GloMax® Protocol Guide GloMax® ユーザーのためのプロトコルガイド

GloMax® Protocol Guide Ver. 1.1 GloMax® ユーザーのためのプロトコルガイド ELISA NanoLuc® Reporter BRET MTT Dual-Luciferase® HiBiT Ca2+ PPI Cell Based Assay ADCC T-Cell Activation Inflammation 会員番号: www.promega.co.jp/kikiclub/ プロメガ株式会社 2 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> プレートリーダーについて 試験管を用いた酵素活性測定など生化学的な反応や培養皿を用いた細胞の応答をより微細化/多検体化して効率よく測定するための機器がプレートリー ダーです。しかし、近年では 96 ウェルから 384 や 1536 ウェルでの測定ニーズも増え、これらのフォーマットに対応するには機器の検出感度はもとより、強力な シグナルが得られる試薬との組合わせが必須であり、プロメガの GloMax® と発光試薬はこれらのニーズに最も適応する進化したプレートベースのアッセイシス テムと言えます。特にプロメガが得意とする発光（生物発光）法をベースとするアッセイは、これまでホタルルシフェラーゼによるレポーターアッセイを代表とするよ うに簡便な操作性と高感度検出が特⾧です。 ● GloMax® アプリケーションリスト アプリケーション サンプル形態※ 発光 蛍光 発色 BRET ページ 細胞生死 細胞増殖･生存性試験 [MTT/ MTS] （2Ｄ / 3D 培養 ） 細胞 ○ ○ ○ 4 細胞死・毒性試験 （ネクローシス / 細胞膜傷害） 細胞 ○ ○ ○ 5 細胞死メカニズム （アポトーシス） 細胞 ○ ○ 6 細胞死メカニズム （炎症/パイロトーシス） 細胞 ○ 7 マルチアッセイ （ネクローシス + 生存性 他）＜マルチ＞ 細胞 ○ ○ 8 細胞応答 エネルギー代謝、代謝物測定 (グルコース、グルタミン、乳酸、グルタミン酸) ＜マルチ＞ 細胞 ○ 9 酸化・還元測定（ROS、GSH、NADH、NADPH） 細胞 ○ 10 薬物代謝活性測定 (P450) 細胞 ○ 11 オートファジーフラックス測定 細胞 G ○ 12 プロテアソーム活性測定 細胞 ○ 13 エフェクター細胞活性（ADCC、T 細胞活性化） 細胞 G ○ 14 ウイルス感染・細胞融合 細胞 G ○ 15 細胞内分子間相互作用 細胞内 タンパク質:タンパク質相互作用検出 細胞 G ○ ○ 16 細胞内 タンパク質:低分子相互作用検出 （Target Engagement） 細胞 G ○ 17 細胞内 標的タンパク質発現・分解検出 標的タンパク質 モニタリング（発現 / 分解 / 局在） 細胞 G ○ 18 セルベース ELISA 細胞 ○ 19 シグナル伝達 & タンパク質修飾 リン酸化（修飾）タンパク質定量 細胞 G ○ 20 プロテインキナーゼ活性測定 in vitro ○ 21 cAMP リアルタイムアッセイ / エンドポイントアッセイ 細胞 (G :リアルタイムのみ) ○ 22 カルシウム (Fluo-4, Fluo-8) 細胞 ○ 23 エピジェネティクス関連酵素活性 in vitro /細胞 ○ 24 転写活性（レポーターアッセイ） レポーターアッセイ（高感度 & 標準）＜デュアル＞ 細胞 G ○ 25 レポーターアッセイ（高感度 & 標準）＜シングル & リアルタイム＞ 細胞 G ○ 26 タンパク質 & 核酸定量 タンパク質定量 (Bradford Assay / BCA Assay) 細胞 ○ 27 2 本鎖 DNA 定量 for NGS (QuantiFluor) in vitro ○ 28 自己抗体検査 (研究用) ルシフェラーゼ免疫沈降システム (LIPS : luciferase lmmunoprecipitation systems) 血清など ○ 29 ※G:遺伝子導入あるいは遺伝子改変細胞を使用 *本アプリケーションガイドには、プロメガ以外のアッセイ試薬が必要な場合も含まれています。 *各試薬・アプリケーションの詳細な使用方法･取扱上の注意事項につきましては、試薬に添付されている説明書や文献などをご参照下さい。 3 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> ● GloMax® プリインストールプロトコル リスト ※GloMax® Discover, Explorer または Navigator にプリインストールされているプロトコルのリストです。 