Anti-ACTIVE® MAPK, p38 and JNK Polyclonal Antibodies and Anti-ACTIVE® Qualified Secondary Antibody Conjugates

プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 prometec@jp.promega.com 1 www.promega.co.jp Anti-ACTIVE® MAPK, p38 and JNK Polyclonal Antibodies and Anti-ACTIVE® Qualified Secondary Antibody Conjugates カタログ番号 V1211, V8031, V7931, V7932, V7951, V7971 I. はじめに……………………………………………….. 1 II. キットの構成品………………………………………….. 2 III. 考慮が必要な事項………………………………………… 3 IV. Anti-ACTIVE® pAb を用いたウエスタンブロッティング解析 A. Anti-ACTIVE® pAbによる抗体反応 …………………………….. 5 B. 検出方法 ………………………………………………… 6 V. Anti-ACTIVE® pAbs を用いた免疫細胞染色法 ………………….. 8 VI. バッファーおよび溶液の組成 ………………………………. 9 VII. 関連製品の紹介………………………………………….. 9 VIII. 参考文献………………………………………………. 11 目次 日本語プロトコール No. TB262J 2000 年 8 月作製 I. はじめに 　プロメガはMitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)スーパーファミリーの3メンバーに対するポリ クローナル抗体(pAb)を開発しました。これらの酵素 MAPK, p38, JNKは真核細胞のシグナル伝達にお いて重要な役割を果たしています。これらのキナーゼはシグナル伝達反応のカスケードにおける連結役 を担っています。Anti-ACTIVE® pAbsは2重リン酸化された活性化型のMAPK, p38, JNKと特異的に反 応するため、これらの酵素の活性化を正確に検出するツールとなります。 Anti-ACTIVE® JNK pAb, Rabbit (カタログ番号 V7931, V7932)はアフィニティー精製されたポロリク ローナル抗体で2重リン酸化された活性化型JNK (c-Jun N-terminal protein kinase)[SAPK (Stress-Activated Protein Kinase) としても知られる ] を認識します。Anti-ACTIVE® JNK pAb は活性化型 JNK の触 媒中心に相当する2重リン酸化ペプチド配列を免疫原として作成されています。このペプチドは JNK2 の Thr183 と Tyr185 に相当するアミノ酸残基がリン酸化されています。Anti-ACTIVE® JNK pAb のウエス タンブロッティング分析に用いる場合の推奨希釈倍率は5,000倍です。 Anti-ACTIVE® MAPK pAb, Rabbit ( カタログ番号 V8031) はアフィニティー精製されたポリクローナ ル抗体で、2重にリン酸化された活性化型MAPK (またはp44/ERK1およびp42/ERK2)を特異的に認識 します。 Anti-ACTIVE® MAPK pAb は活性化型ERKの触媒中心に相当する2重リン酸化ペプチド配列を 免疫原として作成されています。このペプチドはp42/ERK2のThr183とTyr185に相当するアミノ酸残基が リン酸化されています。Anti-ACTIVE® MAPK pAb のウエスタンブロッティング分析に用いる場合の推奨 希釈倍率は5,000倍です。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 prometec@jp.promega.com 2 www.promega.co.jp Anti-ACTIVE® p38 pAb, Rabbit (カタログ番号 V1211), はアフィニティー精製されたポリクローナル 抗体で2重リン酸化された活性化型p38を認識します。Anti-ACTIVE® p38 pAbは活性化型p38Kの触媒 中心に相当する 2 重リン酸化ペプチド配列を免疫原として作成されています。このペプチドは p38 の Thr180とTyr182に相当するアミノ酸残基がリン酸化されています。Anti-ACTIVE® p38 pAb のウエスタン ブロッティング分析に用いる場合の推奨希釈倍率は2,000倍です。 