Cell Tox Guide

セルベースアッセイ

Cell Tox Guide

日本語（PDF）(2016/01改訂)	オンライン閲覧

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Cell Tox Guide 細胞死メカニズムからスクリーニングまで Contents： • イントロダクション 2 　・細胞毒性 4 　・ミトコンドリア毒性 9 　・アポトーシス＆細胞死メカニズム 10 　・グルタチオンアッセイ 12 　・P450アッセイ 13 　・ADCCアッセイ 14 　・レポーターによるストレスアッセイ 15 　・マルチプレートリーダー 16 2 TF NFAT luc2 TF RE luc2 CASPASE-3/7 CASPASE-8 CASPASE-9 LUCIFERASE Target Cell Effector Cell ATP LDH LCP* DCP* P450 NADH DNA FRAGMENT Death Markers Mitochondrial Toxicity Live Markers Mechanism of Apoptosis Apoptosis Markers GSH/GSSG Mechanism of Cell Death ADCC Antibodydependent cell-mediated cytotoxicity Stress Signals * LCP:Live Cell Protease, DCP:Dead Cell Protease Stress Factors 9 ページ 11 ページ 10 ページ 6 ページ 8 ページ 6 ページ 4 ページ 5 ページ 8 ページ 10 ページ 12 ページ 13 ページ 14 ページ 15 ページ 細胞毒性と医薬品開発 培養細胞を用いた増殖試験や毒性試験は、ドラッグスクリーニングや各種物質の毒性分析に不可欠であり、動物個体を用いた 実験手法に比べて処理能力や操作性に優れます。近年は、iPS細胞を代表する多能性幹細胞の研究分野の発展により、疾患モデ ルとしての患者由来の培養細胞を毒性試験のスクリーニングに用いることが可能になりつつあります。このような貴重な細胞 を実験材料として用いる際、少量の細胞から高感度で精度の高い試験データを得ることが、実験上必要となってきます。プロ メガでは、ルシフェラーゼによる生物発光を中心とした高感度で簡便なアッセイ試薬を開発すると同時に、一度のアッセイで より多くの情報が得られる様々なアッセイシステムを開発しており、希少サンプルを用いたスクリーニングに適しています。 また、近年その応用が期待されている抗体医薬は、正常な細胞まで破壊する従来の抗癌剤等とは違い、副作用の少ない効果的 な治療薬として注目されています。この抗体医薬の作用機序の一つADCC（Antibody-Dependent-Cell-mediated-Cytotoxicity： 抗体依存性細胞傷害）活性は抗体医薬の質を測るうえで重要なファクターであり、抗体医薬を開発する上で重要なデータと なります。プロメガでは従来のADCCアッセイを改良し、レポーターを用いた生物発光を利用したアッセイシステムADCC Reporter Bioassay Kitを開発することに成功しました。これにより、従来法に比べ、より高感度かつ短時間で治療用抗体の活性 を定量化することが可能になります。 細胞毒性マーカー（ATP, LDH, Protease, DNA）と毒性シグナル経路について 細胞毒性を図る古典的な方法としてこれまで 51Cr 放出アッセイやトリパンブルー染色などの方法がとられてきましたが、それ ぞれRI取扱いの問題や多検体処理が困難であることなどから現在では細胞内マーカーを測定する方法が広く用いられていま す。細胞内マーカーには細胞傷害により漏出したマーカーを検出し、細胞死を直接的に測定する方法や、細胞内の代謝機能を 測定し、その減少をとらえて細胞毒性を見積もる方法があります。現在最も利用されている細胞漏出マーカーとして乳酸脱水 素酵素（LDH）、細胞代謝活性の指標としてはNADHなどによる還元能を測定する方法などが挙げられます。プロメガでは新 規細胞内マーカーの発見や新しい基質、色素を採用した数多くのアッセイキットを販売しており、用途に合わせ選択して頂け ます。 細胞毒性関連マップ イントロダクション Cell Tox GUIDE 3 細胞毒性関連製品選択ガイド 製品名 マーカー 検出 検出までの 時間 感度 マルチ アッセイ ページ 細胞毒性試験 死細胞 CellTox ™ Green Cytotoxicity Assay DNA 蛍光（Ex513/Em532） 0 分間 -72 時間※ 細胞 200 個 ◎ 4 CytoTox-Glo ™ Assay DCP 発光 15 分間 細胞 10 個 ○ 7 CytoTox-Fluor ™ Assay 蛍光（Ex485/Em520） 30 分間 -3 時間 細胞 10 個 ○ 7 CytoTox-ONE ™ Assay LDH 蛍光（Ex560/Em590） 10 分間 細胞 200 個 ○ 8 CytoTox 96® Cytotoxicity Assay 発色（490nm） 30 分間 細胞 1000 個 － 8 生細胞 CellTiter-Glo® Assay ATP （エネルギー合成能） 発光 10 分間 細胞 10 個 * ○ 5 CellTiter-Fluor ™ Assay LCP 蛍光（Ex400/Em505） 30 分間 -3 時間 細胞 40 個 ◎ 7 CellTiter-Blue® Assay 還元能 （NADH など） 蛍光（Ex560/Em590） または発色（570nm） 1-4 時間 細胞 50 個 * ○ 8 CellTiter 96® AQueous One Solution Assay 発色（490nm） 1-4 時間 細胞 800 個 － 8 アポトーシス細胞 Caspase-Glo® Assay Caspase-3/7、8、9 発光 30 分間 -2 時間 細胞 20 個（3/7）* ○ 10 Apo-ONE® Caspase-3/7 Assay Caspase-3/7 蛍光（Ex499/Em521） 1-18 時間 細胞 200 個 * ○ 11 酸化ストレス細胞 GSH/GSSG-Glo ™ Assay 総グルタチオン /GSSG 発光 1 時間 細胞 300 個 * ○ 12 GSH-Glo ™ Glutathione Assay 還元型グルタチオン 発光 1 時間 細胞 300 個 * ○ 12 細胞死メカニズム（マルチアッセイ） アポトーシス細胞 / 生細胞 / 死細胞 ApoTox-Glo ™ Triplex Assay LCP/ DCP/ カスパーゼ 蛍光（Ex400/Em505） / （Ex485/Em520）/ 発光 1 時間 生細胞 40 個 / 死細胞 10/ アポトーシス細胞 20 個 － 11 アポトーシス細胞 / 生細胞 ApoLive-Glo ™ Multiplex Assay LCP/ カスパーゼ 蛍光（Ex400/Em505） / 発光 30 分間 生細胞 40 個 / アポ トーシス細胞 20 個 ○ 11 生細胞 / 死細胞 MultiTox-Fluor Assay LCP/ DCP 蛍光（Ex400/Em505） / （Ex485/Em520） 30 分間 -3 時間 生細胞 40 個 / 死細胞 10 個 ○ 7 MultiTox-Glo Assay LCP/ DCP 蛍光（Ex400/Em505） / 発光 30 分間 生細胞 40 個 / 死細胞 10 個 ○ 7 ミトコンドリア毒性 （死細胞 / ミトコンド リア活性） Mitochondrial ToxGlo™ Assay DCP/ATP 蛍光（Ex485/Em520）/ 発光 30 分間 － ○ 9 製品名 マーカー 検出 検出までの 時間 感度 マルチ アッセイ ページ P450 活性 薬物代謝 P450-Glo ™ Assay CYP1A2, 3A4, 1A1, 2C9, 4A 発光 1-6 時間 高 ○ 13 製品名 検出 感度 ページ ADCC 抗体医薬の エフェクター機能 ADCC Reporter Bioassay Kit 発光（T 細胞核内転写因子 [NFAT] 応答配列による レポーターアッセイ） 高 14 製品名 応答配列 検出 感度 ページ ストレス応答 酸化ストレス pGL4.37[luc2P/ARE/Hygro] Vector 抗酸化剤応答配列 (ARE) ・各種応答配列を含むルシフェラーゼレポー ター ベクターを細胞内に導入し、ルシフェ ラーゼ活性を測定　　　　　　　　　　　 ・ONE-Glo™ によるストレス応答測定　　　 ・ONE-Glo™ + Tox Luciferase Reporter and Cell Viability Assay による細胞数測定法との マルチプレックスも可能 高 15 DNA 損傷 pGL4.38[luc2P/p53 RE/Hygro] Vector p53 応答配列 (p53 RE) 小胞体ストレス pGL4.39[luc2P/ATF6 RE/Hygro] Vector 活性化転写因子 6 応答配列 (ATF6 RE) 重金属ストレス pGL4.40[luc2P/MRE/Hygro] Vector 金属応答配列 (MRE) 熱ショック pGL4.41[luc2P/HSE/Hygro] Vector 熱ショック配列 (HSE) 低酸素ストレス pGL4.42[luc2P/HRE/Hygro] Vector 低酸素応答配列 (HRE) 生体異物ストレス pGL4.43[luc2P/XRE/Hygro] Vector 生体異物応答配列 (XRE) MAPK/JNK pGL4.44[luc2P/AP1 RE/Hygro] Vector AP1 応答配列 (AP1 RE) ※ 0 ステップアッセイなら常に測定でき、最大 72 時間細胞毒性を観察可能　*384 ウェルプレート LCP：Live Cell Protease、DCP：Dead Cell Protease NEW NEW NEW NEW イントロダクション 4 CellTox™ Green Cytotoxicity Assay （蛍光 : 細胞毒性） 最も簡便な細胞毒性試験。