanoLuc ® ） 他社分泌型ルシフェラーゼアッセイとの S/N 比の比較 100 101 102 103 104 105 106 107 108 Luminescence (RLU) A) autoluminescence background S) secreted luciferase 0.01 0.1 1 10 100 1000 Normalized S/N Ratio (%) Secreted luciferase 他社A (Flash) 他社Bb (Flash) 他社Bf+ 0%安定剤 (Flash) Nluc + NanoGlo (Glow) 他社Ad (Glow) Flash Type Glo Type Flash Type Glo Type 他社Bf + 10%安定剤 (Glow) 他社Bf + 16%安定剤 (Glow) 他社Bf + 20%安定剤 (Glow) A S A S A S A S A S A S A S A S 分泌型 NanoLuc® ルシフェラーゼによる経時的な測定 NanoLuc® ルシフェラーゼ（secNluc）の CRE 応答性発現を 6 時間フォルス コリン誘導あるいは DMSO コントロールの細胞で測定した。培地交換を t = 0 で行った。分泌アッセイフォーマットによりレポーターの活性化キネ ティクスを細胞溶解することなく測定できた。シグナルは GloMax® 96 Microplate Luminometer を用いて測定した。 10561MA –8 –7 –6 –5 –4 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 1 × 109 Log[Forskolin], M Luminescence (RLU) B. Time (hours) Luminescence (RLU) 0 1 2 3 4 5 6 1 × 104 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 DMSO Forskolin A. 10 生体内システムをしらべるための発光生物システム レポーター実験は、細胞内現象の変化を検出可能なシグナ ル（ルシフェラーゼ発光など）に変換し、検知するための 実験方法です。通常、細胞内イベントの変化に応答してレ ポーターの転写活性を調節する配列（例：プロモーター / エンハンサー、その他の転写因子結合配列など）をレポー ター遺伝子に接続したベクターを細胞内に導入します。薬 剤投与などの刺激により細胞内イベントが変化すると、そ れに応じてレポーター遺伝子が転写 / 翻訳されます。細胞 内に蓄積されたレポータータンパク質は容易に定量するこ とができます（右図参照）。ルシフェラーゼはバックグラウン ドが低く高感度な測定ができ、操作がシンプルであるため レポーターとして理想的です。また、翻訳後修飾をともな わずに活性を持つため、より直接的に転写活性をシグナル に変換することができます。 第 2 章 レポーターアッセイでできること External Stimuli Protein-Protein Interactions Vital Infection and Propagation Light Protein Folding Translation mRNA Processing Transcription luc Regulatory Sequences Transcription Factors Signal Transduction Receptor Ribozyme siRNA/Antisense RNA シグナルパスウェイ解析 GPCR パスウェイ ルシフェラーゼレポーターは、シグナル伝達経路の研究や GPCR などの受容体活性を制御する物質の探索に有効です。例えば、細胞内の cAMP レベ ルを調節している受容体の挙動は、一般に cAMP 応答配列（CRE）によってルシフェラーゼの転写と連動します。これらの応答配列を含むルシフェラー ゼレポーターを用いて、各種 GPCR パスウェイの解析が可能です。ホタルルシフェラーゼの内部に cAMP 結合タンパク質の一部を挿入し、cAMP レベ ルをモニタリングできる GloSensor™（cAMP センサー）については 9, 29 ページをご覧ください。 ルシフェラーゼレポーターを利用した GPCR シグナル伝達経路の解析 アゴニスト及びアンタゴニストの解析 pGL4-NFAT-luc2P と pF9A-M3R-hRluc-Neo を安定発現する HEK293 細胞に対し、各種因子を添加し 6 時間培養後、DualGlo™ Assay System（カタログ番号 E2920）で発光測定を行った。 ルシフェラーゼレポーターの利用 AC PLC Gαs Gαi Gαq Gα12/13 Gβγ 5257MA Plasma Membrane Nucleus CRE RE Luciferase SRE AP-1 NFAT-RE SRF-RE cAMP Ras DAG PIP2 RhoGEF RhoA SRF Actin dynamics IP3 PKC Ca2+ Calcineurin fos/jun Raf MEK-1 MAPK ELK-P PKA CREB-P ATP NFAT NFAT-P Modulator Modulator Modulator Modulator Rsk-2 Glo pF9A-M3R 38 Agonist Profile -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 10 20 30 carbachol Mcn-A-343 muscarine chloride pilocarpine HILLSLOPE EC50 carbachol 1.5 3.44e-008 Mcn-A-343 1.5 1.09e-006 MuCl2 1.5 7.99e-009 pilocarpine 1.6 1.61e-007 log [agonist], M Fold Induction 5922MA M3R-38 Antagonis t Profile (30nM Muscarine Chloride agonist) -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 50 100 atropine pirenzipine scopolamine telenzipine HILLSLOPE EC50 atropine -1.7 6.01e-009 pirenzipine -0.93 3.05e-007 scopolamine -2.2 1.13e-009 telenzipine -1.4 8.68e-009 log [antagonist], M % of control pF9A-M3R 38 Agonist Profile -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 10 20 30 carbachol Mcn-A-343 muscarine chloride pilocarpine HILLSLOPE EC50 carbachol 1.5 3.44e-008 Mcn-A-343 1.5 1.09e-006 MuCl2 1.5 7.99e-009 pilocarpine 1.6 1.61e-007 log [agonist], M Fold Induction 5922MA M3R-38 Antagonis t Profile (30nM Muscarine Chloride agonist) -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 0 50 100 atropine pirenzipine scopolamine telenzipine HILLSLOPE EC50 atropine -1.7 6.01e-009 pirenzipine -0.93 3.05e-007 scopolamine -2.2 1.13e-009 telenzipine -1.4 8.68e-009 log [antagonist], M % of control Reporter GUIDE 11 レポーターアッセイでできること ストレスシグナルパスウェイ 細胞は化学物質による毒性のほか、紫外線、放 射線、温度、物理的刺激など様々なストレスに 絶えずさらされています。これらのストレスには 細胞内のストレス応答機構が反応することが分 かっています。レポーターアッセイは、このよう なストレス応答機構を含め、細胞の広範なシグ ナル経路の解析ができます。プロメガでは種々 の細胞ストレスに対する応答エレメントを搭載し た、レポーターベクターシリーズを開発しました。 これらのベクターを用いたレポーターアッセイに より、細胞ストレスのシグナル伝達経路の特定、 各種細胞のストレス耐性の検討、ストレス化合 物の毒性評価などの解析が可能です。 各種シグナルパスウェイ プロメガでは様々な転写因子、シグナルパスウェイに対応する応答配列を含むルシフェラーゼ応答ベクターをご用意しています。がん研究、免疫学、 発生生物学、薬物代謝等様々な研究分野における主要なシグナルパスウェイの解析に応用できます。各種パスウェイ解析用ベクターについては 26, 27 ページをご覧ください。 12052M Thaw-and-Use A cells Traditional Method: Fresh from culture cells (~1-2 weeks) ‘Cells as reagents’: Frozen, thaw-and-use cells (3-24hr) Standard cells Cell culture Cell count, harvest, resuspend in assay buffer and plate for assay Assay and read plates Resuspend in assay buffer and plate for assay Assay and read plates ‘Cells as reagents’: Frozen, thaw-and-use cells (within 24 hours) 転写因子 応答エレメント シグナル経路 GPCR シグナル伝達経路 CREB CRE cAMP / PKA NFAT NFAT RE カルシウム / カルシニウリン ELK / SRF SRE MAP / ERK SRF SRF RE RhoA AP1 AP1 RE MAPK / JNK ストレスシグナル伝達経路 Nrf2 ARE 酸化ストレス p53 p53 RE DNA 損傷 ATF6 ATF6 RE 小胞体ストレス ATF4 ATF4 RE 小胞体ストレス MTF1 MRE 重金属ストレス HSF1 HSE 熱ショック Hif1 α HRE 低酸素 AhR XRE 生体異物ストレス AP1 AP1 RE MAPK / JNK 薬物代謝 3A4 シトクロム P450 / 薬物代謝 2B6 シトクロム P450 / 薬物代謝 各種シグナル伝達経路 NF- κ B NF- κ B RE NF- κ B STAT1：STAT2 ISRE INF- α STAT3：STAT3 SIE IL-6 SMAD3：SMAD4 SBE TGF- β LEF / TCF LEF-TCF RE Wnt STAT5：STAT5 STAT5 RE IL-3 GLI Gli RE ヘッジホッグ STAT1：STAT1 GAS RE JAK / STAT1 IFN- γ C / EBP RE 複数経路 TCF-LEF TCF-LEF RE Wnt STAT4 STAT4-RE JAK / STAT4 IL12 Myc：Max Myc Myc RBP-Jk RBP-JK-RE Notch NF- κ B hIL8 IL1 STAT1：STAT2 hIL8 T 細胞活性化 , IL1 STAT3：STAT3 hEGR1 NGF hID1 TGF- β / BMP PSA-long アンドロゲン活性化（前立腺がん） GCSF STAT3 4 3 2 1 0 -7 -6 -5 -4 log [CdCl2] (M) Fold Response 8 6 4 2 -8 -7 -6 -5 Fold Response log [tunicamycin](M) 0 5 4 3 2 0 -6 -5 -4 -3 Fold Response log [ZnSO4] (M) 1 25 20 15 10 5 -10 -9 -8 -7 Fold Response log [TCDD] (M) 0 p53 RE HRE AP1 RE ARE ERSE XRE HSE MRE Control NF-κB RE Cell-Titer Fluor HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs 4 3 2 1 0 -7 -6 -5 -4 log [CdCl2] (M) Fold Response 8 6 4 2 -8 -7 -6 -5 Fold Response log [tunicamycin](M) 0 5 4 3 2 0 -6 -5 -4 -3 Fold Response log [ZnSO4] (M) 1 25 20 15 10 5 -10 -9 -8 -7 Fold Response log [TCDD] (M) 0 p53 RE HRE AP1 RE ARE ERSE XRE HSE MRE Control NF-κB RE Cell-Titer Fluor HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs 4 3 2 1 0 -7 -6 -5 -4 log [CdCl2] (M) Fold Response 8 6 4 2 -8 -7 -6 -5 Fold Response log [tunicamycin](M) 0 5 4 3 2 0 -6 -5 -4 -3 Fold Response log [ZnSO4] (M) 1 25 20 15 10 5 -10 -9 -8 -7 Fold Response log [TCDD] (M) 0 p53 RE HRE AP1 RE ARE ERSE XRE HSE MRE Control NF-κB RE Cell-Titer Fluor HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs 4 3 2 1 0 -7 -6 -5 -4 log [CdCl2] (M) Fold Response 8 6 4 2 -8 -7 -6 -5 Fold Response log [tunicamycin](M) 0 5 4 3 2 0 -6 -5 -4 -3 Fold Response log [ZnSO4] (M) 1 25 20 15 10 5 -10 -9 -8 -7 Fold Response log [TCDD] (M) 0 p53 RE HRE AP1 RE ARE ERSE XRE HSE MRE Control NF-κB RE Cell-Titer Fluor HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs HepG2 cells stimulated 6 hrs HepG2 cells stimulated 18 hrs p53 RE HRE AP1 RE ARE ATF6RE XRE HSE MRE Control NF-κB RE Cell-Titer Fluor 4 3 2 1 0 -7 -6 -5 -4 log [CdCl2] (M) Fold Response HepG2 cells stimulated 6 hrs 8 6 4 2 -8 -7 -6 -5 Fold Response log [tunicamycin](M) 0 HepG2 cells stimulated 18 hrs 5 4 3 2 0 -6 -5 -4 -3 Fold Response log [ZnSO4] (M) 1 HepG2 cells stimulated 6 hrs 25 20 15 10 5 -10 -9 -8 -7 Fold Response log [TCDD] (M) 0 HepG2 cells stimulated 18 hrs 同一プレートでのストレス応答パネルに対する化合物プロファイリング HepG2 細胞に各ストレス応答配列を含む DNA をトランスフェクションした後、96 ウェルプレートに移し O/N でインキュベーションした。各化合物で処理し、CellTiter-Fluor™ で細胞生存性を蛍光で測定した後に ONEGlo™ でルシフェラーゼレポーターを測定した。 Cell as Reagent　細胞は検出試薬だ！ タンパク質や抗体など、バイオ医薬品の生物活性をモニター する方法はおおまかにセルフリーアッセイと細胞アッセイに分 けられます。