II. キットの構成品 製品名 サイズ カタログ番号 Anti ACTIVE® MAPK pAb, Rabbit (pTEpY) 40µl V8031 Anti-ACTIVE® JNK pAb, Rabbit (pTPpY) 40µl V7931 120µl V7932 Anti-ACTIVE® p38 pAb, Rabbit (pTGpY) 100µl V1211 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP, Anti-ACTIVE® Qualified 60µl V7951 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L), AP, Anti-ACTIVE® Qualified 60µl V7971 推奨する倍率で希釈した場合、カタログ番号 V7932, V7951 および V7971 は 600ml 分、カタログ番号 V1211, V8031 およびV7931は200ml分のブロッティング溶液を調製できます。 内容 : 1 チューブ Anti-ACTIVE® pAb またはAnti-ACTIVE® Qualified antibody conjugate 1 部 Protocol 保存条件 : Anti-ACTIVE® MAPK pAb (カタログ番号 V8031), Anti-ACTIVE® p38 pAb (カタログ番号 V1211)および Donkey Anti-Rabbit IgG antibody conjugates (カタログ番号 V7951およびV7971) は–20°Cで保存（少 なくとも6ヶ月間 安定） Anti-ACTIVE® JNK pAb ( カタログ番号 V7931, V7932) は–70°Cで保存（少なくとも6ヶ月間 安定） ※凍結 /融解の繰返しを避けるため、保存する前に小分けすることを推奨します。 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP, Anti-ACTIVE® Qualified ( カタログ番号 V7951) および Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L), AP, Anti-ACTIVE® Qualified (カタログ番号 V7971) はアフィニティー精製された ホースラディッシュ-ペルオキシダーゼ(HRP)またはアルカリフォスファターゼ(AP) で標識されたAntiACTIVE® pAbs用の2次抗体です。化学発光または発色検出によるウエスタンブロッティング分析用と して検定されています。この標識抗体とヤギ、マウス、ヒツジのIgGやウシ血清アルブミン(BSA) およ び哺乳動物細胞抽出液のタンパク質との交差反応性は最低レベルで、Anti-ACTIVE® MAPK pAbの場合、 5,000 倍希釈、Anti-ACTIVE® JNK pAbとAnti-ACTIVE® p38 pAbの場合、10,000倍希釈でこの2次抗体 を用いると低いバックグラウンドと高い特異的シグナルを示します。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 prometec@jp.promega.com 3 www.promega.co.jp III. 考慮が必要な事項 Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) は、多くの細胞内イベントが調節される哺乳動物細胞のシ グナル伝達において重要な役割を果たしています(1,2)。ERKs, JNKs および p38 キナーゼを含むMAPキ ナーゼスーパーファミリーは3つのシグナル伝達カスケードを織り成しています。これらのキナーゼ群は、 有糸分裂誘起物質、成長因子や様々な形のストレスに応答し、転写因子をリン酸化して活性化します。 ERK, JNK およびp38は、MEKとして知られるMAPキナーゼ・キナーゼにより活性化され、pTXpY配列 上のスレオニンとチロシン残基がリン酸化されます。このようにERK、JNKおよびp38が最大に活性化 されるにはスレオニンおよびチロシン両方のリン酸化が必要です。 ERK( Extracellular signal-Regulated protein Kinase) ファミリーとして5つのアイソフォームERK1～ERK5 が報告されています。JNK (c-Jun N-terminal Kinase) は SAPK とも呼ばれており、転写因子 c-Jun (AP1) をリン酸化します。JNKの主要なアイソフォームはp46/JNK1, p54/JNK2, p49/JNK3 (3)で、最大10種類 のスプライシング産物の存在が考えられています (4)。p38 の場合、そのタンパク質はもともと CSBP (Cytokine-Suppressive anti-inflammatory drug Binding Protein) と呼ばれていました。