ADME/Tox プロダクトガイド

薬物動態試験

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ADME/Tox プロダクトガイド 高感度で迅速な発光法によるADME/Tox Contents： • P450 • GSH • NAT2 • MAO • Pgp More Relevant ADME/Tox Results 2 生物発光の利点 発光法によるADME/Tox アッセイ（スクリーニング） 多項目／多検体の測定が高感度、迅速に行えます。 創薬プロセスの中で、ADME/Tox（薬物動態/毒性）試験は開発途中でのドロップアウトを防ぐためにも重要であり、多くの薬 剤変換酵素やトランスポーターに対する影響について初期段階で薬剤候補のスクリーニングが行われています。多くの項目 について多検体を迅速に調べるには、シンプルでエラーの少ない統合したシステムが求められます。生物発光を用いた測定法 ならば、様々な項目について単一の検出系で高感度なアッセイが可能で、高密度プレートを用いてアッセイを実施すれば、固 定濃度による白黒判定によるスクリーニングだけでなく、幅広い濃度範囲にわたる標的作用を正確に知ることができます。ま た、励起用の光源を必要とするために光学的な干渉を受けやすい蛍光法とは異なり、酵素反応によりシグナルを生じる生物発 光法はバックグラウンドのほとんどない安定な測定が可能です。 発光法による酵素アッセイまたはスクリーニングシステム 基質 製品名（または基質名） 特性 P450 P450-GloTM CYP3A4 Assay (Luciferin-PFBE) ” セルベース ” または “in vitro” での CYP3A アッセイシス テム。主に、セルベースにおける薬剤候補テスト化合物 による CYP3A の誘導アッセイに使用。 P450-GloTM CYP3A4 DMSO-Tolerant Assay; P450-GloTM CYP3A4 Screening System, DMSOTolerant (Luciferin-PPXE) ” セルベース ” または “in vitro” での CYP3A アッセイシ ステムで DMSO に耐性を有す。主に、薬剤候補による CYP3A 阻害スクリーニングに使用。 P450-GloTM CYP3A4, P450-GloTM CYP3A7 Assays (Luciferin-BE) 最初に作られた “in vitro” での CYP3A4 および 3A7 アッ セイシステム。 O N S S N OH O F F F F F O N S S N OH O N N Ph O N S S N OH O Ph 7686MA N Light S S N O O R1 R2 HO N S S N O O R2 H2 N N S S N O O H Enzyme LDR Proluciferin Luciferin, Luciferin ester or Aminoluciferin I II III 発光酵素ルシフェラーゼの基質を修飾したルシフェリン前駆体は新しいプローブとして、様々な酵素活性を測定することが できます。 発光スクリーニングの利点 ・高感度で迅速 ・アッセイ間でデータの欠落がない （例：自己蛍光による測定阻害） ・同じ自動化システムへの集約 （HPLC、MS、など、項目ごとに機器を使い分ける 必要がない） ・ルシフェラーゼの発光阻害を起こす化合物を容易に 排除（すべての項目で低い発光値を示すため） 7685MA Sensitivity Ease of Use fluorescence absorbance mass spec bioluminescence radiometry ルシフェラーゼ反応を利用した 2 ステップの酵素測定法 測定対象酵素の標的となる修飾基 を付加したルシフェリン前駆体がルシフェリンに変換されるとルシフェラーゼ反応により 消費され、酵素活性に比例したシグナルが生じる。 発光プローブ（基質） 感度、簡便性に優れた生物発光法 酵素活性の測定は、酵素触媒反応より生じた産物に由来する シグナル（例 ; ピークエリア、カウント数、光学的シグナル） の特性に依存します。多くのアプリケーションにおいて生物 発光は感度、簡便性において上位にランクされます。 ADME/Tox ガイド 3 Luciferin-3A4 Luminogenic Substrate (Luciferin-IPA) ” セルベース ” または “in vitro” での CYP3A4 アッセイに 用いられる。CYP3A4 に対して非常に高い選択性を有 する。 P450-GloTM CYP2C9 Assay; P450-GloTM CYP2C9 Screening System (Luciferin-H) ” セルベース ” または “in vitro” での CYP2C9 アッセイシ ステムで CYP2C9 の選択性に優れる。薬剤候補による CYP2C9 の誘導または阻害の測定に用いられる。 