わずかなタンパク質構造 / 修飾の違いがもたらす Potency の違いを見分ける能力は細胞アッセイが圧倒的に優れ ています。その反面、細胞は培養の手間や品質がバラつくと いう欠点があります。 細胞を凍結ストックとして保存し用時に溶かしてそのまま使う Thaw and Use format は、細胞培養に起因するこの欠点をなく し、細胞の高性能と試薬の使いやすさをあわせた新しい使い 方です。 プロメガでは ADCC Reporter Bioassay でこの方式を採用してい ます。ぜひ Thaw and Use format を体験してください！（29 ペー ジ参照） 12 タンパク質間相互作用（PPI 解析） タンパク質 ̶ タンパク質相互作用を調べる方法には、多くの手法があります。その中でも生細胞でのネイティブな状態での相互作用を検出する方法 としてツーハイブリッド法および BRET 法があります。プロメガではこれらの手法をルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイで、より簡便に、正確 に、感度よくタンパク質間相互作用を測定するツールをご用意しております。 第 2 章 レポーターアッセイでできること ツーハイブリッドシステム（哺乳動物細胞） ツーハイブリッド法は、酵母を使用する系として開発された方法です。酵母細胞は取扱いが容易な反面、高等生物のモデルとして使うには限界があ ります。そこで、哺乳類細胞を用いたツーハイブリッド法（mammalian two hybrid；M2H）が開発されてきました。この方法は、基本原理は酵母ツーハ イブリッド法と同様で、転写因子が DNA 結合ドメインと転写活性ドメインに分離できるモジュール構造を利用するものです。哺乳類の培養細胞を用 いる実験系であるため次のような利点があります。 ● 目的に合った細胞株を利用することができます。 ● 酵母細胞の実験系では細胞に発現ベクターを導入してから結果の判定を行うのに 3 ̶ 4 日かかるのに対し、哺乳動物培養細胞を用いた場合トラン スフェクション後 1 ̶ 2 日で結果を得ることができます。 低分子 GTP 結合タンパク質 RAS と RAF の相互作用解析例 NIH3T3 細胞に pBIND-RAS Vector および pACT-Raf を導入し、24、 48、72 時間後、Dual-Luciferase® Reporter Assay System で発光 値を測定した。 2050MB GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 GAL4 X Y VP16 Firefly Luciferase Firefly Luciferase Firefly Luciferase pGL4.31 (luc2P/GAL4UAS/Hygro) Vector TATA TATA TATA VP16 GAL4 Luciferase Expression + + +++++ 0% 20% 40% 60% 80% 100% 24 hours 48 hours 72 hours Relative Expression Ratio Post Transfection pBIND/pACT-Raf pBIND-Ras/pACT pBIND-Ras/pACT-Raf プロメガの CheckMate™ / Flexi® Vector Mammalian Two-Hybrid System は、2 つのタンパク質あるいはドメイン同士の相互作用をレポーターアッセイで 評価するためのシステムで、細胞ベースのアッセイを行うためのステイブルな細胞株構築にも使用できます。まず目的の哺乳動物タンパク質をコード する遺伝子をクローニングし、細胞に導入するとネイティブな細胞内環境でタンパク質の発現および翻訳後修飾が起こります。酵母のツーハイブリッ ドシステム同様に目的タンパク質の 1 つ（“Bait”）を DNA 結合ドメインと融合させ、もう片方のタンパク質（“Prey”）を転写活性ドメインと融合させる ように設計します。ツーハイブリッド用のベクターについては 29 ページをご覧ください。 アプリケーション：KeratinoSens KeratinoSens™（Givaudan 社が開発）は皮膚感作性を 調べるための in-vitro 試験法として化粧品・医薬部外品 の安全 性評価に活用されています。この手法の原理 は ARE 応答配列を利用したレポーターアッセイです。 従来はマウス等の動物を用いて皮膚感作性試験が行 われていましたが、近年、動物実験代替法としてこの ような in vitro の試験手法が一般化されつつあります。 Nrf2 Nrf2 Nrf2 皮膚感作 物質 ARE Keap1 ルシフェラーゼ 哺乳動物細胞におけるツーハイブリッドシステムの概要 Reporter GUIDE 13 レポーターアッセイでできること BRET（生物発光共鳴エネルギー移動） 生 物 発 光 共 鳴 エ ネ ル ギ ー 移 動（Bioluminescence resonance energy transfer）は、生細胞におけるタンパク間の直接的な相互作用を検出す る手法として幅 広く用いられています。類似の原 理である FRET （Fluorescence resonance energy transfer）を用いた手法に比べ、励起光 を当てる必要がないので、バックラウンドがきわめて低く、励起光によ る細胞へのダメージを最小限に抑えることができます。発光源にプロ メガが新しく開発したルシフェラーゼ NanoLuc® を用いた NanoBRET ™ system は従来のウミシイタケルシフェラーゼを用いた BRET に比べ、よ り高い発光値と安定性、強固性を持ち、生細胞でのリアルタイム解析、 及びハイスループットスクリーニングに最適です。 NanoBRET ™ の特徴 ドナー NanoLuc® アクセプター HaloTag® 618 ligand 基質 Furimazine ドナーエミッションピーク（nm） 460 アクセプターエミッションピーク（nm） 618 ストークシフト（nm） 158 HT Ac K NanoLuc fusuion NanoLuc Substrate NanoLuc BRET Histone H3 or H4 BRD4 BRET Ligand NanoLuc BRD4 H3 or H4 HT HaloTag fusion 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Frb-NLuc Frb-RLuc8 Rapamycin (nM) Signal-to-Background Ratio 12323MA 0.0001 0.01 1 100 10,000 NLuc HT NLuc FKBP FKBP HT FRB FRB 610nm BRET Rapamycin A. B. HT ligand BRET アッセイにおける NanoLuc® および ウミシイタケルシフェラーゼのパフォーマンス比較 パネル A：実験スキーム。FKBP12- ラパマイシン複合体はラパマイシン存 在下、mTOR の FRB（FKBP12-Rapamycin Binding）ドメインに直接結合した。 FKBP は HaloTag® と融合しており、HaloTag® を蛍光 NanoBRET ™ リガンド で標識した（共有結合）。FRB には NanoLuc® または Renilla ルシフェラーゼ を融合させた。 パネル B：ラパマイシン濃度を増加させながら FKBP と FRB の相互作用を BRET により検出した。 A. B. 12398MA milliBRET Ratio JQ1 [nM] CBP with Histone H3.3 9 8 7 6 0.01 1 100 10,000 1,000,000 10 IC50 = NA milliBRET Ratio JQ1 [nM] BRD4 with Histone H3.3 14 12 10 8 6 0.01 1 100 10,000 1,000,000 16 IC50 = 52nM A. B. 12398MA milliBRET Ratio JQ1 [nM] CBP with Histone H3.3 9 8 7 6 0.01 1 100 10,000 1,000,000 10 IC50 = NA milliBRET Ratio JQ1 [nM] BRD4 with Histone H3.3 14 12 10 8 6 0.01 1 100 10,000 1,000,000 16 IC50 = 52nM ヒストン -ブロモドメインの阻害実験例 ブロモドメインのアセチルリジン認識モチーフに拮抗的に結合する細胞膜 透過性低分子化合物（JQ1）による、ヒストン -ブロモドメインの阻害効果 を NanoBRET ™ により定量化した。 Pre-Designed NanoBRET ™ PPI Assays プロメガでは主要なタンパク間相互作用の組み合わせとして、ヒストン -ブロモド メイン、HDAC1-2、p53、Myc、EGFR 等の最適化済みベクターセットおよび試薬 のカスタム製品 Pre-Designed NanoBRET ™ PPI Assays をご用意しています。 詳細については 25 ページをご覧ください。 14 5456MAj Gal4UAS luc GAL4 DBD NR-LBD Glo Glo RE luc NR 核内受容体の リガンド結合ドメイン Gal4の DNA結合ドメイン 内在性あるいは 外来性の核内受容体 ・pBIND-ERα Vector ・pBIND-GR Vector ・pFN26A (BIND) hRluc-neo Flexi® Vector ・pGL4.35[luc2P/9XGAL4UAS/Hygro] Vector ・GloResponse™ 9XGAL4UAS-luc2P HEK293 Cell Line ・pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro] Vector リガンド A. B. プロモーター解析 ルシフェラーゼアッセイを用いたプロモーター解析は転写 制御の一般的な手法として、広範な分野で用いられていま す。ルシフェラーゼ遺伝子の上流に目的のプロモーターを 挿入することにより、そのプロモーターの活性を解析する ことができます。目的プロモーターの欠損体および変異体 を解析することにより、そのプロモーターで重要な働きを する領域および塩基を特定することができます。 第 2 章 レポーターアッセイでできること Upstream Region Luciferase critical region 0 50% Percent Maximum Luc/Ren 100% プロモーター欠損体を用いたルシフェラーゼアッセイ 核内受容体解析 核内受容体はステロイドやその他の分子が細胞内に存在す ることを感知するリガンド調節性転写因子の一種です。核 内受容体は通常細胞質中に局在し、レギュレータと会合し た複合体を形成するものもあります。受容体はリガンドと の結合が引き金となり核内に移行し、DNA 結合ドメインを 介してゲノム DNA の標的部位に結合します。DNA との結合 は、隣接する遺伝子を正の調節へと導き、リガンドの存在 に対する細胞内応答を誘導します。哺乳動物細胞における 核内受容体の細胞内活性研究に使用される方法の 1 つとし てルシフェラーゼレポーターアッセイを利用したワン – ハイ ブリッドシステムがあります。このシステムでは核内受容体 リガンド結合ドメイン（LBD）を酵母の GAL4 転写因子の DNA 結合ドメインに融合させます。ハイブリッド融合タンパ ク質である核内受容体はその後、GAL4 UAS（GAL4 Upstream Activator Sequence；1）の 9 回繰り返し配列により制御され る luc2P ルシフェラーゼレポーターの転写を活性化します。 核内受容体解析用ベクターについては 26, 29 ページをご覧 ください。 核内受容体によるシグナル解析のための 2 つのアプローチ 8055MA –12 –11 –10 –9 –8 –7 0 100,000 200,000 300,000 400,000 500,000 600,000 700,000 log [E2], M Luminescence (RLU) EC50 = 0.89 nM Fold Induction = 872 ワン – ハイブリッドシステムを利用したエストロゲンの定量解析 9XGAL4UAS-luc2P を安定発現する HEK293 細 胞 GloResponse™ 9XGAL4UAS-luc2P HEK293 cells に pBIND-ER-alpha Vector を導入し、各濃度の E2 エストラジオールを添 加した。添加 24 時間後にルシフェラーゼ活性を Dual-Glo™ Luciferase Assay System で定量した。 Reporter GUIDE 15 レポーターアッセイでできること タンパク質安定性解析 タンパク質のターンオーバーのスピードは、発がんやストレス応答に関 わる多くのシグナルタンパク質を制御しています。下流の転写イベント が活性化した結果として細胞の状態が変化し、これに応答してタンパ ク質の安定化とそれに続く蓄積が起こります。目的タンパク質とルシ フェラーゼの融合タンパク質を用いることにより、タンパク質の安定 性および蓄積を発光値として定量化できます。 レポーターアッセイはストレス応答メカニズムを解析する強力なツール として利用されてきました。転写応答はシグナルの終点で起こるため、 低分子モジュレーターに対する細胞の総体的な応答を測定する上で非 常に簡便であり、これまで薬剤のスクリーニング等に汎用されてきま した。一方で薬剤は転写活性化のはるか上流のシグナルイベントで作 用することが多く、分子標的を見つける上ではレポーターアッセイでは 困難な場合があります。NanoLuc® と調節タンパク質の融合体の細胞内 レベルをモニタリングすることでシグナル上流での変化を迅速にとら えることができ、従来のレポーターアッセイを補完する情報を得ること ができます。 NanoLuc® Stability Sensor（カタログ番号 N1381, N1391：28 ページ）は ready-to-use のベクターシステムであり、NanoLuc® luciferase reporter の 特長を活かし、キーとなる 2 つのシグナルタンパク質 HIF1A と NRF2 の安定性の検討を可能にしました。 NRF2 Vector System：NRF2 は酸化ストレスに対する細胞の応答を仲介 するシグナルタンパク質です。NRF2 Vector System では細胞内 NRF2 タンパク質レベルを簡便に定量し、その動態を検討することが可能で す。NanoLuc® を C 末端に融合した NRF2 タンパク質を CMV プロモー ターの下流にコードしたベクター、細胞内 NRF2 レベルを適切に制御す るための pKEAP1 発現ベクター、細胞内での融合タンパク質の発現量 を調節するための Transfection Carrier DNA を含むシステムです。 HIF1A Vector System：HIF1A は低酸素に対する細胞の応答を仲介する シグナルタンパク質です。HIF1A Vector System では細胞内 HIF1A タン パク質レベルを簡便に定量し、その動態を検討することが可能です。 NanoLuc® を C 末端に融合した HIF1A タンパク質を CMV プロモーター の下流にコードしたベクター、細胞内での融合タンパク質の発現量を 調節するための Transfection Carrier DNA を含むシステムです。 NRF2 タンパクの安定性試験 96 ウェルプレートで HCT-116 細胞に pNLF1-NRF2［CMV/neo］Vector およ び pKEAP1 DNA をトランジェントにトランスフェクションした。細胞は表示 の時間で異なる濃度の D. L スルフォラファンで刺激した後、Nano-Glo® Luciferase Assay Reagent および GloMax® 96 Microplate Luminometer を用い て NanoLuc® ルシフェラーゼを測定した。 A. B. 0 2 x 105 4 x 105 6 x 105 8 x 105 1 x 106 –8 –7 –6 –5 –4 2 hours 4 hours 6 hours Log [M] Phenanthroline Nano-Glo™ Luciferase (RLU) 12165MA Nano-Glo® Luciferase (RLU) –8 –7 –6 –5 –4 0 2 x 105 4 x 105 6 x 105 8 x 105 1 x 106 2 hours 4 hours 0 hours 1 hour 0.5 hours Log [M] D,L-Sulforaphane タンパク質ダイナミクスと遺伝子発現のデュアルアッセイ HEK293 細胞に pNLF1-HIF1A [CMV/neo] 融合タンパク質発現コンストラクトと低酸素応答エレメントを含む pGL4.42 [luc2P/HRE/Hygro] を1：1000 の割合でトランジェン トにトランスフェクションした。