長時間の経時変化も追跡可能！ 細胞毒性を検出する際、細胞死のマーカーの選択が重要となります。従来の細胞毒性試験においては、LDHや死細胞由来のプロテ アーゼなどの酵素活性をマーカーとしてきました。これら酵素ベースの細胞毒性キットの問題点として、細胞死マーカーとしての 酵素が長時間にわたる培養により分解してしまうという点がありました。プロメガではこの問題点を克服するため、細胞膜非透過 性の新規なDNA結合型蛍光色素を利用したアッセイキットCellTox™ Green Cytotoxicity Assayを開発しました。CellTox™ Green Cytotoxicity Assayは細胞膜非透過性のDNA結合型蛍光色素CellTox™ Green Dyeを用いて、生細胞から排出され、死細胞由来のDNAに 選択的に結合し、細胞膜障害性を検出します。CellTox™ Green Dyeは細胞に対して毒性を示さず、薬剤暴露後72時間後でも安定し たシグナルを維持するため、経時的測定あるいは長時間の薬剤暴露後のエンドポイント測定による毒性評価に最適です。 オプション1 色素を予め 培養細胞に添加 （0ステップ） オプション2 披検化合物に予め 色素を添加 （0ステップ） インキュ ベーション 検出 11203MA オプション3 エンドポイントアッセイ （1ステップ） 10887MA 生細胞 死細胞 蛍光 → 低 蛍光 → 高 蛍光色素 DNA DNAと結合し蛍光レベルが増加 Log 10935MA [bortezomib], M Fluorescence (RFU) Luminescence (RLU) –10 –9 –8 –7 –6 –5 6,000 8,000 10,000 12,000 14,000 0 100,000 200,000 300,000 400,000 CellTox™ Green Assay CellTiter-Glo® Assay 11114MA 30,000 20,000 10,000 0 4hr 24hr 48hr 72hr -9 -8 -7 -6 -5 Log [Bortezomib] Fluorescence (RFU) 3 つのプロトコルから選べます！ 予め培養細胞や化合物に試薬を溶解させる 0 ステップアッセイで経時的に 観察が可能。最後に試薬を加える 1 ステップのエンドポイントアッセイ。 マルチアッセイによる細胞健全性の相補的な測定 K562 細胞をボルテゾミブ処理 48 時間後に CellToxTM Green Reagent（細胞毒性）、CellTiter-Glo® Reagent（細胞生存性）で測 定した。どちらども同様の EC50 値を示した。 CellToxTM Green による経時的な分析 K562 細胞のボルテゾミブ処理 4 ～ 72 時間後の細胞毒性 CellToxTM Green の測定原理 細胞非透過性の蛍光色素が死細胞から漏出した DNA に結合し 蛍光強度が増加 ・簡便：0 ステップ（細胞播種前あるいは薬剤含有培地に Dye を直接加える）で、試薬の分注ステップを省略できる。 ・低毒性：薬剤暴露後 0-72 時間の長時間の経時的測定が可能。 ・マルチアッセイ：細胞生存性試験、アポトーシス試験などとの マルチアッセイが可能。 ・様々なサンプル種に対応：接着細胞、浮遊細胞、3D 培養、 バクテリアなど 細胞毒性試験の最先端検出テクノロジー 新しい DNA マーカーと ATP マーカー測定技術 細胞毒性試験（先進技術） 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 細胞毒性試験（蛍光・DNA） アッセイシステム CellTox™ Green Cytotoxicity Assay 10ml G8741 16,000 50ml G8742 63,000 100ml G8743 91,000 CellTox™ Green Express Cytotoxicity Assay (Dye) 200µl G8731 85,000 ・10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 NEW Cell Tox GUIDE 5 CellTiter-Glo® Assay （発光 : 細胞生存性） 超高感度な細胞内ATPをベースとした細胞生存試験 細胞生存性の定量化においても、安定性の高い、より高精度なマーカーの選択が重要となります。ATP （アデノシン三リン酸） は代謝活性のある全ての細胞に存在し、その濃度は細胞がネクローシスあるいはアポトーシスを起こしたときに急速に減少する ため、ATPは細胞障害、細胞増殖抑制あるいは細胞増殖効果の優れたマーカーとなります。プロメガのCellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assayは、代謝活性のある細胞に由来するATPを定量することで培養中の生存細胞数を測定する細胞増殖・毒性 システムです。マルチプレートのアッセイ用にデザインされており、自動化されたハイスループットスクリーニング（HTS）に も最適です。優れた感度を示すため、発色法では困難な浮遊細胞・三次元培養細胞を用いる場合に威力を発揮します。 Luminescence (RLU) Cells per Well 0 100 200 300 400 0 10 20 0 200 400 600 800 1,000 1,200 1,400 1,600 1,800 0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 3171MB04_1A 細胞数と発光量の相関関係 CellTiter-Glo® Assay で測定した場合、発光量と細胞数には直接的な 相関関係が認められる。 0 50 100 150 200 250 300 Activity (% RLU) Time (minutes) No Inhibitor Inhibitor 0 20 40 60 80 100 120 3422MA05_1A CellTiter-Glo® Reagent による ATPase 活性の阻害 L929 細胞ライセートを 2 つのプールに分けて HEPES（no inhibitor）ま たは CellTiter-Glo® Buffer （inhibitor）を添加し、22℃でインキュベーショ ンした。経時的にサンプルを分取しCellTiter-Glo® Substrateで測定した。 4146MA05_3A 0 1 3 10 1 3 10 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Relative Values (Percent) Cell Number (x 103) Absorbance Luminescence 3T3 Cells A-12 Cells CellTiter-Glo® Assay と従来法との比較 従来法は細胞内酵素によりテトラゾリウム塩 WST-1 から変換したホル マザン産物を測定。NIH3T3 および A-12（PARP-1 欠損）を表示量 96 ウェ ルプレートに播種した（100µl）。CellTiter-Glo® Reagent （100µl）また は WST-1（10 µl）を添加、混和し、インキュベーションした後に発光 または吸光度を測定した。各測定は 4 ウェルずつ行い、細胞を含まな いバックグランド値は差し引かずに計算した。 ・ホモジニアス：ワン – ショットタイプ（添加→混合→測定）なので他の ATP 測定システムに比べプレートのハンドリングが最小限。 ・迅　速：試薬添加 10 分後にデーターが得られます。 ・高感度：標準的な発色または蛍光定量法に較べ優れた感度（細胞 10 個［384 プレート］、細胞 50 個［96 プレート］を検出）。 ・正確：発色法より正確な定量性 ・安定性：発光が非常に安定（5 時間以上）。 ・応用性：様々なマルチプレートに適応し、ルミノメーターあるいは CCD カメラで測定 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 10183MA volume [mm3 ] ATP (nmol/microtissue) SNB-19 スフェロイドと ATP 含量の関係 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10,000 cells/drop で播種した 4 日後の SNB-19 （ヒトグリア芽腫細胞）スフェロイドのサイズと ATP 含量は 非常に優れた直線性を示した（r 2 =0.99）。左上パネル：標準的な単層 培養（2D）。右上パネル：スフェロイド培養（3D） 細胞毒性試験（先進技術） 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 細胞生存性試験（発光・ATP） アッセイシステム CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay 10ml G7570 14,000 10X10ml G7571 59,000 100ml G7572 53,000 10X10ml G7573 450,000 ・10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 6 生細胞 死細胞 5847MA 生プロテアーゼ （活性化） GF GF AAF 死細胞用 発光/蛍光基質 (細胞非透過性) 生細胞用 蛍光基質 (細胞透過性) 生プロテアーゼ （不活性化） 死プロテアーゼ GFGF AAF GF SIGNAL SIGNAL 新しい細胞生存性・毒性試験の測定原理 GF- 基質は生細胞に透過し、“生細胞”プロテアーゼ（LCP）による 切断でシグナルを生じる。