プロトコル （プリインストール） 測定モード Discover Explorer Navigator ページ プロトコル （プリインストール） 測定モード Discover Explorer Navigator ページ ADCC Reporter Bioassay 発光 ○ ○ ○ 14 Kinase Selectivity Profiling System 発光 ○ ○ * ADP-Glo 発光 ○ ○ ○ 21 Kinase-Glo 発光 ○ ○ ○ * ApoLive-Glo 発光/蛍光 ○ ○ * LDH-Glo 発光 ○ ○ ○ 5 Apo-ONE 蛍光 ○ ○ 6 Luciferase Assay System 発光 ○ ○ ○ * ApoTox-Glo 発光 ○ ○ * Luminescence Light Plate 発光 ○ ○ ○ * Autophagy HiBiT Reporter Assay 発光 ○ ○ ○ 12 Mitochondrial ToxGlo 発光/蛍光 ○ ○ * BacTiter-Glo 発光 ○ ○ ○ * MTase-Glo 発光 ○ ○ ○ * BCA Protein Assay (Abs 560) 発色 ○ ○ 27 MultiTox-Fluor 蛍光 ○ ○ * Bio-Glo 発光 ○ ○ ○ * MultiTox-Glo 発光/蛍光 ○ ○ * Bradford Assay (Abs 600) 発色 ○ ○ 27 NAD(P)H-Glo 発光 ○ ○ ○ * BRET: NanoBRET 618 BRET ○ 16,17 NAD/NADH-Glo 発光 ○ ○ ○ 10 BRET: Renilla / YFP BRET ○ * NADP/ NADPH-Glo 発光 ○ ○ ○ 10 Bright-Glo 発光 ○ ○ ○ * NanoDLR 発光 ○ ○ ○ 25 cAMP-Glo 発光 ○ ○ ○ 22 Nano-Glo 発光 ○ ○ ○ 26 Caspase-Glo 発光 ○ ○ ○ 6,7 Nano-Glo Endurazine 発光 ○ ○ 26 CellTiter-96 AQ ONE 発色 ○ ○ 4 Nano-Glo Live Cell Assay System 発光 ○ ○ ○ 26 CellTiter-Blue 蛍光/発色 ○ ○ 4 Nano-Glo Vivazine 発光 ○ ○ 26 CellTiter-Fluor 蛍光 ○ ○ 4 ONE-Glo 発光 ○ ○ ○ 26 CellTiter-Glo 発光 ○ ○ ○ 4 ONE-Glo + Tox 発光/蛍光 ○ ○ * CellTox-Green 蛍光 ○ ○ 5 P450-Glo 発光 ○ ○ ○ 11 Chroma-Glo 発光 ○ ○ * QuantiFluor dsDNA 蛍光 ○ ○ * CytoTox-Fluor 蛍光 ○ ○ * QuantiFluor ONE dsDNA 蛍光 ○ ○ 28 CytoTox-Glo 発光 ○ ○ ○ 5 QuantiFluor RNA 蛍光 ○ ○ * CytoTox-ONE 蛍光 ○ ○ * QuantiFluor ssDNA 蛍光 ○ ○ * Dual-Glo 発光 ○ ○ ○ 25 RealTime-Glo 発光 ○ ○ 4 ELISA (Abs 450) 発色 ○ ○ 19 RealTime-Glo Annexin V 発光 ○ ○ ○ 6 FRET: Coumerin / Fluorescein Z-LYTE FRET ○ * Renilla Luciferase Assay System 発光 ○ ○ ○ * GFP protein quantitation 蛍光 ○ ○ * Renilla-Glo Luciferase Assay System 発光 ○ ○ ○ * GloSensor-cAMP 発光 ○ ○ ○ 22 ROS-Glo 発光 ○ ○ ○ 10 Glucose UptakeGlo 発光 ○ ○ ○ 9 Steady-Glo 発光 ○ ○ ○ * GTPase-Glo 発光 ○ ○ ○ * Succinate-Glo 発光 ○ ○ ○ 24 Water-Glo 発光 ○ ○ ○ * ※プリインストールされているプロトコルはソフトウエアのバージョン等により異なる場合があります。最新のプロトコル情報およびソフトウエアに ついては www.promgea.jp より ”Protocols for GloMax” で検索ください。 * ページの表示が無いものについては www.promgea.jp をご覧くださいください。 4 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> 細胞増殖･生存性試験 （2Ｄ / 3D 培養）[発光] [蛍光] [発色] 概要: 細胞の増殖や生存性はライフサイエンス実験において重要であり、薬剤スクリーニングなどでも基本となるパラメーターで、細胞への刺激（薬 剤や培養条件）に対する応答をシンプルな表現型である細胞の増減として検出します。この細胞数あるいは生存活性はこれまで様々な方 法で測定され、トリチウム標識チミジンを DNA に取り込ませる方法などが利用されてきましたが、近年では非放射性標識でも細胞内の活性 を生存マーカー（還元能、ATP など）として非常に高感度なアッセイが行えるようになりました。さらに細胞溶解力を強化した３次元細胞培 養に対応したものや 1 つのサンプルセットで経時的な測定ができる試薬も登場しています。 