18 時間後に様々な濃度の 1,10-フェナントロリンで刺激し、ホタルルシフェラーゼ転写レポーターと Hif1a-NanoLuc® 融合タンパク質 を Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter（NanoDLR™）Assay で表示の時点で定量した。 主要シグナルパスウェイの調節タンパク質の パスウェイ活性化にともなう細胞内寿命の変化 標的タンパク質 通常時 T1/2（分） 誘導時 T1/2（分） 誘導剤 HIF1 α 50 200 ̶ 250 低酸素 IkB α 100 5 TNF α / その他の 炎症性サイトカイン p53 20 300 ̶ 400 遺伝毒性ストレス （UV / 化学物質 DNA 損傷 , etc.） Nrf2 10 ̶ 15 30 ̶ 40 酸化ストレス β -Catenin <60 >200 Wnt FOXO >300 <60 成長因子 PDCD4 300 <60 インシュリン / PI3K c-Jun <60 >200 ストレス c-Myc 20 300 ̶ 400 ストレス c/EBP <60 >300 LiCl Ub VHL HIF NLuc HIF1a NLuc HRE Luc2P VHL VHL HIF NLuc HIF NLuc NLuc HIF Luc2P Ub Ub Ub Ub 1,10-phenanthroline 12468MA HRE – luc2P HIF1a – Nluc Fold Response (log scale) Time (hours) 0 2 4 6 8 1 10 HRE プロモーター活性 HIF1A タンパク質レベル 16 MiCheck miRNA バイオセンサークローン MiCheck miRNA バイオセンサークローンは microRNA 標的配列（代表的なヒト 157 種、マウス 32 種）をプロメガの psiCHECK ™-2 Vector に挿 入した microRNA 評価用クローンです。各組織や未分化細胞で発現の高い microRNA そして疾患（主にがん）と関連性のある microRNA を選 抜しています。各 microRNA 標的配列は SV40 プロモーター制御下にあるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の停止コドンの下流、3′ 非翻訳 領域に挿入しています。このため、microRNA 標的配列を含んだウミシイタケルシフェラーゼ転写物が発現します。ウミシイタケルシフェラー ゼ転写物は検討対象の microRNA によってその翻訳が影響を受けるので、その結果を発光値として検出することができます。ルシフェラーゼ レポーターにより、細胞増殖・分化過程および様々な細胞処理条件（刺激条件、薬剤処理など）について、細胞培養ウェル内で直接、簡単 に機能性 microRNA を評価することができ、様々な細胞の活性型 microRNA のバイオセンサーとして使用できます。お見積り、注文方法等に ついては www.promega.co.jp/micheck/ をご覧ください。 リバーストランスフェクションで実験短縮 接着細胞はプレートに接着していないとトランスフェクションできない。そ う考えてはいませんか ? 実はそんなことはありません。懸濁状態の細胞に トランスフェクトするリバーストランスフェクションという手法があります。 やり方は簡単。通常プロトコールではプレート上の細胞に DNA：トランスフェ クション試薬複合体を添加しますが、リバーストランスフェクションではプ レート上の DNA：トランスフェクション試薬複合体に細胞懸濁液を添加す るだけです。 細胞をプレートに播種しておくというステップが不要なため、リバースト ランスフェクションすれば実験短縮できるのです。通常プロトコールより毒 性がでやすい、導入効率が低いなどの欠点もありますが、良い条件が見つ かれば実験がぐっと楽になります。 プロメガの試薬はすべてリバーストランスフェクションに対応しています。 あなたも試してみませんか ? http://www.promega.jp/resources/pubhub/reverse-transfection-using-fugene-6- and-fugene-hd/ 9 3 12 6 9 3 12 6 9 3 12 6 10447MA Standard Transfection Reverse Transfection Plate cells. Plate transfection reagent and pGL4.10[luc2] Vector. Add cells. Incubate overnight to 24 hours. Incubate 24 hours. Incubate 24 hours. Measure luminescence. Measure luminescence. Add transfection reagent and pGL4.10[luc2] Vector. + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + RNA 干渉解析 siRNA や microRNA などのノンコーディング RNA の機能解析は転写調節、細胞の発生、分化、増殖、がん化およびアポトーシスなどの細胞機能解析 において重要です。プロメガではこれらの RNA 干渉をルシフェラーゼアッセイにより解析するシステムをご用意しております。ルシフェラーゼの発光 を利用することにより、GFP やフラッグ – タグなど、その他の融合法によるアプローチと較べ、より便利、迅速に感度の高い定量が行えます。 psiCHECK ™-1 および psiCHECK ™-2 Vectors は、 RNA 干渉実験初期段階における最適化を定量的、迅速に行うためにデザインされています。標的遺 伝子と融合されたレポーター遺伝子の発現変化をモニタリングします。両ベクターとも第 1レポーター遺伝子としてウミシイタケルシフェラーゼが利 用されており、目的の遺伝子はマルチクローニング領域にクローニン グします。目的遺伝子に対する合成 siRNA または in vivo で発現した shRNA による RNA 干渉機構が開始されると、標的遺伝子とつながる ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子も切断、分解されます。これにと もなうウミシイタケルシフェラーゼ活性の減少を測定することによ り、簡便に RNA 干渉効果をモニタリングすることができます。RNA 干渉に関連するベクターについては 29 ページをご覧ください。 Active siRNA hRluc 第 2 章 レポーターアッセイでできること Reporter GUIDE 17 レポーターアッセイでできること In Vivo イメージング & ウイルスパッケージング ルシフェラーゼ発光を利用した高感度なアッセイ系は生体分子、生体活性を定量する上で非常に強力なツールとして認知されています。ホタルルシフェ ラ－ゼ反応で生じる光には生体を透過しやすい赤色側の光が含まれているため、個体を用いた in vivo イメージングにも応用されています。ルシフェ ラーゼ発光は生体に影響を及ぼす可能性のある励起光を必要とせず、生体内に透過する毒性の低い基質のみを必要とします。さらに、GFP によるイ メージングでは励起光の届かない生体深部のイメージングもルシフェラーゼでは可能です。また、生物発光イメージングは蛍光イメージングに比べ、 シグナル /ノイズ比と感度の高さが特長です。 最新の NanoLuc® レポーターは高い感度と低いバックグラウンドを特長 としています。表層組織でのイベントを中心としたイメージング事例が あります。また、基質の特異性を利用した NanoLuc® とホタルルシフェ ラーゼによるデュアルルシフェラーゼイメージングも可能です。腫瘍の 増殖やウイルスの複製・拡散イメージングなど様々なアプリケーション に応用されています。 ※ NanoLuc® ルシフェラーゼは短波長の波長となるため、深部でのイ メージングには注意が必要です。詳細については、テクニカルサー ビス部 (prometec@jp.promega.com) までお問い合わせください。 ウイルスのマーキング ウイルスにレポーター遺伝子を導入する場合、ゲノムサイズが制限要因となることが多くあります。 NanoLuc® ルシフェラーゼは分子量が小さいため、この問題を解決できる可能性があります。近年、 NanoLuc® ルシフェラーゼによりインフルエンザおよびアルファウイルスレポーターの作製に成功したと いう論文が報告されています。 インフルエンザレポーターウイルスの作製は、ウイルスゲノムが小さく、しかも全ての遺伝子が感染に重 要であるため非常な困難を伴います。これまでのレポーター遺伝子は大きすぎるため、ウイルスの複製 や感染能力に影響を与えずに既存遺伝子との交換、挿入は困難であり、他のルシフェラーゼを用いたこ れまでの試みではウイルスの弱毒化やレポーター遺伝子の不安定化が認められていました。Tran ら （2013）は NanoLuc® ルシフェラーゼを用いて病原性を維持した安定なインフルエンザレポーターウイル スの作製に成功し、生きたマウスを用いた生物発光イメージングでは感染 2 日後でも発光が検出され、 プラークアッセイよりも高感度に検出されることを報告しています。明るい光は感染初期段階でも感度よく検出することができ、サイズの小ささは遺 伝子サイズが問題となる際のレポーターの構築に有利です。また、Sun ら（2014）は NanoLuc® やホタルルシフェラーゼなどを用いたアルファウイル スレポーターコンストラクトの有効性を比較しています。NanoLuc® およびホタルルシフェラーゼのコンストラクトを用いた場合、感染後 24 または 48 時間後のマウスの in vivo イメージングでは、ホタルでは注入部位にのみでシグナルが観察されたのに対して NanoLuc® では全身にシグナルが認められ 48 時間まで増加し続けたことにより、NanoLuc® の有用性が示された結果となりました。 1. Tran, V., Moser, L.A., Poole, D.S., and Mehle, A.（2013） Highly sensitive real-time in vivo imaging of an inuenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. J. Virol. 87 （24）, 13321-9. 2. Sun, C., Gardner, C.L., Watson, A.M., Ryman, K.D., and Klimstra, W.B.（2014） Stable, High-Level Expression of Reporter Proteins from Improved Alphavirus Expression Vectors To Track Replication and Dissemination during Encephalitic and Arthritogenic Disease. J. Virol. 88（4）, 2035-2046. ルシフェリンを用いたマウス個体の In Vivo イメージング In Vivo イメージング in vivo での動物個体イメージングで NanoLuc® と他のルシフェラーゼのパフォーマンスを比較し、in vivo でのホタルと NanoLuc® のデュアルイメージン グアッセイを実施した初めての論文をご紹介いたします。 本論文では新しい NanoLuc® ルシフェラーゼとホタルルシフェラーゼを用いて培養細胞およびマウスモデルにおける細胞内シグナリングイベントのイ メージングについて述べられています。著者らは 2 種類のルシフェラーゼを用いて TGF- β 1 シグナルパスウェイの中の異なるイベントをイメージング しています。このデータでは TGF- β シグナルの 2 つのポイント（受容体活性と転写）の活性化と阻害を定量化しています。ホタルルシフェラーゼレポー ターを TGF- β 1 受容体のキナーゼ活性検出用に、NanoLuc® ルシフェラーゼレポーターを TGF- β 依存的な転写活性検出用にそれぞれデザインし、 TGF- β または特異的阻害剤による影響のモニタリングに成功しています。このデュアルアッセイは細胞と動物個体で成功しています。 また、異なる実験では NanoLuc® だけを用いてマウスにおける腫瘍の増殖と進行をイメージングし、他の低分子ガウシアルシフェラーゼ（Gaussia）と 比較しています。さらに、著者らはホタルと NanoLuc® ルシフェラーゼを共発現するがん細胞を用いて組織表層部と深部の癌の進行モニタリングにつ いて比較しています。 1. Stacer, A.C., Nyati, S., Moudgil, P., Iyengar, R., Luker, K.E., Rehemtulla, A., and Luker, G.D.（2013）Mol. Imaging 12（7）, 1-13. 18 第 3 章 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター レポーターアッセイ実験の流れ ステップ 実験系選択 レポーター & ベクター選定 ベクター挿入配列選定 ベクター構築 プラスミド精製 細胞に導入 ルシフェラーゼ発光測定 選択肢 発現様式 ● 一過性発現／安定発現 レポーターの数 ● シングル／デュアル レポーター ● ホタル / ウミシイタケ / NanoLuc® ● 分解促進配列　有 / 無 薬剤選択マーカー ● Neo / Hygro / Puro ● プロモーター / 応答配列 / 3′ UTR ● 全長 / 一部 作　製 ● 自作 / 受託 購　入 ● 作製済みクローン ● 作製済みシグナル解析 ベクター ● 作製済みレポーター 安定発現株 ● トランスフェクション グレード / エンドトキシンフリー ● リポフェクション / エレクトロポレーション / ウイルスベクター 試　薬 ● フラッシュタイプ / Glo タイプ 機　器 ● プレートリーダー / シングルチューブ お勧めキット ● pGL4 ベクターシリーズ （26 ページ） ● pNL ベクターシリーズ （27 ページ） ● その他レポーターベクター （27 ページ） ● レポータークローン （27 ページ） ● レポーター導入細胞株 （29 ページ） ● カスタム製品 （27 ページ） ● PureYield ™ Plasmid Mini / Midi / Maxi kits （30 ページ） ● ViaFect™（30 ページ） ● デュルアッセイ （21 ～ 22 ページ） ● シングルアッセイ （23 ～ 25 ページ） ● マルチアッセイ（31 ページ） ● GloMax® マルチモード リーダー（32 ページ） 実験系選択 ベクターの選定とクローニング、クローン レポーター 実験レポーターは発光値が高いものを選び ましょう。一般に解析対象のプロモーターは 活性が弱くシグナルは低めです。高発光なら NanoLuc®、実績と種類の豊富さでホタルが お勧めです。 内部標準 レポーター 実験レポーターと基質や発光メカニズムが異 なるものを選びます。 NanoLuc® にはホタルを、ホタルには NanoLuc® かウミシイタケを選択します。 分解促進配列 シグナルへの迅速な応答が必要な場合は分 解促進配列付加タイプを選びます。NanoLuc® は NlucP、ホタルなら発光強度と応答性のバ ランスが取れた luc2P がお勧めです。 一過性発現 標的配列の選定や構築したベクターの評価、 配列を変更しながら解析する実験に適しま す。過剰発現系であるため、比較的高いシグ ナルが得られます。 安定発現 同じベクターを使う実験やスクリーニング、 トランスフェクション効率が悪い細胞に適し ます。細胞あたりのベクターコピー数が少な いため、一般に一過性発現よりシグナルが低 くなります。高発光の NanoLuc® はゲノムに 1 コピー挿入された場合でも検出できるため、 安定発現株でのアッセイに最適です。 レポーター の数 一過性発現の場合は実験レポーターのほか に内部標準レポーターが必要です。また実験 レポーターを 2 種類使うこともできます。レ ポーターを 2 種類使う場合は基質や発光メカ ニズムが異なる組合せを選び、デュアルアッ セイ試薬でアッセイします。 