AAF- 基質は生細胞に透過できず、漏出 した“細胞死”由来のプロテアー ゼ（DCP）によりシグナルを生じる。 プロテアーゼマーカー プロメガでは細胞毒性あるいは細胞生存性にリンクする恒常的プロテアーゼ活性をペプチドベースのスクリーニングにより発 見しました。これらのプロテアーゼ活性は特異的な配列を有するペプチド基質を用いた発光法あるいは蛍光法で検出すること が容易であり、しかもアッセイ系を比較的容易に設計できるため、複数のパラメーターを同時に測定するマルチアッセイに最 適です。 生細胞プロテアーゼ（LCP：Live Cell Protease）は細胞透過性のペプチド基質（蛍光:GF-AFC）を用いて測定します。この生 細胞プロテアーゼマーカーは、細胞膜の完全性が失われて周囲の培地に漏出すると不活性化され、生細胞で起こるような反応 は見られなくなります。一方、死細胞プロテアーゼ（DCP：Dead Cell Protease）マーカーは細胞膜の完全性が失われた細胞 から漏出して初めて測定されます。この活性は細胞非透過性のペプチド基質（蛍光:AAF-R110または発光:AAF-GloTM）で測定し ます。 これらの基質を採用した新しい細胞増殖試験、細胞毒性 試験キットを開発し、細胞死のメカニズムを解析するた めにこれらのシステムを組み合せたマルチアッセイシス テムを揃えました。また、プロメガの発光アッセイや波 長の区別が可能な他の蛍光アッセイと併用することもで きます（カスパーゼアッセイ、レポーターアッセイ、他 のバイオマーカーを用いた生存性試験など）。 LDH Release Fluorescence (RFU) 0 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000 bis-AAF-R110 Fluorescence (RFU) r 2 = 0.9782 0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 Resorufin Fluorescence (RFU) 2,500 2,600 2,700 2,800 2,900 3,000 3,100 GF-AFC Fluorescence (RFU) r2 = 0.963 500 600 700 800 900 1,000 1,100 従来の細胞毒性試験、細胞生存性との相関性 上パネル . 死細胞の希釈系列サンプルからの CytoTox-FluorTM Cytotoxicity Assay シグナルを LDH 放出アッセイ（CytoTox-ONETM Assay）からの 値に対してプロットした。下パネル . 生細胞の希釈系列サンプルから の CytoTox-FluorTM Cytotoxicity Assay シグナルを Resorufin を利用した NADH 還元能アッセイ（CellTiter-Blue® Cell Viability Assay）からの値に 対してプロットした。 マルチプレックス分析に最適なプロテアーゼマーカー プロメガが発見した生細胞、死細胞に特異的なプロテアーゼ活性を利用 細胞毒性試験（プロテアーゼマーカー） GF-AFC および MTT、レサズリンの毒性比較 Balb 3T3 細胞を各細胞生存試験用の発色 / 蛍光基質とともに 4 時間イン キュベーションした後、同一視野を観察した。MTT およびレサズリンで は 4 時間後に明らかな細胞形態の変化が認められたが GF-AFC では変 化はみとめられなかった。Images captured using Incucyte instrument from Essen Biosciences 0 hr GF-AFC MTT レサズリン 4 hr Cell Tox GUIDE 7 シングルアッセイ CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay （蛍光 : 細胞生存性） 蛍光基質（GF-AFC）を用いて細胞生存性を測定します。発光法 をはじめとする様々なアッセイ法との相性が良く、同一ウェル内 で他の測定反応と組み合せた連続マルチプレックスアッセイが行 え、細胞数で補正された正確な値を得ることができます。 CytoTox-Fluor™ Cytotoxicity Assay （蛍光 : 細胞毒性） 蛍光基質（bis-AAF-R110）を用いて細胞毒性を測定します。発 光アッセイやスペクトルが識別できる他の蛍光アッセイ法（カス パーゼの活性化、レポーター遺伝子の発現、生存性試験）とのマ ルチアッセイを想定してデザインされています。 CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay （発光: 細胞毒性） 発光基質（AAF-GloTM）を用いて細胞毒性を測定します。非常に 高感度で従来のLDHアッセイと優れた相関性を示します。本製品 に添付される細胞溶解剤を加えることにより、各アッセイウェル 内の総細胞数に応じた発光シグナルを得ることもできます。その ため、この総細胞数の発光値から死細胞の発光シグナルを差し引 くことにより生存性を算出することもできます。 デュアルアッセイ MultiTox-Glo Multiplex Cytotoxicity Assay （蛍光 – 発光 : 細胞生存性 – 細胞毒性） MultiTox-Fluor Multiplex Cytotoxicity Assay （蛍光 – 蛍光 : 細胞生存性 – 細胞毒性） 蛍光と発光あるいは蛍光波長の違いを利用して同じウェル内で 細胞生存性と細胞毒性を連続して測定することができます。1つ めのアッセイは蛍光基質（GF-AFC）を利用して細胞生存性を測 定します。2つめのアッセイではそれそれAAF-R110（MultiToxFluor Assay）またはAAF-Glo™（MultiTox-Glo Assay）を用いて細 胞毒性を測定します。データのウェル間補正のための比率測定を 行うことができ、2つの独立した測定チャンネルを確保すること によりアッセイへの干渉を容易に認識することができます。 6667MA 0 25 50 75 100 % Viable Cells % of Maximal Response Live Cell Response (GF-AFC Substrate) r2 = 0.9998 r 2 = 0.9998 Dead Cell Response (bis-AAF-R110 Substrate) 0 25 50 75 100 0 25 50 75 100 0 25 50 75 100 0 25 50 75 100 0 25 50 75 100 % Maximal Response % Viable Cells % Viable Cells Live-Cell Response (GF-AFC Substrate) Dead-Cell Response (AAF-Glo™ Substrate) r2 = 0.9982 r 2 = 0.9988 Live-Cell Response (AAF-Glo™ Substrate; Total–Dead) Dead-Cell Response (AAF-Glo™ Substrate) r2 = 0.9999 r2 = 0.9975 % of Maximal Response A. B. C. 各プロテアーゼマーカーを組み合せたレシオメトリックな応答 Jurkat 細胞（100,000 cells/ml）を 2 つに分け、1 つに細胞毒性 処理を施し、もう 1 つを未処理とした。2 つの細胞プールを 様々な割合で混和し、様々な細胞生存性を擬似的に再現した （0–100%）。CytoTox-GloTM, MultiTox-Fluor および MultiTox-Glo Assay を用いて測定した。得られたデータを生細胞レスポンス、 死細胞レスポンスを最大レスポンスに対する％として補正した。 パネル A. MultiTox-Fluor Assay. パネル B. MultiTox-Glo Assay. パネル C. CytoTox-GloTM Assay （細胞溶解プロトコル）。 細胞毒性試験（プロテアーゼマーカー） 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 細胞生存性試験（シングルアッセイ） CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay 10ml G6080 17,000 5X10ml G6081 70,000 2X50ml G6082 108,000 CytoTox-Fluor™ Cytotoxicity Assay 10ml G9260 17,000 5X10ml G9261 69,000 2X50ml G9262 106,000 CytoTox-GloTM Cytotoxicity Assay 10ml G9290 20,000 5X10ml G9291 76,000 2X50ml G9292 118,000 ・ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 Signal to Noise Ratio 500 1,000 1,500 2,000 2,500 6802MA 0 0 2,500 5,000 7,500 10,000 Dead Cells/Well CytoTox-Glo™ Assay Fluorescent LDH Assay LDH 蛍光アッセイ法に比べ優れた CytoTox-GloTM Assay の感度、ダイナミックレンジ 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 細胞生存性・毒性試験（デュアルアッセイ） MultiTox-Glo Multiplex Cytotoxicity Assay 10ml G9270 33,000 5×10ml G9271 95,000 MultiTox-Fluor Multiplex Cytotoxicity Assay 10ml G9200 31,000 5×10ml G9201 86,000 ・ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレー トで 400 ウェル分。 