また、酵母のp38 ホ モログである HOG (High Osmolarity Glycerol response) の特徴が示されました。p38 は ATF (Activating Transcription Factor) をリン酸化します。p38 のアイソフォームは p38, p38 β , p38 γ , p38 δと呼ばれ、 SDS-PAGE においてわずかな移動度の違いを示します(5)。 JNK/SAPK および p38/HOG 経路は紫外線 (UV)、サイトカイン、浸透圧ショックを与える試薬 ( ソルビ トールなど)、タンパク質合成阻害剤(アニソマイシンなど)また、程度は落ちますが成長因子によっても 活性化されます。この調節物質の幅広さは、この酵素が様々なストレス応答を変換する働きのある酵素で あることを物語っています。これらのシグナルは細胞膜結合レセプターから様々な低分子量GTP結合タ ンパク質 (JNK, p38 の場合 Cdc42, Rac など (6)) を経由して、MEK キナーゼ (MEKKs) レベルに達し、さ らに MEK へと伝達されます。次に JNK、p38 は、それぞれに対応するキナーゼ MEK4/7 および MEK3/6 により活性化されますが、MEKの活性化は刺激と細胞のタイプ両方に依存します(7)。例えば、B細胞に おける極度の一過性カルシウムイオン濃度上昇はMEK4/7およびJNKを活性化することが示されています (低レベルに維持されたのCa2+濃度では起こらない)(8)。JNKおよびp38のホモログは系統発生的レベル で広く異なる生物種において見つかっています。Drosophila(ショウジョウバエ)においてはbasket (bsk) 遺伝子が、順調な胚発生(9)や免疫応答(10)に必須のJNKホモログをコードしています。酵母の場合、p38/ HOGホモログの経路が浸透圧ショックにより活性化し、Pbs2pと呼ばれるMEKにより制御されます(11)。 Anti-ACTIVE® 抗体は ERK2 の pTEpY(12)、p38 αの pTGpY、JNK2 の pTPpY の各モチーフを包含する 合成ペプチドを免疫原として作成されました。3種類全ての抗体は2段階のアフィニティー精製工程を経 ています。まず、非リン酸化型のペプチドを用いた特異性の低い抗体のトラップ/除去を行い、次に活性 化型酵素由来の2重リン酸化型ペプチドを用いた陽性イムノアフィニティー選別を行います。この結果、 最終的な調製抗体は各キナーゼのpTXpY配列（活性化型）に特異的なものとなります。図1にAnti-ACTIVE® MAPK, JNK および p38 pAbs を用いたウエスタンブロッティング分析結果を示します。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 prometec@jp.promega.com 4 www.promega.co.jp 図 1. Anti-ACTIVE® MAPK, JNK および p38 ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブ ロッティングによる PC12 細胞抽出液の活性化 MAPK, JNK および p38 の検出 PC12 細胞は 25mM HEPES, 0.5mM EGTA, 10% ウマ血清 , 5% ウシ胎児血清を含む RPMI 1640 培地で 60-80% のコンフルーエントとなるように培養した。無処理の細胞と 図に示したように 50ng/ml nerve growth factor (NGF) で 5 分間または 0.5M ソルビトー ルで 5 分間の処理の細胞を用いた。細胞を回収、ホモジナイズし、高速遠心を行った (7)。この上清を -70℃の保存した。分注したそれぞれの抽出液を SDS-PAGE( 変性条件 下の 10% ゲル ) で解析し、ニトロセルロースメンブランに転写した。図中に示した Anti-ACTIVE® pAb(上段)とそれぞれのキナーゼのサブファミリーの活性型および不活 性型の両方を認識する抗体 ( 下段 ) でメンブランを処理した。JNK において、両方の フォームを検出する抗体は、ラット由来の全 JNK酵素に対して産生されている。一方、 p38 と ERK1 および ERK2 の抗体は、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列の一部から 得られた合成ペプチドに対して産生されている。2 次抗体は Promega の Donkey AntiRabbit IgG (H+L), AP, Anti-ACTIVE® Qualified conjugate ( カタログ番号 V7971) を用い た。