デュアルレポーターアッセイの有用性 （6 ページ） アプリケーション 実験レポーター 内部標準レポーター 全長プロモーター解析（一過性発現） ● pGL4.10［luc2］ ● pNL1.1［Nluc］ ● pGL4.74［hRluc/TK］、pNL-TK、pNL-PGK ● pGL4.53［luc2/PGK］、pGL4.54［luc2/TK］ TK プロモーター ：ウイルス由来 PGK プロモーター：ヒト由来、TK と同程度か少し弱い程度（細胞種に依存） シグナル解析（一過性発現） ● pGL4.23［luc2/minP］ ● pNL3.2［NlucP/minP］ シグナル解析（安定発現） ● pGL4.27［luc2P/minP/Hygro］ － ベクター挿入配列…標的遺伝子のプロモーター領域が不明の場合は、まず転写開始点から1 kb 程度上流まで（近位プロモーター）を選択します。5′ UTR の解 析ではレポーター開始コドンとの重複を避けるため、ATG 手前までを挿入します。シグナル応答配列の解析には最小プロモーター（minP） が必要です。シグナル応答配列とともにベクターに挿入するか、minP を持つベクターを使用します。 ベクター構築………ゲノムからのクローニング、人工遺伝子合成で得た配列をベクターに組み込みます。標的遺伝子の作製済みクローンやベクター、安定発現 株が市販されていれば、実験を早く立ち上げることができます。 ベクター（26 ページ）、クローン（27 ページ）、安定発現株（29 ページ）をご覧ください。 代表的なベクター組合せ Reporter GUIDE 19 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター ステップ 実験系選択 レポーター & ベクター選定 ベクター挿入配列選定 ベクター構築 プラスミド精製 細胞に導入 ルシフェラーゼ発光測定 選択肢 発現様式 ● 一過性発現／安定発現 レポーターの数 ● シングル／デュアル レポーター ● ホタル / ウミシイタケ / NanoLuc® ● 分解促進配列　有 / 無 薬剤選択マーカー ● Neo / Hygro / Puro ● プロモーター / 応答配列 / 3′ UTR ● 全長 / 一部 作　製 ● 自作 / 受託 購　入 ● 作製済みクローン ● 作製済みシグナル解析 ベクター ● 作製済みレポーター 安定発現株 ● トランスフェクション グレード / エンドトキシンフリー ● リポフェクション / エレクトロポレーション / ウイルスベクター 試　薬 ● フラッシュタイプ / Glo タイプ 機　器 ● プレートリーダー / シングルチューブ お勧めキット ● pGL4 ベクターシリーズ （26 ページ） ● pNL ベクターシリーズ （27 ページ） ● その他レポーターベクター （27 ページ） ● レポータークローン （27 ページ） ● レポーター導入細胞株 （29 ページ） ● カスタム製品 （27 ページ） ● PureYield ™ Plasmid Mini / Midi / Maxi kits （30 ページ） ● ViaFect™（30 ページ） ● デュルアッセイ （21 ～ 22 ページ） ● シングルアッセイ （23 ～ 25 ページ） ● マルチアッセイ（31 ページ） ● GloMax® マルチモード リーダー（32 ページ） プラスミド精製とトランスフェクションの重要性 ルシフェラーゼ発光測定 発光試薬 発光持続時間の違いでフラッシュタイプ、Glo タイプに分かれます。 フラッシュタイプは数分～十数分でシグナル が最高値の半分になります。プレートリー ダーで測定する場合はインジェクターが必要 です。 Glo タイプは 30 分～数時間シグナルが持続 します。サンプル数が多い場合は持続時間 が長い製品を使用します。プレート十数枚な ら1 ～ 2 時間程度で十分測定できます。 機器、 測定容器 発光測定にはルミノメーター、または発光測 定モードを持つマルチリーダーを使用しま す。蛍光リーダーは検出感度が低いため使用 できません。 プレートリーダーの場合は白色プレートを使 用します。透明プレートでは隣接ウェルから の発光漏れにより正確な測定ができません。 黒プレートではシグナルが約 1/10 に低下しま す。細胞培養と測定を同じプレートで行う場 合は底面が透明のクリアボトムプレートを使 用します。 シンブルチューブタイプの場合は機器に合っ たチューブを使用します。 一過性発現でレポーターアッセイを行う場合、トランスフェク ション効率は非常に重要な要因です。最適な導入条件や安定発 現株を得ることができれば、あとはデータを取るだけです。トラン スフェクション効率に影響する要因はいくつかあります。 プラスミド 精製度 エンドトキシン、塩、エタノールの混入はトラン スフェクション効率を著しく下げます。トラン スフェクショングレードの精製キットを使用 してください。プライマリー細胞など、エン ドトキシン感受性の高い細胞にはエンドト キシンフリーレベルの精製グレードが必要 です。 トランス フェクション法 操作の簡便さからリポフェクションが広く使 用されていますが、導入が難しい細胞にはエ レクトロポレーションやウイルスベクターが 使われています。 20 アッセイ / 検出試薬　選択ガイド 第 3 章 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター レポーター ベクター トランスフェクション 細胞 （1）エンドポイントアッセイ （2） リアルタイムアッセイ （経時的なモニタリング ） 基質 + 細胞溶解剤 基質 T＝1 T＝2 T＝3 ….. （4）In Vivo イメージング （3）Live Cell イメージング 細胞移植 基質 基質が細胞へ透過 ルシフェラーゼ活性の検出方法には 4 つのタイプがあ ります。 （1）一般的なエンドポイントアッセイでは、細胞を溶解 して内部のルシフェラーゼと基質が反応。 （2）リアルタイムアッセイでは、予め培地に加えられた 基質が細胞内に透過し、細胞内でルシフェラーゼ発光 反応が起る。細胞を破壊しないため、同じサンプルプ レートを経時的に測定することで、ルシフェラーゼ発 光をモニタリングすることができる。また他の細胞内 マーカーアッセイシステムと組み合せたマルチアッセイ も可能。 （3）Live Cell イメージングも同様に基質が細胞内に透 過し、細胞内でルシフェラーゼ発光反応が起る。これ を LV200 などの発光イメージングシステムで撮影する。 （4）In Vivo イメージングでは、ルシフェラーゼ遺伝子 を導入した細胞をマウスなどの動物個体に移植するこ とで、がん細胞の転移や薬物の影響などを経時的に観 察することができる。 ルシフェラーゼレポーターの測定またはイメージング アッセイ数 アッセイの タイミング アッセイ試薬 測定対象 （遺伝子） 感度 ホモジニアス※※※※ 発光持続時間 （測定可能時間） インジェクション （試薬の注入回数） ページ デュアル エンドポイント （細胞破壊） Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System ● ● ✔✔✔✔ ○ 2 時間 / 2 時間 2 21 Dual-Luciferase® Assay System ● ● ✔✔✔ × 15 分間 / 2 分間 2 22 Dual-Glo™ Assay System ● ● ✔✔ ○ 2 時間 / 2 時間 2 22 シングル ONE-Glo™ Assay System ● ✔✔ ○ 1 – 5 時間 1 24 Steady-Glo® Assay System ● ✔✔ ○ 5 時間 1 24 Bright-Glo™ Assay System ● ✔✔✔ ○ 30 分間 1 24 Renilla-Glo™ Assay System ● ✔✔ ○ 1 時間 1 24 Nano-Glo® Assay System ● ✔✔✔✔ ○ 2 時間 1※ 23 リアルタイム / Live Cell イメージング （生細胞） Nano-Glo® Live Cell Substrate and Vivazine™, Endurazine™ ● ✔✔✔✔ ○ （2 時間 / >72 時間 [V] / > 数日間 [E] ） 0 ※※ 23 ViviRen™ and EnduRen™ Cell Substrate ● （ V ）✔✔✔ （ E ）✔✔ ○ （>2 時間 [V] / >24 時間 [E] ） 0 ※※ 25 In Vivo イメージング （動物個体） VivoGlo™ Luciferin, In Vivo Grade ● ✔✔ ○ ̶ 0 ※※※ 25 EnduRen™ In Vivo Renilla Luciferase Substrate ● ✔✔ ○ ̶ 0 ※※※ 25 ViviRen™ In Vivo Renilla Luciferase Substrate ● ✔✔✔ ○ ̶ 0 ※※※ 25 ※ sec ベクター使用し、培地上澄を移してアッセイ。 ※※基質のみを細胞に加えればリアルタイムアッセイ/ Live Cell イメージングが可能。 ※※※試薬は予め培地に溶解。 ※※※※培地の除去、細胞の洗浄、細胞の溶解操作が不要で、培地を含む細胞に試薬を加えるだけの定量方法。 ● NanoLuc® ルシフェラーゼ　 ● ホタルルシフェラーゼ　 ● ウミシイタケルシフェラーゼ NEW Reporter GUIDE 21 製品名 サイズ カタログ番号 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System 10 ml N1610 100 ml N1620 10 × 10 ml N1630 10 × 100 ml N1650 ONE-Glo™ EX Luciferase Assay System 10 ml E8110 100 ml E8120 10 × 10 ml E8130 10 × 100 ml E8150 10 ml は 96 ウェルプレート 100 ～ 120 ウェル分に十分な試薬が含まれます。 ベクターについては 26-28 ページをご覧ください。 【 製品購入における注意点 】 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System の使用は非営利組織（大学、公的研究 機関など）、営利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容をご確認いただく必 要があります。ライセンスプログラムに関しては www.promega.co.jp/license/ をご覧くだ さい。 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System は最も高感度なデュアル – レポーターアッセイで、細胞内の微細な変化も検出することができます。 1 サンプルからホタルおよび NanoLuc® ルシフェラーゼ活性を連続測定することができます。新たなルシフェラーゼの組み合わせに最適化された新し い反応ケミストリによりデュアル – レポーターがより強力なツールとして生まれ変わります。 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System は 96/384/1536 ウェルフォーマットでのハイスループットフォーマットに対応するようにデザインされ ており、2 種類の試薬を順次加えるだけです。どちらの発光シグナルも半減期約 2 時間です。最初にホタルルシフェラーゼ用の試薬を培地中の細胞 に直接加えます（細胞の洗浄や溶解操作は不要）。次に NanoDLR™ Stop & Glo® Reagent を加えることによりホタルルシフェラーゼのシグナルを 1,000,000 分の 1 以下にまで減衰させると同時に NanoLuc® ルシフェラーゼの基質を供給します。 ● 低い発現レベルでも高感度にアッセイ 生体機能への影響を最小限に抑えながらより微細な変化をとらえる ことができます。最新型デュアルレポーターアッセイで最良のシグナ ル / バックグラウンド比がえられます。 ● より柔軟なアッセイデザインが可能 ホタルまたは NanoLuc® ルシフェラーゼのどちらも実験レポーターと して使用可能です。ホモジニアスアッセイでもライセートを用いたアッ セイでも選べます。 ● 試薬の安定性が向上 室温や 4℃での保存※も可能になり、ばらつきが抑制され、繰り返し の使用が簡便になります。また ONE-Glo™ EX も別売され、同じホタ ルアッセイ試薬をシングル、デュアルの両フォーマットで利用可能に なりました。 ※ ONE-Glo™ EX Reagent：室温（22℃）保存 約 18 時間、4℃保存約 3.5 日（10％活性 低下）、NanoDLR ™ Stop & Glo® Reagent：室温保存 約 32 時間、4℃保存 約 3.5 日（10％ 活性低下） ● コントロール DNA 量を抑え、より信頼性の高いデータ 発光量の高いレポーターならばコントロール DNA の使用量を低くお さえることにより、アーティファクトを最小限に抑えることができます。 ● アッセイパフォーマンスの向上 ホタルルシフェラーゼのクエンチング効率向上により、2 つのレポー ターのダイナミックスが広がり、より安定なデータが得られるように なります。 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター デュアルアッセイ（高感度タイプ）〈エンドポイント〉 Fire Fly NanoLuc® 12436MA GloMax® Discover System NanoLuc® ルシフェラーゼ発光の測定 ONE-Glo™ EX Luciferase Assay Reagent を添加 3分～2時間インキュベーション （20-25 ℃） 10分～2時間インキュベーション （20-25 ℃） ホタルルシフェラーゼ発光の測定 NanoDLR™ Stop & Glo® Reagent を添加 Nano-Glo® Dual-Luciferase® のアッセイの概要 12881MA 104 105 106 107 108 Relative Luminescence (RLU) Rluc in DLR Fluc in DLR Nluc in NanoDLR Fluc in NanoDLR Rluc in Dual-Glo Fluc in Dual-Glo Time After Reagent Addition (minutes) 0 20 40 60 80 100 120 NanoLuc is up to 1,000X brighter than Renilla luciferase when expressed o the same promoter. NanoDLR ™ アッセイのより明るく安定な発光特性 NanoDLR ™ アッセイのより明るく安定な発光特性 TK-Rluc（ウミシイタケ）： TK-Flu（c ホタル）：キャリア DNA または TK-Nluc（NanoLuc® ）：TK-Fluc：キャ リア DNA をそれぞれ 1：1：8 の割合で HEK293 細胞にトランスフェクション し、NanoDLR™、DLR ™ または Dual-Glo® Dual-Luciferase Assay System を 用いて測定した。同じプロモーターでルシフェラーゼを発現させた場合、 NanoDLR ™ Assay により測定した Nluc レポーターで最も明るい長時間発 光シグナルが得られ、Fluc レポーターも十分明るい長時間発光シグナルが 得られた。 各種ルシフェラーゼアッセイとの発光比較 22 デュアルアッセイ〈エンドポイント〉 第 3 章 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター Dual-Glo™ Luciferase Assay System Dual-Luciferase® Reporter Assay System Fire Fly Renilla デュアルアッセイにより、実験用レポーターのデータをコントロールレポーターのデータで補正し、実験間のバラツキを低減することができます。 Dual-Glo™ Luciferase Assay System および Dual-Luciferase® Reporter Assay System はホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を導入した哺乳動 物細胞から得られる 2 種類のルシフェラーゼ活性を、発光シグナルとして連続定量するための試薬です。Dual-Glo™ はシンプルなホモジニアスアッ セイ方式（添加→測光）を採用しており、培地の除去、細胞洗浄を行わずに試薬を加えるだけなので特に 96、384 プレートを用いた多検体のアッセ イに最適です。Dual-Luciferase® は細胞ライセートを調製する必要がありますが、Dual-Glo™ に比べ高い発光レベルを特長としています（各システム の発光値、発光半減期については 20 ページ参照）。 