P450-GloTM CYP1A1, P450-GloTM CYP1B1 Assays (Luciferin-CEE) ” セルベース ” または “in vitro” での CYP1A1 アッセイシ ステム。薬剤候補による CYP1A1 の誘導または阻害の 測定に使用される。CYP1B1 の “in vitro” アッセイも可能。 P450-GloTM CYP1A2, P450-GloTM CYP2C8 Assays; P450-GloTM CYP1A2 Screening System (Luciferin-ME) “in vitro” での CYP1A2 または CYP2C8 アッセイシステ ム。” セルベース ” での薬剤候補による CYP4A 誘導 アッセイにも使用可能。 P450-GloTM CYP2D6 Assay; P450-GloTM CYP2D6 Screening System (Luciferin-ME-EGE) “in vitro” での CYP2D6 アッセイシステム。薬剤候補によ る CYP2D6 阻害の測定にも使用可能。 P450-GloTM CYP2C19 Assay; P450-GloTM CYP2C19 Screening System (Luciferin-H-EGE) “in vitro” での CYP2C19 アッセイシステム。薬剤候補に よる CYP2C19 阻害の測定にも使用可能。 Luciferin-3A7 Luminogenic Substrate CYP3A7 により選択的にルシフェリンに変換される 基質。”in vitro” での薬剤候補による CYP3A7 阻害の検出 に有用。 Luciferin-4A11 Luminogenic Substrate CYP4A11 により選択的にルシフェラーゼ基質に変換さ れる。 ” セルベース ” または “in vitro” での薬剤候補によ る CYP4A11 阻害および CYP4A 誘導の検出に有用。 Luciferin-4F2/3 Luminogenic Substrate CYP4F2 および CYP4F3 により選択的にルシフェリンに 変換される基質。”in vitro” における CYP4F2 、CYP4F3 の活性および阻害の測定に有用。 Luciferin-4F12 Luminogenic Substrate CYP4F12 により選択的にルシフェリンに変換される基 質。”in vitro” での CYP4F12 の活性および阻害の測定に 有用。 Luciferin-2J2/4F12 Luminogenic Substrate CYP2J2 および CYP4F12 により選択的にルシフェリン に変換される基質。”in vitro” での CYP2J2、CYP4F12 の 活性および阻害の測定に有用。 Luciferin-MultiCYP Generic Luminogenic Substrate いくつかの P450 アイソザイムによりルシフェリンへ変 換される基質。肝臓サンプルの代謝能評価や P450 の構 造や活性研究に利用可能。 モノアミンオキシダーゼ MAO-GloTM Assay リコンビナント酵素あるいはネイティブなサンプルより モノアミンオキシダーゼ (MAO) 活性を測定するための アッセイ。薬物候補による MAO 阻害の検出に有用。 N- アセチルトランスフェラーゼ Luciferin-NAT2 Luminogenic Substrate N- アセチルトランスフェラーゼ 2 (NAT2) により反応性 の弱いルシフェラーゼ基質から強力な基質に変換される。 薬剤候補による NAT2 阻害の検出に有用。 グルタチオン GSH-GloTM Assay 発光法により還元型グルタチオン (GSH) を検出、定量 するアッセイ。細胞内または様々な生体サンプル中の GSH をアッセイ。 カスパーゼ Caspase-Glo® 3/7 Assay ” セルベース ” または “in vitro” での カスパーゼ -3/7 アッ セイ。アポトーシスのモニタリングに広く用いられる。 Caspase-Glo® 8 Assay ” セルベース ” または “in vitro” での カスパーゼ -8 アッセ イ。特異性向上のためのプロテアソーム阻害剤を含む。 Caspase-Glo® 9 Assay ” セルベース ” または “in vitro” での カスパーゼ -9 アッセ イ。特異性向上のためのプロテアソーム阻害剤を含む。 Caspase-Glo® 2 Assay “in vitro” でのカスパーゼ -2 アッセイ。プロテアソーム阻 害剤およびカスパーゼ -3/7 阻害剤を含んでおり、” セル ベース ” アッセイにも適応可能。 Caspase-Glo® 6 Assay “in vitro” でのカスパーゼ -6 アッセイ。阻害剤のハイス ループットスクリーニングに理想的な基質。 細胞毒性（プロテアーゼ） CytoTox-GloTM , MultiTox-Glo Assays 細胞死に対するプロテアーゼマーカーのアッセイ。蛍光 法による生細胞に対するプロテアーゼマーカーのアッセ イとのマルチアッセイが可能。 備考 : 各基質はキットあるいは特注品として供給されます。