Cell Based Assay Guide

セルベースアッセイ

培養細胞を用いたアッセイシステムに関するプロダクトガイド。細胞増殖 / 毒性試験、アポトーシスアッセイ、細胞の状態（レドックス、エネルギー代謝、薬剤代謝）等を高感度に測定する発光アッセイ試薬をご紹介。

・イントロダクション 2 ・細胞ベースアッセイ選択ガイド NEW 4 ・細胞生存性 & 細胞毒性試験 6 ・アポトーシス・パイロトーシスアッセイ 15 ・酸化ストレスアッセイ 18 ・エネルギー代謝アッセイ （糖代謝・脂質代謝 NEW ） 20 NEW ・LDH-GloTM Cytotoxicity Assay ・Glycerol-GloTM Assay ・Triglyceride-GloTM Assay ・Cholesterol/Cholesterol Ester-GloTM Assay ・Caspase-Glo® 3/7 3D Assay ・オートファジー、プロテアソームアッセイ 23 ・シグナル伝達アッセイ（cAMP） 25 ・その他（HDAC、P450） 27 ・発光 & レポーターテクノロジーについて（概要） 29 ・マルチプレートリーダー 32 Contents Cell Based Assay Guide 高次元の細胞実験ガイド 細 胞を用いたバイオアッセイ 細胞を用いた生理反応・応答の解析は、生命科学を理解する上で不可欠であり、分子レベルでの研究成果を個体レベルに応用する上で 橋渡しとなる重要なステージでもあります。また、細胞系の反応から本質的に生体内の反応を予測すことが可能であることから、セルベー スアッセイは創薬プログラムでも多く導入されています。多様な細胞株の確立や培養技術の発達により、細胞を用いたアッセイ系は比較 的容易になり、動物個体を用いた実験手法に比べて処理能力や操作性にも優れます。また、近年ではより生体の反応に近い細胞として 初代培養細胞や患者由来の疾患 iPS 細胞、3 次元細胞 / マイクロティシュが用いられるようになり、より繊細で高感度なアッセイ系が望 まれています。プロメガでは、これらバイオアッセイに最適なルシフェラーゼによる生物発光を中心とした高感度で簡便なアッセイ試薬 を開発すると同時に、より生物学的に有意な情報が得られる様々なシステム構築を目指しています。 1 細胞内在マーカーの測定：細胞に内在する酵素や代謝物などのバイオマーカーを測定することで細胞の生死から細胞死のメカニズム、 さらには細胞状態を調べることができます。LDH や DCP は死細胞（細胞毒性試験：9, 11 ページ参照）、ATP や LCP は生存細胞（細 胞生存試験：6, 11, 13 ページ参照）を、カスパーゼはアポトーシス・パイロトーシスなど細胞死のメカニズム（15 ページ参照）を、 GSH・H₂O₂ などは酸化ストレスの指標（18 ページ参照）として測定することができます。トリグリセリド、コレステロール、グルコー ス、グルタミン、乳酸などのエネルギー代謝関連マーカーはがんや糖尿病などの研究で注目されており、プロメガの発光アッセイ試 薬として発売されました（20 ページ参照）。 2 バイオセンサー導入による細胞内情報の測定：測定・検出が容易な外来性タンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入して、細胞 内事象の変化をその発現量あるいは動態として検知することができます。レポーター遺伝子の上流に様々な細胞内シグナルに対応 する応答配列を付加したり、標的タンパク質をコードする遺伝子にレポーター遺伝子を融合させることでより詳細な細胞内現象を捕 えることができます（オートファジー 23 ページ、cAMP 25 ページ参照）。 2 よ り高次元な細胞実験のために より生体に近い生理現象を再現するために初代培養細胞、幹細 胞などが用いられていますが、株化細胞のように培養・調製が 容易ではなく、比較的少数の細胞で実験せざるをえません。プ ロメガのアッセイ試薬はより少数の細胞からでも多くの実験情 報を得るための技術開発に取り組んでいます。 感度の高さと容易な操作性によりプロメガのアッセイシステムは 発光法を採用していますが、蛍光法は感度は劣るものの発光法 とは発光機構が異なり、波長の違いによりシグナルを分けるこ とができるため、同一サンプルより複数項目についてのマルチ アッセイに適しています。弊社は安定性や頑健性に関する特殊 な発光技術を有しており、他のアッセイケミストリーとの相性に 優れているため発光法と蛍光法を組み合わせたマルチアッセイ を容易にデザインすることができます。同一のサンプルからよ り多くの情報を少スケール（>96 ウェル形式）で取得することが できるため非常に効率的な測定方法です。 従来の細胞アッセイで経時的な情報を得るためには測定するタ イムポイントごとにサンプルウェルを準備して測定を行うため、 より多くの培養コストがかかっていました。プロメガのリアルタ イムアッセイ（RealTime-Glo™, CellTox® Green など）では 1 つの サンプルウェルで細胞応答を継時的に追跡できるため時間軸を 加えたより高次な情報を取得することができます。また、3 次 元培養細胞に対応するために細胞溶解力を高めた CellTiter-Glo® 3D やプロトコルを改変した Caspase-Glo® 3/7 3D Assay も開発 されました。 3.5E+04 2.0E+06 1.8E+06 1.6E+06 1.4E+06 1.2E+06 1.0E+06 8.0E+05 6.0E+05 4.0E+05 2.0E+05 0.0E+00 3.0E+04 2.5E+04 2.0E+04 1.5E+04 1.0E+04 5.0E+03 0.0E+00 0 10 20 30 40 50 Relative light units（RLUs）, CellTiter-Glo® Relative light units（RLUs）, P450-Glo™ ［Rifampicin］,µM P450-Glo CYP3A4 induction Celltiter-Glo® 3D-viability ヒト肝臓マイクロティッシュを用いた P450 3A4 活性と細胞生存性の測定 リファンピシンで 48 時間処理した後、培地上澄から P450-Glo™ Assay（非溶解法）を 用いて CYP 3A4 を検出した。さらに、CellTiter-Glo® 3D を用いて残りの細胞の細胞生存 性を測定した。 12464MA 試薬を混和した培地を 1度 分注するだけ！ 1つのサンプルセットを 各タイムポイントで 繰り返しアッセイ。 アッセイは各サンプルに2種類の試薬を分注。 呈色反応は1-4時間。 MTTアッセイ（発色法）による 経時的アッセイ RealTime-Glo™ による 経時的アッセイ Incubate Incubate t=1 t=2 t=3 t=1, 2, 3… タイムポイントごとにサンプルを準備 RealTime-Glo™ と従来法による経時アッセイ 3 イントロダクション 製品名 マーカー 検出シグナル 検出までの時間 感度 マルチ 3D リアル タイム ページ 細胞生存性 RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay 還元能 発光 0 分 （最長 72 時間までの リアルタイムアッセイ） 10 分間（エンドポイント） 細胞 30 個 ◎ ◎ ◎ 8 CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay ATP（エネルギー合成能） 発光 30 分間 3 次元培養細胞 （< 700 μ m） ◎ ◎ － 7 CellTiter-Glo® Assay 2.0 ATP（エネルギー合成能） 発光 10 分間 細胞 10 個 * ◎ ○ － 6 CellTiter-Fluor™ Assay LCP 蛍光（400Ex/505Em） 0.5 ～ 3 時間 細胞 40 個 ◎ ○ － 11 CellTiter-Blue® Assay 還元能 蛍光（560Ex/590Em） または発色 (570nm) 1 ～ 4 時間 細胞 50 個 * ○ － － 13 CellTiter-96® AQueous One Solution Assay 還元能 発色（490nm） 1 ～ 4 時間 細胞 800 個 － － － 13 細胞毒性 LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay LDH 発光 約 1 時間 細胞 10 個 ◎ ◎ △ 12 CellTox™ Green Cytotoxicity Assay DNA 蛍光（513Ex/532Em） 15 分～ 72 時間 細胞 200 個 ◎ ◎ ◎ 9 CytoTox-Glo™ Assay DCP 発光 15 分間 細胞 10 個 ○ － － 11 CytoTox-Fluor™ Assay DCP 蛍光（485Ex/520Em） 0.5 ～ 3 時間 細胞 10 個 ○ ○ － 11 CytoTox-ONE™ Assay LDH 蛍光（560Ex/590Em） 10 分間 細胞 200 個 ○ － － 13 CytoTox 96® Cytotoxicity Assay LDH 発色（490nm） 30 分間 細胞 1000 個 － － － 13 MultiTox-Fluor Assay LCP および DCP 蛍光（400Ex/505Em） （485Ex/520Em） 0.5 ～ 3 時間 生細胞 40 個 / 死細胞 10 個 ○ － － 11 MultiTox-Glo Assay LCP および DCP 蛍光（400Ex/505Em）/ 発光 30 分間 生細胞 40 個 / 死細胞 10 個 ○ － － 11 ApoLive-Glo™ Multiplex Assay LCP および Caspase-3/7 蛍光（400Ex/505Em）/ 発光 30 分間 生細胞 40 個 / アポトーシス細胞 20 個 ○ － － 17 ApoTox-Glo™ Triplex Assay LCP、DCP および Caspase-3/7 蛍光（400Ex/505Em） （485Ex/520Em）/ 発 光 1 時間 生細胞 40 個 / 死細胞 10 個 / アポトーシス細胞 20 個 ○ － － 17 Mitochondrial ToxGlo™ Assay DCP および ATP 蛍光（485Ex/520Em）/ 発光 30 分間 － ○ － － 14 アポトーシス / パイロトーシス RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Assay ホスファジチルセリンの 転移 発光 0 分 （48 時間程度までの リアルタイムアッセイ） － ◎ ◎ ◎ 15 Caspase-Glo® Assay Caspase-3/7, 8, 9 発光 30 分間～ 2 時間 細胞 20 個（3/7）* 細胞 1000 個（8） 細胞 1500 個（9） ◎ ◎ （注） － 16 Apo-ONE® Caspase-3/7 Assay Caspase-3/7 蛍光（499Ex/521Em） 1 ～ 18 時間 細胞 200 個 * ◎ ◎ － 16 Caspase-Glo® 1 Inammasome Assay Caspase-1 （インフラマソーム活性） 発光 1 時間 細胞 10 個 ◎ － － 17 酸化ストレス GSH/GSSG-Glo™ Assay 総グルタチオン /GSSG 発光 1 時間 細胞 300 個 * ◎ － － 18 GSH-Glo™ Assay GSH 発光 1 時間 細胞 300 個 * ◎ ◎ － 18 ROS-Glo™ H₂O₂ Assay H₂O₂（活性酸素） 発光 2 時間 ＜細胞 100 個 ◎ － － 19 注：3D 培養細胞用マニュアルが用意された Caspase-Glo® 3/7 3D Assay　が新発売 細 胞ベースアッセイ選択ガイド NEW 4 製品名 マーカー 検出シグナル 検出までの時間 感度 マルチ 3D リアル タイム ページ エネルギー代謝 NAD/NADH-Glo™ Assay NAD/NADH 発光 1 時間 細胞（10nM ～ 400nM： NAD+ または NADH） ◎ ◎ － 20 NADP/NADPH-Glo™-Glo™ Assay NADP/NADPH 発光 1 時間 細胞（10nM ～ 400nM： NADP+ または NADPH） ◎ ◎ － 20 Glucose Uptake-Glo™ Assay グルコース取込み (2- デ オキシグルコース -6- リン酸 [2DG6P]) 発光 約 1 時間 － ◎ ◎ － 21 Glucose-Glo™ Assay グルコース 発光 約 1 時間 － ◎ ◎ ◎ 21 Lactate-Glo™ Assay 乳酸 発光 約 1 時間 － ◎ ◎ ◎ 21 Glutamate-Glo™ Assay グルタミン酸 発光 約 1 時間 － ◎ ◎ ◎ 21 Glutamine/Glutamate-Glo™ Assay グルタミン / グルタミン酸 発光 約 1 時間 － ◎ ◎ ◎ 21 Triglyceride-Glo™ Assay トリグリセリド 発光 1-2 時間 1-80µM グリセロール ◎ ◎ △ 22 Glycerol-Glo™ Assay グリセロール 発光 1-2 時間 1-80µM グリセロール ◎ ◎ △ 22 CholesterolCholesterol Ester-Glo™ Assay コレステロール 発光 1-2 時間 1-80µM コレステロール ◎ ◎ △ 22 タンパク質分解 Autophagy LC3 HiBiT Reporter Assay 導入遺伝子から発現する LC3 融合タンパク質センサー 発光 － － ◎ ◎ － 23 Proteasome-Glo™ Cell-Based Assays Proteasome （chymotrypsin-like, trypsin-like, caspase-like activities） 発光 10 ～ 15 分間 500 個（付着細胞） － － － 24 シグナル伝達 cAMP-Glo™ Assay cAMP 発光 － － ○ － － 25 Glosensor™ cAMP Assay 導入遺伝子から発現する バイオセンサー 発光 － － ○ － ◎ 26 エピジェネティクス HDAC-Glo™ Assay HDAC（class I & II） 発光 15 ～ 45 分間 蛍光法の 10 ～ 100 倍 ○ － － 27 HDAC-Glo™ Class IIa Assay HDAC（class IIa） 発光 20 分間 蛍光法の 100 倍 ○ － － 27 HDAC-Glo™ 2 Assay HDAC （isozyme 2） 発光 20 分間 蛍光法の 100 倍 ○ － － 27 薬剤代謝 P450-Glo™ Assays CYP1A2, 3A4,1A1, 2C9, 4A 発光 1 ～ 6 時間 高 ○ ◎ － 28 マルチ ：他のアッセイと組み合わせたマルチアッセイの適応性。 3D ：3 次元細胞を用いたアッセイへの適応性。 リアルタイム ：継時的なリアルタイム測定への適応性。 LCP: Live cell Protease, DCP: Dead Live Cell * 384 ウェル LCP: Live cell Protease, DCP: Dead Live Cell * 384 ウェル NEW NEW NEW 5 イントロダクション 細 胞生存性エンドポイントアッセイのゴールドスタンダード CellTiter-Glo® Assay（発光：細胞生存性） 超高感度な細胞内 ATP 測定をベースとした細胞生存試験！“高安定性タイプ ”と ”3Ｄ細胞適応タイプ”が登場！ 細胞生存性を測定する上でより安定性が高く、高精度なマーカーの選択が重要となります。ATP （アデノシン三リン酸）は代謝活性のあ る全ての細胞に存在し、その濃度は細胞がネクローシスあるいはアポトーシスを起こしたときに急速に減少するため、細胞障害、細胞 増殖抑制あるいは細胞増殖効果の優れたマーカーとして広く用いられています。プロメガの CellTiter-Glo® シリーズの細胞生存試験は、 代謝活性のある細胞に由来するATPを定量することで培養中の生存細胞数を測定する細胞増殖・毒性システムです。マルチプレートのアッ セイ用にデザインされており、1 種類の試薬を加えるだけなので自動化されたハイスループットスクリーニング（HTS）にも最適です。優 れた感度を示すため、発色法では困難な浮遊細胞・三次元培養細胞を用いる場合に威力を発揮します。CellTiter-Glo® シリーズに保存安 定性が向上してより使いやすくなった CellTiter-Glo® 2.0 と３次元培養細胞用に溶解力が向上した CellTiter-Glo® 3D（次ページ参照）が加わ りました。 • ホモジニアス：ワン - ショットタイプ（添加→混合→測定）なので他の ATP 測定システムに比べプレートのハンドリングが最小限。 • 迅　速：試薬添加 10 分後にデーターが得られます。 • 高感度：標準的な発色または蛍光定量法に較べ優れた感度（細胞 10 個［384 プレート］、細胞 50 個［96 プレート］を検出）。 • 正　確：発色法より正確な定量性 • 長時間発光：発光が非常に安定（CellTiter-Glo® シリーズの比較表 次ページ参照）。 • 試薬安定性：溶液として供給される CellTiter-Glo® 2.0 は冷蔵庫（4℃）で 2 ヵ月、室温（22℃）でも1 週間安定（＞ 85％活性保持） • 応用性：様々なマルチプレートに適応し、ルミノメーターあるいは CCD カメラで測定 Luminescence (RLU) Cells per Well 0 100 200 300 400 0 10 20 0 200 400 600 800 1,000 1,200 1,400 1,600 1,800 0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 3171MB04_1A 細胞数と発光量の相関関係 CellTiter-Glo® Assay で測定した場合、発光量と細胞数には直接的な相関 関係が認められる。 CellTiter-Glo® 2.0 Reagent の優れた安定性 従来品と異なり CellTiter-Glo® 2.0 Reagent は 22℃で保存しても 1 週間 >85% 以上の活性を保持した。 4146MA05_3A 0 1 3 10 1 3 10 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Relative Values (Percent) Cell Number (x 103) Absorbance Luminescence 3T3 Cells A-12 Cells CellTiter-Glo® Assay と従来法との比較 従来法は細胞内酵素によりテトラゾリウム塩 WST-1 から変換したホルマザン産物を測定。 NIH3T3 および A-12（PARP-1 欠損）を表示量 96 ウェルプレートに播種した（100µl）。 CellTiter-Glo® Reagent （100µl）または WST-1（10 µl）を添加、混和し、インキュベーション した後に発光または吸光度を測定した。各測定は 4 ウェルずつ行い、細胞を含まないバッ クグランド値は差し引かずに計算した。 製品名 サイズ カタログ番号 細胞生存性試験（発光・ATP） CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay 10ml G7570 10 × 10ml G7571 100ml G7572 10 × 100ml G7573 CellTiter-Glo® 2.0 Assay 10ml G9241 100ml G9242 500ml G9243 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 0 7 14 21 28 Luminescence (RLU) Time at 22°C (days) CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay CellTiter-Glo® 2.0 Assay 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 >85% activity remaining after 7 days at 22℃ マルチ 6 0 0.4×107 0.2×107 0.6×107 0.8×107 1.0×107 1.2×107 0 0 200 400 600 800 0.2×107 0.4×107 0.6×107 0.8×107 1.0×107 1.2×107 1.4×107 1.6×107 1.8×107 CellTiter-Glo® 3D Luminescence（RLU） Nano-Glo® Luminescence（RLU） Spheroid Diameter（µm） Nano-Glo® Luciferase Assay CellTiter-Glo® 3D Assay CellTiter-Glo® 3D Luminescence（RLU） Nano-Glo® Luminescence（RLU） 0 200 400 600 800 Spheroid Diameter（µm） Nano-Glo® Luciferase Assay CellTiter-Glo® 3D Assay 0 0.4×107 0.8×107 1.2×107 1.6×107 2.0×107 0 0.5×105 1.0×105 1.5×105 2.0×105 2.5×105 A. B. CellTiter-Glo® -3D Cell Viability Assay （発光：細胞生存性） 細胞溶解力を強化した 3 次元培養細胞用 細胞生存試験 通常の細胞増殖試験試薬は単層培養細胞用で細胞塊の中心まで試薬が届かないため、3 次元培養細胞の測定は困難です。