FuGENE® HD トランスフェクション条件の最適化

FuGENE® HD トランスフェクション条件の最適化 トランスフェクションを成功させるために、トランスフェクション試薬と DNA（プラスミド） の割合および添加量の最適化は非常に重要です。 FuGENE® HD 製品マニュアルに掲載される混合比（FuGENE® HD:DNA=4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1）および添加容量（2, 5, 10l）について、導入効率を検討する手順をご紹介 します。表 1 の混合比の組み合わせで最適化を行います。 表 1. 96well プレートにおける培地量と最適化のための FuGENE® HD と DNA の比率 以下のリンクより、96well プレートでの最適化のためのグラフ作成用テンプレート（エクセ ルファイル形式）をダウンロードしてご利用頂けます。 ・FuGENE® HD Optimization Analysis Worksheet http://www.promega.com/resources/tools/fugene-hd-optimization-analysis/ 手順 ① トランスフェクションの前日に、細胞を準備する。96well プレートに血清を含む培地 100l/well で、80%コンフルエントになるように細胞を蒔く。 （例：HEK-293 細胞の場合、2×104 cells/100l/well） ② トランスフェクション当日、表 1 の比率の DNA/ FuGENE® HD 混合液を調整する。滅 菌チューブまたは U- or V-bottom プレートに、無血清培地または Opti-MEM と DNA 2g を最終容量 100l となるように加えた後、各容量 (3-8l)の FuGENE® HD を加える。 ③ 混合後、0-15 分間待つ。 ④ ②で作成した DNA/ FuGENE® HD 混合液を、各 well に 2, 5, 10l を加える（図 1 参照）。 ⑤ 24 時間後に細胞生存性試験、遺伝子導入効率の測定を行う。 図 1 トランスフェクション最適化のための 96well プレートレイアウト 図 2 では以下の条件で最適化を検討した例を示しています。 ・DNA：pGL4.13 Vector (Cat.# E6681) ・細胞生存性試験：CellTiter-Fluor™ Viability Assay (Cat.# G6080) ・レポーターアッセイ：ONE-Glo™ Luciferase Assay System (Cat.# E6110) ・蛍光および発光の測定機器：GloMax®-Multi Detection System 図 2 HEK-293 細胞を用いたトランスフェクション最適化の例 検討の結果、HEK-293 細胞の最適条件は、混合比 2.5:1、混合液 5l 添加となった。 0 200 400 600 800 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 Cell DNA FuGENE 2µl 5µl 10µl 2µl 5µl 10µl 2µl 5µl 10µl 2µl 5µl 10µl 2µl 5µl 10µl 2µl 5µl 10µl Controls 1.5:1 2:1 2.5:1 3:1 3.5:1 4:1 Viability (RFU) Reporter Activity (RLU) Transfection Condition (FuGENE® HD:DNA Ratio and Volume Added) Reporter Viability