基質を用いたアッセイにはルシフェラーゼを検出するための Luciferase Detection Reagent が必要で、キットに含まれるものや、別途必要なものがあります。 ※その他のプロテアーゼ活性測定用のルシフェリン基質などについては弊社までお問合せ下さい。 COOH N S S N N H Z–LETD COOH N S S N N H Z–DEVD O N S S N OH O S NO2 O O N H N S S N OH O H2 N O N S S N O O H2 N O N S S N O O O N S S N O OH O O O O N S S N OH O Cl O N S S N OH O s COOH N S S N N H Z–LEHD COOH N S S N N H Z–VDVAD COOH N S S N N H Z–VEID COOH N S S N N H AAF O N S S N OH O Cl N S S N OH O O N S S N OH O O N S S N O O OH N S S N O OH O O N S S N OH O O N S S N OH O OH O S N N O N S S N HO O O 4 P450 P450-Glo™ Assay ルシフェリン基質の修飾により広範なアイソフォームを簡便、迅速に測定 P450-GloTMAssayは発光法を利用してシトクロムP450活性を測定するホモジニアスタイプのシステムです。このアッセイ法は、 リコンビナントまたはネイティブソースのシトクロムP450活性に対する分析対象物（薬剤、新しい化合物など）の影響をテス トするためにデザインされました。この発光法によるアッセイは、非常に優れた感度を有し、低いバックグラウンド、広いダ イナミックレンジを示します。P450-GloTM Assay では、ルシフェリン誘導体であるシトクロムP450発光基質を利用し、シトク ロムP450活性により変換されたルシフェリンをルシフェラーゼ発光量として示すことができます。P450-GloTM Assayで生成す る“グロータイプ”の発光シグナルは、耐熱性ルシフェラーゼと特殊なバッファーシステムを組合わせることにより実現しま した。また、この特殊な成分組成は、シトクロムP450阻害剤のスクリーニングにおいて弊害となるルシフェラーゼ阻害による 擬陽性を低減します。発光の半減期が2時間以上であるため、インジェクターを必要とせず、プレートのバッチ処理にも適して います。 新しい P450-Glo™ CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA には、 ヒトCYP3A4に対するすべてのアプリケーションに非常によく 適応する新しい基質 Luciferin-IPA が含まれており、特に細胞 ベースのアプリケーションに最適です。この新しい基質は容易 に細胞内に取り込まれ、迅速にルシフェリンに変換されます。 このため、インキュベーション時間を短縮することができます （通常 30-60分間）。Luciferin-IPAの使用によりバックグラウン ドが低く抑えられ、高いシグナル/ノイズ比を実現できるため、 酵素や化合物などの使用量を低く抑えることができます。 P450-GloTM CYP3A4 Assay (Luciferin-PFBE) Cell-Based /Biochemical Assayにはシトクロム3A4用の新しい基質が含 まれており、細胞をベースにしたアプリケーション（3A4遺伝 子誘導の実験など）に最適です。 P450-GloTM CYP3A4 System（Luciferin-PPXE）DMSOTolerant Assayは3A4反応でDMSO（0.2%）に耐性を持つよう 特別にデザインされています。DMSOは化合物の可溶化に汎用 される溶媒で、低濃度（<0.1%）でもシトクロムP450の3A4アイ ソフォームの活性を著しく阻害することが知られています。 P450-GloTMは、ヒト肝臓ミクロゾームや精製酵素で使用するこ とができ、各基質の選択性や細胞透過性により細胞ベースのアッ セイも可能です（詳細については弊社までお問い合わせください）。 特 長 • 広いダイナミックレンジと低いバックグランド：優れた感度はデータを明確にし、HPLC法や蛍光法に較べ、使用する シトクロムP450を少量に抑えることができます。 • 発光法：蛍光を有する化合物により干渉されません。 • ホモジニアス & グロー発光：シンプルな“添加-測定”フォーマットで発光の半減期は≧2時間。 • 擬陽性が最低限：特殊なルシフェラーゼ試薬により、ルシフェラーゼ反応阻害物質による擬陽性を最低レベルに抑える ことができます（擬陽性比率: P450-GloTM ＜0.16%、蛍光法＞5%）。 • 384ウェルプレートまで対応：1ウェルあたりのコストを低減。 