CellTiterGlo®3D Cell Viability Assay は 3 次元培養細胞の生細胞数を ATP 量（代謝活性を有する細胞のマーカー）の測定に基づき測定するホモジニ アスなアッセイシステムです。3 次元培養細胞で作製した微小組織用にデザインされており、細胞溶解能力が強化されています。溶液タ イプとして供給されるため、従来品のように調製時に凍結乾燥した基質をバッファーで溶解する必要もありません。CellTiter-Glo®3D Assay はハンギングドロッププレート、超低接着表面プレート、Matrigel™ コーティングプレート、アガロースコーティングプレート、メ チルセルロース懸濁培養、Alvetex®プレートで得られた 3 次元細胞での実績を有しています。標準的な ATP アッセイで使用されるネイティ ブのホタルルシフェラーゼよりも安定性が高く、界面活性剤や pH などの影響を受けにくいプロメガの Ultra-Glo™ ルシフェラーゼを使用 することにより溶解力を高めた 3 次元培養細胞対応の CellTiter-Glo® 3D が完成しました。 他社との細胞溶解力の違い HCT116 大腸がんスフェロイ ドを作製し、パネル A. 全て のサンプルに CellTiter-Glo® 3D または他社 ATP 発光測 定試薬を等量加え、5 分間 撹拌し、30 分後に測定した。 パネル B, C. 2 倍濃度の CellTox™Green Dye （細胞非透過性 DNA 結合蛍光色素）をあらかじめ CellTiter-Glo® 3D Reagent（パネル C, 左）および他社 ATP 発光測定試薬（パネル C, 右）に添加し たものを加え、5 分間撹拌し、30 分後に測定した。パネル C. 細胞が溶解した部分 は緑色に染色された（イメージ内のバーの長さは 200 µm に相当）。 従来品とのスフェロイドからの ATP 検出比較 HCT116 細胞を InSphero GravityPLUS™ 96-well hanging-drop platform に播種し、表示サ イズのマイクロティッシュを形成するまで 4 日間培養し、CellTiter-Glo® または CellTiterGlo® 3D を用いて測定した。検出した ATP 量は ATP スタンダードより算出した。 C. 12330TA 12192MA CellTox™ Green Dye (RFU) 0 6,000 12,000 18,000 24,000 A. 0 2 4 6 8 10 12 B. 0 2 4 6 8 10 12 CellTiter-Glo® 3D (RLU x 106 ) HCT116 Cells Seeded CellTiter-Glo® 3D ATPlite 1Step Luminescence (RLU x 106 ) 0 3,000 6,000 9,000 製品名 サイズ カタログ番号 細胞生存性試験（発光・ATP） CellTiter-Glo® 3D Cell Assay 10ml G9681 10 × 10ml G9682 100ml G9683 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 スフェロイドの 直径 (µm) ATP 回収（pmol/microtissue） CellTiter-Glo® （従来品） CellTiter-Glo® 3D 比率 188 16 ± 4 17 ± 4 1.10 386 79 ± 3 94 ± 11 1.19 459 103 ± 2 126 ± 11 1.22 565 127 ± 3 178 ± 17 1.40 CellTiter-Glo® 2.0 CellTiter-Glo® 3D CellTiter-Glo® （従来品） ◎ ○ ○ 保存性 4℃、2 ヵ月（＞ 85％） 4℃、3.5 日（＞ 90％） 4℃、3.5 日（＞ 90％） 室温、7 日（＞ 85％） 室温、12 時間（＞ 90％） 室温、12 時間（＞ 90％） 操作性 ◎ ◎ △ アプリケーション 単層培養細胞 3 次元培養細胞（< 700 µm） 単層培養細胞 溶解力 ○ ◎ ○ 発光半減期 ＞ 3 hr ＞ 3 hr ＞ 5 hr 発光レベル ★★★ ★★★ ★★ 所要時間 * 10 分以内 30 分以内（撹拌 5 分 + 静置 25 分） 10 分以内 製品形態 1 液 1 液 基質 + バッファー * 試薬添加から測定開始までの時間 CellTiter-Glo® 2.0 Reagent 室温または 4℃保存 （4℃保存の場合は室温に平衡化） “添加 - 混和 - 測定 ” CellTiter-Glo® Reagent -20℃保存 -20℃保存 4℃ /-20℃ 保存 融解後、室温に平衡化 “添加 - 混和 - 測定 ” 基質 混和（室温） CellTiter-Glo バッファー ® 3D Reagent -20℃保存 融解後、室温に平衡化 “添加 - 混和 - 測定 ” マイクロティッシュにおける HIF-1 プロモーター活性の測定 HIF-1 プロモーターにより駆動する NanoLuc® ルシフェラーゼ遺伝子を含む HCT116 細胞を 4 日間 InSphero GravityPLUS™ 3D 細胞培養システムで培養した マイクロテッシュ（約 200-700 µm）を調製し、NanoGlo® または CellTiter-Glo® 3D でレポーター活性および細胞生存性を測定した。マイクロティッシュの直径 が大きくなるほど酸化ストレスが増加した。 A. B. マルチ 3D 7 細胞生存性試験（ATP［発光］） リ アルタイムの細胞生存性 & 毒性試験 RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay （発光：細胞生存性） 従来法（MTT/WST）と同じ細胞の還元能を指標にした高感度リアルタイムアッセイ RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay は細胞の還元力（代謝［MT］）を測定することにより培養中の生細胞数をリアルタイムに測定する ための細胞非溶解性の発光ホモジニアスアッセイ法です。アッセイでは培養細胞に NanoLuc® ルシフェラーゼと細胞内に透過する NanoLuc® 基質前駆体を添加します。生存細胞はこの特殊な前駆体基質を還元し、NanoLuc® ルシフェラーゼの基質を生成します。この 基質は細胞内から培地に拡散し、NanoLuc® ルシフェラーゼにより迅速に消費され発光シグナルを生じます。このシグナルは生存細胞数 に相関するため、細胞毒性研究に理想的です。試薬は最大 72 時間は安定で細胞への毒性もありません。細胞の洗浄、培地の除去、そ の他の試薬を添加する必要もありません。このアッセイは細胞溶解が不要で、同じウェルを長時間にわたってモニタリングすることがで きます。これにより、必要な細胞数を抑え、細胞培養、下流のアプリケーション（マルチプレックスアッセイや核酸の分析）にかかるコ ストを低減することができます。また 3 次元培養細胞でのアッセイにも利用できます。 • リアルタイムな細胞生存試験：毒性の開始点の決定、長時間におよぶ効力 [potency]（有効性 [efcacy] に対して）の分析、異なる細胞 増殖の分析を行うための簡便なプレートベースでの細胞生存性リアルタイムモニタリング。 • 優れた感度：他の蛍光法 / 発色法に比べ、優れたシグナル / バックグラウンド比および高い感度が短時間に得られます。 • 柔軟なアッセイ：細胞播種時またはテスト化合物添加時、あるいは測定したい時点で試薬を加えるだけ。エンドポイントアッセイも可能。 • 細胞非溶解性：細胞溶解を伴わないため、特殊なフィルターを用いずに細胞を他の発光 / 蛍光アッセイとのマルチアッセイに使用したり、 その他の様々なアプリケーションに細胞を用いることが可能。これは少ないサンプルより多くのデータポイントでより多くの情報が得られ ることを意味します。 • 確立された細胞生存性マーカーを測定：細胞の還元力を指標にしたアッセイは細胞生存性の代謝マーカーとして長年の信頼を得て います。 • 自動化に対応：アッセイは自動化、ハイスループットに対応しており、反応はスケール変更自在で、96、384、1536 ウェルプレートの 低容量にも対応。 Hours post-treatment CellTox™ Green Cytotoxicity Assay Hours post-treament RealTime-Glo™ Cell Viability Assay A Luminescence (RLU) 0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Etoposide dilution series No treatment control Fluorescence (RFU) B 15,000 20,000 25,000 30,000 35,000 40,000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 No treatment control Etoposide dilution series 同一プレート上での細胞生存性と 細胞毒性のリアルタイムアッセイ MCF7 細胞（500 個 / ウェル）を RealTimeGlo™ MT Cell Viability Assay および CellTox™ Green Cytotoxicity Assay Reagents を含む 培地に播種しエトポシドで処理した。細 胞生存性（発光法、パネル A）および細 胞毒性（蛍光法、パネル B）について同じ サンプルウェルを 1 時間おきに 72 時間測 定した。エトポシドによる細胞還元能の 低下（生存性）が、細胞障害性（毒性）より も先に検出された。 細胞生存試験後の自動精製 RNA の収量 細胞の生存性を RealTime-Glo®、CellTiter-Glo® （2.0）で 測定した後、Maxwell® RSC を用いて Total RNA を精製した。細胞非破壊アッセイである RealTime-Glo® は細胞破壊して測定する CellTiter-Glo® に比べ多くの RNA が得られた。 スフェロイドを用いた RealTime-Glo™ と CellTiter-Glo® 3D による細胞生存試験 結腸がんスフェロイド（直径 522 ± 4 µm）は 4,000 個の細胞を播いた 96 ウェルの GravityPLUS™ ハンギングドロッププレート（InSphero AG）で 4 日かけて調製した。表示 濃度のドキソルビシンで処理した後、RealTime-Glo™ Reagent をサンプルセットに添加し て 48 時間までの異なるタイムポイントで細胞生存性をモニタリングした。異なるサンプ ルセットでは 48 時間後に CellTiter-Glo® 3D Reagent を添加した。グラフではドキソルビ シン処理細胞とビークルコントロールの細胞生存性の倍率変化示し、GraphPad Prism® ソフトウエア（ver 5.03.）を用いて EC₅₀ 値（µM）決定した。 12467MA EC 8.77 2.65 1.09 1.50 50 Value （µM） RealTime-Glo™ Assay at 8 hours RealTime-Glo™ Assay at 24 hours RealTime-Glo™ Assay at 48 hours CellTiter-Glo® Assay at 48 hours –2 –1 0 1 2 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 log[doxorubicin], µM RealTime-Glo™ Cell Viability Assay, 8h RealTime-Glo™ Cell Viability Assay, 24h RealTime-Glo™ Cell Viability Assay, 48h CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay, 48h Change in Cell Viability Compared to Vehicle Control （fold） 12467MA EC 8.77 2.65 1.09 1.50 50 Value （µM） RealTime-Glo™ Assay at 8 hours RealTime-Glo™ Assay at 24 hours RealTime-Glo™ Assay at 48 hours CellTiter-Glo® Assay at 48 hours –2 –1 0 1 2 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 log[doxorubicin], µM RealTime-Glo™ Cell Viability Assay, 8h RealTime-Glo™ Cell Viability Assay, 24h RealTime-Glo™ Cell Viability Assay, 48h CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay, 48h Change in Cell Viability Compared to Vehicle Control （fold） 製品名 サイズ カタログ番号 細胞生存性試験（発光・還元能） RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay 100 回分 G9711 10 × 100 回分 G9712 1000 回分 G9713 ※表示のサイズは 96 ウェルプレートの場合。 Amplifiable RNA Yield (ng) CellTiter-Glo® CellTiter-Glo® 2.0 RealTime-Glo™ MT PBS control 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 マルチ 3D リアルタイム 8 細胞生存性試験（還元能［発光］） CellTox™ Green Cytotoxicity Assay （蛍光 : 細胞毒性） 最も簡便な細胞毒性試験。長時間の経時変化も追跡可能！ 細胞毒性を検出する際、細胞死のマーカーの選択が重要となります。従来の細胞毒性試験においては、LDH や死細胞由来のプロテアー ゼなどの酵素活性をマーカーとしてきました。これら酵素ベースの細胞毒性キットの問題点として、細胞死マーカーとしての酵素が長時 間にわたる培養により分解してしまうという点がありました。プロメガではこの問題点を克服するため、細胞膜非透過性の新規な DNA 結合型蛍光色素を利用したアッセイキット CellTox™ Green Cytotoxicity Assay を開発しました。CellTox™ Green Cytotoxicity Assay は細胞膜 非透過性の DNA 結合型蛍光色素 CellTox™ Green Dye を用いて、生細胞から排出され、死細胞由来の DNA に選択的に結合し、細胞膜障 害性を検出します。CellTox™ Green Dye は細胞に対して毒性を示さず、薬剤暴露後 72 時間後でも安定したシグナルを維持するため、経 時的測定あるいは長時間の薬剤暴露後のエンドポイント測定による毒性評価に最適です。 オプション1 色素を予め 培養細胞に添加 （0ステップ） オプション2 披検化合物に予め 色素を添加 （0ステップ） インキュ ベーション 検出 11203MA オプション3 エンドポイントアッセイ （1ステップ） Log 10935MA [bortezomib], M Fluorescence (RFU) Luminescence (RLU) –10 –9 –8 –7 –6 –5 6,000 8,000 10,000 12,000 14,000 0 100,000 200,000 300,000 400,000 CellTox™ Green Assay CellTiter-Glo® Assay 11114MA 30,000 20,000 10,000 0 4hr 24hr 48hr 72hr -9 -8 -7 -6 -5 Log [Bortezomib] Fluorescence (RFU) 3 つのプロトコルから選べます！ 予め培養細胞や化合物に試薬を溶解させる 0 ステップアッセイで経時的に観察が可 能。最後に試薬を加える1 ステップのエンドポイントアッセイ。 マルチアッセイによる細胞健全性の相補的な測定 K562 細胞をボルテゾミブ処理 48 時間後に CellTox™ Green Reagent（細胞毒 性）、CellTiter-Glo® Reagent（細胞生存性）で測定した。どちらども同様の EC₅₀ 値を示した。 CellTox™ Green による経時的な分析 K562 細胞のボルテゾミブ処理 4 ～ 72 時間後の細胞毒性 10887MA 生細胞 死細胞 蛍光 → 低 蛍光 → 高 蛍光色素 DNA DNAと結合し蛍光レベルが増加 CellTox™ Green の測定原理 細胞非透過性の蛍光色素が死細胞から漏出した DNA に結合し蛍光強度が増加 • 簡　便：0 ステップ（細胞播種前あるいは薬剤含有培地に Dye を直接加える）で、試薬の分注ステップを省略できる。 • 低毒性：薬剤暴露後 0-72 時間の長時間の経時的測定が可能。 • マルチアッセイ：細胞生存性試験、アポトーシス試験などとの マルチアッセイが可能。 • 様々なサンプル種に対応：接着細胞、浮遊細胞、3D 培養、 バクテリアなど 製品名 サイズ カタログ番号 細胞毒性試験（蛍光・DNA） CellTox™ Green Cytotoxicity Assay 10ml G8741 50ml G8742 100ml G8743 CellTox™ Green Express Cytotoxicity Assay （Dye） 200µl G8731 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 マルチ 3D リアルタイム 9 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 細胞毒性試験（漏出 DNA［蛍光］） 新 規なプロテアーゼマーカーを採用した細胞生存 & 細胞毒性試験 新規プロテアーゼマーカー測定試薬は細胞にやさしくマルチアッセイにも最適 プロメガでは細胞毒性あるいは細胞生存性にリンクする恒常的プロテアーゼ活性をペプチドベースのスクリーニングにより発見しまし た。これらのプロテアーゼ活性は特異的な配列を有するペプチド基質を用いた発光法あるいは蛍光法で検出することが容易であり、し かもアッセイ系を比較的容易に設計できるため、複数のパラメーターを同時に測定するマルチアッセイに最適です。 生細胞プロテアーゼ（LCP：Live Cell Protease）は細胞透過性のペプチド基質（蛍光 :GF-AFC）を用いて測定します。この生細胞プロテアー ゼマーカーは、細胞膜の完全性が失われて周囲の培地に漏出すると不活性化され、生細胞で起こるような反応は見られなくなります。 一方、死細胞プロテアーゼ（DCP：Dead Cell Protease）マーカーは細胞膜の完全性が失われた細胞から漏出して初めて測定されます。こ の活性は細胞非透過性のペプチド基質（蛍光 :AAF-R110 または発光 :AAF-Glo™）で測定します。 これらの基質を採用した新しい細胞増殖試験、細胞毒性試験キットを開発し、細胞死のメカニズムを解析するためにこれらのシステム を組み合せたマルチアッセイシステムを揃えました。また、プロメガの発光アッセイや波長の区別が可能な他の蛍光アッセイと併用する こともできます（カスパーゼアッセイ、レポーターアッセイ、他のバイオマーカーを用いた生存性試験など）。 生細胞 死細胞 5847MA 生プロテアーゼ （活性化） GF GF AAF 死細胞用 発光/蛍光基質 (細胞非透過性) 生細胞用 蛍光基質 (細胞透過性) 生プロテアーゼ （不活性化） 死プロテアーゼ GFGF AAF GF SIGNAL SIGNAL 新しい細胞生存性・毒性試験の測定原理 GF- 基質は生細胞に透過し、“生細胞”プロテアーゼ（LCP）による切断でシグナルを 生じる。AAF- 基質は生細胞に透過できず、漏出した“細胞死”由来のプロテアー ゼ （DCP）によりシグナルを生じる。 