化学発光の検出は Tropix Western- Star™ Kit と Kodak® BioMax® film を用い、これ ら製品のマニュアルにしたがって行った。 レーン 1, 5, 9: 2µg の無処理の PC12 細胞抽出液 ; レーン 2, 6, 10: 2µg の NGF 刺激した PC12 細胞抽出液 ; レーン 3, 7, 11: 20µg の無処理の PC12 細胞抽出液 ; レーン 4, 8, 12: 20µg のソルビトール処理した PC12 細胞抽出液。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 prometec@jp.promega.com 5 www.promega.co.jp IV. Anti-ACTIVE® pAbs を用いたウエスタンブロッティン グ分析 図2 はAnti-ACTIVE® pAbsを用いたウエスタンブロッティング分析の方法概要で す。この方法はこれまでの様々な実験系で強いシグナルと非常に低いバックグラ ンドを示す結果を得ています。しかし、個々の実験系で最良の結果を出すために は、いくつかのポイントで最適化を要する場合があります。 Anti-ACTIVE® MAPK, JNK およびp38 pAbsの陽性および陰性コントロールとし てPC12細胞抽出液がプロメガからご利用いただけます。 本製品以外に実験前に準備するもの ( 溶液の組成についてはセクション VI を参照のこと ) • HRP発色検出の場合：TMB reagent (KPL カタログ番号 50-77-00) • AP発色検出の場合：Western Blue® Stabilized (Promega カタログ番号 S3841) • HRP 化学発光検出の場合：ECL™ detection (Amersham Pharmacia カタロ グ番号 RPN 2109) • AP 化学発光検出の場合：Western- Star™substrate (Tropix カタログ番号 WL10RS) • 2 次抗体 [Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP, Anti-ACTIVE® Qualified, (Promega カタログ番号 V7951)、またはDonkey Anti-Rabbit IgG (H+L), AP, Anti-ACTIVE® Qualified, (Promega カタログ番号 V7971)] A. Anti-ACTIVE® pAbs による抗体反応 1. SDS-PAGE分析を行った後、ニトロセルロースまたはPVDFメンブレンに転 写する。 2. ニトロセルロースメンブレン : TBS buffer/1% BSA で 1 時間、37°C または O/N、4°C でブロッキングする。 PVDF メンブレン: PVDF buffer で1 時間、37°C またはO/N、4°Cでブロッ キングする。 3. メンブレンを抗体とともにインキュベートするために1次抗体を調製する。 推奨希釈倍率は次の通りです。 Anti-ACTIVE® MAPK pAb (カタログ番号 V8031)の場合5000倍 Anti-ACTIVE® JNK pAb (カタログ番号 V7931, V7932) の場合5000倍 Anti-ACTIVE® p38 pAb (カタログ番号 V1211) の場合2000倍 ニトロセルロースメンブレン : TBST/0.1% BSA で希釈した Anti-ACTIVE® pAbを振盪しながら室温で2時間インキュベートする。 PVDF メンブレン : PVDF buffer で希釈した Anti-ACTIVE® pAb を振盪しな がら室温で2時間インキュベートする。 4. ニトロセルロースメンブレン: TBST buffer 75ml を用いて 15 分づつ 3 回洗 浄する（各洗浄ごとに液体をデカントし、新しいバッファーを加える )。 PVDF メンブレン: PVDF buffer 75ml を用いて 15 分づつ 3 回洗浄する（各 洗浄ごとに液体をデカントし、新しいバッファーを加える)。 備考: 実験系によって抗 体の希釈倍率を最適化 する必要があるかもし れません。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 prometec@jp.promega.com 6 www.promega.co.jp 5. メンブレンを抗体とともにインキュベートするために2次抗体を調製する。 Anti-ACTIVE® Qualified Donkey Anti-Rabbitantibody conjugateの推奨希釈倍 率は 5,000 ～ 10,000 倍です。 ニトロセルロースメンブレン : TBST/0.1% BSA で希釈した Donkey AntiRabbit Antibody conjugateを振盪しながら室温で1時間インキュベートする。 