8 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 0 .01 .04 .62 2.5 10 MTS Corrected Ab. 490nm ng/ml GM-CSF 16 12 8 4 0 .16 CPM (x 10 -3 ) [ 3 H]-Thy 2372MA08_8A GM-CSF により刺激された HT-2 細胞の増殖試験における [ 3 H]thymidine 取り込み試験との比較 GM-CSF により刺激された HT-2 細胞の増殖における CellTiter 96® AQueous One Solution と [ 3 H]thymidine 取り込み試験との比較 乳酸脱水素酵素（LDH） CytoTox-ONETM Homogeneous Membrane Integrity Assay （蛍光 : 細胞毒性） 細胞膜にダメージを受けた細胞から漏出された乳酸脱水素酵 素（LDH）を、レサズリン/ジアホラーゼ共役系を介して生 成するレゾルフィンの蛍光として定量することができます。 細胞質局在分子の漏出を検出することにより、生存活性を 失った細胞を測定する方法は各種あり、広く用いられてい る手法です。用事調製したCytoTox-ONE™ Reagentを細胞/ 培地を含む各ウェルに添加し、10分間インキュベートを行っ た後、Stop Solutionを加え、蛍光を測定（励起波長560nm、 蛍光波長 590nm）します。 CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay （発色: 細胞毒性） 細胞上清に放出されたLDHと30分間の酵素反応を行い、テ トラゾリウム塩（INT）から変換された赤色フォルマザンを 490nmで測定します。このアッセイは、エフェクター細胞 によるターゲット細胞の溶解や、細菌・ウィルス・タンパク 質・化学物質などによる細胞溶解など、細胞膜の完全性を測 定する場合に使用します。 還元能力（NADHなど） CellTiter-Blue® Cell Viability Assay （蛍光 ・発色 : 細胞生存性 ） 酸化還元色素であるレサズリンが生細胞により蛍光産物レゾ ルフィンに変換されることに基づいています。アッセイあ たりのコストが非常に低く、コストパフォーマンスに優れま す。発色法でも検出可能ですが、感度は蛍光検出が優れます。 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay （発色 : 細胞生存性 ） 新しいテトラゾリウム化合物[3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）- 5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2Htetrazolium, inner salt（MTS）]と電子捕獲剤phenazine ethosulfate（PES）が含まれます。MTSとの共存下でPESが より安定化するため、便利な単一溶液にすることができま した。他のMTTやINTのようなテトラゾリウム化合物と比較 し、CellTiter 96® AQueous One Solution Assayは作業行程を 短縮することができます。 control lysed 0 10 20 30 40 50 Cells/Well (x 10–3) RFU 0 2,000 4,000 6,000 8,000 細胞数と蛍光強度における直線性 96 ウェルプレートに 2 倍希釈系列で L929 細胞を 添加し、Triton® X-100 で処理したものを“Lysed”、 PBS を添加したものを“Control”とした。 CytoTox-ONETM を用いた細胞数と蛍光強度における直線性 96 ウェルプレートに 2 倍希釈系列で L929 細胞を添加し、 Triton® X-100 で処理したものを“Lysed”、PBS を添加した ものを“Control”とした。 細胞毒性試験（LDH, 還元能） 実績のあるトラディショナルバイオマーカー 乳酸脱水素酵素（LDH）と還元能力（NADH など）を発色法と蛍光法で測定 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 細胞生存試験（NADH など） 蛍光法 CellTiter-Blue® Cell Viability Assay 20ml G8080 18,000 100ml G8081 51,000 10X100ml G8082 440,000 ・ 20ml は 96 ウェルプレートで 1000 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 発色法 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 1,000 回分 G3580 24,500 5,000 回分 G3581 83,000 200 回分 G3582 6,500 ・表示のサイズは 96 ウェルプレートの場合 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 細胞毒性試験（LDH） 蛍光法 CytoTox-ONETM Homogeneous MembraneIntegrity Assay 200 回分 G7890 19,000 1,000 回分 G7891 56,000 ・表示のサイズは 96 ウェルプレートの場合。 胞生存試験（NADH） 発色法 CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay 1,000 回分 G1780 40,000 ・表示のサイズは 96 ウェルプレートの場合。 Cell Tox GUIDE 9 Mitochondrial ToxGlo™ Assay マルチアッセイでミトコンドリア機能障害性と細胞毒性を一挙に測定！ Mitochondrial ToxGlo™ Assay は 2 種類の試薬を連続して添加するマルチアッセイケミストリーを採用したセルベースアッセイ システムで、生体異物暴露による潜在的なミトコンドリア機能障害の予測に利用することができます。本アッセイでは細胞膜 損傷に関するマーカーと細胞内 ATP の 2 つのバイオマーカーを測定し、短時間暴露においてビークルコントロール細胞と比較 します。まず最初にネクローシスに関連した”死細胞プロテアーゼ活性”を測定するための蛍光ペプチド基質（bis-AAF-R110） を用いて細胞膜の完全性を判定します。bis-AAF-R110 Substrate は生細胞の細胞膜を透過できないため生細胞ではシグナルを 生じません。次に ATP detection reagent を加えて細胞を溶解し、ATP 量に比例した発光シグナルを測定します。得られた 2 つ のデータセットは、ミトコンドリアの機能障害あるいはミトコンドリアに関連しない細胞毒性メカニズムを反映したプロファ イル作成に使用できます。 ミトコンドリア毒性の代表的なプロファイル K562 細胞（10,000 細胞 / ウェル）はグルコースフリー（ガラクトース添加） RPMI 培地で 2 時間段階希釈した化合物で処理した。 9954MA –12 –10 –8 –6 0 25 50 75 100 125 Log [Oligomycin], M Percent Vehicle Control Galactose ATP EC50 = 2.3nM Glucose ATP EC50 = ND Glucose Cytoxicity EC50 = ND Galactose Cytoxicity EC50 = ND ガラクトースまたはグルコース存在下における代表的な ミトコンドリア毒に対する応答 グルコース存在下で処理した細胞は生体エネルギーの要求性 に従いグルコースに依存し、ミトコンドリア毒に対して比較 的無反応（Glucose ATP）。ガラクトース存在下で処理した細 胞は ATP 産生に酸化的リン酸化を利用しなければならず、ミ トコンドリア毒性に対する応答性が高くなった（Galactose ATP）。オリゴマイシン処理ではどちらの培地組成でも細胞 膜の完全性は変化しなかった（Glucose Cytoxicity および Galactose Cytoxicity）。表示のデータは 96- ウェルプレート フォーマットで１ウェルあたり 10,000 個の K562 細胞より得 られたもので、細胞は２時間オリゴマイシンに暴露した。 Cytotoxicity Cytotoxicity Cytotoxicity Cytotoxicity ATP ATP ATP ATP 9955MD –7 –6 –5 0 50 100 150 Log [imipramine], M Percent Vehicle Control Percent Vehicle Control –7 –6 –5 –4 0 100 200 300 400 500 600 Log [antimycin], g/L –6 –5 –4 0 50 100 150 200 250 Log [digitonin], g/L Percent Vehicle Control –7 –6 –5 0 50 100 150 Percent Vehicle Control Log [CCCP], M ATPおよび細胞膜の完全性に 変化なし → ミトコンドリア毒性なし ATPおよび細胞膜の完全性が 協調的に低下 → プライマリーネクローシス 細胞膜の完全性に変化なく、 ATP低下 → ミトコンドリア毒性 ATPの枯渇にともなう 用量依存的な細胞膜完全性の低下 → ミトコンドリア毒性 細胞毒性試験（ミトコンドリア毒性）　 ミトコンドリア毒性を簡便に検出 ミトコンドリア毒性と細胞毒性を分離検出 NEW 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） ミトコンドリア毒性試験 Mitochondrial ToxGlo™ Assay 10ml G8000 30,000 100ml G8001 141,000 ・ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 10 Caspase-Glo® Assay （発光 : カスパーゼ3/7） 高感度でシンプルなカスパーゼアッセイシステム Caspase-Glo® Assaysは、各種カスパーゼ活性を測定するためのホモジニアスフォーマット発光アッセイシステムです。