製品名 サイズ カタログ番号 Dual-Glo™ Luciferase Assay System 10 ml E2920 100 ml E2940 10 × 100 ml E2980 10 ml は 96 ウェルプレートで約 130 ウェル分に相当。 ベクター、組換え細胞については 26, 29 ページをご覧ください。 製品名 サイズ カタログ番号 Dual-Luciferase® Reporter Assay System 100 回分 E1910 Dual-Luciferase® Reporter Assay System 10-Pack 1000 回分 E1960 Dual-Luciferase® Reporter 1000 Assay System 1000 回分 E1980 サイズは 96 ウェルプレートに換算した回数。 ベクター、組換え細胞については 26, 29 ページをご覧ください。 デュアル – ルシフェラーゼ レポーターは 特異的および非特異的な細胞内反応を識別する Tet-Off プロモーターで制御されるウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子およ び CMV プロモーターで制御されるホタルルシフェラーゼ遺伝子（pCI Vector+luc+）を、CHO 細胞に一過性にトランスフェクションし、様々な濃 度の特異的阻害剤ドキシサイクリン（テトラサイクリン誘導体）および全般 的阻害剤 G418 に暴露した。 パネル A（シングルレポーター）：実験用レポーターとしてのウミシイタケ ルシフェラーゼのみの値（阻害剤無添加の際の値を差し引いた）。その結 果、ウミシイタケルシフェラーゼ発光は、2 つの阻害剤により減少した。 パネル B（デュアルレポーター）：実験用レポーターとしてのウミシイタケ ルシフェラーゼの値を、コントロールとしてのホタルルシフェラーゼ発光 値で補正した。この結果、デュアル – レポーターを用いることにより、特 異的、非特異的細胞内反応を識別できることが示された。 0 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1,000 20 40 60 80 100 120 140 [Inhibitor] (ug/ml) A. B.Relative Renilla Luminescence (as % of no inhibitor) Relative Response Ratio Renilla/Firefly Luminescence (as % of no inhibitor) G148 Doxycycline G148 Doxycycline 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1,000 0 20 40 60 80 100 120 [Inhibitor] (ug/ml) 3649MA02_2A Reporter GUIDE 23 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター シングルアッセイ〈エンドポイント & リアルタイム［分泌アッセイ］〉 Live Cell イメージング Nano-Glo® Luciferase Assay Reagent は NanoLuc® Luciferase の検出用のアッセイシステムです。Nano-Glo® Luciferase Assay System は 1 種類の試薬を加 えるだけのシンプルな操作性を提供するホモジニアスフォーマットを採用しており、培地の除去や細胞の洗浄は不要です。一般的な培地で使用した 場合、半減期約 2 時間におよぶグロータイプの発光シグナルが得られます。試薬は Nano-Glo® Luciferase Assay Substrate と Nano-Glo® Luciferase Assay Buffer を混和するだけで調製できます。試薬には溶解バッファーが含まれており、NanoLuc® luciferase を発現する細胞あるいはルシフェラーゼが分泌 された培地に直接使用することができます（IL6 分泌シグナルを含む“secNluc”ベクターを用いた場合）。 Nano-Glo® Live Cell Assay System は生細胞のまま発光を測定する1 液添加方式の非細胞溶解性の試薬です。NanoLuc® および NanoBiT® の検出の他、 NanoBRET ™ や NanoLuc® 融合タンパク質の生細胞イメージングにも使用できます。Nano-Glo® Live Cell Substrate は付属の Dilution Buffer で希釈して Nano-Glo® Live Cell Reagent を調製し、培地中に直接添加することで、細胞生存性を損なわずに最長 2 時間まで連続した発光モニタリングが行えます。 Endurazine™、Vivazine™ は数時間から数日にわたる長時間発光モニタリングが可能であり、内在レベルのタンパク質測定も可能な感度を有します。 Nano-Glo® Luciferase Assay System Nano-Glo® Live Cell Assay, Endurazine™, Vivazine™ NanoLuc®、ホタルおよび ウミシイタケルシフェラーゼアッセイの感度の比較 Nano-Glo® Live Cell Assay System、Endurazine™、Vivazine™ の 発光カイネティクス比較 Log[luciferase], pM 10549MA Luminescence (RLU) –3 –2 –1 0 1 2 3 4 5 6 7 1 × 102 1 × 103 1 × 104 1 × 105 1 × 106 1 × 107 1 × 108 1 × 109 1 × 1010 Firefly Luciferase Renilla Luciferase NanoLuc® Luciferase NanoLuc® NanoLuc® 製品名 サイズ カタログ番号 Nano-Glo® Luciferase Assay System 10 ml N1110 100 ml N1120 10 × 10 ml N1130 10 × 100 ml N1150 10 ml は 96 ウェルプレート 100 ウェル分に十分な試薬が含まれます。 ベクターについては 27, 28 ページをご覧ください。 【 製品購入における注意点 】 Nano-Glo® Luciferase Assay System の使用は非営利組織（大学、公的研究機関など）、営 利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容をご確認いただく必要があります。 ライセンスプログラムに関しては www.promega.co.jp/license/ をご覧ください。 製品名 サイズ カタログ番号 Nano-Glo® Live Cell Assay System 100 回分 N2011 1,000 回分 N2012 10,00 回分 N2013 Nano-Glo® Vivazine™ Substrate 0.1 ml N2580 1 ml N2581 10 ml N2582 Nano-Glo® Endurazine™ Substrate 0.1 ml N2570 1 ml N2571 10 ml N2572 Nano-Glo® Extended Live Cell Substrate Trial Pack （Endurazine™ および Vivazine™　各 0.1 ml ） 0.2 ml N2590 【 製品購入における注意点 】 Nano-Glo® Live Cell の使用は非営利組織（大学、公的研究機関など）、営利組織にかか わらず、ライセンスプログラムの内容をご確認いただく必要があります。ライセンス プログラムに関しては www.promega.co.jp/license/ をご覧ください。 Vivazine™ substrate Endurazine™ substrate Nano-Glo® Live Cell Assay System 104 105 106 107 108 Luminescence (RLU) Time (hours) 0 5 10 15 20 25 ● ハイエンドなレポーターシステム 発光量の高い NanoLuc® レポーターはより感度が求められる難しい 実験用途に使用可能。 ● 最適化が容易 添加して測定するだけのシンプルな操作性により HTS への変更が 容易。 ● より明るく長い発光時間 バッチ操作あるいは連続操作に最適化。 ● 自己発光の低減 低いバックグラウンドを実現する試薬組成により感度が向上。 24 ONE-Glo™/ Bright-Glo™/ Steady-Glo® Luciferase Assay Systems シングルアッセイ〈エンドポイント〉 ONE-Glo™ Luciferase Assay System は、より高感度、頑健に哺乳動物細胞 で発現したルシフェラーゼを測定するためのホモジニアスアッセイシステム で、ハイスループット、ウルトラハイスループットアプリケーションに最適 です。ONE-Glo™ Assay には新しく開発されたルシフェラーゼの基質が含 まれているため、試薬の安定性、サンプルに含まれる成分に対する寛容性 が向上しました。また、標準的なルシフェラーゼアッセイ試薬よりも硫黄 臭が低減され、使いやすくなっています。これらの特長により、他のレポー ターアッセイを多検体で行う際の不便さを低減することができ、発光パ フォーマンスが確実に発揮されます。シングル – エンドポイントアッセイで 最も使いやすいシステムです。 Bright-Glo™ Reagent、Steady-Glo® Reagent は従来型のグロータイプのシン グルルシフェラーゼアッセイシステムで、それぞれ発光強度（Bright-Glo™ Reagent は Steady-Glo® Reagent の約 7 ～ 8 倍）、発光時間が異なります。 ONE-Glo™ Luciferase Assay System ● よりシンプルな最適化 頑健なパフォーマンス、硫黄臭の低減、保存条件の改善、大容 量サイズの設定などにより最適化が容易で効率的に行えるよう になりました。 ● 室温または 4℃保存も可能 室温または 4℃での安定性増加により、日々の使用にも簡便な 保存が可能になりました。 ● 定量精度の増加 ONE-Glo™ Reagent は混和や分注の条件に対して寛容であるた め、再現性が向上（384, 1536 ウェルプレートに最適）。 ● より明るく長いシグナル バッチおよび連続プロセスに最適化されており、長時間の高レ ベル発光は特に検出前に長時間のインキュベーションを要する 場合に有用です。 ● サンプルに含有する成分による影響を低減 ONE-Glo™ Assay の新しいケミストリーは他のルシフェラーゼ アッセイよりも培地、フェノールレッド、ルシフェラーゼ阻害剤 に寛容。 製品名 サイズ カタログ番号 ONE-Glo™ Luciferase Assay System 10 ml E6110 100 ml E6120 1 L E6130 10 ml は 96 ウェルプレートで約 100 ウェル分に相当。 ベクター、組換え細胞については 26, 29 ページをご覧ください。 製品名 サイズ カタログ番号 Bright-Glo™ Luciferase Assay System 10 ml E2610 100 ml E2620 10 × 100 ml E2650 10 ml は 96 ウェルプレートで約 100 ウェル分に相当。 ベクター、組換え細胞については 26, 29 ページをご覧ください。 製品名 サイズ カタログ番号 Steady-Glo® Luciferase Assay System 10 ml E2510 100 ml E2520 10 × 100 ml E2550 10 ml は 96 ウェルプレートで約 100 ウェル分に相当。 ベクター、組換え細胞については 26, 29 ページをご覧ください。 6837MA 0 20 40 60 80 100 120 Time (minutes) Luminescence (RLU) 1 × 105 1 × 106 1 × 107 Bright-Glo™ Reagent ONE-Glo™ Reagent Steady-Glo® Reagent 第 3 章 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター 長時間発光タイプのルシフェラーゼ試薬の発光比較 96 ウェルプレートに 1 ウェルあたり 50 µl 分注した精製ルシフェラー ゼを含むサンプルに各ルシフェラーゼアッセイ試薬 50 µl（14.9 ng/ml with 0.1% Prionex® ）を加えた。 Fire Fly Renilla-Glo™ Luciferase Assay System Renilla-Glo™ Luciferase Assay System は、1 種類の試薬を加えるだけでグ ロータイプのウミシイタケルシフェラーゼシグナルを測定することができま す。基質を再溶解した試薬をサンプルに加えると安定なシグナルを得るこ とができます（例：22℃、60 分以上の半減期）。また、この試薬には細胞を溶 解する作用もあり、セレンテラジン基質の自家発光も抑えられています。 製品名 サイズ カタログ番号 Renilla-Glo™ Luciferase Assay System 10 ml E2710 100 ml E2720 10 × 100 ml E2750 10 ml は 96 ウェルプレートで約 100 ウェル分に相当。 ベクターについては 26, 27 ページをご覧ください。 11126MA 0 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 0 20,000 40,000 60,000 80,000 –8 –7 –6 –5 –4 Renilla-Glo™ Luciferase Assay System (No CellTox™ Green Dye) Renilla-Glo™ Luciferase Assay System (With CellTox™ Green Dye) CellTox™ Green Dye Control Renilla-Glo™ Assay (With CellTox™ Green Dye) Renilla-Glo™ Assay (No CellTox™ Green Dye) Log[Ionomycin], M Luminescence (RLU) Fluorescence (RFU) IC50 (µM) 9.88–23.42 10.32–15.97 Renilla Renilla-Glo™ と CellTox™ Green とのマルチアッセイ Reporter GUIDE 25 EnduRen™/ ViviRen™/ VivoGlo™ Substrate シングルアッセイ〈リアルタイム〉& In Vivo イメージング EnduRen™ Live Cell Substrates は、生細胞を用いてウミシイタケルシフェ ラーゼ活性を経時的（>24 時間）に測定するための試薬です。 この EnduRen™ 基質は、酸化を受けるサイトがブロックされているた め、基質の分解および自家発光を最低限に抑えるとともに、野生型の セレンテラジンに較べ、最大 10 倍のシグナル / バックグラウンド比を 示します。従来のセレンテラジンにくらべ、自動化への適応性、より 高い感度、BRET のアプリケーションを与えます。 EnduRen™ 基質は標準的な培地に溶かすだけで、ほとんどの哺乳動物 細胞種で基質が細胞内に透過します。そのため、細胞培養後にアッセ イ試薬を新たに添加するステップが無いため、アッセイをより単純化で きます。EnduRen™ 基質が細胞内に透過すると、細胞内のエステラー ゼにより保護基が外れ、セレンテラジン h になります。これがウミシイ タケルシフェラーゼの基質となり発光が開始されます。 製品名 サイズ カタログ番号 ViviRen™ Live Cell［In Vivo］ Substrate 1 プレート分 （0.37 mg） E6491 ［P1231］ 10 プレート分 （3.7 mg） E6492 ［P1232］ 【 In Vivo 用基質（カタログ番号 P1111, P1112, P1231, P1232, P1041）における注意点 】 各種ベクターの使用は非営利組織（大学、公的研究機関など）、営利組織にかかわらず、 ライセンスプログラムの内容をご確認いただく必要があります。 ライセンスプログラムに関しては www.promega.co.jp/license/ をご覧ください。 