用 途 • Sf9細胞や大腸菌など、異なる発現系から得られた膜画分に含まれるリコンビナントCYP450活性の測定 • 組織（例：肝臓）のミクロゾーム画分からネイティブCYP450活性を測定 • ネイティブ/リコンビナント中のCYP450活性を変化させる薬剤や新規化合物のスクリーニング P450-Glo™ Substrate cytochrome P450 Firefly Luciferase Luciferin Light cytochrome P450 Reaction Luciferase Reaction 5564MA S N S N OH O HO CYP1A1, CYP1B1 CYP1A2, CYP2C8 CYP3A4, CYP3A7 CYP2C9 CYP2D6 CYP2C19 S N S N O O HO OH Luciferin Luciferin EGE Luciferin Detection Reagent S N S N OH O O Luciferin-ME S N N N O S N S N OH O O Luciferin-BE S N S N OH O Luciferin-H S N S N O O OH Luciferin-ME EGE O S N S N O O OH Luciferin-H EGE S N S N OH O O Cl Luciferin-CEE CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 Luciferin-PFBE Luciferin-PPXE F F S N S N OH O O F F F P450-GloTM Assay の測定原理 シトクロム P450 アイソフォームに特異的なルシフェリン前駆基質は、 それぞれのシトクロム P450 活性によりルシフェリンに変換され、ルシ フェラーゼ反応の基質として消費される。 ADME/Tox ガイド 5 5563MA Luciferin-CEE control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 25,000 50,000 75,000 100,000 125,000 150,000 175,000 Luminescence/pmol CYP450 Luminescence/pmol CYP450 Luminescence/pmol CYP450 Luminescence/pmol CYP450 Luminescence/pmol CYP450 Luminescence/pmol CYP450 Luminescence/pmol CYP450 Luciferin-ME control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 25,000 50,000 75,000 100,000 125,000 225,000 Luciferin-BE 50,000 150,000 100,000 200,000 1,300,000 Luciferin-H control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 100,000 200,000 300,000 400,000 Luciferin-H EGE control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 50,000 150,000 250,000 350,000 450,000 550,000 650,000 Luciferin-ME EGE control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 1,500,000 A. B. C. D. E. G. F. H. control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 25,000 50,000 75,000 100,000 450,000 Luciferin-PFBE 125,000 250,000 375,000 500,000 Luciferin-PPXE control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 100,000 200,000 300,000 400,000 Luminescence/pmol CYP450 CYP3A4 基質の決定版 Luciferin-IPA 新発売 ! Luminescence (RLU/0.1 pmol CYP450) control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 450,000 50,000 150,000 250,000 350,000 新しい CYP3A4 基質である Luciferin-IPA は、これまでの発光基質の中で最も選択性 に優れ、迅速にルシフェリンに変換されるため、より少量の CYP3A4 酵素あるい は短いインキュベーション時間でアッセイを実施できます。また、広範な阻害剤を 感度良く検出するため理想的な阻害剤スクリーニングが行えます。これらの特長は セルベースアッセイにも最適です。 