PVDF メンブレン : PVDF buffer で希釈した Donkey Anti-Rabbit conjugate を振盪しながら室温で2時間インキュベートする。 6. ニトロセルロースメンブレン: TBST buffer 75ml を用いて 15 分づつ 3 回洗 浄し、TBS buffer 1 分づつ 2 回すすぐ ( 各洗浄 / すすぎごとに液体をデカン トし廃棄 )。 PVDF メンブレン : PVDF buffer 75ml を用いて 15 分づつ 3 回洗浄し、TBS buffer 1 分づつ 2 回すすぐ ( 各洗浄 / すすぎごとに液体をデカントし廃棄 )。 備考 : 実験系によって 2 次抗体の希釈倍率を最 適化する必要があるか もしれません。 B. 検出方法 ニトロセルロースメンブレンおよびPVDFメンブレンについてそれぞれ2種類の 検出方法がお選びいただけます。発色検出法または化学発光検出法のいずれかを 選んで以下のプロトコルに従ってください。 発色検出法: ニトロセルロースまたはPVDFメンブレンとも、適度なシグナルが 得られるまでインキュベートする。 化学発光検出法 (HRP) : ニトロセルロースまたはPVDFメンブレンとも、1分間 ECL™ Detection Reagentに浸漬し、フィルムに感光する。 化学発光検出法 (AP) : ニトロセルロースまたは PVDF メンブレンとも、5 分間 Tropix Western- Star™ Substrateに浸し、余分な試薬を除去した後フィルムに感 光する。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 prometec@jp.promega.com 7 www.promega.co.jp A. B. ニトロセルロース PVDF SDS-PAGE 後、ニトロセルロースメンブレンに転 写 TBS/1%BSA で 1 時間 (37℃) または O/N(4℃) でニ トロセルロースメンブレンをブロッキング TBST/0.1%BSAで希釈したAnti-ACTIVE® pAbを添 加し、振盪しながら室温で 2 時間インキュベート TBST 75mlで3回(15分づつ)メンブレンを洗浄(洗 浄液は毎回デカントして廃棄 ) TBST/0.1%BSA で希釈 (1:5,000 ～ 1:10,000) した Anti-ACTIVE® qualified Donkey Anti-Rabbit Antibody conjugate を添加し、振盪しながら室温で 1 時間イ ンキュベート TBST 75mlで3回(15分づつ)メンブレンを洗浄し、 TBS で 2 回 (1 分づつ ) すすぐ ( 洗浄液は毎回デカン トして廃棄 ) 発色検出 適度なシグナルが得ら れるまで検出試薬とイ ンキュベート HRP:KPL TMB Reagent AP:PromegaのWestern Blue® Substrate 化学発光検出 HRP: メンブレンを ECL™ Detection Reagent 中で 1 分間浸 し、フィルムに感光 AP:メンブレンをTropix Western- Sta r ™ Substrateで5分間浸し、 余分な試薬を除いて、 フィルムに感光 SDS-PAGE 後、PVDF メンブレンに転写 TBS/1%BSA で 1 時間 (37℃) または O/N(4℃) で PVDF メンブレンをブロッキング PVDF Buffer で希釈した Anti-ACTIVE® pAb を添加 し、振盪しながら室温で 2 時間インキュベート PVDF Buffer 75ml で3回(15分づつ)メンブレンを 洗浄 ( 洗浄液は毎回デカントして廃棄 ) PVDF Bufferで希釈 (1:5,000～ 1:10,000)したAntiACTIVE® qualified Donkey Anti-Rabbit Antibody conjugate を添加し、振盪しながら室温で 1 時間イ ンキュベート PVDF Buffer 75ml で3回(15分づつ)メンブレンを 洗浄し、TBS で 2回 (1 分づつ )すすぐ (洗浄液は毎 回デカントして廃棄 ) 発色検出 適度なシグナルが得ら れるまで検出試薬とイ ンキュベート HRP: KPL TMB Reagent AP: Promega の Western Blue® Substrate 化学発光検出 HRP: メンブレンを ECL™ Detection Reagent 中で 1 分間浸 し、フィルムに感光 AP:メンブレンをTropix Western- Sta r ™ Substrateで5分間浸し、 余分な試薬を除いて、 フィルムに感光 備考: 実験系によって1 次抗体、2次抗体の希釈 倍率を最適化する必要 があるかもしれません。 また、プロメガの2次抗 体以外のものを使って みるのも 1 つの方法で す。 