生存マーカー 測定モード 特⾧ 試薬（ カタログ番号: 最小サイズ ） ATP 発光 グローバルスタンダード（最高感度） CellTiter-Glo® 2.0 (G9241) グローバルスタンダード（最高感 度）、3D 培養対応 CellTiter-Glo® 3D (G9681) 還元能 発光 リアルタイム（経時的測定）、3D 培 養対応 RealTime-Glo™ MT (G9711) 発色 (490nm) 実績豊富（従来法）、色素溶解ス テップなし MTS [ CellTiter96® AQueous One] (G3582) 発色(570nm) 実績豊富（従来法） MTT [CellTiter96®] (G4000) 蛍光 (Ex/Em:560/590nm) 廉価 AlamarBlue [CellTiter-Blue®] (G8080) 生プロテアーゼ 蛍光 (Ex/Em:400/505nm) 発光アッセイとの併用に最適 （マルチ） CellTiter-Fluor™ (G6080) 操作概要:（例）CellTiter-Glo® 2.0 ・ 細胞を培養し、薬剤などの刺激を与える ・ CellTiter-Glo® を添加（培地除去 & 洗浄不要） ・ 10 分後に GloMax®で測光 [GloMax® で “CellTiter-Glo” プロトコルを選択] プロトコル詳細: ・ 発光 ATP アッセイ (CellTiter-Glo® 2.0 Assay) [資料番号 TM403] ・ 発光 ATP 3D 培養対応 アッセイ (CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay) [資料番号 TM412] ・ 発光 還元能 リアルタイムアッセイ (RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay) [資料番号 TM431] ・ 発色 MTS アッセイ (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay) [資料番号 TB245] ・ 発色 MTT アッセイ (CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay) [資料番号 TB112] ・ 蛍光 アラマーブルー アッセイ (CellTiter-Blue™ Cell Viability Assay) [資料番号 TB317] ・ 蛍光 生細胞プロテアーゼ アッセイ (CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay) [資料番号 TB371] 微小組織サイズに比例する発光レベル 細胞を 3.2×105 個/ml から 2.5×103 個/ml に段階希釈し、 GravityPLUS™ 3D Culture and Assay のマニュアルに従い培養 した。CellTiter-Glo® 3D Reagent (100µl)を加え 10 分後に測定 し、GloMax® Discover System で測定した。 ここがすごい ! ・ 発光法による高感度なホモジニアスアッセイ ・ 3D 培養 および リアルタイム 対応の試薬も ・ 他の細胞アッセイとのマルチアッセイも可能 ◀ おすすめポイント ” 実績最多” ◀ おすすめポイント ”リアルタイム” ◀ おすすめポイント ”マルチアッセイ” 細胞生死 5 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> 細胞死・毒性試験 （ネクローシス / 細胞膜傷害）[発光] [蛍光] [発色] 概要: 細胞毒性は薬効（がん標的薬）あるいは薬剤の副作用などを調べる際に利用されます。通常は細胞毒性（細胞膜の傷害）を検出する ために細胞外に漏出した細胞内酵素あるいは核酸などをマーカー（LDH や死プロテアーゼ、DNA）として測定します。漏出したマーカーを 選択する上で、感度はもとよりマーカーの半減期の⾧さなどもポイントになります。プロメガの最新の LDH 測定試薬 LDH-Glo® は発光法 によるアッセイシステムで、培地 2µl を分取し、さらに 50 倍に希釈して測定できるほどの高い感度を有しています。また、複数のタイムポイン トで培地を測定すれば経時的なリアルタイムアッセイも可能です。一方、CellTox Green は細胞死にともない細胞外に漏れだす DNA を 蛍光色素で染めるアッセイ方法です。その他、新規な死プロテアーゼをマーカーとして測定する発光アッセイや LDH を検出する発色アッセイ も取り揃えています。 操作概要:（例）LDH-Glo™ ・ 培養細胞を化合物などで刺激 ・ 培地 2~5µl を分取 ・ Storage Buffer で希釈し、保存またはアッセイ ・ LDH Detection Reagent を 1:1 で加える ・ 30～60 分後に GloMax®で測光 [GloMax® で “LDH-Glo” プロトコルを選択] プロトコル詳細: ・ 発光 LDH アッセイ（LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay） [資料番号 TM548] ・ 発色 LDH アッセイ（CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay） [資料番号 TB163] ・ 蛍光 DNA 断片 アッセイ（CellTox™ Green Cytotoxicity Assay） [資料番号 TM375] ・ 蛍光 死プロテアーゼ アッセイ（CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay ） [資料番号 TB359] 死細胞マーカー 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） LDH 発光 高感度/リアルタイム/マルチ LDH-Glo™ (J2380) 発色 (490nm) 実績豊富、廉価 CytoTox96® (G1780) DNA 蛍光 (Ex/Em:513/532nm) 高感度/リアルタイム/マルチ CellTox™ Green (G8741) 死プロテアーゼ 発光 高感度/マルチ CytoTox-Glo™ (G9290) LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay と CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay のマルチアッセイ ヒト肝臓マイクロティシュを Aflatoxin B1 で 48 時間処理した。 