Luciferin-IPA による高感度な CYP3A4 アッセイ 様々な発光基質および蛍光基質を用いてリコンビナント CYP3A4 のアッセイを行った。点線で示す検出限界はシグナル / ノイズ＝ 3。 優れた選択性を示す Luciferin-IPA 基質 Luciferin-IPA を用いて各リコンビナント ヒト P450 を 測定した。 CYP3A4 Assays with Different Substrates 0.01 0.1 1 1 10 100 1000 10000 100000 -Vivid Red (InVitrogen) -BFC (BD/Gentest) -Luciferin-BE -Luciferin-PFBE -Luciferin-PPXE -New Luciferin-IPA -limit of detection pmoles CYP3A4 Signal to Noise Ratios ヒトのシトクロム P450 に対する P450-GloTM substrate の選択性 21 種類のヒト -P450 アイソフォームについて 7 種類の P450-Glo™ substrate を用いて測定した。 酵素 基質 阻害剤 /IC50 (µM) 測定法 CYP1A2 Luciferin-ME a-Naphthoflavone/0.08 Luminogenic Phenacetin a-Naphthoflavone/0.04 LC/MS CEC a-Naphthoflavone/0.02 Fluorogenic CYP2C9 Luciferin-H Sulfaphenazole/0.2 Luminogenic Diclofenac Sulfaphenazole/0.26 LC/MS CEC Sulfaphenazole/0.18 Fluorogenic CYP2C19 Luciferin-H-EGE Omeprazole/2.4 Luminogenic Diazapam, mephenytoin Omeprazole/6, 6.1 Radiometric DBF Omeprazole/4.0 Fluorogenic CYP2D6 Luciferin-ME-EGE Quinidine/0.008 Luminogenic Bufuralol Quinidine/0.02 LC/MS CEC Quinidine/0.009 Fluorogenic CYP3A4 Luciferin-PPXE Ketoconazole/0.06 Luminogenic midazolam Ketoconazole/0.008 LC/MS testosterone Ketoconazole/0.05 LC/UV BzRes Ketoconazole/0.083 Fluorogenic 酵素 基質 誘導剤 / 誘導倍率 核内 受容体 測定法 CYP3A Luciferin-PFBE Rifampicin/7 PXR Luminogenic Testosterone Rifampicin/9.6 PXR LC/UV CYP1A Luciferin-CEE Omeprazole/12.1 AHR Luminogenic Ethoxyresorufin Omeprazole/~5-7 AHR Fluorogenic Phenacetin Omeprazole/12.5-41.4 AHR LC/MS CYP2C9 Luciferin-H Rifampicin/3.5 PXR Luminogenic Diclofenac Rifampicin/2.1-3.4 PXR LC/MS CYP4A Luciferin-ME Clofibrate/2.0 PPARa Luminogenic Clofibrate/~1.5 PPARa Immunoblot Luciferin-ME (rat) Clofibrate/6.9 PPARa Luminogenic Lauric Acid (rat) Clofibrate/14 PPARa Radiometric 発光法と公表されている他法の同等性 阻 害 ア ッ セ イ 透 導 ア ッ セ イ 6 グルタチオン GSH-Glo™ Assay 細胞内および様々なサンプルに含まれるGSHを簡便に測定 GSH-GloTM Assayは、細胞内あるいは様々な生体サンプルからグルタチオン（GSH）を定量するための発光セルベースアッセイ システムです。グルタチオンレベルの変化は毒性反応の評価や酸化ストレス（アポトーシスや細胞死へ移行する可能性を有す） の指標として重要です。本アッセイは、GSH存在下でルシフェリン誘導体がルシフェリンに変換される反応がベースとなって います。反応はキットに添付されるグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）酵素により触媒されます。生成したルシフェ リンは、グロータイプの発光を生じるUltra-GloTM Recombinant Luciferaseを用いた反応により検出され、生じたシグナルは細 胞内に存在するグルタチオン量に比例します。このアッセイ法は、発色法や蛍光法に変わるシンプル、迅速で高感度な方法 で、ハイスループットなアプリケーションにも容易に適応します。 