図 2. Anti-ACTIVE® pAbs を用いたウエスタンブロッティングの簡易プロトコル ( ニトロセルロース / PVDF メンブレン ) ニトロセルロースを用いたプロトコル ( パネル A) と PVDF ( パネル B) メンブレ ン。 Anti-ACTIVE® pAbsの推奨希釈倍率(Anti-ACTIVE® MAPK pAb:5,000倍、AntiACTIVE® p38 pAb:2,000倍、Anti-ACTIVE® JNK pAb:5,000倍、Anti-ACTIVE® Qualified Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) secondary anti-bodies HRP または AP:10,000 倍 )。KPL ＝ Kirkegaard and Perry Laboratories プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 prometec@jp.promega.com 8 www.promega.co.jp V. Anti-ACTIVE® pAbs を用いた免疫細胞染色法 本製品以外に実験前に準備するもの ( 溶液の組成についてはセクション VI を参照のこと ) • Lab Tek® 4-チャンバースライド (Fisher カタログ番号 12-565-21) • rat tail コラーゲン (Collaborative BioScience Products) • RPMI 1640 (25mM HEPES, 300mg/L L-glutamine, 10% ウマ血清, 5% ウシ胎 児血清 および 0.5mM EGTAを含む) • NGF (Promega カタログ番号 G5141) またはソルビトール • PBS • 10% パラホルムアルデヒド • メタノール (–20°C) • ブロッキングバッファー (1% BSA, 5% ロバ血清を含むPBS) • Donkey Anti-Rabbit Cy™3 conjugate (Jackson ImmunoResearch カタログ番 号 741-165-152) 以下の手順はMAP キナーゼを活性化させるためにNGFを、JNKおよびp38を活 性化させるためにソルビトールをそれぞれ加えたPC12細胞における調製/免疫 染色法です。図3には各Anti-ACTIVE® pAbsで免疫細胞染色したPC12細胞の染 色像を示しています。 1. Lab Tek® 4- チャンバースライドを 滅菌 PBS に溶解した rat tail コラーゲン (6µg/cm2 ) で 1時間コートする 2. PC12細胞をRPMI 1640培地 ( 25mM HEPES, 300mg/L L-グルタミン, 10% ウマ血清 , 5% ウシ胎児血清 および 0.5mM EGTA を含む ) の入ったチャン バー内で培養 (37°C, 5% CO2)。細胞密度が 80％になるまで、培地を毎日交 換する 3. 2 つのチャンバー内の細胞を以下の要領で活性化し、残りの2チャンバーの 細胞は未処理のコントロールとして使用する ERK 活性化のための NGF 処理 免疫細胞染色を行う前日、血清を含む新鮮な培地を加え、当日に NGF (200ng/ml) を含む RPMI を加えて 37℃で 5 分間インキュベート JNK および p38 活性化のためのソルビトール処理 免疫細胞染色を行う前日、血清を含まない新鮮な培地を加え、 含まない 当日にソルビ トールを終濃度 1M になるように加えて 37℃で30 分間インキュベート 4. 冷たい PBS で 1 回 洗浄する 5. 10% パラホルムアルデヒドで細胞を固定 (30 分間、室温 ) する 6. PBS で各 5 分間、3 回洗浄する 7. 細胞を冷たい (–20°C) メタノールで10分間 透過処理を行う 8. PBS で各 5 分間、3 回洗浄する 9. ブロッキングバッファー(1% BSA, 5%ロバ血清を含むPBS)で3時間, 室温 でインキュベートする プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 prometec@jp.promega.com 9 www.promega.co.jp 10. PBS で 1 回、5 分 洗浄する。 11. Dilution buffer (1% BSA, 1% ロバ血清を含む PBS) で希釈した Anti- ACTIVE® pAbと4℃でO/Nインキュベート(推奨希釈倍率：MAPKは500倍、JNK は 1,000 倍、p38 は 500 倍 ) する。 12. PBS で各 15 分間、5 回洗浄する。 13. Dilution buffer (1% BSA, 1% ロバ血清を含む PBS) で 1,000 倍に希釈した Donkey Anti-Rabbit Cy™3 Conjugateとともに90分間, 室温でインキュベー トする。 