サンプルを 25 倍に希釈して、希釈サンプル 15μl に 15μl LDH Detection Reagent を加え 60 分後にアッセイした。さらに残った マイクロティシュサンプルに等量の CellTiter-Glo® 3D Reagent を添加して細胞生存性を測定した。 ◀ おすすめポイント ”マルチ＆リアルタイム” ◀ おすすめポイント ”蛍光 & リアルタイム” ここがすごい ! ・ 培地たったの 2µl で高感度発光 LDH アッセイ ・ 残った培地や細胞を利用したマルチアッセイも! ・ 同じウェルの培地より複数のタイムポイントでアッセイ可能 細胞生死 6 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> 細胞死メカニズム（アポトーシス）[発光] [蛍光] 概要: アポトーシスは細胞死形態の一つとして⾧年研究され様々なマーカーを利用したアッセイ方法が開発され、がん標的薬のスクリーニグなどにも 利用されてきました。その中でもカスパーゼの有するプロテアーゼ活性により発光基質に付加された認識配列が切断されて生じる発光シグナ ルを測定する方法は、試薬を１度添加して測光するだけの簡便性によりスクリーニングなどに広く使用されています（Caspase-Glo®）。さ らにアポトーシスマーカーとして細胞膜の外側に露出されるホスファチジルセリン (PS) をリアルタイムで測定する新しい試薬は経時的なアポト ーシスシグナルを定量することができ、漏出する DNA（ネクローシスマーカー）を検出する蛍光試薬と組合わせれば後期アポトーシスで起こ る２次ネクローシスと他の細胞毒性イベントにより起こるネクローシスとを見分けることができます（RealTime-Glo™ Annexin V）。 アポトーシスマーカー 測定モード 特⾧ 試薬（ カタログ番号: 最小サイズ ） PS/アネキシン V 発光 リアルタイム（経時的測定） RealTime-Glo™ Annexin V (JA1000) カスパーゼ 3/7 試薬を混ぜるだけ､ エンドポイント Caspase-Glo® 3/7 (G8090) カスパーゼ 8 Caspase-Glo® 8 (G8200) カスパーゼ 9 Caspase-Glo® 9 (G8210) カスパーゼ 3/7 蛍光 (Ex/Em:499/521nm) Apo-ONE® (G7792) 操作概要:RealTime-Glo™ Annexin V ・ 細胞を培養し、薬剤 / アポトーシス誘導剤などの刺 激を与える ・ Detection Reagent を添加し、GloMax®で経時 的にアポトーシスを測定（培地除去 & 洗浄不要） [GloMax® で “RealTime-Glo Annexin V” プ ロトコルを選択] プロトコル詳細: ・ 発光 PS:アネキシン V アッセイ (RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Assay) [資料番号 TM507] ・ 発光 カスパーゼ 3/7 アッセイ (Caspase-Glo® 3/7 Assay) [資料番号 TB323] ・ 発光 カスパーゼ 8 アッセイ (Caspase-Glo® 8 Assay) [資料番号 TB332] ・ 発光 カスパーゼ 9 アッセイ (Caspase-Glo® 9 Assay) [資料番号 TB333] ・ 蛍光 カスパーゼ 3/7 アッセイ Apo-ONE® Homogeneous) [資料番号 TB295] https://pr リアルタイムでのアネキシン V のホスファチジルセリン (PS:Anx) への結合と細胞膜完 全性の欠失 rhTRAIL 希釈系列および RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay Reagents 存在下で U937 細胞を 37°C/5% CO2でインキュベートした。GloMax® Discover で 0, 3.5, 6.5, および 24 時間後に測定し、バックグラウンドの発光、蛍光を差 し引いて RLU（ホスファチジルセリンへのアネキシン V 結合:パネル A）および RFU（細 胞膜の完全性:パネル B）として示した。時間の経過とともに増加する蛍光よりも早く時間 依存的な発光の増加を観察し、アポトーシスの後の 2 次的ネクローシスが起こっていること が示唆された。 ◀ おすすめポイント ”リアルタイム & マルチ” ここがすごい ! ・ 細胞表面の PS をマーカーとした発光リアルタイムアッセイ ・ DNA 漏出マーカーと組合わせたマルチ+リアルタイム! ・ その他のエンドポイントアッセイとのトリプルアッセイも可能 細胞生死 7 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> 細胞死メカニズム （炎症/パイロトーシス）[発光] 概要: Caspase-Glo® 1 Inflammasome Assay はインフラマソームの必須構成要素でカスパーゼのメンバーであるカスパーゼ-1 の活性を選 択的に測定するシンプルでホモジニアスな発光法です。