LDH Release Fluorescence (RFU) 0 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000 bis-AAF-R110 Fluorescence (RFU) r2 = 0.9782 0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 Resorufin Fluorescence (RFU) 2,500 2,600 2,700 2,800 2,900 3,000 3,100 GF-AFC Fluorescence (RFU) r2 = 0.963 500 600 700 800 900 1,000 1,100 従来の細胞毒性試験、細胞生存性との相関性 上パネル . 死細胞の希釈系列サンプルからの CytoTox-Fluor™ Cytotoxicity Assay シグナルを LDH 放出アッセイ（CytoTox-ONE™ Assay）からの値に対してプロット した。下パネル . 生細胞の希釈系列サンプルからの CytoTox-Fluor™ Cytotoxicity Assay シグナルを Resorun を利用した NADH 還元能アッセイ（CellTiter-Blue® Cell Viability Assay）からの値に対してプロットした。 GF-AFC および MTT、レサズリンの毒性比較 Balb 3T3 細胞を各細胞生存試験用の発色 / 蛍光基質とともに 4 時間インキュベー ションした後、同一視野を観察した。MTT およびレサズリンでは 4 時間後に明らかな 細胞形態の変化が認められたが GF-AFC では変化はみとめられなかった。 0 hr GF-AFC MTT レサズリン 4 hr 10 6667MA 0 25 50 75 100 % Viable Cells % of Maximal Response Live Cell Response (GF-AFC Substrate) r2 = 0.9998 r 2 = 0.9998 Dead Cell Response (bis-AAF-R110 Substrate) 0 25 50 75 100 0 25 50 75 100 0 25 50 75 100 0 25 50 75 100 0 25 50 75 100 % Maximal Response % Viable Cells % Viable Cells Live-Cell Response (GF-AFC Substrate) Dead-Cell Response (AAF-Glo™ Substrate) r2 = 0.9982 r 2 = 0.9988 Live-Cell Response (AAF-Glo™ Substrate; Total–Dead) Dead-Cell Response (AAF-Glo™ Substrate) r2 = 0.9999 r2 = 0.9975 % of Maximal Response A. B. C. シングルアッセイ CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay （蛍光 : 細胞生存性） 蛍光基質（GF-AFC）を用いて細胞生存性を測定します。発光法をはじめ とする様々なアッセイ法との相性が良く、同一ウェル内で他の測定反応 と組み合せた連続マルチプレックスアッセイが行え、細胞数で補正され た正確な値を得ることができます。 CytoTox-Fluor™ Cytotoxicity Assay （蛍光 : 細胞毒性） 蛍 光 基 質（bis-AAF-R110） を 用 いて 細 胞 毒 性 を 測 定しま す。 発 光 アッセイやスペクトル が 識 別 で きる 他 の 蛍 光 アッセイ 法（ カス パーゼの活性化、レポーター遺伝子の発現、生存性試験）とのマルチアッ セイを想定してデザインされています。 CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay （発光 : 細胞毒性） 発光基質（AAF-Glo™）を用いて細胞毒性を測定します。非常に高感度 で従来の LDH アッセイと優れた相関性を示します。本製品に添付される 細胞溶解剤を加えることにより、各アッセイウェル内の総細胞数に応じ た発光シグナルを得ることもできます。そのため、この総細胞数の発光 値から死細胞の発光シグナルを差し引くことにより生存性を算出するこ ともできます。 デュアルアッセイ MultiTox-Glo Multiplex Cytotoxicity Assay （蛍光 – 発光 : 細胞生存性 – 細胞毒性） MultiTox-Fluor Multiplex Cytotoxicity Assay （蛍光 – 蛍光 : 細胞生存性 – 細胞毒性） 蛍光と発光あるいは蛍光波長の違いを利用して同じウェル内で細胞生存 性と細胞毒性を連続して測定することができます。1 つめのアッセイは蛍 光基質（GF-AFC）を利用して細胞生存性を測定します。2 つめのアッセイ ではそれそれ AAF-R110（MultiTox-Fluor Assay）または AAF-Glo™（MultiToxGlo Assay）を用いて細胞毒性を測定します。データのウェル間補正のた めの比率測定を行うことができ、2 つの独立した測定チャンネルを確保 することによりアッセイへの干渉を容易に認識することができます。 各プロテアーゼマーカーを組み合せたレシオメトリックな応答 Jurkat 細胞（100,000 cells/ml）を 2 つに分け、1 つに細胞毒性処理を施 し、もう1 つを未処理とした。2 つの細胞プールを様々な割合で混和し、 様々な細胞生存性を擬似的に再現した（0–100%）。CytoTox-Glo™, MultiTox-Fluor および MultiTox-Glo Assay を用いて測定した。得られた データを生細胞レスポンス、死細胞レスポンスを最大レスポンスに対 す る ％ として 補 正した。パネル A. MultiTox-Fluor Assay. パネル B. MultiTox-Glo Assay. パネル C. CytoTox-Glo™Assay （細胞溶解プロトコル）。 Signal to Noise Ratio 500 1,000 1,500 2,000 2,500 6802MA 0 0 2,500 5,000 7,500 10,000 Dead Cells/Well CytoTox-Glo™ Assay Fluorescent LDH Assay LDH 蛍光アッセイ法に比べ優れた CytoTox-Glo™ Assay の感度、ダイナミックレンジ 製品名 サイズ カタログ番号 細胞生存性・毒性試験（デュアルアッセイ） MultiTox-Glo Multiplex Cytotoxicity Assay 10ml G9270 5 × 10ml G9271 MultiTox-Fluor Multiplex Cytotoxicity Assay 10ml G9200 5 × 10ml G9201 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 製品名 サイズ カタログ番号 細胞生存性・毒性試験（シングルアッセイ） CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay 10ml G6080 5 × 10ml G6081 2 × 50ml G6082 CytoTox-Fluor™ Cytotoxicity Assay 10ml G9260 5 × 10ml G9261 2 × 50ml G9262 CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay 10ml G9290 5 × 10ml G9291 2 × 50ml G9292 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 11 細胞生存性＆毒性試験（プロテアーゼ［ 発光 & 蛍光］） 実 績のあるトラディショナルバイオマーカーによる 細胞生存 & 細胞毒性試験 ADCC 1,167,840 Effector + Target 407,150 Effector Cell 307,258 Target Cell 98,917 Medium 11,782 Luminescence (RLU) 1,400,000 1,200,000 1,000,000 600,000 400,000 800,000 200,000 0 RTX 3µg/ml 4 hours 4 hours log [RTX], µg/ml Luminescence (RLU) 6 hours –4 –3 –2 –1 0 1 2 × 106 1.5 × 106 1 × 106 5 × 105 0 EC50 0.08958 4 hours 0.09978 6 hours LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay（発光 : 細胞毒性） たった 2µl の培地より LDH を高感度に測定 LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay は細胞膜の損傷により培地に放出される乳酸脱水素酵素（LDH）をプレートベースで発光測定します。発光 による測定は発色法や蛍光法に比べて高感度な検出を可能にするため、少数の細胞（初代培養細胞や 3D 培養細胞を含む）から漏出す る LDH でも正確に検出することができます。 このアッセイでは処理後の各ウェルより極少量の培地を使用するだけなので、長時間にわたり同じウェル中のサンプルから より多くのデーターを取得できることができ、残った培地や細胞を利用して他の細胞ベースアッセイを行うこともできます。 • 極微量の培地より高感度に測定：培地 2-5 µl より高感度に LDH を定量でき、発色法・蛍光法に比べ高感度 • リアルタイムアッセイも可能：タイムポイントごとに培地を 分取して経時的モニタリング • マルチアッセイで効率的：残った細胞、培地は他の実験で 使用可能 • 3D 細胞 にも対応 log [Kadcyla], µg/ml Luminescence (RLU) –5 –4 –3 –2 –1 0 1 3 × 105 2 × 105 1 × 105 0 EC50 0.005767 0.009311 0.04597 0.01308 0.01722 6 hours 24 hours 48 hours 72 hours 96 hours 6 hours 24 hours 48 hours 72 hours 96 hours 抗体薬物複合体（ADC）による細胞死リアルタイムアッセイ カドサイラ ® （trastuzumab emtansine）を SKBR3 細胞に増量投与し最大 96 時間まで処 理し、384 ウェルプレートフォーマットで LDH-Glo™ アッセイを行った。 log [Doxorubicin], µM Luminescence (RLU) CellTiter-Glo® 3D Assay –2 –1 0 1 2 3.5 × 104 2.8 × 104 2.1 × 104 1.4 × 104 7 × 103 0 Luminescence (RLU) LDH-Glo™ Assay 1.4 × 106 7 × 105 1.05 × 106 3.5 × 105 0 48 ho 72 ho 72 ho Celr-Glo® 24 ho 3D 細胞毒性・生存性マルチアッセイ ドキソルビシンで処理した HCT116 スフェロイド（384 ウェルプレート：2,500 個 / ウェ ル）を 用いて LDH-Glo™ Assay（リアルタイム細胞毒性試験）と CellTiter-Glo® 3D（エン ドポイント細胞生存性試験）で解析した。 細胞刺激後の培地 2 ～ 5 µl を分取 培地を Storage Buffer で 希釈し、直ぐに測定 あるいは -20℃以下で保存 LDH Detection Reagent を 希釈サンプルと等量添加 30 ～ 60 分後に発光測定 アッセイプロトコル ADCC アッセイの例 エフェクター細胞（PBMC）とターゲット細胞（Daudi）を 20：1 の割合でプレート に播 種し、リツキシマブ（RTX）で 4 時 間 処 理した 後、培 地 2.5 µl を LDH Storage Buffer で希釈して 50 µl とし、半量をアッセイに使用した。エフェクター 細胞またはターゲット細胞からの発光シグナルは最低限で、RTX を加えた ADCC （エフェクター細胞 + ターゲット細胞 + RTX）で劇的にシグナルが増加した。 製品名 サイズ カタログ番号 細胞毒性試験（LDH） 発光法 LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay 10ml J2380 50ml J2381 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 200 ウェル分に相当。 マルチ 3D リアルタイム 12 製品名 サイズ カタログ番号 細胞毒性試験（LDH） 蛍光法 CytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay 200 ウェル分 G7890 1000 ウェル分 G7891 ※表示のサイズは 96 ウェルプレートの場合。 発色法 CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay 1000 ウェル分 G1780 ※表示のサイズは 96 ウェルプレートの場合。 製品名 サイズ カタログ番号 細胞生存試験（還元能） 蛍光法 CellTiter-Blue® Cell Viability Assay 20ml G8080 100ml G8081 10 × 100ml G8082 ※ 20ml は 96 ウェルプレートで 1000 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 発色法 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 200 ウェル分 G3582 1000 ウェル分 G3580 5000 ウェル分 G3581 ※表示のサイズは 96 ウェルプレートの場合。 CytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay （蛍光 : 細胞毒性） 細胞膜にダメージを受けた細胞から漏出された乳酸脱水素酵素 （LDH）を、レサズリン / ジアホラーゼ共役系を介して生成する レゾルフィンの蛍光として定量することができます。細胞質局在 分子の漏出を検出することにより、生存活性を失った細胞を測 定する方法は各種あり、広く用いられている手法です。用事調 製した CytoTox-ONE™ Reagent を細胞 / 培地を含む各ウェルに 添加し、10 分間インキュベートを行った後、Stop Solution を加え、 蛍光を測定（励起波長 560nm、蛍光波長 590nm）します。 CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay（発色 : 細胞毒性） 細胞上清に放出された LDH と 30 分間の酵素反応を行い、テトラ ゾリウム塩（INT）から変換された赤色フォルマザンを 490nmで 測定します。このアッセイは、エフェクター細胞によるターゲット 細胞の溶解や、細菌・ウィルス・タンパク質・化学物質などによる 細胞溶解など、細胞膜の完全性を測定する場合に使用します。 CellTiter-Blue® Cell Viability Assay （蛍光・発色 : 細胞生存性 ） 酸化還元色素であるレサズリンが生細胞により蛍光産物レゾル フィンに変換されることに基づいています。アッセイあたりのコ ストが非常に低く、コストパフォーマンスに優れます。発色法で も検出可能ですが、感度は蛍光検出が優れます。 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（発色 : 細胞生存性 ） 新しいテトラゾリウム化合物［3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-5- （3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium, inner salt（MTS）］と電子捕獲剤 phenazine ethosulfate（PES）が含 まれます。MTS との共存下で PES がより安定化するため、便利 な単一溶液にすることができました。他の MTT や INT のような テトラゾリウム化 合 物 と 比 較し、CellTiter 96® AQueous One Solution Assay は作業行程を短縮することができます。 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 0 .01 .04 .62 2.5 10 MTS Corrected Ab. 490nm ng/ml GM-CSF 16 12 8 4 0 .16 CPM (x 10 -3 ) [ 3 H]-Thy 2372MA08_8A GM-CSF により刺激された HT-2 細胞の増殖試験における [ 3 GM-CSF H]thymidine により刺激された 取り込み試験との比較 HT-2 細胞の増殖における CellTiter 96® AQueous One Solution と［³H］thymidine 取り込み試験と の比較 control lysed 0 10 20 30 40 50 Cells/Well (x 10–3) RFU 0 2,000 4,000 6,000 8,000 細胞数と蛍光強度における直線性 96 ウェルプレートに 2 倍希釈系列で L929 細胞を 添加し、Triton® X-100 で処理したものを“Lysed”、 PBS を添加したものを“Control”とした。 CytoTox-ONE™ を用いた細胞数と蛍光強度における直線性 96 ウェルプレートに 2 倍希釈系列で L929 細胞を添加し、Triton® X-100 で処理したものを“Lysed”、PBS を添加したものを“Control”とした。 13 細胞生存性＆毒性試験（LDH & 還元能［発色 & 蛍光］） Cytotoxicity Cytotoxicity Cytotoxicity Cytotoxicity ATP ATP ATP ATP 9955MD –7 –6 –5 0 50 100 150 Log [imipramine], M Percent Vehicle Control Percent Vehicle Control –7 –6 –5 –4 0 100 200 300 400 500 600 Log [antimycin], g/L –6 –5 –4 0 50 100 150 200 250 Log [digitonin], g/L Percent Vehicle Control –7 –6 –5 0 50 100 150 Percent Vehicle Control Log [CCCP], M ATPおよび細胞膜の完全性に 変化なし → ミトコンドリア毒性なし ATPおよび細胞膜の完全性が 協調的に低下 → プライマリーネクローシス 細胞膜の完全性に変化なく、 ATP低下 → ミトコンドリア毒性 ATPの枯渇にともなう 用量依存的な細胞膜完全性の低下 → ミトコンドリア毒性 ミ トコンドリア毒性を簡便に検出 Mitochondrial ToxGlo™ Assay マルチアッセイでミトコンドリア機能障害性と細胞毒性を一挙に測定！ Mitochondrial ToxGlo™ Assay は 2 種類の試薬を連続して添加するマルチアッセイケミストリーを採用したセルベースアッセイシステムで、 生体異物暴露による潜在的なミトコンドリア機能障害の予測に利用することができます。本アッセイでは細胞膜損傷に関するマーカーと 細胞内 ATP の 2 つのバイオマーカーを測定し、短時間暴露においてビークルコントロール細胞と比較します。まず最初にネクローシスに 関連した”死細胞プロテアーゼ活性”を測定するための蛍光ペプチド基質（bis-AAF-R110）を用いて細胞膜の完全性を判定します。bisAAF-R110 Substrate は生細胞の細胞膜を透過できないため生細胞ではシグナルを生じません。次に ATP detection reagent を加えて細胞を 溶解し、ATP 量に比例した発光シグナルを測定します。得られた 2 つのデータセットは、ミトコンドリアの機能障害あるいはミトコンド リアに関連しない細胞毒性メカニズムを反映したプロファイル作成に使用できます。 ミトコンドリア毒性の代表的なプロファイル K562 細胞（10,000 細胞 / ウェル）はグルコースフリー（ガラクトース添加） RPMI 培地で 2 時間段階希釈した化合物で処理した。 