製品名 サイズ カタログ番号 EnduRen™ Live Cell ［In Vivo］ Substrate 1 プレート分 （0.34 mg） E6481 ［P1111］ 10 プレート分 （3.4 mg） E6482 ［P1112］ 製品名 サイズ カタログ番号 VivoGlo™ Luciferin, In Vivo Grade 50 mg P1041 ViviRen™ Live Cell Substrate は野生型セレンテラジンよりも 3 ～ 5 倍の 発光レベルを示します。さらに、自家発光が極めて低く抑えられてい るため、セレンテラジンに比べて最大 100 倍のシグナル /ノイズ比を 実現できます。 T 4810MA ime (minutes) 0 10 20 30 40 50 60 Luminescence (RLU) ViviRen™ Substrate EnduRen™ Substrate 10 100 1,000 10,000 100,000 NanoBRET ™ Nano-Glo® Detection System は NanoBRET ™ アッセイ用試 薬であり、NanoLuc® 基質である Nano-Glo® Luciferase Assay Substrate と、HaloTag® 蛍光リガンドである HaloTag® NanoBRET ™ 618 Ligand の セットです。明るく低波長側にシフトした NanoLuc® ドナーと、近赤外 側にシフトした HaloTag® アクセプターにより最適なスペクトルオーバー ラップを実現し、従来の BRET に比べシグナルが増加し高い定量性を 示します。HaloTag® は 33 kDa のタグタンパク質で、特異的に HaloTag® リガンドと共有結合するため様々なタンパク質機能解析に利用するこ とができます。 製品名 サイズ カタログ番号 NanoBRET ™ Nano-Glo® Detection System 200 回分 N1661 1,000 回分 N1662 【 製品購入における注意点 】 NanoBRET ™ Nano-Glo® Detection System の使用は非営利組織（大学、公的研究機関な ど）、営利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容をご確認いただく必要があり ます。ライセンスプログラムに関しては www.promega.co.jp/license/ をご覧ください。 Pre-Designed NanoBRET ™ PPI Assays プロメガでは主要なタンパク間相互作用の組み合わせとして、ヒストン -ブロモドメイン、HDAC、p53、Myc、EGFR、Kras、RNA 結合タンパク 質等の最適化済みベクターセットおよび試薬の製品 Pre-Designed NanoBRET ™ PPI Assays をご用意しています。 NanoBRET ™ Nano-Glo® Detection System NanoBRET ™ をタンパク質相互作用アッセイの例 HEK293 細胞におけるヒストン H3.3 と BRD4 または CBP（完全長）との相 互作用に対する JQ1 阻害の特異性 A. B. 12398MA milliBRET Ratio JQ1 [nM] CBP with Histone H3.3 9 8 7 6 0.01 1 100 10,000 1,000,000 10 IC50 = NA milliBRET Ratio JQ1 [nM] BRD4 with Histone H3.3 14 12 10 8 6 0.01 1 100 10,000 1,000,000 16 IC50 = 52nM Pre-Designed NanoBRET ™ PPI Assays ラインナップ ● ブロモドメイン（例：BRD2 Histone, H3.3） ● その他のエピジェネティクス（例：HDAC1, HDAC2） ● 転写（例：P53, MDM2） ● シグナル伝達 / キナーゼ（例：GRB2, EGFR） ● 膜タンパク質（例：EGFR, EGFR） ● RNA 結合タンパク質（例：hnRNPA, hnRNPF） NanoBRET ™ 関連試薬 ※ NanoBRET ™ PPI Assay へのお問い合わせ、見積もり請求については弊社テクニカルサービス部までお寄せください。 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター Fire Fly Renilla HaloTag® NanoLuc® 26 製品名 マルチ クローニング サイト レポーター遺伝子用 プロモーター / 応答配列 レポーター 遺伝子 分解 / 分泌配列 動物細胞 選択マーカー カタログ 番号 NanoLuc® ルシフェラーゼ シグナル解析用ベクター pNL[NlucP/NFAT-RE/Puro] Vector （特注） No NFAT-RE Nluc hPEST Puro CS175401 pNL[NlucP/NFAT-RE/Hygro] Vector （特注） No NFAT-RE Nluc hPEST Hygro CS177602 pNL[NlucP/CRE/Hygro] Vector （特注） No CRE Nluc hPEST Hygro CS186804 pNL[NlucP/p53-RE/Hygro] Vector （特注） No p53-RE Nluc hPEST Hygro CS194102 pNL[NlucP/ATF6-RE/Hygro] Vector （特注） No ATF6-RE Nluc hPEST Hygro CS186805 pNL[NlucP/ATF4-RE/Hygro] Vector （特注） No ATF4-RE Nluc hPEST Hygro CS183701 pNL[NlucP/MRE/Hygro] Vector （特注） No MRE Nluc hPEST Hygro CS194106 pNL[NlucP/HRE/Hygro] Vector （特注） No HRE Nluc hPEST Hygro CS180901 pNL[NlucP/GAS-RE/Hygro] Vector （特注） No GAS-RE Nluc hPEST Hygro CS191901 pNL[NlucP/ISRE/Hygro] Vector （特注） No ISRE Nluc hPEST Hygro CS190901 pNL[NlucP/SIE/Hygro] Vector （特注） No SIE Nluc hPEST Hygro CS189701 pNL[NlucP/STAT5-RE/Hygro] Vector （特注） No STAT5-RE Nluc hPEST Hygro CS180903 pNL[NlucP/AP1-RE/Hygro] Vector （特注） No AP1-RE Nluc hPEST Hygro CS177603 pNL[NlucP/CEBP-RE/Hygro] Vector （特注） No CEBP-RE Nluc hPEST Hygro CS188003 pNL[NlucP/MycMax-RE/Hygro] Vector （特注） No MycMax-RE Nluc hPEST Hygro CS175201 pNL[NlucP/ARE/Hygro] Vector （特注） No ARE Nluc hPEST Hygro CS180902 pNL[NlucP/SRE/Hygro] Vector （特注） No SRE Nluc hPEST Hygro CS177601 pNL[NlucP/SRF/Hygro] Vector （特注） No SRF Nluc hPEST Hygro CS194101 pNL[NlucP/SBE/Hygro] Vector （特注） No SBE Nluc hPEST Hygro CS177101 pNL[NlucP/TCF/LEF-RE/Hygro] Vector （特注） No TCF-LEF-RE Nluc hPEST Hygro CS181801 pNL[NlucP/XRE/Hygro] Vector （特注） No XRE Nluc hPEST Hygro CS186808 pNL3.2.NF-κB-RE [NlucP/NF-κB-RE/Hygro]Vector No NF- κB-RE Nluc hPEST Hygro N1111 クローニングベクター pNL3.1[Nluc/minP]Vector Yes minP Nluc No No N1031 pNL3.2[NlucP/minP]Vector Yes minP Nluc hPEST No N1041 pNL3.3[secNluc/minP]Vector Yes minP Nluc IL-6 No N1051 pNLCoI2[luc2-P2A-NlucP/minP/Hygro]Vector Yes minP Nluc/2A/luc2 hPEST Hygro N1471 pNL1.1[Nluc]Vector Yes No Nluc No No N1001 pNL1.2[NlucP]Vector Yes No Nluc hPEST No N1011 pNL1.3[secNluc]Vector Yes No Nluc IL-6 No N1021 pNL2.1[Nluc/Hygro]Vector Yes No Nluc No Hygro N1061 pNL2.2[NlucP/Hygro]Vector Yes No Nluc hPEST Hygro N1071 pNL2.3[secNluc/Hygro]Vector Yes No Nluc IL-6 Hygro N1081 pNLCoI1[luc2-P2A-NlucP/Hygro] Vector Yes No Nluc/2A/luc2 hPEST Hygro N1461 コントロール ベクター pNL1.1.PGK[Nluc/PGK]Vector No PGK Nluc No No N1441 pNLCoI4[luc2-P2A-NlucP/PGK/Hygro]Vector No PGK Nluc/2A/luc2 hPEST Hygro N1491 pNL1.1.TK[Nluc/TK]Vector No TK Nluc No No N1501 pNL1.1.CMV[Nluc/CMV]Vector No CMV Nluc No No N1091 pNL1.3.CMV[secNluc/CMV]Vector No CMV Nluc IL-6 No N1101 pNL3.2.CMV[NlucP/CMV]Vector No CMV Nluc hPEST Hygro N1411 pNLCoI3[luc2-P2A-NlucP/CMV/Hygro]Vector No CMV Nluc/2A/luc2 hPEST Hygro N1481 ウミシイタケルシフェラーゼ クローニングベクター pGL4.70[hRluc]Vector Yes No hRluc No No E6881 pGL4.71[hRlucP]Vector Yes No hRluc hPEST No E6891 pGL4.72[hRlucCP]Vector Yes No hRluc hCL1-hPEST No E6901 pGL4.76[hRluc/Hygro]Vector Yes No hRluc No Hygro E6941 pGL4.77[hRlucP/Hygro]Vector Yes No hRluc hPEST Hygro E6951 pGL4.78[hRlucCP/Hygro]Vector Yes No hRluc hCL1-hPEST Hygro E6961 pGL4.79[hRluc/Neo] Yes No hRluc No Neo E6971 pGL4.80[hRlucP/Neo] Yes No hRluc hPEST Neo E6981 pGL4.81[hRlucCP/Neo] Yes No hRluc hCL1-hPEST Neo E6991 pGL4.82[hRluc/Puro] Yes No hRluc No Puro E7501 pGL4.83[hRlucP/Puro] Yes No hRluc hPEST Puro E7511 pGL4.84[hRlucCP/Puro] Yes No hRluc hCL1-hPEST Puro E7521 ベクター ロール コント pGL4.73[hRluc/SV40]Vector No SV40 hRluc No No E6911 pGL4.74[hRluc/TK]Vector No HSV-TK hRluc No No E6921 pGL4.75[hRluc/CMV]Vector No CMV hRluc No No E6931 レポーターベクター 第 3 章 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター 特注：特別注文品のため専用の注文用紙が必要です。promega.formstack.com/forms/casorder よりお申込みください。 Reporter GUIDE 27 製品名 マルチ クローニング サイト レポーター遺伝子用 プロモーター / 応答配列 レポーター 遺伝子 分解 / 分泌配列 動物細胞 選択マーカー カタログ 番号 ホタルルシフェラーゼ シグナル解析用ベクター pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]Vector No CRE luc2 hPEST Hygro E8471 pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro]Vector No NFAT-RE luc2 hPEST Hygro E8481 pGL4.31[luc2P/Gal4 UAS/Hygro]Vector No GAL4 UAS luc2 hPEST Hygro C9351 pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]Vector No NF-KB-RE luc2 hPEST Hygro E8491 pGL4.33[luc2P/SRE/Hygro]Vector No SRE luc2 hPEST Hygro E1340 pGL4.34[luc2P/SRF-RE/Hygro]Vector No SRF-RE luc2 hPEST Hygro E1350 pGL4.35[luc2P/9XGal4 UAS/Hygro]Vector No 9XGAL4 UAS luc2 hPEST Hygro E1370 pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro]Vector No MMTV luc2 hPEST Hygro E1360 pGL4.37[luc2P/ARE/Hygro]Vector No ARE luc2 hPEST Hygro E3641 pGL4.38[luc2P/p53 RE/Hygro]Vector No p53 RE luc2 hPEST Hygro E3651 pGL4.39[luc2P/ATF6 RE/Hygro]Vector No ATF6 RE luc2 hPEST Hygro E3661 pGL4.40[luc2P/MRE/Hygro]Vector No MRE luc2 hPEST Hygro E4131 pGL4.41[luc2P/HSE/Hygro]Vector No HSE luc2 hPEST Hygro E3751 pGL4.42[luc2P/HRE/Hygro]Vector No HRE luc2 hPEST Hygro E4001 pGL4.43[luc2P/XRE/Hygro]Vector No XRE luc2 hPEST Hygro E4121 pGL4.44[luc2P/AP1 RE/Hygro]Vector No AP1 RE luc2 hPEST Hygro E4111 pGL4.45[luc2P/ISRE/Hygro]Vector No ISRE luc2 hPEST Hygro E4141 pGL4.47[luc2P/SIE/Hygro]Vector No SIE luc2 hPEST Hygro E4041 pGL4.48[luc2P/SBE/Hygro]Vector No SBE luc2 hPEST Hygro E3671 pGL4.49[luc2P/TCF-LEF RE/Hygro]Vector No TCF-LEF RE luc2 hPEST Hygro E4611 pGL4.52[luc2P/STAT5 RE/Hygro]Vector No STAT5 RE luc2 hPEST Hygro E4651 クローニングベクター pGL4.10[luc2]Vector Yes No luc2 No No E6651 pGL4.11[luc2P]Vector Yes No luc2 hPEST No E6661 pGL4.12[luc2CP]Vector Yes No luc2 hCL1-hPEST No E6671 pGL4.14[luc2/Hygro]Vector Yes No luc2 No Hygro E6691 pGL4.15[luc2P/Hygro]Vector