インフラマソームは多様な炎症性刺激により誘導されるタンパク質複合体です。自然 免疫細胞は病原体やその他の危険信号に応答してインフラマソームを形成し、プロカスパーゼ-1 前駆体が活性化カスパーゼ-1 に変換され ます。カスパーゼ-1 活性化の結果、サイトカイン IL-1β および IL-18 のプロセシングと放出が起こり、免疫原性の細胞死であるパイロトー シスとなります。 Caspase-Glo® 1 assay は細胞内や培地中のカスパーゼ-1 活性を直接測定できる感度を有しています。 炎症マーカー 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） カスパーゼ-1 発光 高感度発光アッセイ Caspase-Glo® 1 Inflammasome Assay (G9951) 操作概要:Caspase-Glo® 1 ・ ”Caspase-Glo® 1 Reagent” および Ac-YVAD-CHO 阻害剤 を添加した ”Caspase-Glo® 1 YVAD-CHO Reagent” を 調製（Ac-YVAD-CHO は 1 µM でカスパーゼ-1 活性を 99% 阻害） ・ サンプルに ”Caspase-Glo® 1 Reagent” または ” CaspaseGlo® 1 YVAD-CHO Reagent” を添加 ・ 室温で 1 時間以上インキュベートした後、GloMax®で測光 [GloMax® で “Caspase-Glo” プロトコルを選択] プロトコル詳細: ・ 発光 カスパーゼ-1 アッセイ (Caspase-Glo® 1 Inflammasome Assay ) [資料番号 TM456] 培地中の放出カスパーゼ-1 のモニタリングも可能な Caspase-Glo 1 Inflammasome Assay THP-1 細胞を培養し、PMA で分化させた後、 Pam3CSK4 (2μg/ml) または resiquimod (R848, 20μM) で 2 時間処理した。培地を 2 つの プレートに分け (50μl/well) 、 Caspase-Glo 1 Reagent または Caspase-Glo 1 YVAD-CHO Reagent を添加し、測光した。 ここがすごい ! ・ 細胞、培地中の活性化カスパーゼ-1 のみを高感度に測定 ・ ELISA やウェスタンなどに比べて非常に簡便 ・ マルチプレックスアッセイも可能 細胞生死 8 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> マルチアッセイ （ネクローシス + 生存性 他） [発光] [蛍光] 概要: 1 ウェル内の細胞から複数マーカーを同時に測定するマルチアッセイは、 取得可能なデータの増加およびデータの精度の向上と同時に、細 胞培養に要する時間や試薬などの費用も節約することができます。様々な内在性および分泌マーカー（生死:ATP、還元能、LDH など、 代謝:グルコース、グルタミンなど、酸化/還元:GSH、H2O2 など）を測定することで細胞状態、応答性に関するプロファイルを得ることがで きます。またレポーターアッセイと細胞生存性を組合わせることで、細胞数に依存しないレポーター活性が得られ、より正確なデータを取得する こともできま す。 ※ マルチアッセイの詳細、その他の組合わせなどについては弊社までお問合せください。 細胞生死 9 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> エネルギー代謝、代謝物測定 (グルコース、乳酸、グルタミン、グルタミン酸) [発光] 概要: 幹細胞の分化やがん化などにより、その特徴的な代謝に変化が現れるため、その変化のメカニズムを調べ、がんに特徴的な代謝を標的とす る創薬なども試みられています。プロメガの代謝物発光アッセイ法は解糖系（グルコース、乳酸）またはグルタミン分解（グルタミン、グルタミ ン酸）の主要な指標を培養細胞で高感度に測定することができるシステムです。除タンパク質ステップも無く、高価な専用検出器を必要と せずにハイスループットでアッセイを行うことができます。代謝物測定アッセイ（グルコース、乳酸、グルタミン/グルタミン酸）では、測定に必要 な培地は数 µl なので各タイムポイントで複数の指標を同時に測定することもできます。 操作概要:（例）Glucose-Glo™ ・ 細胞を培養し、薬剤などの刺激を与える ・ Detection Reagent を調製 ・ 培地 2µl を回収、50 倍希釈し、一部を測定プレートに 移して等量の Detection Reagent を混和して 60 分 インキュベート ・ GloMax®で測光 プロトコル詳細: ・ 発光 グルコース取込みアッセイ (Glucose Uptake-Glo™ ) [資料番号 TM467] ・ 発光 グルコースアッセイ (Glucose-Glo™-Assay ) [資料番号 TM494] ・ 発光 乳酸アッセイ (Lactate-Glo™ Assay ) [資料番号 TM493] ・ 発光 グルタミン/グルタミン酸アッセイ (Glutamine/Glutamate-Glo™ Assay ) [資料番号 TM496] ・ 発光 グルタミン酸アッセイ (Glutamate-Glo™ Assay ) [資料番号 TM495] 代謝マーカー 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） 