特 長： • 迅速：45 分で結果が得られます • シンプルな測定法：2 種類の試薬を加えるだ けなので、従来の GSH アッセイ法に比べ、 ステップ数が少なく、容易にハイスループッ トアプリケーションに適応させることができ ます（除タンパク質ステップも不要） • 高感度：発光法は他法で起こる蛍光による特 有のバックグラウンドの問題を回避できるた め、優れたシグナル / ノイズ比を実現 • 安定なシグナル：発光半減期は 5 時間以上 用 途： • 細胞死の指標として細胞内あるいは組織抽出液中の GSH レベルを測定 • 細胞、組織あるいは血液ライセートの GSH レベルを変動 させる薬剤や新規化学物質のスクリーニング 7778MA Physiological compounds, xenobiotics Phase I enzymes Phase II enzymes (e.g., CYP450) GSH transferase Metabolism GSH GSH GSH GSH GSH biosynthesis GSH pool Endogenous/ exogenous stimuli ROS level balance Cell death, disease Detoxification, elimination GSH-GloTM により得られた優れた直線性 Jurkat 細胞の 2 倍希釈系列を 384 プレートに作製し、GSHGloTM Assay に供した。GSH 標準曲線を基に算出した Jurkat 細胞の検出限界は約 20 個。r 2 値は 0.999。 7397MA Jurkat Cells (cells/well) Luminescence (RLU) 200,000 160,000 120,000 80,000 40,000 0 0 500 1,000 1,500 2,000 2,500 7781MA Luminescence (RLU) Control BSO NAC 0 2,000 4,000 6,000 8,000 16,000 14,000 12,000 10,000 BSO または NAC による U937 細胞内の GSH 濃度変化の測定 BSO：L- ブチオニン - スルホキシミン（GSH 生合成を抑制）、 NAC：N- アセチルシステイン（チオール生合成を促進）。 Control：未処理。 Liver extract titration r2 = 0.9964 2,500,000 5,000,000 7,500,000 10,000,000 0 50 100 150 200 µg/ml tissue protein conc. RLU 肝抽出液を用いたグルタチオンアッセイ ADME/Tox ガイド 7 モノアミンオキシダーゼ MAO-Glo™ Assay 高感度に多検体を処理するMAOアッセイ MAO-GloTM AssayはMAO酵素により発光前駆体基質がルシフェリンに変換され、発光を生じるルシフェラーゼ反応に供され ます。発光は5時間以上の発光半減期を有するため測光時間の厳密な管理が不要になります。MAO-GloTM Assayは発光前駆体 MAO基質と2種類のMAO反応バッファー（1つはMAO AおよびMAO B用、もう1つはMAO B専用）、凍結乾燥されたLuciferin Detection ReagentおよびLuciferin Detection Bufferから構成されます。準備するものはMAOを含むサンプルだけです。プロト コルはマルチウェルプレート形式で設定されていますが、シングル-チューブにも簡単に適応できます。HPLCなどの方法より も迅速、高感度に測定することができます。 N-アセチルトランスフェラーゼ NAT2 Assay Substrate 新しく開発されたNAT2発光アッセイ N-アセチルトランスフェラーゼ (NAT) は、芳香族アミンをアセチル化し、薬剤や生体異物となる化合物の臨床効果や毒性の決 定に役立つ第2相の生体内変換酵素です。NAT2はアセチル化遅延型に関連するバリアントとしてヒトに存在します。LuciferinNAT2はこの酵素の特異的基質で、NAT1に対する活性はほとんどありません。このLuciferin-NAT2は、NAT2酵素活性と比例す る発光シグナルを利用する発光アッセイに使用されます。 NA 7740MA T2 (U) Luminescence (RLU) 100 1,000 10,000 100,000 1,000,000 0.01 0.1 1 NAT2 量に依存した直線的な発光シグナル 反応には4µM Luciferin-NAT2, 0.01-1 unit NAT2を使用し、 Luciferin Detection Reagent（LDR）の添加により発光 シグナルを得た。 