9954MA –12 –10 –8 –6 0 25 50 75 100 125 Log [Oligomycin], M Percent Vehicle Control Galactose ATP EC50 = 2.3nM Glucose ATP EC50 = ND Glucose Cytoxicity EC50 = ND Galactose Cytoxicity EC50 = ND ガラクトースまたはグルコース存在下における代表的な ミトコンドリア毒に対する応答 グルコース存在下で処理した細胞は生体エネルギーの要求性に従いグルコースに依存 し、ミトコンドリア毒に対して比較的無反応（Glucose ATP）。ガラクトース存在下で処 理した細胞は ATP 産生に酸化的リン酸化を利用しなければならず、ミトコンドリア毒 性に対する応答性が高くなった（Galactose ATP）。オリゴマイシン処理ではどちらの培 地組成でも細胞膜の完全性は変化しなかった（Glucose Cytoxicity および Galactose Cytoxicity）。表示のデータは 96- ウェルプレートフォーマットで１ウェルあたり 10,000 個の K562 細胞より得られたもので、細胞は２時間オリゴマイシンに暴露した。 製品名 サイズ カタログ番号 ミトコンドリア毒性試験 Mitochondrial ToxGlo™ Assay 10ml G8000 100ml G8001 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 14 ミトコンドリア毒性試験（ATP & プロテアーゼ［ 発光 & 蛍光］） ア ポトーシスおよび細胞死メカニズムを最も簡便に測定 リアルタイム - デュアルアッセイ RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Assay （発光 : ホスファチジルセリン） アポトーシスの進行をリアルタイムでモニタリング RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay はアポトーシスの過程で細胞膜の外側に露出されるホスファチジルセリン (PS) をリ アルタイムで測定することができます。本アッセイ試薬に含まれるアネキシン V - ルシフェラーゼ断片（LgBiT または SmBiT）融合タンパク 質が初期アポトーシスで細胞表面に現れる PS に結合すると発光シグナルが検出されます。また、本試薬には細胞膜の完全性が損なわれ ると細胞内の DNA に結合し蛍光シグナルを生じる色素も含まれます。発光と蛍光シグナルの組合わせとタイミングは、後期アポトーシス で起こる２次ネクローシスと他の細胞毒性イベントにより起こるネクローシスとを見分けるために利用することができます。このアッセイ は細胞を溶解せず、簡便な " 添加 - 測定 " だけの方法なので 1 つのアッセイウェルより複数回にわたり測定を行うことができます。何枚 ものプレート、複雑な工程、特殊な検出装置を必要とせずにアポトーシスをリアルタイムでモニタリングすることができます。定量には発 光と蛍光を検出できるマルチモードリーダーのみが必要です。 マルチ 3D リアルタイム 製品名 サイズ カタログ番号 Annexin V アッセイ（発光） RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay（アポトーシス & ネクローシス デュアルアッセイ） 100 回分 JA1011 1000 回分 JA1012 RealTime Glo™ Annexin V Apoptosis Assay （アポトーシス シングルアッセイ） 100 回分 JA1000 1000 回分 JA1001 ※ 100 回分は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル 分に相当。 • 簡単な測定プロトコル：Add to Measure の簡単プロトコル・最大 48 時間までの経時的なアッセイが可能。 • フローサイトメーター不要：発光測定と蛍光測定に対応したプレー トリーダーにて簡便に測定可能！Throughput も格段にアップ！ • 様々なサンプルでの応用例：通常の 2 次元培養サンプルに加え、 3次元培養サンプルや共培養アッセイ（CTLアッセイ）にも応用可能。 経時的なアポトーシス / ネクローシスアッセイ DLD-1 細胞を 400 ng/mL rhTRAIL（パネル A）、K562 細胞を 1.1 µM Bortezomib（パ ネル B）でそれぞれ処理してアポトーシスを誘導した。検出試薬を加えたタイ ミングを 0hr とし、各点線は Annexin V 検出試薬（発光：●）と DNA 結合試薬（蛍 光：□）のシグナルが検出され始めたタイミングを示す。 RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay の原理 初期アポトーシス NanoLuc® Luciferase PS は細胞膜の外層に転移 細胞膜はインタクトな状態 発光（RLU）あり 蛍光（RFU）なし 後期アポトーシス （2 次的ネクローシス） PS は細胞膜の内層および 外層に存在 細胞膜は損傷した状態 発光（RLU）あり 蛍光（RFU）あり SmBiT Necrosis Detection Reagent LgBiT 健全な細胞 ホスファチジルセリン（PS） PS は細胞膜の内層に限局 細胞膜はインタクトな状態 発光（RLU）なし 蛍光（RFU）なし アネキシン V アネキシン V RealTime-Glo™ Annexin V および 発光イメージングシステム LV200 を用いた発光 & 蛍光イメージング U2OS 細胞にスタウロスポリン（終濃度 1 µM）を添加し、アポトーシスを誘導した。 LV200（Olympus）にてイメージングを行い、Annexin V の発光（Blue）とネクローシス の蛍光（Green）の像を重ねあわせた。 ＜オリンパス社のご厚意によりデータ提供＞ www.promega.co.jp/movie/annexinv_sglcel/ フローサイトメトリーとの整合性 RealTime™ Glo Annexin V Assay とフローサイトメトリーの結果 Luminescence(RLU) Fluorescence(RFU) [bortezomib](µM) AF488-Anx V (green) Plot P02, gated on P01.R1 10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴ Green Fluorescence (GRN-HLog) Red Fluorescence (RED-HLog) 9.2% Apoptotic 3.2% Necrotic 11.7% Apoptotic 2.8% Necrotic 23.9% Apoptotic 4.7% Necrotic 47.7% Apoptotic 14.1% Necrotic Untreated ① 0.01 µM ① ② ③ ② 0.1 µM ③ 10 µM V = Viable A = Apoptotic N = Necrotic 7 - AAD (red) 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 50000 0 10000 20000 30000 40000 50000 0 10000 20000 30000 40000 10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴ Plot P02, gated on P01.R1 10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴ Green Fluorescence (GRN-HLog) Red Fluorescence (RED-HLog) 10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴ Plot P02, gated on P01.R1 10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴ Green Fluorescence (GRN-HLog) Red Fluorescence (RED-HLog) 10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴ Plot P02, gated on P01.R1 10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴ Green Fluorescence (GRN-HLog) Red Fluorescence (RED-HLog) 10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴ 本実験では K562 細胞を様々な濃度のボルテゾミブに 16 時間暴露した。 上パネル：細胞を採取、洗浄した後に Alexa Fluor® 488（緑色蛍光 , PS:AnxV 結合） および 7-AAD（赤色蛍光 , 細胞膜の完全性）で標識し、フローサイトメトリー （10,000 イベント）により分析した。 下パネル：K562 細胞（10,000/ ウェル）を RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Assay reagent 存在下で段階希釈したボルテゾミブに暴露した。発光（PS:AnxV 結合）および蛍光（細胞膜の完全性）を動力学的に記録した。ボルテゾミブ で 16 時間インキュベーションした細胞のデータ。 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 0 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 A. Time (hours) Luminescence (RLU) Fluorescence (RFU) 1.5 hr 10 hr Apoptosis 2゜Necrosis Apoptosis 2゜Necrosis 0 8 16 24 32 40 48 0 70,000 140,000 210,000 280,000 350,000 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 Time (hours) Luminescence (RLU) Fluorescence (RFU) B. 8 hr 20 hr A B 15 アポトーシスアッセイ（アネキシン V ［発光］） 0h 24h 48h 72h 0h 24h CP70 R182 48h 72h Active Caspase-3 Beta-actin p17/p19 4546TA Western Analysis Caspase-Glo® 3/7 0 4 8 12 16 20 0 24 48 72 CP70 (DOC sensitive) R182 (DOC resistant) Relative Caspase-3/7 Activity Duration of Docetaxel Treatment (hours) ウェスタン分析と Caspase-Glo® の相関性 ウェスタン分析と Caspase-Glo® の相関性 Anti-Fas Treated Cells Untreated Cells 1,600 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 100 200 300 400 500 600 700 –10 1,400 1,200 1,000 800 600 400 200 0 0 –200 10,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 7,000 8,000 9,000 Luminescence (RLU, Blank Subtracted) Cell # Jurkat 細胞を用いた場合の Caspase-Glo® 3/7 Assay の感度 Jurkat 細胞は抗 -Fas mAb で 4.5 時間処理し、アポトーシスを誘導した。 Caspase-Glo® Reagent 添加 1 時間後に測定した。 Jurkat 細胞を用いた場合の Caspase-Glo® 3/7 Assay の感度 Jurkat 細胞は抗 -Fas mAb で 4.5 時間処理し、アポトーシスを誘導した。 Caspase-Glo® Reagent 添加 1 時間後に測定した。 1,000 1,000 10,000 100 100 10 10 1 Number of Cells Caspase-Glo® 3/7 Fluorescent Substrate Signal-to-Noise Ratio 7299MA 蛍光法と Caspase-Glo® の感度とダイナミックレンジの比較 蛍光法と Caspase-Glo® の感度とダイナミックレンジの比較 製品名 サイズ カタログ番号 カスパーゼアッセイ（発光） Caspase-Glo® 3/7 Assay 2.5ml G8090 10ml G8091 100ml G8092 Caspase-Glo® 3/7 3D Assay （各種 3D 培養細胞用 プロトコル） 10ml G8981 100ml G8982 10 × 10ml G8983 Caspase-Glo® 8 Assay 2.5ml G8200 10ml G8201 Caspase-Glo® 9 Assay 2.5ml G8210 10ml G8211 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分。 ※ 3/7 Assay と 3/7 3D Assay の試薬は同じで、プロトコルが異なります。 製品名 サイズ カタログ番号 アポトーシス + 細胞生存性 + 細胞毒性 アッセイ（蛍光 & 発光） トリプルアッセイ ApoTox-Glo™ Triplex Assay 10ml G6320 5 × 10ml G6321 デュアルアッセイ ApoLive-Glo™ Multiplex Assay 10ml G6410 5 × 10ml G6411 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分。 シングルアッセイ Caspase-Glo® Assay （発光 : カスパーゼ 3/7） 高感度でシンプルなカスパーゼアッセイシステム Caspase-Glo® Assays は、各種カスパーゼ活性を測定するためのホモジニアスフォーマット発光アッセイシステムです。本アッセイでは、 プロテアーゼ認識配列を付加した発光基質アミノルシフェリンと特殊な耐熱性ルシフェラーゼを含む試薬がベースになっており、カス パーゼ活性に最適化されています。Caspase-Glo® Reagent を添加すると細胞が溶解し、続いてカスパーゼにより基質が切断されます。遊 離したアミノルシフェリンは耐熱性の Ultra-Glo™ Recombinant Luciferase により消費され、カスパーゼ活性に比例した“グロータイプ”の 発光シグナルを生じます。本アッセイは、蛍光法や発色法のアッセイよりも高感度で、アポトーシスを判定する TUNEL 法、抗体法などに 比べ飛躍的に簡便になっています。Caspase-Glo® 8 および 9 Assays には、非特異的なバックグラウンドをより低減するプロテアーゼ阻害 剤 MG-132 が新たに添付されています。また、新規な細胞生存性および細胞毒性マーカーと組み合わせたマルチアッセイシステム （ApoTox-Glo™ & ApoLive-Glo™ : 次ページ参照）により細胞死のメカニズムを調べることもできます。 マルチ 3D Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay （蛍光 : カスパーゼ 3/7） 蛍光基質 Z-DEVD-rhodamine 110 によりカスパーゼを測定します。 カスパーゼ 3/7 の定量には精製された酵素や細胞抽出液、培養細 胞（付着細胞・浮遊細胞・初代培養細胞）をサンプルとして使用し ます。発光法の Caspase-Glo® 8 または 9 を組み合せたアポトーシ スメカニズムの解析にも使用することができます。 製品名 サイズ カタログ番号 カスパーゼアッセイ（蛍光） Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay 1ml G7792 10ml G7790 100ml G7791 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分。 マルチ 3D ア ポトーシスおよび細胞死メカニズムを最も簡便に測定（続き） 16 アポトーシスアッセイ（カスパーゼ［ 発光 & 蛍光］） Caspase-Glo® 1 Inammasome Assay によるアポトーシス、ネクローシスと区別されたインフラマソーム活性測定 トリプルアッセイ ApoTox-Glo™ Triplex Assay （蛍光 - 発光：細胞生存性 - 細胞毒性 -アポトーシス） 培養細胞を含む単一のウェルから細胞生存性 / 毒性 / アポトー シスの各イベントについて容易に評価するための 3 つのアッセイ ケミストリを組合せたシステムです。細胞毒性および細胞生存 性に対する新規なプロテアーゼ活性を蛍光で測定（10 ページ参 照 ） し、 カス パーゼ 3/7 活性は発光法により測定します （Caspase-Glo® 3/7）。1 つのサンプルから細胞死のメカニズムを 決定することができます（右図参照）。 デュアルアッセイ ApoLive-Glo™ Multiplex Assay （蛍光 - 発光：細胞生存性 -アポトーシス） 細胞生存マーカーとして生細胞プロテアーゼ（10 ページ参照） を、アポトーシスマーカーとしてカスパーゼの活性化（CaspaseGlo® 3/7）を 1 ウェルで測定し、細胞死のメカニズムを決定する ことができます。カスパーゼ活性と生存細胞の比率はカスパー ゼ活性化量の決定および細胞数に対する補正に有用です。 10420M –9 –8 –7 –6 –5 –4 A 0 25,000 50,000 75,000 100,000 0 25,000 50,000 75,000 100,000 125,000 Caspase EC50 ~4µM Cytotoxicity EC50 ~4µM Viability EC50 = 5.6µM Log[Imatinib], M Fluorescence (RFU) Luminescence (RLU) –9 –8 –7 –6 –5 –4 0 5,000 10,000 15,000 0 5,000 10,000 15,000 Caspase EC50 = N.D. Cytotoxicity EC50 > 36µM Viability EC50 = 6.2µM Log[Imatinib], M Fluorescence (RFU) Luminescence (RLU) iCell® Cardiomyocytes B K562 Cells A イマチニブ処理した iCell® Cardiomyocytes（iPS 細胞由来心筋細胞） および K562（ヒト慢性骨髄性白血病細胞）の細胞毒性プロファイル ApoTox-Glo™ Triplex Assay を使用して細胞毒性、細胞生存性、カスパーゼ活性の トリプルアッセイを行った。高濃度のイマチ二ブ（1µM）でどちらの細胞株ともに 細胞生存性が低下した。K562 細胞の細胞死メカニズムはカスパーゼ 3/7 活性の 増加によるアポトーシスとそれに付随した細胞毒性の増加であることが示された。 炎 症性細胞死（パイロトーシス）：インフラマソーム／カスパーゼ -1 測定 Caspase-Glo® 1 Inflammasome Assay（発光：カスパーゼ 1） ウェスタンブロッティングや ELISA 法より簡便で多検体処理に最適なカスパーゼ 1 測定 Caspase-Glo® 1 Inammasome Assay は、インフラマソーム活性化の主要なバイオマーカーであるカスパーゼ 1 の活性を選択的に測定する ホモジニアス発光アッセイです。カスパーゼ -1 の活性化により 1）プロセシングとサイトカイン IL-1 βおよび IL-18 の放出 , 2）パイロトー シス [pyroptosis]（炎症性細胞死）が起こります。本試薬 1 回の添加で細胞溶解、カスパーゼ 1 による基質（ Z-WEHD-アミノルシフェリン） の切断、特殊な耐熱性組換えルシフェラーゼ（Ultra-Glo™ ）によりカスパーゼ活性に比例した安定な発光シグナルを生じます。プロテア ソーム阻害剤 MG-132 が試薬に含まれるため、プロテアソームを介した非特異的な基質の切断を防ぎ、カスパーゼ 1 活性の高感度アッ セイを可能にします。 