細胞に取り込まれたグルコース類 似体（2DG → 2DG6P） 発光 Non-RI の発光グルコース取込みアッセイ で、分レベルでの取込み量（µM）を測定 Glucose Uptake-Glo™ (J1341) グルコース 高感度アッセイで数時間から数日の変化を 測定（mM レベルの変化） Glucose-Glo™ (J6021) 乳酸 高感度、培地・細胞などのサンプルより測定 Lactate-Glo™ (J5021) グルタミン/グルタミン酸 高感度、培地・細胞などのサンプルより測定 Glutamine/Glutamate-Glo™ ( J8021) グルタミン酸 高感度、培地・細胞などのサンプルより測定 Glutamate-Glo™ (J7021) 培養上清を用いた、各代謝産物の経時的測定 各代謝産物のグラフにおいて、濃い棒グラフは 15,000 細胞の条件を示し、薄い棒グラ フは 5,000 細胞の条件を示す。また、赤い点線は培地のみの測定値を示す。培地は DMEM, 5mM glucose, 2mM glutamine, 10% dialyzed serum を使用した。 ここがすごい ! （取込みアッセイを除く） ・ 培地でアッセイ後に残った細胞で他のアッセイが可能 ・ 1 回に培地 2µl のみ使用するので、タイムコース実験やマル チアッセイが可能 細胞応答 10 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> 酸化・還元測定（ROS、GSH、NADH、NADPH） [発光] 概要: 好気性生物は酸素を用いた代謝機構により大きなエネルギーを得ていますが、同時に酸化ストレスに曝されるため様々な防御機構を発達 させてきました。細胞内の酸化還元状態の変化は、細胞の老化や疾患発症などにつながると考えられており、幅広い研究分野で注目され ています。また、H₂O₂ により NFκB 経路や MAPK 経路の活性化が誘導され発がんに寄与することや、酸化ストレスが幹細胞の自己複 製能や分化に関与していることなどが報告されています。プロメガでは 細胞内の酸化還元に関与する細胞内マーカーを発光法により測定す る技術を有しています。 レドックスマーカー 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） H2O2 発光 HRP 酵素を使用しないので、偽陽性が最低限 ROS-Glo™ H2O2 Assay (G8820) GSH 除タンパク質や遠心が不要な簡便な操作性 GSH -Glo™ Assay (V6911) GSH（還元型） /GSSG（酸化型） 高感度に総 GSH および酸化型 GSSG を定量 GSH/GSSG-Glo™ Assay (V6611) NADP/NADPH 高感度 NADP+/NADPH 定量（10nM- 400nM） NADP/NADPH-Glo™ Assay (G9081) NAD/NADH 高感度 NAD+ or NADH 定量（10nM- 400nM） NAD/NADH-Glo™ Assay (G9071) 操作概要:(例) ROS-Glo™ ・ 96ウェルプレートに細胞を播種し、インキュベート ・ 薬剤などとともに H2O2 Substrate Solution を添加し、最大６時間 までインキュベート ・ ROS-Glo™ Detection Solution を添加し、20分間インキュベート ・ GloMax®で測光 [GloMax® で “ROS-Glo” プロトコルを選択] プロトコル詳細: ・ 発光 H2O2アッセイ (ROS-Glo™ H2O2 Assay) [資料番号 TM391] ・ 発光 GSH アッセイ (GSH-Glo™ Glutathione Assay) [資料番号 TB369] ・ 発光 GSH/GSSG アッセイ (GSH/GSSG-Glo™ Assay) [資料番号 TM344] ・ 発光 NADP/NADPH アッセイ (NADP/NADPH-Glo™ Assay) [資料番号 TM400] ・ 発光 NAD/NADH アッセイ (NAD/NADH-Glo™ Assay) [資料番号 TM399] ROS-Glo™ H2O2 Assay と細胞毒性試験 CellTox™ Green と のマルチアッセイ 384 ウェルプレートの各ウェルに HepG2 細胞 2000 個を播取し、メナジ オン、ピロガロールおよびジギトニンで 2 時間処理し、ROS-Glo™ および CellTox™ Green アッセイを行った。 ここがすごい ! ・ 発光法による高感度で頑健なアッセイ ・ 従来法に比べてシンプルなので HTS にも最適 ・ マルチアッセイにも対応 細胞応答 11 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> 薬物代謝活性測定 (P450) [発光] 概要: P450 酵素は薬物のクリアランス、毒性、活性化に深く関与し、薬物間の有害な相互作用にも影響を及ぼすことがあります。そのため、薬剤 開発工程において P450 酵素により変化するものや、毒性を持つような化合物はスクリーニングの早い段階に排除されることが望ましいとさ れています。プロメガのセルベースアッセイ用の P450 発光基質および反応産物（ルシフェリン）は細胞透過性であるため、培地上清を用 いて P450 活性を発光測定することもでき、残った細胞を他のアッセイ（CellTiter-Glo® などの生存性アッセイ）に用いることもできます。 