7739MA 0 100,000 200,000 300,000 400,000 500,000 600,000 0 5 10 15 20 25 30 Luciferin-NAT2 (µM) Luminescence (RLU) NAT2 による Luciferin-NAT2 の Km 値は 3.8 ± 0.5µM NAT2 を用いた Luciferin-NAT2 の Km 値を決定するために基質 25µl (400µM Acetyl-CoA, 表示濃度の Luciferin-NAT2, HEPES [pH8]) と 酵 素 25µl (0.25U, 100mM HEPES [pH8]) を 混 和 し た。室温で 1 時間インキュベーションした後、50µl Luciferin Detection Reagent を添加し、20 分後に測光した。NAT2 はメ タノールにより阻害されるため、全ての基質濃度で一定量 (1%) 加えた。 5693MA 1 10 100 1,000 10,000 MAO (ng) 40µM MAO A, luminescent 4µM MAO B, luminescent 50µM MAO A, fluorescent (p-tyramine) 100µM MAO B, fluorescent (benzylamine) 150µM MAO B, fluorescent (p-tyramine) Signal-to-Noise Ratio 0.1 1.0 10 100 1,000 10,000 MAO-Glo™と蛍光法の感度とダイナミックレンジの比較 点線は検出限界（S/N 比：3）を示す。 5694MA 0 20 40 60 80 100 120 Percent Activity [Test Compound], µM 0.0001 0.01 1.0 100 10,000 MAO A Clorgyline Phenylethylamine Deprenyl Dopamine Serotonin 0 20 40 60 80 100 120 Percent Activity [Test Compound], µM 0.001 0.1 10 1,000 MB. MAO AO-Gl B o™による MAO とテスト化合物との親和性の測定 テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982 ● E-Mail : prometec@jp.promega.com 日本語 Web site：www.promega.co.jp プロメガ株式会社 本 社 〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所 〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2009年7月現在のものであり予告なしに変更することがあります。 PK090704 販売店： P-グリコプロテイン 価格表 Pgp-Glo™ Assay ATPase活性により消費されたATP減少分を 発光シグナルとして測定 Pgp-GloTM Assayは、細胞膜画分内の組換えヒトPgpに対する化合物の影響を検出します。ATPをPgpとともにインキュベー ションした後、Pgp ATPase 反応を停止させます。代謝されずに残存した ATP をルシフェラーゼによる発光シグナルとして 検出します。Pgp依存的に減少した発光は、Pgpにより消費されたATP量を反映しています。そのため、減少量が多い場合、 Pgp活性が高いことを表しています。 ベラパミルによる Pgp ATPase の活性化 100µM Na3VO4 および 200µM ベラパミルで処理した後、製 品プロトコルに従いアッセイを行った。パネル A：サンプル +Na3VO4 と NT サンプルの差（RLUbasal）は基底レベルの Pgp ATPase 活性を示し、ベラパミル処理したサンプルとの差 （RLUTC）はベラパミル処理により刺激された ATPase 活性。 パネル B：RLUbasal および RLUTC の値をプロット。 TC=test compound 4930MA Basal TC (Verapamil) 0 200,000 400,000 600,000 Change in luminescence (RLU) Verapamil 0 250,000 500,000 750,000 ∆ RLUbasal Luminescence (RLU) RLUTC Na3VO4 NT ∆ A. B. 4930MA Basal TC (Verapamil) 0 200,000 400,000 600,000 Change in luminescence (RLU) Verapamil 0 250,000 500,000 750,000 ∆ RLUbasal Luminescence (RLU) RLUTC Na3VO4 NT ∆ A. B. 