13130MA 0 10,000 30,000 20,000 40,000 50,000 70,000 60,000 Doxorubicin Aphidicolin Paclitaxel Puromycin Nigericin α-Hemolysin Ionomycin No-cell control Vehicle control Treated cells Treated cells + YVAD-CHO Inhibitor Treated cells + VEID-CHO Inhibitor Luminescence (RLU) 0 10,000 5,000 25,000 20,000 15,000 30,000 40,000 35,000 No-cell control Vehicle control Treated cells Nigericin α-Hemolysin Ionomycin Fluorescence (RFU) A B 製品名 サイズ カタログ番号 カスパーゼ 1 アッセイ（発光） Caspase-Glo® 1 Inammasome Assay 10ml G9951 5 × 10ml G9952 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分。 パネル A. THP-1 細胞を培養し、アポトーシス誘導剤（ドキソルビシン、アフィジコリン、 パクリタキセル、ピューロマイシン）で 18 時間処理した。同様に 2 枚目のプレートでは、 インフラマソーム誘導剤（ニゲリシン、α – ヘモリジン）またはネクローシス誘導剤（イオ ノマイシン）で２時間処理した。Caspase-Glo® 1 Reagent に YVAD-CHO（カスパーゼ 1 阻 害剤）または VEID-CHO inhibitor（カスパーゼ 6 阻害剤）を添加して測定した。パネル B. CellTox™ Green Cytotoxicity Reagent はニゲリシン、α – ヘモリジンおよびイオノマイシンと 同時に添加し、Caspase-Glo® 1 Reagent を加える直前に蛍光を測定した。 マルチ 17 パイロトーシスアッセイ（カスパーゼ 1 ［発光］） 酸 化ストレス：GSH & GSSG の測定 GSH/GSSG-Glo™ Assay 除タンパク操作の不要な高感度グルタチオンアッセイ 化合物には細胞内の活性酸素の発生を誘導するものが多く存在し、その結果与えられる細胞へのダメージにより最終的にアポ トーシスやネクローシスを起こす場合もあります。還元型と酸化型のグルタチオンの比率（GSH/GSSG 比）を求めることで、これらの化 合物による細胞内酸化還元電状態の変化量を調べることができます。GSH/GSSG-Glo™ Assay は、培養細胞内の総グルタチオン（GSH ＋ GSSG）、GSSG、GSH/GSSG 比を簡単に検出、定量するための発光アッセイシステムです。培養ウェル内の細胞で直接定量できるため GSH や GSSG のロスが最小限に抑えられバラツキが低減します。 メナジオン濃度にともなう GSH、GSSG レベルおよび細胞生存性の変化 肺腺癌細胞 A549 細胞 5,000 個 / ウェル（96 ウェルプレート）をメナジオンで 30 分間処理した後、CellTiter-Fluor™（GF-AFC）で細胞生存性を測定した。続いて、 GSH/GSSG-Glo™ を用いて GSSG および GSH を測定した。 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 µM menadione RLU（millions) RFU（thousands) 6 5 4 3 2 1 0 8 7 6 5 4 3 2 1 0 GF-AFC GSSG µM menadione RLU（millions) RFU（thousands) 6 5 4 3 2 1 0 24 19 14 9 4 -1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 GF-AFC GSH 9520MA Light Ultra-Glo™ rLuciferase ATP Luciferin-NT Luciferin GSH GSH-NT GST GSH GSH GSH GSH GSSG GSSG GSSG GSSG GSH GSH GSH GSH GSSG GSSG GSSG GSSG 細胞溶解後にGSSGを還元し、 総グルタチオン量を測定 細胞溶解時に、GSHをブロッキング し、その後GSSGを還元し、 酸化型グルタチオン量として測定 総グルタチオン量測定（GSH + GSSG） GSSG → 2GSH GSH → GSH GSSG → 2GSH GSH → GSH × GSH/GSSG-Glo™ の測定原理 GSH 依存的に Luciferin-NT（GSH プローブ）がグルタチオン -S-トランスフェラーゼに よりルシフェリンへ変換される反応とホタルルシフェラーゼ反応のカップリングに基 づく。総グルタチオンと GSSG の決定は並行して実施することができます。総グルタ チオンの測定は還元剤を用いて細胞ライセートに含まれるすべてのグルタチオン （GSH および GSSG）を還元型の GSH に変換して測定。酸化型の GSSG のみの測定 はライセートに含まれるインタクトな GSSG を GSH と分けるために全ての GSH をブ ロックする試薬を加え、残った GSSG を GSH に変換して発光反応で定量。 • 生体に近い GSH/GSSG 比：総グルタチオンや GSSG の実質レ ベルを細胞培養ウェルで直接測定できるので、従来法に比べ て GSH や GSSG のロスを抑えサンプルの調製作業や間接的な GSSG 算出も必要ありません。 • 頑健なパフォーマンス：生物発光技術およびシンプルなプロト コルにより、サンプルのハンドリングやバラツキが低減。 • シンプルなプロトコル：マルチウエルプレート内の細胞に直接 試薬を添加するホモジニアスな”添加 – 混和 – 測定”形式で、 従来法のような時間のかかる除タンパクや遠心操作が不要。 • 高い感度：感度が高いので従来法よりも少数の細胞でアッセ イが可能 • 自動化が容易：グロータイプの長時間発光（半減期 2 時間以 上）なので 96 あるいは 384 ウェルプレートでの自動化が可能 • 蛍光による干渉がありません：感度が高いので従来法よりも 少数の細胞でアッセイが可能 製品名 サイズ カタログ番号 グルタチオンアッセイシステム（発光） 酸化型・還元型・比率 GSH/GSSG-Glo™ Assay 10ml V6611 50ml V6612 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分（総グルタチオンまたは GSSG 100 ウェ ル分、GSH/GSSG 比の決定なら 50 ウェル分）。 製品名 サイズ カタログ番号 グルタチオンアッセイシステム（発光） 還元型 GSH-Glo™ Glutathione Assay 10ml V6911 50ml V6912 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 マルチ 18 酸化ストレスアッセイ（グルタチオン ［発光］） 細胞でも酵素でも使用可能 • 培養細胞サンプルの H₂O₂ レベル変化の直接的な測定に • H₂O₂ を生成あるいは消費する酵素活性の測定に 簡便、迅速、多検体処理にも最適 • 細胞内 ROS レベルを変化させる低分子阻害剤 / 誘導剤の評価に • HPR を使用しないため、HRP 阻害剤による偽陽性が排除されます ROS-Glo™ Assay の操作概要 10 μ M H₂O₂ に LOPAC-1280 を添加し、ROS-Glo™ Assay と他社 HRP 法で測定を行っ た。HRP 法では 7.1% の化合物が系に影響を与えたのに対し、ROS-Glo™ Assay では 0.5% であった。 活 性酸素：H₂O₂ の測定 ROS-Glo™ H₂O₂ Assay HRP 法に比べ飛躍的に偽陽性が低減した高感度な H₂O₂ アッセイ H₂O₂ は培養細胞が有する活性酸素種 ROS の中で半減期が最も長く、酸化ストレスのバイオマーカーに適しています。また、生体中では 様々な ROS が H₂O₂ に変換されるため、H₂O₂ 量の変化は全体的な ROS レベルの変化を示すものとなり得ます。ROS-Glo™ H₂O₂ Assay は活性酸素種（ROS）である過酸化水素（H₂O₂）レベルを測定する迅速で高感度なホモジニアス生物発光アッセイで、培養細胞あるい は特定の酵素反応より直接測定することができます。ルシフェリン誘導体基質をサンプルとともにインキュベートすると H₂O₂ と直接反 応してルシフェリン前駆体が生成されます。ROS-Glo™ Detection Solution の添加によりこの前駆体がルシフェリンに変換され、試薬に含 まれる Ultra-Glo™ Recombinant Luciferase がサンプル中に存在する H₂O₂ レベルに比例した発光シグナルを生じます。 ROS-Glo™ H₂O₂ と一般的な HRP 法（蛍光）による 低分子スクリーニグの偽陽性率の比較 ROS-Glo™ Assay HRP 法 化合物 の数 LOPAC に 占める割合（％） 化合物 の数 LOPAC に 占める割合（％） スクリーニングに用いた 化合物数 1,280 ー 1,280 ー インヒビター： 活性 75% 以下 6 0.5 91 7.1 インヒビター： 活性 50% 以下 3 0.2 67 5.2 アクチベーター： 活性 150% 以上 2 0.2 0 0 製品名 サイズ カタログ番号 H₂O₂ アッセイ（発光） ROS-Glo™ H₂O₂ Assay 劇 10ml G8820 50ml G8821 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 劇 ：「毒物及び劇物取締法」に基づく医薬用外劇物です。法規制に従って、保管、 廃棄等を行って下さい。 マルチ 培養細胞における ROS の誘導 384 ウェルプレートで培養した K562 細胞に濃度を増加させながらメナジオン で処理し、その間に H₂O₂ Substrateを加えた。2 時間のインキュベーションの後、 等量の ROS-Glo™ Detection Solution を添加し、さらに 20 分間インキュベー ションして測光した。 11901MA Menadione (log µM) Luminescence (RLU) 0 100,000 200,000 300,000 –1 0 1 2 3 ROS-Glo™ Assay と細胞毒性試験のマルチアッセイ 384 ウェルプレートに HepG2 細胞を 2,000 細胞 / ウェルで播種し、100µM メ ナジオン、100µM ピロガロールまたは 200µg/ml ジギトニンで 2 時間処理した （1X CellTox™ Green Dye および 25µM H₂O₂ Substrate も添加）。インキュベー ション後、CellTox™ Green（細胞毒性）の蛍光シグナルを測定し、等量の ROS-Glo™ Detection Solution を添加して 20 分後に測光した。 11586MA 0 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 35,000 40,000 45,000 Fluorescence (RFU) ROS-Glo™ H2 O2 Assay CellTox™ Green Cytotoxicity Assay Luminescence (RLU) Medium 100µM menadione 100µM pyrogallol 200µg/ml digitonin 0 100,000 200,000 300,000 400,000 500,000 600,000 11360MA ROS-Glo™ Detection Solution を添加し、 20 分間インキュベーション サンプルに H₂O₂ Substrate Solution を 添加し、最長 6 時間インキュベーション 測光 ROS-Glo™ Assay の操作概要 19 酸化ストレスアッセイ（ROS/H₂O₂［発光］） エ ネルギー代謝：糖・グルタミン・脂質代謝物の測定 がんや糖尿病などの疾患では細部内の代謝が大きく変化していることが明らかとなり、疾患メカニズムの解明や薬剤開発において代謝 物を簡便、高感度に検出する手法が望まれています。プロメガの NADH 発光アッセイ法および特異的なデヒドロゲナーゼとを組み合わ せた種々の代謝物アッセイはマルチウェルプレートに試薬を加えるだけの簡便なプロトコルで、高感度に測定することができるようにな りました。 NADP/NADPH-Glo™ and NAD/NADH-Glo™ Assay ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを高い選択性と感度で検出 NAD/NADH-Glo™ Assay および NADP/NADPH-Glo™ Assay は、細胞などの生物学的サンプルよりニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（非 リン酸化型：NAD+［酸化型］あるいは NADH［還元型］）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（リン酸化型：NADP+［酸 化型］あるいは NADPH［還元型］）の全体量あるいは酸化型と還元型の比率を検出するためのホモジニアスな生物発光アッセイで、1 種 類の試薬を添加するだけの簡単なシステムです。 各システムに含まれる Cycling Enzyme がサンプルに含まれる NAD+ または NADP+ を還元型に変換し、次にキットに含まれレダクターゼ がプロルシフェリン基質をルシフェリンに還元します。このルシフェリンと Ultra-Glo™ Recombinant Luciferase により生じた発光シグナル はサンプルに含まれる非リン酸化型（NAD+/NADH）またはリン酸化型（NADP+/NADPH）の総量に比例します。付属プロトコルにより NAD/NADH-Glo™ Assay ではNAD+ および NADHを、NADP/NADPH-Glo™ AssayではNADP+ および NADPHを区別して測定することができ、 それぞれの酸化型と還元型の比率を算出することができます。“添加 – 混和 – 測定”だけのシンプルなプロトコルとスケール自在の測定 ケミストリにより NAD/NADH または NADP/NADPH に対する低分子化合物のハイスループットモニタリングに最適です。 高感度な発光法 NAD/NADH-Glo™ Assay、NADP/NADPH-Glo™ Assay は酵素サイクリング 法を採用（特異性が高く、高感度）。発光法では同原理の発色法・蛍光 法よりも高い S/N 比が得られた。 分子種特異性と直線性 NADH, NADPH, NAD+, NADP+ を PBS で表示濃度に希釈し、NAD+ および NADH に選択的な NAD/NADH-Glo™ Assay を用いて測定した。 製品名 サイズ カタログ番号 NAD アッセイ（発光） NAD/NADH-Glo™ Assay 10ml G9071 50ml G9072 NADP/NADPH-Glo™ Assay 10ml G9081 50ml G9082 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分。 代謝産物や栄養成分に対する特異的デヒドロゲナーゼとレダクターゼを用いた方法により、代謝産物・栄養成分を発光シグナル に変換して測定（次ページ参照）。 NAD(P)H NAD(P) ルシフェリン前駆体 ルシフェリン ルシフェラーゼ デヒドロゲナーゼ レダクターゼ Light Light グルコース、乳酸、 グルタミン、グルタミン酸 1 10 100 1,000 1 10 100 1,000 10,000 Signal-to-Background [NAD], nM Bioluminescence Fluorescence Absorbance 11730MA 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 1 × 106 2 × 106 3 × 106 4 × 106 5 × 106 6 × 106 7 × 106 Luminescence (RLU) [Dinucleotide], nM NAD+ NADH NADP+ NADPH 0 0 10 20 30 40 2 × 105 4 × 105 6 × 105 8 × 105 0 0 10 20 30 40 2 × 105 4 × 105 6 × 105 8 × 105 プロメガの代謝アッセイの測定プラットフォーム マルチ 3D 20 糖・グルタミン代謝産物の測定（グルコース、乳酸、グルタミン、グルタミン酸） ラジオアクティブ法と発光法の比較 結腸がん細胞 HCT116 （表示の個数）を用いて Glucose Uptake-Glo™ Assay および標準的な 2DG ラジオアクティブアッセイを行った。2 つの方法で同 等のシグナル / バックグラウンド比を示した。 培地中の代謝物の測定 A549 細胞を 96 ウェルプレートに 15,000 個（濃い棒グラフ）または 5,000 個（薄い棒 グラフ）播種（培地：5mM グルコース、2mM グルタミンおよび 10% 透析済み血清を含 む DMEM）。表示時間に培地を分取して PBS で希釈し、それを分けてそれぞれグルコー ス、乳酸、グルタミン、グルタミン酸を測定。赤い点線は培地コントロール（細胞無し）。 発光テクノロジーを用いた代謝シフトの解析 乳がん細胞株 MDA-MB-231 細胞と MCF7 細胞を通常酸素分圧下（約 20% O₂）および低酸素条件下（3% O₂）でそれぞれ培養し、細胞内グルコース量 と分泌された乳酸量を比較した。MCF7 細胞では低酸素条件下で培養する ことにより、乳酸の産生量が亢進し、解糖系への代謝シフトが観察された。 一方で、MDA-MB-231 細胞では代謝経路の変化は観察されていない。 標識物質を培地に添加（グルコース取込みの場合） グルコース類似体 2- デオキシグルコース（2-DG）を培地に添加 リアルタイム細胞生存試験とのマルチアッセイ 3T3L1-MBX 脂肪細胞を用いた同一ウェルでのGlucose Uptake-Glo™ Assay （パネルA） と RealTime-Glo™ Cell Viability Assay （パネル B）　のマルチアッセイ。3T3L1-MBX 脂 肪細胞に様々な処理を行い製品プロトコルに従いアッセイを行った。条件によってグ ルコース取込み量に大きな差が表れたが細胞生存性の変化は最小限。 製品名 サイズ カタログ番号 グルコース取込みアッセイ（発光） Glucose Uptake-Glo™ Assay 5ml J1341 10ml J1342 50ml J1343 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分。 製品名 サイズ カタログ番号 代謝産物アッセイ（発光） Glucose-Glo™ Assay 5ml J6021 Lactate-Glo™ Assay 5ml J5021 Glutamate-Glo™ Assay 5ml J7021 Glutamine/Glutamate-Glo™ Assay 5ml J8021 グルコースの取込み Glucose Uptake-Glo™ Assay グルコースの取込み試験はこれまで放射性標識、蛍光または吸 光により取り込み活性の測定が行われてきましたが、従来法で は煩雑な操作性、感度やバックグラウンドなどに問題がありまし た。Glucose Uptake-Glo™ Assay は従来法と同じく、蓄積された 2- デオキシグルコース-6- リン酸（2DG6P）を測定しますが、発 光シグナルに変換することで高感度にグルコースの取り込み量を 測定します。操作法も簡便で細胞の洗浄や除タンパクが不要に なり、試薬加えるだけの簡便な測定が可能になりました。 ‘Cells as reagents’: Frozen, thaw-and-use cells (3-24hr) w-and-use cells (3-24hr) a th , ‘Cells as reagents’: Frozen w-and-use cells (3-24hr) a th , ‘Cells as reagents’: Frozen 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 RLU Hypoxia MDA-MB-231 MCF7 Normoxia Hypoxia Normoxia Glucose Lactate 細胞溶解液添加 細胞溶解、代謝停止、内在タンパク質の変性、内在性 NAD（P） H の分解 中和剤添加 そのまま測定（サンプルを分けて、異なる代謝物のアッセイも 可）、-20℃保存可能 各アッセイ試薬添加 1 時間インキュベーションした後に測光 Luminescence 1,800,000 1,600,000 1,400,000 1,200,000 1,000,000 800,000 600,000 400,000 200,000 0 8h 24h 48h 72h Glucose consumption Time, hrs Remove small volume of media at each time point Dilute into PBS Collect and store at -20°C or transfer aliquots to plate for assay of individual metabolites Add Metabolite Specific Detection Reagent Incubate 1 hour, read light signal Luminescence 1,800,000 1,600,000 1,400,000 1,200,000 1,000,000 800,000 600,000 400,000 200,000 0 8h 24h 48h 72h Lactate secretion Time, hrs Luminescence 800,000 700,000 600,000 500,000 400,000 300,000 200,000 100,000 0 8h 24h 48h 72h Glutamine consumption Time, hrs Luminescence 8h 24h 48h 72h Glutamate secretion Time, hrs 400,000 300,000 200,000 100,000 0 13508MA 0 10 20 30 40 50 60 0 20,000 40,000 60,000 Signal-to-Background Ratio Cell Number Glucose Uptake-Glo™ Assay Radioactive assay マルチ 3D Glucose-Glo™ Assay Lactate-Glo™ Assay Glutamate-Glo™ Assay Glutamine/Glutamate-Glo™ Assay これまで代謝産物の測定は質量分析など煩雑な方法などに限ら れ、多検体を簡便に処理する方法はほとんどありませんでした。 