Yes No luc2 hPEST Hygro E6701 pGL4.16[luc2CP/Hygro]Vector Yes No luc2 hCL1-hPEST Hygro E6711 pGL4.17[luc2/Neo] Yes No luc2 No Neo E6721 pGL4.18[luc2P/Neo] Yes No luc2 hPEST Neo E6731 pGL4.19[luc2CP/Neo] Yes No luc2 hCL1-hPEST Neo E6741 pGL4.20[luc2/Puro] Yes No luc2 No Puro E6751 pGL4.21[luc2P/Puro] Yes No luc2 hPEST Puro E6761 pGL4.22[luc2CP/Puro] Yes No luc2 hCL1-hPEST Puro E6771 pGL4.23[luc2/minP]Vector Yes minP luc2 No No E8411 pGL4.24[luc2P/minP]Vector Yes minP luc2 hPEST No E8421 pGL4.25[luc2CP/minP]Vector Yes minP luc2 hCL1-hPEST No E8431 pGL4.26[luc2/minP/Hygro]Vector Yes minP luc2 No Hygro E8441 pGL4.27[luc2P/minP/Hygro]Vector Yes minP luc2 hPEST Hygro E8451 pGL4.28[luc2CP/minP/Hygro]Vector Yes minP luc2 hCL1-hPEST Hygro E8461 コントロール ベクター pGL4.13[luc2/SV40]Vector No SV40 luc2 No No E6681 pGL4.50[luc2/CMV/Hygro]Vector No CMV luc2 No Hygro E1310 pGL4.51[luc2/CMV/Neo]Vector No CMV luc2 No Neo E1320 pGL4.53[luc2/PGK]Vector No PGK luc2 No No E5011 pGL4.54[luc2/TK]Vector No TK luc2 No No E5061 Hygro ＝ Hygromycin PGK ＝ Human phosphoglycerate kinase promoter hCL1 ＝ Degradation sequence derived from yeast Neo ＝ Neomycin HSV-TK ＝ Herpes simplex virus-thymidine kinase promoter hPEST ＝ Degradation sequence derived from mouse ornithine carboxylase Puro ＝ Puromycin SV40 ＝ Simian virus 40 promoter IL-6 ＝ IL-6 secretion signal CMV ＝ Cytomegalovirus promoter minP ＝ Minimal promoter P2A ＝ viral P2A peptide sequence 【 ベクター・細胞株 購入における注意点 】 各種ベクターの使用は非営利組織（大学、公的研究機関など）、営利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容をご確認いただく必要があります。 ライセンスプログラムに関しては www.promega.co.jp/license/ をご覧ください。 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター 28 製品名 マルチ クローニング サイト 発現用 プロモーター 融合遺伝子 （＋融合パートナー） 蛋白質分解 / 分泌配列 動物細胞選択 マーカー （大腸菌選択マーカー） カタログ 番号 NanoLuc® 融合タンパク質発現ベクター ベクター 標的融合 pNLF1-HIF1A[CMV/neo]Vector No CMV Nluc ＋ HIF1A No Neo N1381 pNLF1-NRF2[CMV/neo]Vector No CMV Nluc ＋ NRF2 No Neo N1391 クローニングベクター pFN31A Nluc CMV-Hygro Flexi® Vector Flexi® CMV Nluc No Hygro（Amp） N1311 pFN31K Nluc CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV Nluc No Neo（Kan） N1321 pFC32A Nluc CMV-Hygro Flexi® Vector Flexi® CMV Nluc No Hygro（Amp） N1331 pFC32K Nluc CMV-neo Flexi Vector Flexi® CMV Nluc No Neo（Kan） N1341 pNLF1-N[CMV/Hygro]Vector Yes CMV Nluc No Hygro N1351 pNLF1-C[CMV/Hygro]Vector Yes CMV Nluc No Hygro N1361 pNLF1-secN[CMV/Hygro]Vector Yes CMV Nluc IL-6 Hygro N1371 HaloTag® 融合タンパク質発現ベクター クローニングベクター pFC14A HaloTag® CMV Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （C 末端） No （Amp） G9651 pFC14K HaloTag® CMV Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （C 末端） No （Kan） G9661 pFC15A HaloTag® CMVd1 Flexi® Flexi® CMV d1（強） HaloTag® （C 末端） No （Amp） G1611 pFC15K HaloTag® CMVd1 Flexi® Flexi® CMV d1（強） HaloTag® （C 末端） No （Kan） G1601 pFC16A HaloTag® CMVd2 Flexi® Flexi® CMV d2（中） HaloTag® （C 末端） No （Amp） G1591 pFC16K HaloTag® CMVd2 Flexi® Flexi® CMV d2（中） HaloTag® （C 末端） No （Kan） G1571 pFC17A HaloTag® CMVd3 Flexi® Flexi® CMV d3（弱） HaloTag® （C 末端） No （Amp） G1551 pFC17K HaloTag® CMVd3 Flexi® Vector Flexi® CMV d3（弱） HaloTag® （C 末端） No （Kan） G1321 pFN21A HaloTag® Flexi® Flexi® CMV（最強） HaloTag® （N 末端） No （Amp） G2821 pFN21K HaloTag® Flexi® Flexi® CMV（最強） HaloTag® （N 末端） No （Kan） G2831 pFN22A HaloTag® CMVd1 Flexi® Flexi® CMV d1（強） HaloTag® （N 末端） No （Amp） G2841 pFN22K HaloTag® CMVd1 Flexi® Flexi® CMV d1（強） HaloTag® （N 末端） No （Kan） G2851 pFN23A HaloTag® CMVd2 Flexi® Flexi® CMV d2（中） HaloTag® （N 末端） No （Amp） G2861 pFN23K HaloTag® CMVd2 Flexi® Flexi® CMV d2（中） HaloTag® （N 末端） No （Kan） G2871 pFN24A HaloTag® CMVd3 Flexi® Flexi® CMV d3（弱） HaloTag® （N 末端） No （Amp） G2881 pFN24K HaloTag® CMVd3 Flexi® Flexi® CMV d3（弱） HaloTag® （N 末端） No （Kan） G2981 pFC27A HaloTag® CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （C 末端） No Neo（Amp） G8421 pFC27K HaloTag® CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （C 末端） No Neo（Kan） G8431 pFN28A HaloTag® CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （N 末端） No Neo（Amp） G8441 pFN28K HaloTag® CMV-neo Flexi® Vector Flexi® CMV（最強） HaloTag® （N 末端） No Neo（Kan） G8451 融合タンパク質発現ベクター ● HaloTag® 融合タンパク質発現クローンについては Flexi HaloTag® クローン（10,000 種以上）も併せてご覧ください。 www.promega.co.jp/exiclone/ Flexi® ＝ Flexi® Cloning System（3 つの制限酵素だけで簡単に ORF の移換えが可能なクローニングシステム） IL-6 ＝ IL-6 secretion signal 第 3 章 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター Reporter GUIDE 29 製品名 マルチ クローニング サイト 発現用 プロモーター 融合遺伝子 （＋融合パートナー） 蛋白質分解 / 分泌配列 動物細胞選択 マーカー （大腸菌選択マーカー） カタログ 番号 ツーハイブリッド / ワンハイブリッド用 GAL4 DNA 結合ドメイン融合タンパク質発現ベクター ベクター コントロール ポジティブ pBIND-ER α Vector No CMV Gal4 DBD ＋ ER-LBD （N 末端） No hRluc-neo（Amp） E1390 pBIND-GR Vector No CMV Gal4 DBD ＋ GR-LBD （N 末端） No hRluc-neo（Amp） E1581 クローニング ベクター pFN26A（BIND）hRluc-neo Flexi® Vector Flexi® CMV Gal4 DBD （N 末端） No hRluc-neo（Amp） E1380 pFN11A（BIND）Flexi® Vector Flexi® CMV Gal4 DBD （N 末端） No hRluc（Amp） C9341 VP16 転写活性化ドメイン融合タンパク質発現ベクター ベクター ニング クロー pFN10A（ACT）Flexi® Vector Flexi® CMV VP16 TAD （N 末端） No hRluc（Amp） C9331 ※ E1390, E1581, E1380 は pGL4.35［luc2P/9XGal4 UAS/Hygro］Vector （カタログ番号 E1370：26 ページ参照）とともに核内受容体解析用ワンハイブリッドシステムとして使用します。 ※ C9341, C9331 は pGL4.31［luc2P/Gal4 UAS/Hygro］Vector（カタログ番号 C9351：26 ページ参照）とともにタンパク質間相互作用解析用ツーハイブリッドシステムとして使用します。 RNAi 効果評価用ベクター クローニングベクター pmirGLO Dual-Luciferase® miRNA Target Expression Vector Yes PGK luc2（N 末端） No hRluc-neo（Amp） E1330 psiCHECK ™-1 Vector Yes SV40 hRluc（N 末端） No （Amp） C8011 psiCHECK ™-2 Vector Yes SV40 hRluc（N 末端） No hluc+（Amp） C8021 ※ psiCHECK ™-2 Vector をベースにしたヒト、マウス miRNA 標的配列クローニング済みクローンについては www.promega.co.jp/micheck/ をご覧ください。 製品名 バリアント カタログ番号 cAMP 結合ルシフェラーゼセンサー pGloSensor™-22F cAMP Plasmid 22F E2301 pGloSensor™-20F cAMP Plasmid 20F E1171 Caspase 3/7 認識配列導入ルシフェラーゼセンサー pGloSensor™-30F DEVDG Vector 30F CAS ※プロテアーゼセンサーの詳細については www.promega.co.jp/proteasesensor/ をご覧ください。 ※専用アッセイ試薬 GloSensor™ cAMP Reagent カタログ番号 E1290（25 mg）が必要です。大サイズについてはお問い合わせください。 センサータンパク質発現ベクター 製品名 細胞株 応答配列 レポーター遺伝子 蛋白質分解 / 分泌配列 カタログ番号 シグナル伝達解析用細胞センサー 応答配列＋レポーター遺伝子導入済細胞 GloResponse™ NF-κB-RE-luc2P HEK293 Cell Line HEK293 NF-κB-RE luc2 hPEST E8520 GloResponse™ CRE-luc2P HEK293 Cell Line HEK293 CRE luc2 hPEST E8500 GloResponse™ NFAT-RE-luc2P HEK293 Cell Line HEK293 NFAT-RE luc2 hPEST E8510 GloResponse™ 9XGAL4UAS-luc2P HEK293 Cell Line HEK293 9XGAL4UAS luc2 hPEST E8530 ● 各バイアルには 2 × 106 個の細胞が含まれる 製品名 細胞株 遺伝子改変内容 カタログ番号 cAMP モニタリング用細胞センサー GloSensor™ cAMP HEK293 Cell Line HEK293 cAMP 結合すると構造が変化して発光活性が回復する ルシフェラーゼを発現する細胞（バリアント 20F） E1261 ※専用アッセイ試薬 GloSensor™ cAMP Reagent カタログ番号 E1290（25 mg）が必要です。大サイズについてはお問い合わせください。 製品名 エフェクター細胞 ターゲット細胞 カタログ番号 ADCC 抗体依存性細胞傷害アッセイ用細胞センサーキット ADCC Reporter Bioassay, Complete Kit（WIL2-S） Jurkat （Fc RIIIa［V158 バリアント］発現、 NFAT-RE-luc2 レポーター導入細胞） WIL2-S（CD20 発現細胞） G7014 ADCC Reporter Bioassay, Complete Kit（Raji） Raji（CD20 発現細胞） G7015 ※上記製品には細胞の他にアッセイ試薬やコントロール抗体（Anti-CD20）などが含まれます。 ※その他のセンサータンパク質発現ベクター、細胞センサー（バイオアッセイ）については 弊社までお問合せください。 【 ベクター・細胞株 購入における注意点 】 各種ベクターの使用は非営利組織（大学、公的研究機関など）、営利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容をご確認いただく必要があります。 ライセンスプログラムに関しては www.promega.co.jp/license/ をご覧ください。 細胞センサー（安定発現細胞株） レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター 30 87 50 211 151 148 87 DNA Yield (µg) PureYield™ Maxiprep 350 300 250 200 150 100 50 0 31.2 61.8 111.4 79.7 28.7 0 20 40 60 80 100 120 140 DNA Yield (µg) PureYield™ Midiprep DNA Yield (µg) 他社Miniprep A 他社Miniprep B 他社Miniprep C 他社Midiprep A 他社Midiprep B 他社Midiprep C 他社Midiprep D 他社Maxiprep A 他社Maxiprep B 他社Maxiprep C 他社Maxiprep D 他社Maxiprep E PureYield™ Miniprep 5.7 2.7 7.3 7.6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ViaFect™ Transfection Reagent は一般的に使用される付着細胞だけでな く、浮遊細胞や幹細胞由来の細胞株などトランスフェクションが難し いとされる細胞でも優れたトランス フェクション効率を示します（細胞 によってはエレクトロポレーションによる導入と同等以上の結果が得 られています）。