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） P450 アッセイ P450 基質 + 発光試薬 P450-Glo TM CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA 10 ml V9001 18,500 P450-Glo TM CYP3A4 Assay (Luciferin-PPXE) DMSO-Tolerant Assay 10 ml V8911 18,500 P450-Glo TM CYP3A4 Assay (Luciferin-PFBE) Cell-Based/Biochemical Assay 10 ml V8901 18,500 P450-Glo TM CYP1A1 Assay 10 ml V8751 18,500 P450-Glo TM CYP1B1 Assay 10 ml V8761 18,500 P450-Glo TM CYP1A2 Assay 10 ml V8771 18,500 P450-Glo TM CYP2C8 Assay 10 ml V8781 18,500 P450-Glo TM CYP2C9 Assay 10 ml V8791 18,500 P450-Glo TM CYP3A4 Assay 10 ml V8801 18,500 P450-Glo TM CYP3A7 Assay 10 ml V8811 18,500 P450-Glo TM CYP2C19 Assay 10 ml V8881 18,500 P450-Glo TM CYP2D6 Assay 10 ml V8891 18,500 P450 基質 + 発光試薬 + ミクロゾームメンブレン P450-Glo TM CYP3A4 Screening System with Luciferin-IPA 1,000 assays V9920 143,000 P450-Glo TM CYP3A4 Screening System (Luciferin-PPXE) DMSO-Tolerant 1,000 assays V9910 143,000 P450-Glo TM CYP1A2 Screening System 1,000 assays V9770 143,000 P450-Glo TM CYP2C9 Screening System 1,000 assays V9790 143,000 P450-Glo TM CYP3A4 Screening System 1,000 assays V9800 143,000 P450-Glo TM CYP2C19 Screening System 1,000 assays V9880 143,000 P450-Glo TM CYP2D6 Screening System 1,000 assays V9890 143,000 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） P450 基質 Luciferin-3A7 Luminogenic Substrate 3 mg P1741 33,000 Luciferin-4A11 Luminogenic Substrate 3 mg P1621 33,000 Luciferin-4F2/3 Luminogenic Substrate 3 mg P1651 33,000 Luciferin-4F12 Luminogenic Substrate 3 mg P1661 33,000 Luciferin-2J2/4F12 Luminogenic Substrate 3 mg P1671 33,000 Luciferin-MultiCYP Generic Luminogenic Substrate 3 mg P1731 33,000 発光試薬 Luciferin Detection Reagent 10 ml V8920 15,500 Luciferase Detection Reagent with Esterase 10 ml V8930 15,500 N- アセチルトランスフェラーゼ Luciferin-NAT2 Luminogenic Substrate 3 mg P1721 33,000 グルタチオン GSH-Glo TM Assay 10ml V6911 60,500 モノアミンオキシダーゼ (MAO) MAO-Glo TM Assay System 10ml V1401 24,000 P- 糖タンパク質 (Pgp) Pgp-Glo TM Assay System with P-glycoprotein 96 well V3601 105,500 Pgp-Glo TM Assay System 192 well V3591 64,000 カスパーゼ Caspase-Glo ® 3/7 Assay 10 ml G8091 66,000 Caspase-Glo ® 8 Assay 10 ml G8201 66,000 Caspase-Glo ® 9 Assay 10 ml G8211 66,000 Caspase-Glo ® 6 Assay 10 ml G0970 66,000 Caspase-Glo ® 2 Assay 10 ml G0940 66,000 細胞毒性マーカー（プロテアーゼ） CytoTox-Glo TM Cytotoxicity Assay 10 ml G9290 16,500 MultiTox-Glo Multiplex Cytotoxicity Assay 10 ml G9270 29,500