本アッ セイでは、プロテアーゼ認識配列を付加した発光基質アミノルシフェリンと特殊な耐熱性ルシフェラーゼを含む試薬がベースに なっており、カスパーゼ活性に最適化されています。Caspase-Glo® Reagent を添加すると細胞が溶解し、続いてカスパーゼに より基質が切断されます。遊離したアミノルシフェリンは耐熱性のUltra-Glo™ Recombinant Luciferaseにより消費され、“グロー タイプ”の発光シグナルを生じます。このシグナルはカスパーゼ活性に比例します。安定化されたルシフェラーゼおよび特殊な バッファーシステムは、広範なアッセイ条件でのパフォーマンスを向上させます。本アッセイは、蛍光法や発色法のアッセイに 比べて化合物による影響を受け難くなっています。また、アポトーシスを判定するTUNEL法、抗体法などに比べ飛躍的に簡便に なっています。Caspase-Glo® 3/7, 8および9 Assaysは培養細胞あるいは精製酵素を用いたマルチウェルプレートでのアッセイ用 にデザインされています。Caspase-Glo® 8および9 Assaysには、非特異的なバックグラウンドをより低減するプロテアーゼ阻害 剤MG-132が新たに添付されています。 0h 24h 48h 72h 0h 24h CP70 R182 48h 72h Active Caspase-3 Beta-actin p17/p19 4546TA Western Analysis Caspase-Glo® 3/7 0 4 8 12 16 20 0 24 48 72 CP70 (DOC sensitive) R182 (DOC resistant) Relative Caspase-3/7 Activity Duration of Docetaxel Treatment (hours) ウェスタン分析と Caspase-Glo® の相関性 ウェスタン分析と Caspase-Glo® の相関性 Anti-Fas Treated Cells Untreated Cells 1,600 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 100 200 300 400 500 600 700 –10 1,400 1,200 1,000 800 600 400 200 0 0 –200 10,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000 7,000 8,000 9,000 Luminescence (RLU, Blank Subtracted) Cell # Jurkat 細胞を用いた場合の Caspase-Glo® 3/7 Assay の感度 Jurkat 細胞は抗 -Fas mAb で 4.5 時間処理し、アポトーシスを誘導した。 Caspase-Glo® Reagent 添加 1 時間後に測定した。 Jurkat 細胞を用いた場合の Caspase-Glo® 3/7 Assay の感度 Jurkat 細胞は抗 -Fas mAb で 4.5 時間処理し、アポトーシスを誘導した。 Caspase-Glo® Reagent 添加 1 時間後に測定した。 1,000 1,000 10,000 100 100 10 10 1 Number of Cells Caspase-Glo® 3/7 Fluorescent Substrate Signal-to-Noise Ratio 7299MA 蛍光法と Caspase-Glo® 蛍光法と Caspase-Glo® の感度とダイナミックレンジの比較 の感度とダイナミックレンジの比較 カスパーゼを最も簡便に測定 アポトーシス、ネクローシスなど細胞死メカニズムを簡便に解析 細胞毒性試験（アポトーシス） 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 発光・カスパーゼアッセイ アッセイシステム Caspase-Glo® 3/7 Assay 2.5ml G8090 21,000 10ml G8091 75,000 100ml G8092 366,000 Caspase-Glo® 8 Assay 2.5ml G8200 21,000 10ml G8201 75,000 Caspase-Glo® 9 Assay 2.5ml G8210 21,000 10ml G8211 75,000 ・10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分 シングルアッセイ Cell Tox GUIDE 11 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） アポトーシス + 細胞生存性 + 細胞毒性 アッセイシステム トリプルアッセイ ApoTox-Glo™ Triplex Assay 10ml G6320 86,000 5×10ml G6321 260,000 デュアルアッセイ ApoLive-Glo™ Multiplex Assay 10ml G6410 80,000 5×10ml G6411 238,000 ・10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分 Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay （蛍光 : カスパーゼ3/7） 蛍光基質 Z-DEVD-rhodamine 110によりカスパーゼを測定します。カスパーゼ3/7の定量には精製された酵素や細胞抽出液、培養 細胞（付着細胞・浮遊細胞・初代培養細胞）をサンプルとして使用します。発光法のCaspase-Glo® 8または9を組み合せたアポトー シスメカニズムの解析にも使用することができます（下グラフ参照）。 10420MA –9 –8 –7 –6 –5 –4 0 25,000 50,000 75,000 100,000 0 25,000 50,000 75,000 100,000 125,000 Caspase EC50 ~4µM Cytotoxicity EC50 ~4µM Viability EC50 = 5.6µM Log[Imatinib], M Fluorescence (RFU) Luminescence (RLU) –9 –8 –7 –6 –5 –4 0 5,000 10,000 15,000 0 5,000 10,000 Caspase EC50 = N.D. 15,000 Cytotoxicity EC50 > 36µM Viability EC50 = 6.2µM Log[Imatinib], M Fluorescence (RFU) Luminescence (RLU) A. B. iCell® Cardiomyocytes K562 Cells トリプルアッセイ ApoTox-Glo™ Triplex Assay （蛍光-発光：細胞生存性細胞毒性-アポトーシス） 培養細胞を含む単一のウェルから細胞生存性 / 毒性 / アポ トーシスの各イベントについて容易に評価するための 3 つの アッセイケミストリを組合せたシステムです。細胞毒性およ び細胞生存性に対する新規なプロテアーゼ活性を蛍光で測定 （6 ページ参照）し、カスパーゼ 3/7 活性は発光法により測定 します（Caspase-Glo ® 3/7）。1 つのサンプルから細胞死のメ カニズムを決定することができます（右図参照）。 デュアルアッセイ ApoLive-Glo™ Multiplex Assay（蛍光-発光：細胞生存性アポトーシス） 細胞生存マーカーとして生細胞プロテアーゼ（6ページ参 照）を、アポトーシスマーカーとしてカスパーゼの活性化 （Caspase-Glo® 3/7）を1ウェルで測定し、細胞死のメカニズ ムを決定することができます。カスパーゼ活性と生存細胞の 比率はカスパーゼ活性化量の決定および細胞数に対する補正 に有用です。 イマチニブ処理した iCell® Cardiomyocytes（iPS 細胞由来心筋細胞） および K562（ヒト慢性骨髄性白血病細胞）の細胞毒性プロファイル ApoTox-Glo ™ Triplex Assay を使用して細胞毒性、細胞生存性、カスパー ゼ活性のトリプルアッセイを行った。高濃度のイマチ二ブ（1µM）でどち らの細胞株ともに細胞生存性が低下した。K562 細胞の細胞死メカニズム はカスパーゼ 3/7 活性の増加によるアポトーシスとそれに付随した細胞 毒性の増加であることが示された。 4754MA 500 600 700 800 900 1,000 1,100 1,200 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 6 10 14 18 22 26 TRA IL Caspase-8 Vehicle Caspase-8 TRA IL Caspase-3/7 Vehicle Caspase-3/7 Caspase-3/7 Activity (RFU x 103) Duration of Drug Exposure (Hours) Caspase-8 Activity (RLU) 発光カスパーゼ -8 アッセイと蛍光カスパーセ 3/7 アッセイの マルチアッセイ Jurkat 細胞を 25,000 個 / ウェルで播種した。