P450-Glo™ Assay を用いた細胞ベースのアプリケーションとして、基底 CYP 活性の測定、テスト化合物による活性誘導、テスト化合物 による基底活性 / 誘導活性の阻害、核内受容体活性化の追跡（PXR,PXR, CAR, AHR, PPAR）などがあります。 薬剤代謝マーカー 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） CYP3A4 発光 CYP3A4 に対して最も高感度で選択性 が非常に高い基質（阻害アッセイおよび 細胞ベースの誘導アッセイに最適） P450-Glo™ CYP3A4 Assay [ Luciferin-IPA ] (V9001) CYP3A4 に対する選択性が高い P450-Glo™ CYP3A4 Assay [ Luciferin-PFBE ] Cell-Based/Biochemical Assay(V8901) CYP1A2 CYP1A2 に対する選択性が高い P450-Glo™ CYP1A2 Induction/Inhibition Assay[ Luciferin-1A2 ] (V8421) CYP2C9 CYP2C9 に対する選択性が非常に高い P450-Glo™ CYP2C9 Assay [Luciferin-H] (V8791) 操作概要:（例）細胞非溶解アッセイ ・ 細胞にテスト化合物を添加 ・ 発光 CYP 基質を含む新しい培地に交換し、37℃で 30 分-4 時間 （基質により異なる）インキュベート ・ 培地 25µl を白色プレートに分注し、調製した Luciferin Detection Reagent を添加 ・ 室温で 20 分インキュベートした後に、GloMax®で測光 [GloMax® で “P450-Glo” プロトコルを選択] プロトコル詳細: ・ 発光 P450 アッセイ (P450-Glo™ Assays) [資料番号 TB325] ここがすごい ! ・ 発光法による高感度アッセイ ・ HPLC など従来法に比べ非常に簡便 ・ 細胞非溶解プロトコルなら細胞を用いたマルチアッセイも可能 P450-Glo™ 細胞アッセイの原理 細胞ベースアッセイに適した特異性の高い P450 発光基質 21 種類のヒト -P450 アイソフォームについて各 P450-Glo™ Substrate を用いて測定した。 ◀ おすすめポイント ”時短 & 高シグナル/ノイズ” 細胞応答 12 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> オートファジーフラックス測定 [発光] 概要: オートファジーは余剰あるいは有害な細胞内のタンパク質などを分解する重要な細胞内パスウェイであり、平常あるいはストレス誘導条件下 における細胞の健全性を維持する上でも重要な機構です。現在のオートファジーのモニタリングは主に煩雑なフローサイトメトリーやイメージン グで行われており、定量性にも限界があります。プロメガではプレートベースで“添加 – 混和 – 測定”するだけの新規なオートファジーフラック スの定量レポーターシステムを開発しました。このレポーターシステムは簡便でオートファジーフラックスを高感度に定量でき、ハイスループット フォーマットにも対応します。 オートファジーレポーターシステムではオートファジーのマーカーとして広く知られている LC3 に 11 アミノ酸の発光タグ HiBiT を付加した レポーターを用いています。LC3-HiBiT レポーターベクターを細胞に導入し、相補的な LgBiT と発光基質を含む検出試薬を添加することで LC3-HiBiT の発現や分解を検出することができます。オートファジーの誘導は発光シグナルの低下として、オートファジーの阻害は発光シグナ ルの増加としてオートファジーフラックスを評価することが可能です。 マーカー 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） LC3 発光 LC3 HiBiT Reporter を安定発現する HEK293 細胞と検出試薬 HEK293 Autophagy LC3 HiBiT Reporter Cell Line and Detection System (GA1040) LC3 HiBiT Reporter を安定発現する U2OS 細胞と検出試薬 U2OS Autophagy LC3 HiBiT Reporter Cell Line and Detection System (GA1050) Autophagy LC3 HiBiT Reporter Vector と検 出試薬 Autophagy LC3 HiBiT Reporter Vector and Detection System(GA2550) 操作概要: ・ Autophagy LC3 HiBiT Reporter を発現する細胞をプレートに播種 ・ 化合物などを添加し、インキュベート ・ Nano-Glo® HiBiT Lytic Reagent を添加して、10 分～3 時間後に GloMax®で測光 [GloMax® で “Autophagy HiBiT Reporter Assay” プロトコルを選択] 遺伝子改変・安定発現株作成受託についてはお問合せください。 