プロメガ NAD 発光測定法をベースとした簡便な測定法で、細胞 内や培地中の代謝物を測定することができます。がんや糖尿病 の研究で注目される糖代謝やグルタミン代謝を標的とした化合 物スクリーニングなどに最適です。 13506MA 0 500,000 1,000,000 1,500,000 2,000,000 2,500,000 3,000,000 3,500,000 Luminescence (RLU) Luminescence (RLU) 0 100,000 200,000 300,000 400,000 500,000 None Insulin Cytochalasin B LY294002 Treatment None Insulin Cytochalasin B LY294002 Treatment A. B. マルチ 3D リアルタイム 各製品の大容量品の価格、詳細は Web でご覧いただけます。 21 エネルギー代謝 アッセイ（糖・グルタミン代謝物［ 発光］） 脂質代謝物の測定 （グリセロール、トリグリセライド、コレステロール / コレステロールエステル） Glycerol-Glo™ Assay Triglyceride-Glo™ Assay Cholesterol/Cholesterol Ester-Glo™ Assay プロメガ脂質代謝アッセイは、グリセロール、トリグリセライド、コレステロールおよびコレステロールエステルを定量するための高感 度でシンプルな方法を提供します。これらのアッセイは、生物学的プロセスの中でも、脂肪分解および脂肪生成の定量化に使用するこ とができます。脂質代謝アッセイは、他のプロメガ代謝アッセイでも採用されている生物発光技術をベースにしています。 脂質代謝アッセイは培養細胞、組織、培地、血漿、血清など、多くの生体サンプルに適応でき、細胞タイプとしては、単層および 3D 培 養した肝細胞および脂肪細胞なども含まれます。このプロトコルでは、面倒な有機抽出ステップが不要なので、サンプル調製が飛躍的 に簡素化されます。また、このアッセイは広い直線性を示すとともに感度も高いため、サンプルを希釈する手間を低減し、脂質代謝産 物の微小な変化を簡便にとらえることができます。 マルチ 3D 代謝マーカーの測定操作 溶解剤添加 30 分インキュ ベーション 検出液添加 約 1 時間室温で 静置 発光測定 エ ネルギー代謝：糖・グルタミン・脂質代謝物の測定（続き） • 有機溶媒による抽出不要：のプレートベースのアッセイに含まれる面倒な 有機溶媒抽出ステップは不要 • 定量的なデータ：定性的な染色イメージよりも結果が明瞭な定量的情報を 取得可能 • プレートベース：アッセイはハイスループット分析に対応 • 広いダイナミックレンジ：レンジ内に収めるために何度も希釈する必要は ありません 22 エネルギー代謝 アッセイ（脂質代謝物［発光］） 製品名 サイズ カタログ番号 グリセロールアッセイ Glycerol-Glo™ Assay 5ml J3150 50ml J3151 トリグリセリドアッセイ Triglyceride-Glo™ Assay 5ml J3160 50ml J3161 コレステロール / コレステロールエステル アッセイ Cholesterol/Cholesterol Ester-Glo™ Assay 5ml J3190 50ml J3191 β – シクロデキストリン添加後の培地中コレステロールおよび 細胞生存性、細胞毒性のマルチプレックスアッセイ HCT116 結腸がん細胞をウェルあたり 2000 個 96 ウェルプレートに播種し、20mM メチル – β – シクロデ キストリン存在下（青色）または非存在下（赤色）、表示の時間に RealTimeGlo™ Assay による細胞生存性、 分取した培地で Cholesterol/Cholesterol Ester-Glo™ Assay でコレステロール量を、LDH-Glo™ Assay で細 胞毒性を測定した。 16253MA Relative Viability Time (Hours) Time (Hours) Cholesterol (µM) 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 0 20 40 60 80 100 120 Time (Hours) Relative Toxicity 0 2 4 6 8 0% 40% 20% 60% 80% 100% 120% 140% – CD + CD – CD + CD – CD + CD 16253MA Relative Viability Time (Hours) Time (Hours) Cholesterol (µM) 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 0 20 40 60 80 100 120 Time (Hours) Relative Toxicity 0 2 4 6 8 0% 40% 20% 60% 80% 100% 120% 140% – CD + CD – CD + CD – CD + CD 16253MA Relative Viability Time (Hours) Time (Hours) Cholesterol (µM) 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 0 20 40 60 80 100 120 Time (Hours) Relative Toxicity 0 2 4 6 8 0% 40% 20% 60% 80% 100% 120% 140% – CD + CD – CD + CD – CD + CD 脂肪細胞分化にともなう脂質の蓄積 96-ウェルプレートで、 3T3L1-MBXにおける脂質の蓄積を分化の指標として線維芽細胞（パネルA, 5日目） から分化ステージ 1（パネル B, 12 日目）、分化ステージ 2（パネル C, 14 日目）、成熟した脂肪細胞（パ ネル D, 21 日目）までをモニタリングした。1 セットのプレートは Oil Red O（パネル A–D）で染色し、そ の他は Triglyceride-Glo™ Assayプロトコールに従いアッセイした（パネル E）。 16244MA Triglcyeride (µM) 600 700 400 500 300 200 100 A B C D 0 A. B. C. E. D. 16244MA Triglcyeride (µM) 600 700 400 500 300 200 100 A B C D 0 A. B. C. E. D. ATP Reductase Substrate Luciferin NADH Glycerol-3-P Product Glycerol G-3-P Dehydrogenase Reductase Ultra-Glo™ Luciferase + ATP + Mg2+ + O2 NAD+ Light Glycerol Kinase 3 FFA TAG Lipase 発光アッセイの測定原理 上図は Triglyceride-Glo™ Assay および Glycerol-Glo™ Assay の測定原理。 Cholesterol/ Cholesterol Ester-Glo™ Assay の場合は コレステロールエ ステルがエステラーゼによりコレステロールに変換され、さらにコレ ステロールデヒドロゲナーゼにより NADH が再生される。 Autophagy LC3 HiBiT Reporter Spacer LC3 Phagophore Autophagosome Autolysosome: LC3 HiBiT Reporter and cargo degradation Lysosome Add Nano-Glo® HiBiT Lytic Reagent to disrupt cells and introduce LgBiT Protein and substrate Increased autophagic flux results in decreased luminescence Decreased autophagic flux results in increased luminescence HiBiT LgBiT オートファジー誘導剤の評価 HEK293 Autophagy LC3 HiBiT Reporter Cells を白色 96 ウェルプレートに播種 し（20,000 個 / ウェル ）、オーバーナイトで細胞を付着させた。オートファジー 誘導剤 PP242 の濃度を増加させて表示の時間トリプリケートで処理を行っ た。Nano-Glo® HiBiT Lytic Reagent を添加後し 10 分後に発光を測定した。平 均シグナルは同時間のビークルコントロールの値で補正した値。 オートファジー阻害剤の評価 U2OS Autophagy LC3 HiBiT Reporter Cells を白色 96 ウェルプレートに播種し （ 8,000 個 / ウェル）、オーバーナイトで細胞を付着させた。オートファジー 阻害剤 Baf A1 の濃度を増加させて 2 µM PP242 の有無の 2 つの条件で 21 時間トリプリケートで処理を行った。発光シグナルはそれぞれ未処理コント ロールで補正した。PP242 による同時処理は、オートファジー阻害剤 Baf A1 のシグナルの増加幅を向上させるためにオートファジーを顕著に増加させ発 光シグナルを低減させるために行った。 製品名 サイズ カタログ番号 オートファジーフラックス アッセイ（発光） ベクター ＋ 検出試薬 Autophagy LC3 HiBiT Reporter Vector and Detection System 1 セット GA2550 細胞 ＋ 検出試薬 HEK293 Autophagy LC3 HiBiT Reporter Cell Line and Detection System 1 セット GA1040 U2OS Autophagy LC3 HiBiT Reporter Cell Line and Detection System 1 セット GA1050 検出試薬 Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System 大きなサイズについてはウェブを参照ください 10 ml N3030 ※ 製品購入における注意点: Autophagy LC3 HiBiT Reporter Assay の使用は非営利組織 （大学、公的研究機関など）、営利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容 （www.promega.co.jp/license/）をご確認頂く必要があります。 タ ンパク質分解：オートファジーフラックスとプロテアソーム Autophagy LC3 HiBiT Reporter Assay オートファジーフラックス高感度レポーターアッセイ オートファジーは余剰あるいは有害な細胞内のタンパク質などを分解する重要な細胞内パスウェイです、平常あるいはストレス誘導条件 下における細胞の健全性を維持する上で重要です。現在のオートファジーのモニタリングは主に煩雑なフローサイトメトリーやイメージン グで行われており、定量性にも限界があります。プロメガではプレートベースで“添加 – 混和 – 測定”するだけの新規なオートファジー フラックスの定量レポーターシステムを開発しました。このレポーターシステムは簡便でオートファジーフラックスを高感度に定量でき、 ハイスループットフォーマットにも対応します。 オートファジーレポーターシステムはオートファジーフラックスを定量するためにオートファジーマーカーとして広く知られている LC3　に 11 アミノ酸の発光タグ HiBiT を付加したレポーターを細胞に導入するため、試薬に含まれる相補的なポリペプチド LgBiT を添加すること でその分解を検出することができます（シグナルの増加はオートファジーの阻害を示し、シグナルの低下はオートファジーの誘導を示す）。 実験に合わせて構築済みの 2 種類のレポーター細胞株 (HEK293 または U2OS) またはご自身の細胞株で安定トランスフェクションするた めのレポーターベクターからお選びいただけます。 • 定量性：主観的なイメージングベースの分析に比べデータの解釈がシンプル。 • 簡便：“添加 – 混和”してルミノメーターで 測定するだけで、洗浄操作やイメージングやフローサイトメトリーなど煩雑なシステムは 不要。ハイスループットスクリーニングも可能。プレートベースの測定で 384ウェルプレートまで対応し、オートファジーモジュレーター の候補物質を効率的にスクリーニング可能。 • 3D 細胞系に対応：スフェロイドやその他の 3D 細胞モデルにおけるオートファジーの変化を解析可能。 ファゴフォア オートファゴソーム オートリソソーム： LC3 HiBiT レポーターおよび 積み荷分子（カーゴ）が分解 オートファジーフラックスが 増加すると発 光が減 衰し、 オートファジーフラックが減 少すると発光が増強される Nano-Glo ® HiBiT Lytic Reagent の添加により 細胞を破壊し LgBiT と 基質を供給 オートファジーレポーターシステムの原理 PP242 (nM) HEK293 Autophagy LC3 HiBiT Reporter Luminescence (% untreated) 6 hours 21 hours 0 10 100 1,000 10,000 120 140 100 80 60 20 40 0 BafA1 (nM) U2OS Autophagy LC3 HiBiT Reporter Luminescence (% untreated) Vehicle 2µM PP242 0 1 10 100 250 300 200 150 50 100 0 マルチ 3D 23 タンパク質分解アッセイ（オートファジー［発光］） プロテアソームおよびカスパーゼ 3/7 活性検出のための 連続マルチアッセイ H929 細胞（10,000 個 / ウェル）を 96 ウェルプレートに播種した。1 昼夜培 養した後、エポキソマイシン（10µl/ ウェル）とともに 1.5 または 4.5 時間イン キュベートした。Proteasome-Glo™ Cell Based Assay Reagent 添加 15 分後に 発 光 を 測 定 し た。 そ の 後 すぐ に Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Reagent を 20µl/ ウェル添加した。アッセイプレートを 22℃、30 分間混和し てカスパーゼ 3/7 による蛍光を検出した。 エポキソマイシン処理細胞のプロテアソームシグナルカイネティクス U266 細胞（15,000 個 / ウェル）を 96 ウェルプレートに播種した。2 時間 37ºC, 5% CO2 で平衡化した後にエポキソマイシン 0 または 8µM で 2 時間処 理した。Proteasome-Glo™ Cell-Based Reagent を添加、混和した後に発光を 測定した。 製品名 サイズ カタログ番号 プロテアソームアッセイ（発光） Proteasome-Glo™ Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay 10ml G8660 5 × 10ml G8661 2 × 50ml G8662 Proteasome-Glo™ Trypsin-Like Cell-Based Assay 10ml G8760 5 × 10ml G8761 Proteasome-Glo™ Caspase-Like Cell-Based Assay 10ml G8860 5 × 10ml G8861 Proteasome-Glo™ 3-Substrate Cell-Based Assay System 10ml G1180 50ml G1200 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 ※ Proteasome-Glo™ 3-Substrate Cell-Based System は 3 種のプロテアソーム測定試薬 のセットです。 Proteasome-Glo™ Cell Based Assay 細胞内のプロテアソーム活性を高感度に測定 Proteasome-Glo™ Cell Based Assay は、培養細胞内に存在するプロテアソーム複合体のキモトリプシン様、トリプシン様、カスパーゼ様 プロテアーゼ活性を測定するための発光ホモジニアスアッセイシステムです。Proteasome-Glo™ Cell Based Assayでは、特殊なバッファー （細胞透過性、プロテアソーム活性およびルシフェラーゼ活性に最適化）に溶解したプロテアソームに対する発光基質を使用します。“添 加 – 混和 – 測定”の簡単なフォーマットで、Proteasome-Glo™ Cell Based Assay Reagent が添加されるとプロテアソームによる基質の切断 が起こり、さらにルシフェラーゼ反応により迅速に発光シグナルが生じます。本システムでは各プロテアーゼの活性に特異的な発光基質、 Suc-LLVY-aminoluciferin（キモトリプシン様活性）、Z-LRR-aminoluciferin（トリプシン様活性）、Z-nLPnLD-aminoluciferin（カスパーゼ様活性） を用います（※ Suc-LLVY, Z-LRR または Z-nLPnLD の配列を含む発光基質は 20S プロテアソームにも認識されます）。 5813MA 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 Epoxomicin Concentration (µM) 0 100 200 300 400 500 600 700 Luminescence (RLU) 0 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 7,000 8,000 Fluorescence (RFU) 1.5-hour Proteasome-Glo™ Assay 4.5-hour Proteasome-Glo™ Assay 1.5-hour Caspase-3/7 Activity 4.5-hour Caspase-3/7 Activity • 簡便な ” 添加 – 混和 – 測定 ” だけのプロトコール • 培養細胞より直接 キモトリプシン様、トリプシン様および カスパーゼ様活性を測定 • 試薬添加 10 ～ 30 分以内に結果を取得 7394MA 0 100 200 300 400 Trypsin-like activity (– drug) Trypsin-like activity (+ drug) Chymotrypsin-like activity (– drug) Chymotrypsin-like activity (+ drug) Caspase-like activity (– drug) Caspase-like activity (+ drug) Time (minutes) Luminescence (RLU) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 タ ンパク質分解：オートファジーフラックスとプロテアソーム（続き） 24 タンパク質分解アッセイ（プロテアソーム［発光］） 組織抽出液の cAMP-Glo™ Assay ラット脳抽出液 2 ml/gm を、0.5 mM IBMX および 100 µM Ro20-1724 を含有 する cAMP-GloTM Lysis Bufferでホモジナイズし、70℃で 5 分間加熱した。