細胞毒性もきわめて低く、健全な細胞状態を保つため、 レポーター実験に最適です。また、使用前に血清や培地を除く必要の ない（試薬 / DNA 複合体を導入した後）簡便なプロトコルで、リバース トランスフェクションにも対応します。 ViaFect ™ Transfection Reagent TF-1 浮遊細胞に pGL4.32［luc2P/NF- κ B-RE/Hygro］Vector（NF- κ B 応答配 列を含むルシフェラーゼレポーター）を ViaFect™ Transfection Reagent ま たは Amaxa Nuclefector® II（エレクトロポレーション）を用いてトランジェン トにトランスフェクションした。翌日に細胞を TNF α で 6 時間刺激し、応 答を Bio-Glo™ Luciferase Reagent を用いて測定した。 12105MA Luminescence (RLU) log[TNFα], ng/ml 0 –4 –2 0 2 20,000 40,000 60,000 80,000 ViaFect™ Transfection Reagent Amaxa T01 protocol トランスフェクション試薬 ベクターを細胞内に導入するレポーター実験を行う上で、トランスフェクションは非常に重要なステップで、効率の高い試薬を用いることでベクター 導入の困難な細胞でもレポーター実験を行うことが可能になる場合もあります。トランスフェクション試薬を評価する場合、導入効率もさることな がら細胞毒性にも注意を払う必要があります。導入効率が高い場合でも、死細胞や活性の低い細胞では細胞の応答を正しくとらえているとは言えま せん。通常のトランスフェクション試薬の評価系では GFP、β – ガラクトシダーゼなど導入細胞を可視化できる方法が汎用されますが、細胞毒性を含 めた正しい評価を得るには定量的なアッセイがかかせません。 製品名 サイズ カタログ番号 ViaFect™ Transfection Reagent 0.75 ml E4981 2 × 0.75 ml E4982 ViaFect™ 0.75 ml は 24 ウェルプレートで 500 ウェル分。 第 3 章 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター PureYield ™ Plasmid Prep System プラスミド精製 レポーターベクター / プラスミドはレポーター実験の重要な要素であり、簡便に高純度なベクターを調製することが望まれます。特に哺乳動物細胞 へのトランスフェクションにおいては細胞への影響が懸念されるエンドトキシンを最低限に抑えたトランスフェクショングレードのプラスミドが必要 です。 PureYield ™ Plasmid Miniprep System は高純度なプラスミド DNA を迅速 に精製するためのシステムです。プラスミドからタンパク質、RNA、エン ドトキシンを除去するためにデザインされたユニークな Endotoxin Removal Wash が組み込まれています。不純物の除去により、真核細胞 へのトランスフェクションをはじめとする繊細なアプリケーションにも 適応します。精製までの所要時間は Miniprep 約 10 分、Midiprep 約 30 分、 Maxiprep 約 60 分で、精製までのステップにイソプロパノール沈殿や多 くの遠心操作が無く、簡便、迅速に精製することができます。このシ ステムは遠心法または吸引法で簡単に操作することができます。 製品名 サイズ カタログ番号 PureYield ™ Plasmid Miniprep System 100 回分 A1223 250 回分 A1222 PureYield ™ Plasmid Midiprep System 25 回分 A2492 100 回分 A2495 PureYield ™ Plasmid Maxiprep System 10 回分 A2392 25 回分 A2393 ※ midi, maxiprep にはスイングローターの遠心機が必要です。 他社トランスフェクショングレードのプラスミド精製キットとの収量比較 Reporter GUIDE 31 RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay は細胞の還元力（代謝［MT］）を測定することにより培養中の生細胞数をリアルタイムに測定するための細 胞非溶解性の発光ホモジニアスアッセイ法です。アッセイでは予め培養細胞に NanoLuc® luciferase と細胞透過性の NanoLuc® 基質前駆体を添加する だけです。生存細胞はこの特殊な前駆体基質を還元し、NanoLuc® ルシフェラーゼの基質に変換します。この基質は細胞内から培地に拡散し、 NanoLuc® ルシフェラーゼにより迅速に消費され生存細胞数に相関する発光シグナルを生じます。細胞応答（還元能の増減）は数分以内に発光シグナ ルの変化として現れ、1 回の試薬供給で最大 72 時間生細胞のままモニタリングすることができます。 CellTox™ Green Cytotoxicity Assay は細胞死による細胞膜の完全性 の変化を測定します。生細胞からは排出され、死細胞由来の DNA を 選択的に染色する非対称のシアニン色素を用いています。細胞から遊 離した DNA にこの色素が結合すると蛍光特性が大幅に増強されます。 しかし、生細胞では蛍光の増加は検出されません。そのため、死細胞 の DNA に結合することで得られた蛍光シグナルは細胞毒性に比例しま す。CellTox™ Green Dye は細胞に対して毒性を示さず、72 時間後でも 安定したシグナルを維持するため、カイネティック測定あるいはエンド ポイント測定による毒性効果の決定に理想的です。 CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay は、細胞溶解を伴わずに生細胞 を測定する蛍光アッセイで、試薬を 1 種類加えるだけの簡便な方式を 採用しています。本アッセイでは、恒常的に発現する特定のプロテアー ゼをマーカーとして利用します。このプロテアーゼ活性は、インタクト な生細胞内に限定され、細胞透過性の蛍光性ペプチド基質がインタク トな細胞内に入ると、このプロテアーゼ活性により切断され、生細胞 数に比例した蛍光シグナルを生じます。 マルチアッセイ プロメガのセルベースアッセイにはマルチアッセイに対応する組合せが数多く存在しており、よりハイコンテントなデータを簡便に取得することがで きます。レポーターアッセイに対して（特にステイブル）、細胞の増減を同時に調べることはデータの解釈を容易にし、精度を高めます。細胞の生存性、 毒性試験についてはリアルタイムで経時的に測定できる新しい技術も開発されています。また、その他の細胞内マーカー（カスパーゼ活性、P450 活性、 他）を測定することにより多様なプロファイリングを取得することができます。 発光レポーターアッセイとのマルチアッセイには通常蛍光アッセイ法が用いられますが、タイミングやサンプルを分離することで発光×発光アッセイ を行うことも可能です。マルチアッセイの詳細については弊社テクニカルサービス部までお問い合わせください。 Multi-Assay Compatible Asssay Systems ONE-Glo™（ホタルレポーター）と CellTox™ Green（細胞毒性）のマルチアッセイ 発光シグナルは細胞死およびタンパク質合成低下により減少。細胞膜の損 傷により CellTox™ Green 蛍光色素が DNA に結合するため蛍光シグナルは 増加。ONE-Glo™ アッセイはホタルルシフェラーゼを恒常的に発現する HEK293 細胞で実施した。 P450 とルシフェラーゼレポーターのマルチアッセイ P450 は薬物の代謝 / 排泄に深く関与しており、薬剤による P450 の発現誘導（転 写活性の増加）および酵素阻害（代謝活性の低下）を調べることは薬剤の開発 を行う上で非常に重要です。3A4プロモーターを導入したルシフェラーゼベクター および PXR を恒常的に発現するベクターをトランスフェクションすることにより、 3A4 の転写活性と代謝活性を測定することも可能です（詳細についてはお問い合 わせください）。 inducible 3A4 luc PXR constitutive Luciferase Light Reporter Gene Assay + Drug PXR Drug RXR Light P450 Endogenous CYP3A gene(s) endogenous P450-GloTM Assay 2.5×107 2.0×107 1.5×107 1.0×107 5.0×106 0 0 20,000 40,000 60,000 80,000 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 ONE-Glo™ Assay (No CellTox™ Green Dye) ONE-Glo™ Assay (With CellTox™ Green Dye) CellTox™ Green Dye Control Log[terfenadine], M Luminescence (RLU) Fluorescence (RFU) 製品名 サイズ カタログ番号 RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay 100 回分 G9711 10 × 100 回分 G9712 CellTox™ Green Cytotoxicity Assay 10 ml G8741 5 × 10 ml G8742 CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay 10 ml G6080 5 × 10 ml G6081 MultiTox-Fluor Multiplex Cytotoxicity Assay 10 ml G9200 5 × 10 ml G9201 Apo-ONE ™ Homogeneous Caspase-3/7 10 ml G7790 100 ml G7791 P450-Glo™ CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA 10 ml V9001 50 ml V9002 P450-Glo™ CYP1A2 Induction/ Inhibition Assay 10 ml V8421 50 ml V8422 P450-Glo™ CYP2B6 Assay 10 ml V8321 50 ml V8322 100 回分および 10 ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分に相当（但し、P450-Glo™ については 10 ml は 96 ウェルプレートで 200 ウェル分に相当）。 レポーターアッセイ試薬 & レポーターベ クター テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980／Fax. 03-3669-7982 ● E-Mail : prometec@jp.promega.com PK1906-03B 販売店 日本語 Web site：www.promega.jp プロメガ株式会社 本　　　社　〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所　〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2019年6月現在のものであり予告なしに変更することがあります。 GloMax® Discover System はプロメガのアッセイシステムに関する英知を結集してデザインした Ready-to-Use の多機能性マルチモードリーダー（発光、蛍光、 吸光［UV / 可視光］、BRET、FRET）で、フィルターによる 2 色発光測定やカイネティクス測定にも対応します。プリインストールされたプロメガ試薬のアッ セイプロトコルで直ぐに実験を開始することができ、ネットワークへのアクセスによりデータを望みのドライブに転送することができます。フィルターパド ルとフィルター自動切り替え機能によりマルチプレックスアッセイやカイネティクス実験にも対応します。プレートマスキングシステム（96 / 384 スイッチン グ）によりウェル間のクロストークを極限まで抑えた高感度測定が可能となり、ワイドなダイナミックレンジが得られます。新発売された GloMax® Explorer System は、検出機能を発光および蛍光に限定したスタートモデルで、初期投資を抑えることができます。また必要に応じてモジュール（可視吸光 / UV-可視吸光検出や BRET / FRET 測定機能）を追加して、段階的なアップグレードが可能になりました。 特長 ● 発光、蛍光、吸光［UV / 可視光］測定および BRET、FRET 対応 ● 9 桁以上のダイナミックレンジ（発光測定） ● 6 ～ 384 ウェルプレートおよび自動分注ロボットによる HTS にも対応 （ハイスピード測定：96 ウェル［1 分間］、384 ウェル［3 分間］） ● 撹拌機能 / 温度管理機能 ● 付属のタブレット PC によるタッチスクリーン操作、LAN 接続 ● スタートモデル GloMax® Explorer System は初期投資を低減 GloMax® Discover / Explorer System ルミノメーター ルミノメーターは生物発光を高感度に測定する装置で、ルシフェラーゼレポーターアッセイの普 及により一般的になり、現在では細胞ベースの様々なアッセイや生化学的測定にも使用されて います。プロメガのルミノメーターは、数多くの発光アッセイ試薬を開発しアッセイケミストリー を熟知した技術者のアイディアを反映させた、高感度で使いやすい測定装置です。 製品名 サイズ カタログ番号 GloMax® Discover System 1 台 GM3000 GloMax® Explorer System, Fully Loaded Model （発光 / 蛍光 / 可視吸光） 1 台 GM3500 GloMax® Explorer System, Luminescence and Fluorescence（発光 / 蛍光） 1 台 GM3510 NanoBRET ™ アッセイの例 阻害剤である Nutlin-3 の存在下・非存在下で p53 と Mdm2 の相互作用を検 出した。機器は GloMax® Discover System を使用した。エラーバーが小さく、 良好な Z’-factor が得られた。 1.71 0.49 No Drug Corrected mBU Nutlin-3 Z’=0.92 1.85 0.68 No Drug Corrected mBU Nutlin-3 Z’=0.71 1.71 0.49 No Drug Corrected mBU Nutlin-3 Z’=0.92 1.85 0.68 No Drug Corrected mBU Nutlin-3 Z’=0.71 96 ウェル プレート 384 ウェル プレート 生理的レベルのレポーター 融合タンパク質を発現する HCT-116 細胞の測定 GloMax® Discover と NanoLuc® テクノロジーにより非誘導時の生理的レベルの HIF1α-NanoLuc® 融合タンパク質の発現を細胞 2,500 個で検出した（NanoLuc® はゲノム編集技術により融合）。 12672MA 20K 10K 5K 2.5K 0 4 x 105 8 x 105 1.2 x 106 Luminescence (RLU) Cell Number ルミノメーターをお貸出しいたします！ www.promega.co.jp/rentamax/ Reporter GUIDE EXPLORER GloMax® Discover / Explorer System の装備比較 Model Lum Fluor. Vis Abs UV-Vis Abs BRET/FRET GloMax® Discover GM3000 ✓ ✓ ✓ ✓ GloMax® Explorer GM3500 ✓ ✓ ✓ Upgrade Upgrade GloMax® Explorer GM3510 ✓ ✓ Upgrade Upgrade Upgrade アップグレードについては弊社までお問い合わせください。