rTRAIL またはビークルコン トロールをタイムポイントごとの複製ウェルに 1 時間づつずらして 10 時間にわたって添加した。蛍光カスパーゼ 3/7 基質［（Z-DEVD）2-R110］ は Caspase-GloTM Reagent に混和した。調製した各試薬 100µl を添加し た後、60 分間インキュベーションし、発光および蛍光を測定した。 発光カスパーゼ -8 アッセイと蛍光カスパーセ 3/7 アッセイの マルチアッセイ Jurkat 細胞を 25,000 個 / ウェルで播種した。rTRAIL またはビークル コントロールをタイムポイントごとの複製ウェルに 1 時間づつずらし て 10 時間にわたって添加した。蛍光カスパーゼ 3/7 基質［（Z-DEVD） 2-R110］は Caspase-Glo® Reagent に 混 和 し た。 調 製 し た 各 試 薬 100µl を添加した後、60 分間インキュベーションし、発光および蛍光 を測定した。 細胞毒性試験（細胞死メカニズム） 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 蛍光・カスパーゼアッセイ アッセイシステム Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay 1ml G7792 7,000 10ml G7790 66,000 100ml G7791 316,000 Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Buffer 100ml G7781 215,000 * 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分 11 12 GSH/GSSG-GloTM Assay 除タンパク操作の不要な高感度グルタチオンアッセイ 化合物には細胞内の活性酸素の発生を誘導するものが多く存在し、その結果与えられる細胞へのダメージにより最終的にアポ トーシスやネクローシスを起こす場合もあります。還元型と酸化型のグルタチオンの比率（GSH/GSSG比）を求めることで、こ れらの化合物による細胞内酸化還元電状態の変化量を調べることができます。GSH/GSSG-GloTM Assay は、培養細胞内の総グル タチオン（GSH + GSSG）、GSSG、GSH/GSSG比を簡単に検出、定量するための発光アッセイシステムです。培養ウェル内の 細胞で直接定量できるためGSHやGSSGのロスが最小限に抑えられバラツキが低減します。 ･ 生体に近い GSH/GSSG 比：総グルタチオンや GSSG の実質 レベルを細胞培養ウェルで直接測定できるので、従来法に比 べて GSH や GSSG のロスを抑えサンプルの調製作業や間接 的な GSSG 算出も必要ありません。 ･ 頑健なパフォーマンス：生物発光技術およびシンプルなプロ トコルにより、サンプルのハンドリングやバラツキが低減。 ･ シンプルなプロトコル：マルチウエルプレート内の細胞に直 接試薬を添加するホモジニアスな”添加 – 混和 – 測定”形式で、 従来法のような時間のかかる除タンパクや遠心操作が不要。 ･ 高い感度：感度が高いので従来法よりも少数の細胞でアッセ イが可能 ･ 自動化が容易：グロータイプの長時間発光（半減期 2 時間以上） なので 96 あるいは 384 ウェルプレートでの自動化が可能 ･ 蛍光による干渉がありません：発光ベースなので、蛍光アッ セイにみられる試薬と化合物との蛍光干渉がありません。 メナジオン濃度にともなう GSH、GSSG レベルおよび細胞生存性の変化 肺腺癌細胞 A549 細胞 5,000 個 / ウェル（96 ウェルプレート）をメナ ジオンで 30 分間処理した後、CellTiter-Fluor ™（GF-AFC）で細胞生存 性を測定した。続いて、GSH/GSSG-Glo ™を用いて GSSG および GSH を測定した。 9520MA Light Ultra-Glo™ rLuciferase ATP Luciferin-NT Luciferin GSH GSH-NT GST GSH GSH GSH GSH GSSG GSSG GSSG GSSG GSH GSH GSH GSH GSSG GSSG GSSG GSSG 細胞溶解後にGSSGを還元し、 総グルタチオン量を測定 細胞溶解時に、GSHをブロッキング し、その後GSSGを還元し、 酸化型グルタチオン量として測定 総グルタチオン量測定（GSH + GSSG） GSSG → 2GSH GSH → GSH GSSG → 2GSH GSH → GSH × 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 µM menadione RLU（millions) RFU（thousands) 6 5 4 3 2 1 0 8 7 6 5 4 3 2 1 0 GF-AFC GSSG µM menadione RLU（millions) RFU（thousands) 6 5 4 3 2 1 0 24 19 14 9 4 -1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 GF-AFC GSH GSH/GSSG-GloTM の測定原理 GSH 依存的に Luciferin-NT（GSH プローブ）がグルタチオン -S-トランス フェラーゼによりルシフェリンへ変換される反応とホタルルシフェラーゼ 反応のカップリングに基づく。総グルタチオンと GSSG の決定は並行して 実施することができます。総グルタチオンの測定は還元剤を用いて細胞 ライセートに含まれるすべてのグルタチオン（GSH および GSSG）を還元 型の GSH に変換して測定。酸化型の GSSG のみの測定はライセートに 含まれるインタクトな GSSG を GSH と分けるために全ての GSH をブロッ クする試薬を加え、残った GSSG を GSH に変換して発光反応で定量。 細胞毒性試験（酸化ストレス） 酸化ストレス：GSH & GSSGの測定 細胞内の酸化／還元状態を迅速、高感度に解析 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） グルタチオンアッセイシステム 酸化型・還元型・比率 GSH/GSSG-GloTM Assay 10ml V6611 90,000 50ml V6612 358,000 ・ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分（総グルタチオンまたは GSSG 100 ウェル分、GSH/GSSG 比の決定なら 50 ウェル分） 還元型 GSH-GloTM Glutathione Assay 10ml V6911 69,000 50ml V6912 280,000 ・ 10ml は 96 ウェルプレートで 100 ウェル分、384 ウェルプレートで 400 ウェル分。 Cell Tox GUIDE 13 P450-GloTM Assay 細胞内のP450活性を簡便に測定 P450-GloTM（Cell Based） Assayは発光法を利用してシトクロムP450活性を測定するためのシステムです。この発光法によるアッ セイは、非常に優れた感度を有し、低いバックグラウンド、広いダイナミックレンジを示します。P450-GloTM Assayでは、ルシ フェリン誘導体であるP450発光基質を利用し、P450活性により変換されたルシフェリンをルシフェラーゼ発光量として検出す ることができます。P450-GloTM Assayで生成する“グロータイプ”の発光シグナルは、耐熱性ルシフェラーゼと特殊なバッファー システムを組合わせることにより実現しました。 P450発光基質および反応産物（ルシフェリン）は細胞透過性であるため細胞ベースのアッセイが可能です。発光性基質と培養 細胞をインキュベートすると細胞内のCYP酵素により変換されたルシフェリンは、非溶解アッセイ（細胞上澄を移してアッセ イ）あるいは溶解アッセイ（細胞を含むウェルでアッセイ）で測定されます。非溶解アッセイの場合、P450活性測定後に残る 細胞を利用して他の細胞ベースアッセイを行うことができます（細胞生存性試験：CellTiter-Glo® など）。P450-GloTM Assayを用 いた細胞ベースのアプリケーションとして、基底CYP活性の測定、テスト化合物による活性誘導、テスト化合物による基底活性/ 誘導活性の阻害、核内受容体活性化の追跡（PXR, PXR, CAR, AHR, PPAR）などがあります。 ･ 迅速：煩雑で時間のかかる LC/MS や薄層クロマトグラフィー に比べ飛躍的に分析時間を短縮化。 ･ シンプル：簡単なプロトコルなのでマルチウェルプレートを 用いたハイスループットスクリーニングに対応。 ･ 蛍光による干渉なし：発光法なので、蛍光法で問題となる分 析対象や NADPH, CYP 基質の励起波長 / 蛍光波長の干渉が問 題になりません。 ･ 低い偽陽性：新規な安定型ホタルルシフェラーゼ（Ultra-GloTM Luciferase）、バッファー組成によりルシフェラーゼ阻害によ る偽陽性を低減。 細胞ベースアッセイに適した特異性の高い P450 発光基質 21 種類のヒト -P450 アイソフォームについて各 P450-GloTM Substrate を 用いて測定した。 