0、 2、4、6、8 および 10 µl のサンプルに等量の Krebs Ringer バッファーを添加 した後、cAMPGlo™ 反応バッファーを添加することにより試験を行った。反 応液を室温で 20 分 間インキュベーションした 後、等量 の Kinase-Glo® Reagent を添加した。10 分後の相対発光量を測定し、溶解バッファーのみの RLU 値から各サンプルの RLU 値を減じることにより、Δ RLU を算出した。Δ RLU = RLU (0 µl) – RLU（サンプル） D1 受容体を発現する HEK293 細胞における SCH23390 の IC50 決定 細胞を Induction Buffer に懸濁し、384 ウェルプレートの各ウェルに 3000 個ず つ添加した。細胞は 100nM のアゴニスト, SKF38393 存在下で表示量のアン タゴニスト SCH23390 で処 理した。ネガティブコントロール反 応 では SCH23390 の代わりにアルプレノロールを用いた。測定は cAMP-Glo™ Max Assay を使用した。 cAMP-Glo™ Assay の原理の概略図 細胞内 cAMP 濃度の変化により、ヘテロ四量体として存在する不活性状態の cAMP 依 存性プロテインキナーゼ（PKA）が修飾され、調節サブユニット二量体から酵素活性を 有する触媒サブユニット 2 個が遊離する。PKA の活性化は、キナーゼ反応における ATP 基質の減少によりモニターでき、残存する ATP はルシフェラーゼ反応により定量 できる。 細 胞内 cAMP を発光法により高感度に検出 cAMP-Glo™ Assay 細胞溶解によるエンドポイントアッセイ cAMP-Glo™ Assay および cAMP-Glo™ Max Assay は細胞内の cAMP を発光シグナルとして測定するホモジニアスなハイスループットアッセイシステムです （96、384 または 1536 ウェルプレートでアッセイ可能）。アデニル酸シクラーゼと連動する G タンパク質共役受容体（GPCR）を変調させる化合物は、 通常細胞内の cAMP レベルを変動させます。これらの製品は、GPCR に対するアゴニスト、アンタゴニストあるいはテスト化合物に応答する細胞内 cAMP レベルをモニタリングすることができます。本アッセイの原理は、cAMP がタンパク質キナーゼ A（PKA）ホロ酵素活性を刺激し、ルシフェラーゼ 反応に利用可能な ATP が減少することにより発光が抑えられることに基づきます。実験では、cAMP レベルが変化する適切な時間をかけて細胞をテス ト化合物で誘導します。誘導後に細胞を溶解し、プロテインキナーゼ A 供給します。次に残存する ATP を Kinase-Glo® Reagent で測定します。cAMP 標 準曲線を用いることにより発光レベルから cAMP 濃度が決定されます。発光シグナルの半減期は 4 時間以上です。シグナルの半減期が長いため、ル ミノメーターにインジェクターは不要で、マルチプレートのバッチモード処理を可能にします。cAMP-Glo™ MaxAssay は cAMP-Glo™ Assay の改良型で、 細胞溶解剤と cAMP 反応バッファーが cAMP-Glo™ ONE Buffer に統合されました。この新しいフォーマットによりプロトコルの効率化が図られ、アッセ イ完了までの時間を短縮することができます。新しい ONE Buffer は 5 Ｘ濃度で供給されるため培養ボリュームを柔軟に設定できるようになりました。 • 迅速で簡便：シンプルなホモジニアスフォーマット（cAMP-Glo™ Max Assayでは細胞溶解および cAMP 検出が 1 ステップに統合 ［約 30 分でアッセイ完了］）。 • 優れたシグナル / バックグラウンド比（S/B 比）：優れた S/B 比 （>200 ［cAMP］，>15 ［細胞］）を示し、1536 ウェルプレート 以上のフォーマットにも簡単に変更可能。 • 柔軟性：ONE Buffer：5X 濃度は細胞培養ボリュームの柔軟性 を向上（cAMP-Glo™ Max Assay）。 • 優れた発光技術を採用：定評のある Ultra-Glo™ Recombinant Luciferase を使用しており、蛍光化合物による干渉もありま せん。 6872MA r 2 = 0.9937 0 200,000 400,000 600,000 800,000 1,000,000 1,200,000 1,400,000 0 2 4 6 8 10 Extract Volume (µl) Luminescence (∆RLU) 6127 MA α α Ligand P β γ β γ GDP GTP cAMP ATP R R C C C C cAMP cAMP R R G protein G protein-coupled receptor Protein kinase A substrate Phosphorylated protein kinase A substrate ATP ADP Active protein kinase A Inactive protein kinase A holoenzyme Inactive adenylate cyclase Active adenylate cyclase luciferin + O2 luciferase oxyluciferin + AMP + Light 製品名 サイズ カタログ番号 cAMP アッセイ（発光・エンドポイント） cAMP-Glo ™ Assay 300 ウェル分 V1501 3,000 ウェル分 V1502 30,000 ウェル分 V1503 cAMP-Glo™ Max Assay 2 プレート分 V1681 20 プレート分 V1682 200 プレート分 V1683 ※表示のサイズは 384 プレートの場合。 9530MA ※バルク注文については別途お問合わせください。 –10 –9 –8 –7 –6 –5 0 1.0 × 105 2.0 × 105 3.0 × 105 4.0 × 105 5.0 × 105 SCH23390 Alprenolol IC50 = 9.3 × 10–9M Log10[SCH23390], M Luminescence (RLU) 25 シグナル伝達アッセイ（ cAMP［発光］） 細 胞内 cAMP を発光法により高感度に検出（続き） GloSensor™ cAMP Assay cAMP センサーによるリアルタイムアセイ GloSensor™ cAMP Assay は、細胞内の cAMP レベルを測定する新しいアプローチを提供します。cAMP は Gas および Gai タンパク質を介 した GPCR のシグナル伝達に関与する重要なセカンドメッセンジャーです。本製品は GloSensor™ 技術をベースにした新しいアッセイ法で、 ホタルルシフェラーゼの内部に cAMP 結合タンパク質の一部を挿入するための遺伝子改変が施されたベクターを生細胞に導入します。発 現したバイオセンサーに cAMP が結合すると、構造が変化して発光量が増加します。この生細胞アッセイは cAMP を通じたシグナル伝達 のカイネティックスやモジュレーションの研究に最適です。 選択した細胞株で標的受容体および本バイオセンサーを一過性に発現させて GloSensor™ cAMP Assay を行います。また、バイオセンサー と受容体を安定に発現する細胞株を調製して実施することもできます。プロトコルはシンプルで、細胞を GloSensor™ cAMP Reagent で 事前に約 2 時間平衡化します。その後、特異的なアゴニスト / アンタゴニストあるいは活性未知の化合物で処理し、10 ～ 30 分後に発 光を測定します。それ以外に試薬の添加や、手作業は不要です。GloMax® などインジェクターが付属する標準的なルミノメーターで測定 できます。GloSensor™ cAMP Reagent は、本アッセイでの使用に必要です（GloSensor™ Limited Use Label License に明示）。pGloSensor™ Plasmid は 2 種類のバイオセンサーバリアントごとに 20F と 22F をご用意しています。多くの用途において pGloSensor™-22F を最初の選 択肢として推奨します（詳細についてはプロトコル TM076 を参照下さい。） GloSensor™ cAMP Assay の発光原理 Allosteric（アロステリック型）改変ルシフェラーゼ遺伝子：cAMP が結合するドメイン （RII β B ）の構造変化により発光シグナルが調節される。 HEK293 での cAMP モニタリング GloSensor™ cAMP タンパク質を一過性に発現する HEK293 細胞のイメージング。 イメージングは LV200（オリンパス社）を用いた。 アロステリック cAMP バイオセンサー 生細胞（37℃）におけるシグナルのカイネティクスと可逆性を示す。cAMP バイオセン サーを一過性に発現する HEK293 細胞を 10mM イソプロテレノール（ISO）または 10mM フォルスコリン（FSK）それぞれ単独で処理した。変調を加える細胞は、10 μ M ISO, 10 μ M プロプラノール（PRO）および 10 μ M FSK で連続的に処理した。 （n=3）Fan, F. et al.（ 2008）ACS Chem. Biol. 3, 346-51. より許可を得て転載した。 • シンプルなアッセイ：HTS や ultra HTS（例 : 3456- ウェル形式） に理想的な 0 ステップアッセイ。 • リアルタイムの測定：処理後 15 分で cAMP レベルを検出。 • より生体反応に近いデータ：非溶解性の生細胞アッセイによ るカイネティックなデータ取得。 7707TA N C 359–544 RIIβB 4–355 N C N C 7708MA 1 × 105 1 × 104 1 × 103 Luminescence (RLU) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 MOD FSK ISO NA ISO PRO FSK Time (minutes) 製品名 サイズ カタログ番号 cAMP アッセイ（発光・リアルタイム） ベクターおよび安定発現細胞株 pGloSensor™-20F cAMP Plasmid 20 µg E1171 pGloSensor™-22F cAMP Plasmid 20 µg E2301 アッセイ試薬 GloSensor™ cAMP Reagent 1 vial（25mg*） E1290 1 vial（250mg*） E1291 * 25mg は 384 ウェル形式で 817 ウェル分。 ※製品購入における注意点 : GloSensor™ cAMP Assay の使用は非営利組織（大学、 公的研究機関など）、営利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容（www. promega.co.jp/license/）をご確認頂く必要があります。 リアルタイム 26 シグナル伝達アッセイ（ cAMP［発光］） そ の他のバイオマーカー（エピジェネティクス、薬物代謝） HDAC-Glo™ Assay 3 種類の特異性基質が選べる発光 HDAC アッセイ HDAC-Glo™ Assays は、1 回の試薬添加だけで操作が完了するホモジニアスな発光アッセイシステムで、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC） クラス I、II、IIa およびクラス I 酵素 2 の相対的な酵素活性を細胞、抽出液、精製酵素などのサンプルソースより測定することができます。 このアッセイでは生細胞透過性の発光性アセチル化ペプチド基質を使用し、これが HDAC 活性により脱アセチル化されます。このペプ チドアミノルシフェリン基質の脱アセチル化は、Developer Reagent に含まれるアミノルシフェリン基質より脱アセチル化ペプチドを切除 するプロテアーゼ消化反応と遊離したアミノルシフェリンを定量するための Ultra-Glo™ 組換えホタルルシフェラーゼによる発光反応の連 動により測定することができます。アッセイの反応は通常 15 ～ 45 分以内に完了し、サンプルを移し換えるような手間もありません。 HDAC を介した発光シグナルは持続性（半減期 3 時間以上）を持ち、マルチウェルプレートのバッチ処理も行えます。 HDAC-Glo™ と CellTox™ Green（細胞毒性試験）のマルチアッセイ K562 細胞を CellTox™ Green Dye（細胞毒性試験）存在下で SAHA（選択的クラス I/IIb HDAC 阻害剤）または TMP269 （選択的クラス IIa HDAC 阻害剤）に 72 時間暴露 した。細胞毒性を蛍光測定した後、HDAC-Glo™ 2 Assay または HDAC-Glo™ Class IIa Assay で発光測定した。 製品名 サイズ カタログ番号 HDAC アッセイ（発光） HDAC-Glo™ I/II Assay 10ml G6420 5 × 10ml G6421 100ml G6422 HDAC-Glo™ Class IIa Assay 10ml G9560 HDAC-Glo™ 2 Assay 10ml G9590 ※ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 各種 HDAC-Glo™ のリコンビナント HDAC アイソザイムに 対する選択性 12638MA 0 4,000 8,000 12,000 16,000 20,000 0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 HDAC Luminescence (RLU) Cytotoxicity Fluorescence (RFU) CellTox™ Green Cytotoxicity Assay HDAC-Glo™ Class IIa Assay TMP269 Concentration (µM) 0 12,000 24,000 36,000 48,000 60,000 0 3,000 6,000 9,000 12,000 15,000 HDAC Luminescence (RLU) Cytotoxicity Fluorescence (RFU) CellTox™ Green Cytotoxicity Assay HDAC-Glo™ 2 Assay SAHA Concentration (µM) 0.01 0.1 1 1 10 00 0.01 0.1 1 1 10 00 A. B. 12638MA 0 4,000 8,000 12,000 16,000 20,000 0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 HDAC Luminescence (RLU) Cytotoxicity Fluorescence (RFU) CellTox™ Green Cytotoxicity Assay HDAC-Glo™ Class IIa Assay TMP269 Concentration (µM) 0 12,000 24,000 36,000 48,000 60,000 0 3,000 6,000 9,000 12,000 15,000 HDAC Luminescence (RLU) Cytotoxicity Fluorescence (RFU) CellTox™ Green Cytotoxicity Assay HDAC-Glo™ 2 Assay SAHA Concentration (µM) 0.01 0.1 1 1 10 00 0.01 0.1 1 1 10 00 A. B. Buffer 123 4 5 6 7 8 9 10 11 0 10,000 20,000 30,000 40,000 250,000 500,000 750,000 1,000,000 HDAC-Glo™ I/II Assay Luminescence (RLU) HDAC Isoenzyme A. Buffer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 HDAC-Glo™ Class IIa Assay Luminescence (RLU) HDAC Isoenzyme 0 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000 B. 12634MA Buffer 1 2 3456789 10 11 HDAC-Glo™ 2 Assay Luminescence (RLU) HDAC Isoenzyme 0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000 27 その他のアッセイ（HDAC ［発光］） P450-Glo™ Assay 細胞内の P450 活性を簡便に測定 P450-Glo™ （Cell Based） Assay は発光法を利用してシトクロム P450 活性を測定するためのシステムです。この発光法によるアッ セイは、非常に優れた感度を有し、低いバックグラウンド、広いダイナミックレンジを示します。P450-Glo™ Assayでは、ルシフェリン 誘導体である P450 発光基質を利用し、P450 活性により変換されたルシフェリンをルシフェラーゼ発光量として検出することができます。 P450-Glo™ Assayで生成する“グロータイプ”の発光シグナルは、耐熱性ルシフェラーゼと特殊なバッファーシステムを組合わせること により実現しました。 P450 発光基質および反応産物（ルシフェリン）は細胞透過性であるため細胞ベースのアッセイが可能です。発光性基質と培養細胞をイン キュベートすると細胞内の CYP 酵素により変換されたルシフェリンは、非溶解アッセイ（細胞上澄を移してアッセイ）あるいは溶解アッ セイ（細胞を含むウェルでアッセイ）で測定されます。非溶解アッセイの場合、P450 活性測定後に残る細胞を利用して他の細胞ベースアッ セイを行うことができます（細胞生存性試験：CellTiter-Glo® など）。P450-Glo™ Assay を用いた細胞ベースのアプリケーションとして、基 底 CYP 活性の測定、テスト化合物による活性誘導、テスト化合物による基底活性 / 誘導活性の阻害、核内受容体活性化の追跡（PXR, PXR, CAR, AHR, PPAR）などがあります。 • 迅速：煩雑で時間のかかる LC/MS や薄層クロマトグラフィー に比べ飛躍的に分析時間を短縮化。 • シンプル：簡単なプロトコルなのでマルチウェルプレートを用 いたハイスループットスクリーニングに対応。 • 蛍光による干渉なし：発光法なので、蛍光法で問題となる分 析対象や NADPH, CYP 基質の励起波長 / 蛍光波長の干渉が問 題になりません。 • 低い偽陽性：新規な安定型ホタルルシフェラーゼ（UltraGlo™Luciferase）、バッファー組成によりルシフェラーゼ阻害 による偽陽性を低減。 細胞ベースアッ セイ に適し た特異性の高い P450 発光基質 21 種類のヒト -P450 アイソフォームについて各 P450-GloTM Substrate を 用いて測定した。 5563MA Luciferin-CEE control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 25,000 50,000 75,000 100,000 125,000 150,000 175,000 Luminescence/pmol CYP450 E. A. B. Luciferin-1A2 control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 250,000 500,000 750,000 1,000,000 1,250,000 Luminescence/0.5pmol P450 Luciferin-IPA control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 100,000 200,000 300,000 400,000 500,000 Luminescence/0.1pmol CYP450 Luciferin-4A control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 250,000 500,000 750,000 1,000,000 1,250,000 Luminescence/pmol CYP450 D. Luminescence/pmol CYP450 Luciferin-H control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 100,000 200,000 300,000 400,000 C. 細胞ベースアッセイに適した特異性の高い P450 発光基質 21 種類のヒト -P450 アイソフォームについて各 P450-Glo™ Substrate を 用い て測定した。 