14. PBS で各 15 分間、5 回洗浄する。 15.グリッドを外し、DAPIを含む Vectashield®でスライドをマウントする。 VI. バッファーおよび溶液の組成 備考 : 実験系によって 1 次抗体、2次抗体の希釈 倍率を最適化する必要 があるかもしれません。 10％ パラホルムアルデヒド 5g パラホルムアルデヒド 50ml PBS フュームフォード ( ドラフト ) 内で 75℃に 暖めて溶解するまで撹拌し、室温まで冷ま した後、水で50mlにメスアップ(温めてい る間に水分が蒸発するため ) TBS buffer 20mM Tris-HCl (pH 7.5) 150mM NaCl PVDF buffer 0.2% I-Block™ (Tropix, Inc.) および 0.1% Tween® 20を含むTBS buffer TBST buffer 0.05% Tween® 20を含むTBS buffer VII. 関連製品の紹介 製品名 サイズ カタログ番号 Anti-ERK 1/2 pAb, Rabbit 40µl V1141 Anti-pT183 MAPK pAb, Rabbit 50µl V8081 PC12 Cell Extracts, Western Control – Sorbitol/Untreated 10blots V8100 PC12 Cell Extracts, Western Control – NGF/Untreated 10blots V8110 MEK Inhibitor U0126 5mg V1121 PD 98059 (inhibitor for MEK1) 5mg V1191 SB 203580 (inhibitor for p38) 1mg V1161 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 prometec@jp.promega.com 10 www.promega.co.jp A. Anti-ACTIVE® MAPK pAb 未処理 NGF 処理 B Anti-ACTIVE® JNK pAb 未処理 ソルビトール処理 C Anti-ACTIVE® p38 pAb 未処理 ソルビトール処理 図 3. 免疫細胞染色による PC12 細胞における活性化型 MAPK, JNK, p38 の検出 (ICC) PC12 細胞は RPMI 培地 (25mM HEPES, 300mg/L L- グルタミン , 10% ウマ血清 , 5％ウシ胎児血清および 0.5mM EGTA を含む )で80％コンフルーエンスになるまで培養した。細胞は200ng/ml NGF または1M ソルビトールで処 理(または未処理)した。免疫細胞染色の方法については製品に添付のプロトコルに従った。各Anti-ACTIVE® pAb の希釈倍率は、MAPK：500 倍 (A)、JNK：1,000 倍 (B)、p38：500 倍 (C)。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 prometec@jp.promega.com 11 www.promega.co.jp VI. 参考文献 1. Seger, R. and Krebs, E.G. (1995) The MAPK signaling cascade. FASEB J. 9, 726. 2. Cano, E. and Mahadevan, L.C. (1995) Parallel signal processing among mam-malian MAPKs. TIBS 20, 117. 3. Kyriakis, J.M. et al.(1994) The stress-activated protein kinase subfamily of c-Jun kinases. Nature 369, 156. 4. Gupta, S. et al.(1996) Selective interaction of JNK protein kinase isoforms with transcription factors. EMBO J. 15, 2760. 5. Li, Z., Jiang, Y., Ulevitch, R.J. and Han, J. 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Tween is a registered trademark of ICI Americas, Inc. I-Block and Western- Starare trademarks of Tropix, Inc. Vectashield is a registered trademark of Vector Laboratories, Inc.