5563MA Luciferin-CEE Luciferin-4A control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 25,000 50,000 75,000 100,000 125,000 150,000 175,000 Luminescence/pmol CYP450 control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 E. F. A. B. Luciferin-1A2 control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 250,000 500,000 750,000 1,000,000 1,250,000 Luminescence/0.5pmol P450 Luciferin-IPA control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 100,000 200,000 300,000 400,000 500,000 Luminescence/0.1pmol CYP450 0 250,000 500,000 750,000 1,000,000 1,250,000 Luminescence/pmol CYP450 D. Luminescence/pmol CYP450 control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 25,000 50,000 75,000 100,000 450,000 Luciferin-PFBE Luminescence/pmol CYP450 Luciferin-H control CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8 CYP2C9 CYP2C18 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2J2 CYP3A4 CYP3A5 CYP3A7 CYP4A11 CYP4F2 CYP4F3A CYP4F3B CYP4F12 CYP19 0 100,000 200,000 300,000 400,000 C. Luciferin-CEE-Normalized (34-fold induction) 0.0 0.1 0.2 0.3 P450-Glo/CTG Luciferin-BE-Normalized (2.6-fold induction) 0.00 0.08 0.16 0.24 P450-Glo/CTG 0 50000 100000 150000 RLU Luciferin-CEE (38-fold induction) 0 40000 80000 120000 RLU Luciferin-BE (3-fold induction) Control 3-MC Control Control 3-MC Dex Control Dex 生細胞数で補正した P450 アッセイデータ 初代培養ラット肝細胞を用いて P450-Glo™ アッセイを行った。細胞は CYP450 遺伝子誘導剤（3- メチルコラントレンまたはデキサメタゾン）で 2 日間処理した。その後、P450-Glo™ Substrate を培地に加え、4 時間イン キュベーションした。培地 100µl を取り出し、等量の P450-Glo™ luciferin detection reagent と混和した。下 2 つのグラフでは引き続き CellTiter-Glo® Assay により細胞生存性を測定し、それにより補正した P450 活性を示した。 化合物による処理は P450 活性を誘導したが、細胞死は誘導しなかった。 解毒活性測定（P450活性） 薬物代謝：P450の測定 発光法による細胞ベースの P450 アッセイ 細胞ベースアッセイに適した特異性の高い P450 発光基質 21 種類のヒト -P450 アイソフォームについて各 P450-GloTM Substrate を 用いて測定した。 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） P450 アッセイ アッセイシステム P450-GloTM CYP1A2 Induction/Inhibition Assay 10ml V8421 22,000 50ml V8422 63,000 P450-GloTM CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA 10ml V9001 22,000 50ml V9002 63,000 P450-GloTM CYP3A4 Assay （Luciferin-PFBE） Cell-Based/Biochemical Assay 10ml V8901 22,000 50ml V8902 63,000 P450-GloTM CYP1A1 Assay （Luciferin-CEE） 10ml V8751 22,000 50ml V8752 63,000 P450-GloTM CYP2C9 Assay （Luciferin-H） 10ml V8791 22,000 50ml V8792 63,000 Luciferin-4A 3mg P1621 38,000 ・ 96 ウェルプレートの場合 10ml は 200 ウェル分、50ml は 1000 ウェル分 に相当（1 ウェルあたり 50µl 使用）。384 ウェルプレートの場合 10ml は 400 ウェル分、50ml は 2000 ウェル分に相当（1 ウェルあたり 25µl 使用）。 13 14 10338MA NFAT-RE Luc 抗原 抗体 エフェクター細胞 （遺伝子組換Jurkat 細胞） ターゲット細胞 FcγRIIIa NFAT パスウェイ Bio-Glo™ Luciferase Assay System Glo 抗原受容体を発現するターゲット細胞と抗体 FcγRIIIa/NFAT-RE-luc2レポーターを含む Jurkat エフェクター細胞 インキュベーション（6～25時間） 測定 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 75000 5000 2500 0 Bioluminescence (RLU) Log10 [Rituximab], g/ml 10487MA WIL2-S, Jurkat/NFAT-luc+FcγRllla, Rituximab NO WIL2-S, Jurkat/NFAT-luc+FcγRllla, Rituximab WIL2-S, Jurkat-NFAT-luc (NO FcγRllla), Rituximab WIL2-S, NO Jurkat/NFAT-luc+FcγRllla, Rituximab WIL2-S, Jurkat/NFAT-luc+FcγRllla, NO Rituximab WIL2-S, Jurkat/NFAT-luc+FcγRllla, Trastuzumab ADCC Reporter Bioassay Kit 抗体医薬の開発、製造管理に最適です。 抗体依存性細胞傷害（ADCC：Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）は、細胞性免疫系によるウイルス感染細胞あるい はその他罹患細胞を標的とした傷害性に関連する抗体の作用機序の一つであり、抗体医薬の開発などに応用されています。抗体 が細胞表面の標的抗原に結合し、抗体のFcエフェクター部位もエフェクター細胞（主にナチュラルキラー細胞）のFcγRIIIa受容 体に結合すると2種類の細胞がクロスリンクを形成し、ADCCの作用機序パスウェイが活性化されます。通常のADCCアッセイは この機序によりターゲット細胞が傷害され、その死細胞を測定します。ADCC Reporter BioassayはNFATシグナル経路の活性化を 指標として治療用抗体Fc領域のエフェクター機能を定量するための生物発光レポーターアッセイです。ADCCの作用機序活性化 におけるエフェクター細胞のNFAT（T細胞核内転写因子）パスウェイを通じた転写活性化をとらえ、ルシフェラーゼレポーター アッセイで定量します。エフェクター細胞として、FcγRIIIa 受容体, V158（高親和性）バリアントを安定に発現し、ホタルルシ フェラーゼの発現を駆動するNFAT応答配列を安定に保持する遺伝子組換えJurkat細胞を用います。従来法で使用するそのエフェ クター細胞は応答性が非常に変わりやすく、調製が面倒でバックグラウンドが高くなる場合が多くありましたが、本製品は短時 間（１日）でバラツキが少なく高精度のバイオアッセイを行うことができ、抗体医薬の研究、開発からロット管理試験にまで利 用することができます。 ADCC Reporter Bioassay の概要 NFAT 応答配列により発現制御されるホタルルシフェラーゼの発光シグナル を測定。 ADCC Reporter Bioassay のプロトコル 特異性に優れた ADCC Reporter Bioassay リツキシマブ（anti-CD20 キメラモノクローナル抗体薬）、トラスツズマブ （anti-Her2 ヒト化モノクローナル抗体薬）、コントロール培地（抗体なし）の 段階希釈系列を遺伝子組換え型 Jurkat エフェクター細胞（ADCC Bioassay Effector Cells）とともに ADCC Bioassay Target Cells （WIL2-S）の存在下 あるいは非存在下で 37℃、6 時間インキュベーションした。ルシフェラー ゼ活性は Bio-Glo ™ Reagent を用いて定量し、データは GraphPad Prism® ソフトウエアの 4PL curve fitting を用いてフィッティングした。 抗体依存性細胞傷害性試験 ADCCアッセイ（レポーターアッセイ） 従来の ADCC アッセイよりも飛躍的に簡便でバラツキも低減されます！ NEW 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） ADCC アッセイシステム ADCC Reporter Bioassay, Complete Kit (WIL2-S) 1Kit G7014 138,000 ADCC Reporter Bioassay, Core Kit 1Kit G7010 115,000 5Kit G7018 515,000 ADCC Bioassay Effector Cells, Propagation Model 1 セット G7102 お問い合せ 下さい ADCC Reporter Bioassay, Target Kit (WIL2-S) 1Kit G7013 51,000 Bio-Glo™ Luciferase Assay System 100ml G7940 148,000 ・ G7014、G7010 は 96 ウェルプレートの場合 120 ウェル分 ※細胞購入における注意点：ADCC Bioassay Effector Cells、 ADCC Bioassay Target cells の使用は非営利組織（大学、公的研究機関など）、営利組織にかかわらず、ライセン スプログラムの内容（www.promega.co.jp/license/）をご確認頂く必要があります。 Cell Tox GUIDE 15 p53 RE HRE AP1 RE ARE ATF6RE XRE HSE MRE Control NF-κB RE Cell-Titer Fluor 4 3 2 1 0 -7 -6 -5 -4 log [CdCl2] (M) Fold Response HepG2 cells stimulated 6 hrs 8 6 4 2 -8 -7 -6 -5 Fold Response log [tunicamycin](M) 0 HepG2 cells stimulated 18 hrs 5 4 3 2 0 -6 -5 -4 -3 Fold Response log [ZnSO4] (M) 1 HepG2 cells stimulated 6 hrs 25 20 15 10 5 -10 -9 -8 -7 Fold Response log [TCDD] (M) 0 HepG2 cells stimulated 18 hrs TF RE luc2 LUCIFERASE ベクター 応答エレメント シグナル経路 pGL4.37 抗酸化剤応答配列（ARE） 酸化ストレス pGL4.38 p53 応答配列（p53 RE） DNA 損傷 pGL4.39 活性化転写因子 6 応答配列 （ATF6 RE） 小胞体ストレス pGL4.40 金属応答配列 （MRE） 重金属ストレス pGL4.41 熱ショック配列（HSE） 熱ショック pGL4.42 低酸素応答配列（HRE） 低酸素ストレス pGL4.43 生体異物応答配列（XRE） 生体異物ストレス pGL4.44 AP1 応答配列（AP1 RE） MAPK/JNK 同一プレートでのストレス応答パネルに対する化合物プロファイリング HepG2 細胞に各ストレス応答配列を含む DNA をトランスフェクションした後、96 ウェ ルプレートに移し O/N でインキュベーションした。各化合物で処理し、CellTiter-FluorTM で細胞生存性を蛍光で測定した後にONE-GloTM でルシフェラーゼレポーターを測定した。 応答エレメントとストレス応答 ストレスシグナルの検出 ストレス応答アッセイ（レポーターアッセイ） 各種ストレス応答配列を利用したレポーターアッセイ 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） ストレスアッセイ ストレスモニタリング用レポーターベクター pGL4.37[luc2P/ARE/Hygro] Vector 20µg E3641 73,000 pGL4.38[luc2P/p53 RE/Hygro] Vector 20µg E3651 73,000 pGL4.39[luc2P/ATF6 RE/Hygro] Vector 20µg E3661 73,000 pGL4.40[luc2P/MRE/Hygro] Vector 20µg E4131 73,000 pGL4.41[luc2P/HSE/Hygro] Vector 20µg E3751 73,000 pGL4.42[luc2P/HRE/Hygro] Vector 20µg E4001 73,000 pGL4.43[luc2P/XRE/Hygro] Vector 20µg E4121 73,000 pGL4.44[luc2P/AP1 RE/Hygro] Vector 20µg E4111 73,000 pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]Vector 20µg E8491 73,000 レポーターアッセイ試薬 ONE-Glo™ Luciferase Assay System 10ml E6110 22,000 100ml E6120 139,000 ONE-Glo™ + Tox Luciferase Reporter and Cell Viability Assay 1 プレート分 E7110 31,000 10 プレート分 E7120 194,000 トランスフェクション試薬 FuGENE® HD Transfection Reagent 1ml E2311 63,500 5X1ml E2312 252,000 ※ベクター購入における注意点：pGL4 Luciferase Reporter Vector の使用は非営利組織 （大学、公的研究機関など）、営利組織にかかわらず、ライセンスプログラムの内容 （www.promega.co.jp/license/）をご確認いただく必要があります。 Reporter Assay for Cell Stress 各種ストレス応答を簡便に検出。 細胞は化学物質による毒性のほか、紫外線、放射線、温度、物理的刺激など様々なストレスに絶えずさらされています。過度 なストレスは、細胞が生来備えている恒常性を破綻させ、細胞自らが死を選択する細胞死（アポトーシス）を引き起こしま す。これらのストレスには細胞内のストレス応答機構が反応することが分かっています。レポーターアッセイは、このような ストレス応答機構を含め、細胞の広範なシグナル経路の解析ができます。ある種の細胞ストレスは、細胞レベルでのストレス のみならず個体レベルでのストレスにも応答します。したがって、その異常は、分子・細胞レベルでの現象に止まらず、自己 免疫疾患や癌などの疾病をも引き起こすことになり、その解明を通じて創薬、新規治療への応用などが期待されます。プロメ ガでは種々の細胞ストレスに対する応答エレメントを搭載した、レポーターベクターシリーズを開発しました。これらのベク ターを用いたレポーターアッセイにより、細胞ストレスのシグナル伝達経路の特定、各種細胞のストレス耐性の検討、ストレ ス化合物の毒性評価などの解析が可能です。 15 テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982 ● E-Mail : prometec@jp.promega.com 日本語 Web site：www.promega.jp プロメガ株式会社 本　　　社　〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所　〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2016年1月現在のものであり予告なしに変更することがあります。 PK1601-P04 販売店： マルチプレートリーダー GloMax® Discover/Explorer シリーズ最高峰のマルチモードプレートリーダー GloMax® Discover / Explorer System は、 GloMax® シリーズの上位機種で、最高レベル の感度と最大のダイナミックレンジを備え、わずかなシグナルの変動から NanoLuc® ルシフェラーゼのような強い発光まで幅広く対応します。GloMax® Explorer は、基本の 発光・蛍光を搭載し、吸光や最上位機種 Discover へのアップグレードが可能なマルチ プレートリーダーで、最上位機種 GloMax® Discover System は、発光、蛍光、UV / 可視 光測定に加え BRET、FRET にも対応可能です。 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 検出システム GloMax® Discover System / 本体（発光・蛍光・吸光［UV / 可視光］） 1 台 GM3000 4,600,000 GloMax® Dual Injectors with Pumps（デュアルインジェクター） 1 セット GM3030 900,000 GloMax® Discover マニュアル不要の直感操作 • 特別なトレーニングなしで、どなたでもすぐに操作習得可能 • 大型タブレット PC で簡単アクセス • プロメガ試薬用アッセイプログラムはインストール済み • オートメーションロボットとの接続対応可 より確実な検出を • 絶対信頼の超高感度（3 × 10-21 moles ルシフェラーゼ） • ワイドダイナミックレンジ（>9 桁） • ドームマスキングシステムによる クロストークの排除（< 3 × 10-5） 細胞のアッセイに最適な機能を搭載 • フタ付きプレートでの測定可能：コンタミ防止 • 培養条件に対応した多彩なプレートで測定可能 （6-384 ウエルプレート) • 細胞にやさしいシリンジポンプ方式を採用 • 高精度ヒーター & 自在なシェーカー （旋回/ 直線、振幅1 ～ 3 mm）を搭載 Discover NanoBRET™/ BRET 対応 マルチモードプレートリーダー フルスペックの最上位機種 Explorer 臨機応変なマルチモードプレートリーダー 基本の発光・蛍光から最上位機種へ アップグレードも自由自在 直感的な簡単操作 プレートの挿入方向 NanoBRET™/ BRET やマルチアッセイなど 新技術に対応　* Discover のみ • NanoBRET™/ BRETに対応したプロトコールとフィルター を搭載 • マルチアッセイのプロトコールを簡単設計 研究の進展に応じて、 機器のアップグレード可能　* Explorer のみ • フルスペックの最上位機種 Discover への アップグレードが可能