Luciferin-CEE-Normalized (34-fold induction) 0.0 0.1 0.2 0.3 P450-Glo/CTG Luciferin-BE-Normalized (2.6-fold induction) 0.00 0.08 0.16 0.24 P450-Glo/CTG 0 50000 100000 150000 RLU Luciferin-CEE (38-fold induction) 0 40000 80000 120000 RLU Luciferin-BE (3-fold induction) Control 3-MC Control Control 3-MC Dex Control Dex 生細胞数で補正した P450 アッセイデータ 初代培養ラット肝細胞を用いて P450-Glo™ アッセイを行った。細胞は CYP450 遺伝子誘導剤（3-メチルコラントレンまたはデキサメタゾン）で 2 日 間処理した。その後、P450-Glo™ Substrate を培地に加え、4 時間インキュベー ションした。培地 100µl を取り出し、等量の P450-Glo™ luciferin detection reagent と混和した。下 2 つのグラフでは引き続き CellTiter-Glo® Assay により 細胞生存性を測定し、それにより補正した P450 活性を示した。化合物によ る処理は P450 活性を誘導したが、細胞死は誘導しなかった。 製品名 サイズ カタログ番号 P450 アッセイ（発光） P450-Glo™ CYP1A2 Induction/Inhibition Assay 10ml V8421 50ml V8422 P450-Glo™ CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA 10ml V9001 50ml V9002 P450-Glo™ CYP1A1 Assay （Luciferin-CEE） 10ml V8751 50ml V8752 P450-Glo™ CYP2C9 Assay （Luciferin-H） 10ml V8791 50ml V8792 ※ 96 ウェルプレートの場合 10ml は 200 ウェル分、50ml は 1000 ウェル分に相当 （1 ウェルあたり 50µl 使用）。384 ウェルプレートの場合 10ml は 400 ウェル分、 50ml は 2000 ウェル分に相当（1 ウェルあたり 25µl 使用）。 3D そ の他のバイオマーカー（エピジェネティクス、薬物代謝）（続き） 28 その他のアッセイ（P450 ［発光］） ル シフェラーゼ発光技術 ルシフェラーゼ酵素、基質および酸素（ホタルルシフェラーゼは ATP も）により発光シグナル（光子）を生じる発光反応はその希少性か ら殆どの生物においてバックグラウンドが実質的に無く、さらにエネルギー変換効率の高さや光源を不要とする特性により長く生物学 実験で利用されています。しかし、急激に消光する特性やルシフェラーゼタンパク質の不安定性（易熱性）などのネイティブタンパク質 の本来の性質により、アプリケーションは限られていました。プロメガは発光時間の延長や反応系の安定化を図ることにより、これらの 問題を解決することで、より使いやすく、幅広い用途に使えるルシフェラーゼ試薬を開発してきました。 Ultra-Glo™ ルシフェラーゼ 安定性の高い改変型ホタルルシフェラーゼで、プロメガの ATP およびルシフェリン検出試薬（発光アッセイ試薬）に含まれています。様々 な試薬成分存在下でも活性が保持されるため、様々なアッセイ試薬の構成成分として利用されています。またネイティブのルシフェラー ゼに比べ偽陽性が低く抑えられているため、ハイスループットスクリーニングにも最適です。 NanoLuc® ルシフェラーゼ 深海エビ（トゲオキヒオドシエビ［Oplophorus gracilirostris］）由来の新しいルシフェラーゼで、発光レポーターとして最適なパフォーマン スを発揮するために改変された分子量の小さな発光酵素（19 kDa）です。このルシフェラーゼはホタルやウミシイタケのものより約 150 倍明るく、高レベルの発光を長時間維持するための新規な基質 furimazine を用いて測定します。発光反応は ATP 非依存性で、最大の感 度を得るためにバックグラウウンド発光が抑えられるようにデザインされています。furimazine を改変した MT Cell Viability Substrate は細 胞透過性の前駆体基質で、生細胞の還元能により NanoLuc® の基質に変換され、発光反応に利用されます。この基質は RealTime-Glo™ に含まれており、経時的な細胞生存性試験を可能にします。また、この NanoLuc® を 2 つに分断した SmBiT および LgBiT 断片にアネキシン V を融合させたタンパク質を利用した発光アッセイ法によりリアルタイムにアポトーシスを観察することができるようになりました。 Reporter Sensor CASPASE-3/7 CASPASE-8 Glucose Glucose HDAC Lactate Glutamin Glutamate Glycerol Triglyceride Cholesterol Proteasome CASPASE-9 CASPASE-1 AUTOPHAGY-SENSOR CAMP-SENSOR y R ATP LDH LCP* PS** DCP* P450 H₂ O₂ 還元能 DNA FRAGMENT Death Markers Mitochondrial Toxicity Live Markers Mechanism of Apoptosis Apoptosis & Pyrotosis Markers GSH/GSSG NAD（P）/NAD（P）H Mechanism of Cell Death Redox Markers Other Markers Energy Metabolism Markers * LCP:Live Cell Protease, DCP:Dead Cell Protease **PS : Phosphatidylserine Stimulus プロメガのアッセイ試薬で測定可能な各種バイオマーカー 29 転写活性レポーター（ジェネティックレポーター） 転写応答をレポーティングするジェネティックレポーターの応用 定量に適した酵素を利用したレポーターアッセイは遺伝子発現に必要なシスエレメント（DNA 配列）の 解析に長く利用され、様々なシグナル伝達経路から転写因子に対応したプロモーター、応答配列が明らかとなりました。これらシグナ ル応答に対応する応答配列を“受信機”、レポーター酵素を“定量可能なシグナル”として利用することにより、低分子化合物のスクリー ニング、抗体医薬の評価、毒性物質の感受性試験などに利用されるバイオセンサーとして応用されています。近年普及してきたゲノム編 集技術や高輝度レポーター酵素（NanoLuc® など）を組み合わせることでより様々な分野での応用が期待されます。 バイオロジックスのためのバイオアッセイ 抗体医薬の開発・品質管理に最適［応答配列： NFAT, IL-2 など］ NFAT 応答や IL-2 プロモーターは免疫細胞などが活性化すると 応答することが知られており、ルシフェラーゼを組み込んだ細 胞はバイオロジックス（抗体医薬など）を評価するバイオセンサー として利用することができます。プロメガではルシフェラーゼレ ポーターを組み込んだ細胞を含む ADCC（抗体依存性細胞傷害）、 ADCP（抗体依存性細胞貪食）、PD-1/PD-L1 遮断、T 細胞活性化 に関する各種バイオアッセイをそろえています。 転写活性 / シグナル伝達 特定のシグナルの ON と OFF をハイスループットで解析 分子生物学的手法により様々なタンパク質発現にかかわる転写 調節配列が明らかになり、レポーターアッセイは細胞内のシグ ナル伝達スイッチ（転写量）を検出する有効なツールとして基礎 研究や創薬研究に利用されています。細胞は化学物質による毒 性のほか、紫外線、放射線、温度、物理的刺激など様々なスト レスに絶えずさらされています。これらのストレスには細胞内の ストレス応答機構が反応することが分かっています。レポーター アッセイは、このようなストレス応答機構を含め、細胞の広範 なシグナル経路の解析ができます。プロメガでは種々の細胞ス トレスに対する応答エレメントを搭載した、レポーターベクター を幅広く揃えています。これらのベクターを用いたレポーター アッセイにより、細胞ストレスのシグナル伝達経路の特定、各 種細胞のストレス耐性の検討、ストレス化合物の毒性評価など の解析が可能です。 感受性試験 化粧品、医薬部外品の安全性評価、薬物代謝試験や環境ホルモン検出など［応答配列： ARE、XRE など］ 応答配列とレポーターを組み合わせたバイオセンサーは化合物やホルモンなどの生理活性物質を検知することができます。 KeratinoSens™（Givaudan 社が開発）は皮膚感作性を調べるための in vitro 試験法として化粧品・医薬部外品の安全性評価に活用されて います。この手法の原理は ARE 応答配列を利用したレポーターアッセイです。従来はマウス等の動物を用いて皮膚感作性試験が行われ ていましたが、近年、動物実験代替法としてこのような in vitro の試験手法が一般化されつつあります。 標的シグナル 標的配列 転写因子 13008MA イベント 1 TCR（T 細胞受容体）を介した NFAT の活性化 イベント 3 抗PD-1 または 抗PD-L1 抗体による NFAT シグナルの回復 イベント 2 PD-1:PD-L1 による NFAT シグナル の阻害 PD-1 Effector Cell PD-L1 aAPC Cell Glo NFAT-RE Luciferase Signal Recovery PD-1 PD-L1 p53 RE HRE AP1 RE ARE ATF6RE XRE HSE MRE Control NF-κB RE Cell-Titer Fluor 4 3 2 1 0 -7 -6 -5 -4 log [CdCl2] (M) Fold Response HepG2 cells stimulated 6 hrs 同一プレートでのストレス応答パネルに対する化合物プロファイリング HepG2 細胞に各ストレス応答配列を含むレポーター DNA をトランスフェク ションした後、96 ウェルプレートに移し O/N でインキュベーションした。各化 合物で処理し、CellTiter-Fluor™ で細胞生存性を蛍光で測定した後に ONE-Glo™ でルシフェラーゼレポーターを測定した。 PD-1/ PD-L1 Blockade Bioassay の測定原理 30 レ ポーターアッセイ：プラスミドセンサーを導入した細胞アッセイ 外来性の DNA を導入し、細胞内の様々な情報をレポートするバイオセンサー 生体機能を反映すると同時に実験のスループットを満たす培養細胞は、これまでの生物学実験に必須の実験サンプルであり、生きた細 胞の変化や応答性を内在性の様々なマーカーを指標として測定する高感度な測定法が開発されました。多くの細胞内イベントは酵素に よるシグナル伝達や代謝経路で構成されており、これらのマーカーとしての酵素や代謝物を測定することで細胞内の応答を測定するこ とができます。しかし、酵素活性を持たない場合、結合活性 [ 相互作用 （タンパク質： ] DNA、タンパク質：タンパク質）を測定すること は有用です。細胞内での分子間相互作用は外来遺伝子ベクターを導入することで容易に測定することができます。これは細胞内の重要 な情報をキャッチする重要なバイオセンサーと考えることができます。 タンパク質標識レポーター（プロテインレポーター） 標的タンパク質と融合させたタンパク質機能の解析、イメージングへの応用 これまで、標的タンパク質の局在性観察や単離・精製を容易にするために検出に適したタンパク質（例：蛍光タンパク質）や特定の分子 と親和性を有するタンパク質（例：His タグ）を融合させた標的タンパク質を発現させる手法が利用されてきました。また、酵素などに 変異を加えたタンパク質センサーなども開発されています。プロメガでは新しいレポーター分子 NanoLuc® と HaloTag® 並びにホタルルシ フェラーゼをプロテインレポーターとして様々なバイオセンサーを開発しています。 レポーターアッセイの詳細について以下の “ 発光レポーターガイド ” をご覧ください。 www.promega.co.jp/tech/reference タンパク質間相互作用 NanoBRET™ NanoLuc® 融合タンパク質（X）と HaloTag® 融合タンパク質（Y）を細 胞内で発現させ、タンパク質間の相互作用を BRET （生物発光共鳴 エネルギー転移）で検出するシステム。NanoLuc® による強力な発光 と HaloTag® を標識するための HaloTag® 618 Ligand の蛍光特性によ りこれまでにない BRET 解析が可能です。 NanoBiT™ NanoLuc® を低分子の SmBiT（11 アミノ酸）と LgBiT（17.6kDa）に分 割した酵素断片をそれぞれタンパク質（X）またはタンパク質（Y）と の融合タンパク質として発現させ、細胞内で標的タンパク質間の相 互作用を検出する発光アッセイ法。SmBiT が非常に小さいため標的 タンパク質の機能を損わず、発光による高感度測定が可能です。 酵素改変センサー GloSensor™ 発光酵素自体を改変することで様々なバイオセンサーを設計するこ とができます。ホタルルシフェラーゼの内部に cAMP 結合タンパク 質の一部を挿入するための遺伝子改変を行った GloSensor™ cAMP Assay は細胞内の cAMP をリアルタイムに検出することができます。 タンパク質安定性試験（タンパク質分解） NanoLuc™ または HaloTag® 融合タンパク質 細胞内でのタンパク質のターンオーバーのスピードはそれぞれ異な り、その安定性を定量化することでより上流のシグナルを捕えること ができます。NanoLuc® や HaloTag® との融合タンパク質は簡便に作成 できるタンパク質安定性センサーとして機能します。 標的タンパク質の検出 HiBiT 標的タンパク質の遺伝子に HiBiT 配列 (11 アミノ酸 ) を導入し、LgBiT を含む試薬を添加することで標的タンパク質を高感度に検出するこ とができます（HiBiT と LgBiT タンパク質のペアは SmBiT と LgBiT の ペアとは異なり高い親和性を有する）。HiBiT はサイズが非常に小さ いのでゲノム編集による内在性タンパク質の検出やウィルスゲノムへ の導入に最適です。現在、ライセート中のタンパク質の迅速な定量 法や膜に転写したタンパク質の高感度測定などのアプリケーション が考えられています。詳細については弊社までお問合せください。 標的タンパク質 B 標的タンパク質 A 変異サイト 標的分子 タンパク質間相互作用の ダイナミクスをモニタリングできる NanoBiT™ の可逆性 SmBiT-CA:LgBiT-R2A（PKA 触媒サブユニットあるいは調節サブユニット と NanoBiT™ 断片の融合タンパク質）を発現する HEK293 細胞にイソ プロ テレノール（ISO）、プロプラノール（PRO）または フォルスコリン （FSK）で順次刺激してタンパク質間相互作用を検出した •NanoLuc® : 分子量 19KDa の小さな発光酵素で、従来のルシフェラーゼの 100 倍以上の輝度を有する最新のルシフェラーゼ •HaloTag® : 分子量 33kDa のタンパク質で試薬として加える低分子の蛍光リガンドやビオチンリガンドと特異的に共有結合するため、細胞内イメージングやタンパク質精製が可能 100 75 50 25 0 0 20 40 60 NanoBiT（% signal decreas ）e Time（min） NanoBiT ISO PRO FSK レポーターアッセイ（ジェネティック & プロテイン［発光］） 31 GloMax® System GloMax® Discover System はプロメガのアッセイシステムに関する英知を結集してデザインした Ready-to-Use の多機能性マルチモードリーダー（発 光、蛍光、吸光［UV / 可視光］、BRET、FRET）で、カイネティクス測定にも対応します。プリインストールされたプロメガ試薬のアッセイプロト コルで直ぐに実験を開始することができ、ネットワークへのアクセスによりデータを望みのドライブに転送することができます。フィルターパド ルとフィルター自動切り替え機能によりマルチプレックスアッセイやカイネティクス実験にも対応します。プレートマスキングシステム（96 / 384 スイッチング）によりウェル間のクロストークを極限まで抑えた高感度測定が可能となり、ワイドなダイナミックレンジが得られます。多機能な Discover （発光、蛍光、吸光や BRET / FRET 測定機能）から発光測定専用機 Navigator まで用途に合わせてお選びいただけます。 ルミノメーターは生物発光を高感度に測定する装置で、ルシフェラーゼレポー ターアッセイの普及により一般的になり、現在では細胞ベースの様々なアッ セイや生化学的測定にも使用されています。プロメガのルミノメーターは、 数多くの発光アッセイ試薬を開発しアッセイケミストリーを熟知した技術者 のアイディアを反映させた、高感度で使いやすい測定装置です。 NanoBRET™ アッセイの例 阻害剤である Nutlin-3 の存在下・非存在下で p53 と Mdm2 の相互作用を検出した。機器 は GloMax® Discover System を使用した。エラーバーが小さく、良好な Z’-factor が得られた。 1.71 0.49 No Drug Corrected mBU Nutlin-3 Z’=0.92 1.85 0.68 No Drug Corrected mBU Nutlin-3 Z’=0.71 1.71 0.49 No Drug Corrected mBU Nutlin-3 Z’=0.92 1.85 0.68 No Drug Corrected mBU Nutlin-3 Z’=0.71 96 ウェル プレート 384 ウェル プレート ルミノメーターをお貸出しいたします！ www.promega.co.jp/rentamax/ • 発光、蛍光、吸光［UV / 可視光］測定および BRET、FRET 対応 • 9 桁以上のダイナミックレンジ（発光測定） • 6 ～ 384 ウェルプレートおよび自動分注ロボットによる HTS にも 対応（ハイスピード測定：96 ウェル［1 分間］、384 ウェル［3 分間］） • 撹拌機能 / 温度管理機能 • 付属のタブレット PC によるタッチスクリーン操作、LAN 接続 特長（GloMax® Discover） クロストークを最小限に抑える検出機構 製品名 サイズ カタログ番号 GloMax® Discover System （発光 / 蛍光 / 紫外可視吸光 / BRET / FRET） 1 台 GM3000 GloMax® Explorer System, Fully Loaded Model （発光 / 蛍光 / 可視吸光） 1 台 GM3500 GloMax® Explorer System, Luminescence and Fluorescence （発光 / 蛍光） 1 台 GM3510 GloMax® Navigator System（発光） 1 台 GM2000 GloMax® Discover / Explorer / Navigator System の装備比較 Model Lum Fluor. Vis Abs UV-Vis Abs BRET/FRET GloMax® Discover GM3000 ✓ ✓ ✓ ✓ GloMax® Explorer GM3500 ✓ ✓ ✓ GloMax® Explorer GM3510 ✓ ✓ GloMax® Navigator GM2000 ✓ マ ルチプレートリーダー GloMax® GloMax Navigator ® Discover/Explorer 他社プレートリーダー断面図 検出器 検出器 GloMax® 96 断面図 プレート プレート オプティカルマスク サンプルトレイカバー 検出器 GloMax® ドームマスキングシステム Discover / Explorer 断面図 プレート 他社プレートリーダー断面図 検出器 検出器 GloMax® 96 断面図 プレート プレート オプティカルマスク サンプルトレイカバー 検出器 GloMax® ドームマスキングシステム Discover / Explorer 断面図 プレート テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982　● E-Mail : prometec@jp.promega.com PK2009-03B 販売店 日本語 Web site：www.promega.jp プロメガ株式会社 本　　　社　〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所　〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2020年9月現在のものであり予告なしに変更することがあります。 マルチプレートリーダー