プロトコル詳細: ・ 発光 オートファジーアッセイ用 細胞 & 試薬 (Autophagy LC3 HiBiT Cell and Detection) [資料番号 TM535] ・ 発光 オートファジーアッセイ用 ベクター (Autophagy LC3 HiBiT Vector ) [資料番号 9PIGA255] オートファジー阻害剤の評価 U2OS Autophagy LC3 HiBiT Reporter Cells を白色 96 ウェ ルプレートに播種し（ 8,000 個 / ウェル）、オーバーナイトで細胞を 付着させた。Baf A1 の濃度を増加させて 2 µM PP242 の有無の 2 つの条件で 21 時間トリプリケートで処理を行った。発光シグナルはそ れぞれ未処理コントロールで補正した。 ここがすごい ! ・ 定量性のある明瞭な結果が得られる LC3 レポーターアッセイ ・ 簡便な “添加 – 混和 – 測定” プロトコル ・ ハイスループットアプリケーションに合わせてスケール変更自在 細胞応答 13 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> プロテアソーム活性測定 [発光] 概要: Proteasome-Glo™ Cell Based Assay は、培養細胞内に存在するプロテアソーム複合体のキモトリプシン様、トリプシン様、カスパーゼ 様プロテアーゼ活性を測定するための発光ホモジニアスアッセイシステムです。Proteasome-Glo™ Cell Based Assay では、特殊なバッ ファー（細胞透過性、プロテアソーム活性およびルシフェラーゼ活性に最適化）に溶解したプロテアソームに対する発光基質を使用します。 “添加 – 混和 – 測定”の簡単なフォーマットで、Proteasome-Glo™ Cell Based Assay Reagent が添加されるとプロテアソームによ る基質の切断が起こり、さらにルシフェラーゼ反応により迅速に発光シグナルが生じます。本システムでは各プロテアーゼの活性に特異的な発 光基質、Suc-LLVY-aminoluciferin（キモトリプシン様活性）、Z-LRR-aminoluciferin（トリプシン様活性）、Z-nLPnLDaminoluciferin（カスパーゼ様活性）を用います（※ Suc-LLVY, Z-LRR または Z-nLPnLD の配列を含む発光基質は 20S プロ テアソームにも認識されます）。 マーカー 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） キモトリプシン様活性 発光 Suc-LLVY- アミノルシフェリン 発光基質 Proteasome-Glo™ ChymotrypsinLike Cell-Based Assay (G8660) トリプシン様活性 Z-LRR- アミノルシフェリン 発光基質および非特異 的プロテアーゼ活性抑制のための阻害剤 Proteasome-Glo™ Trypsin-Like Cell-Based Assay (G8760) カスパーゼ様活性 Z-nLPnLD- アミノルシフェリン 発光基質 Proteasome-Glo™ Caspase-Like Cell-Based Assay (G8860) 操作概要: ・ Proteasome-Glo™ Cell-Based Reagent を調製 ・ サンプルと等量の Proteasome-Glo™ Cell-Based Reagent を添加し、混和後 5–10 分間 インキュベート ・ GloMax®で測光 プロトコル詳細: 発光 プロテアソームアッセイ (Proteasome-Glo™ Cell-Based Assays ) [資料番号 TB346] 384 ウェルプレートでの各プロテアーゼアッセイで得られたエポキソマイシン阻害 曲線 U266 細胞 (5,000 個/ウェル)を 384 ウェルプレートに播種し、2.5 時間イン キュベートした。エポキソマイシンを添加し、2 時間インキュベート。ProteasomeGlo™ Cell-Based Reagent を加えて 15 分後に測光した. プロテアソームおよびカスパーゼ 3/7 活性検出のための連続マルチアッセイ H929 細胞を 96 ウェルプレートに播種し、1 昼夜培養した後、エポキソマイシン （10µl/ ウェル）とともに 1.5 または 4.5 時間インキュベートした。ProteasomeGlo™ Cell Based Assay Reagent 添加 15 分後に発 光 を 測 定 し、すぐ に Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Reagent を 追添してカスパーゼ 3/7 による蛍光を検出した。 ここがすごい ! ・ 培養細胞に試薬を加えて混ぜて測るだけ ・ 試薬を加えて 10 分で結果が得られます。 ・ 高感度で優れたシグナル/ノイズ比 細胞応答 14 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> エフェクター細胞活性（ADCC、T 細胞活性化） [発光] 概要: 近年、がん免疫療法がクローズアップされ、免疫細胞の活性化をターゲットとする薬剤、細胞治療などが注目を集めています。これまでの免 疫細胞活性化による細胞毒性の評価には、患者由来のエフェクター細胞として NK 細胞や T 細胞を含む末梢血単核細胞 (PBMC) な どを採取する必要があり、煩雑で S/N 比や再現性が低いなど様々な問題があり、特に多検体でのスクリーニング・モニタリングには困難が伴 いました。プロメガのレポーターアッセイを応用した遺伝子組み換え細胞を用いれば、必要に応じてすぐに実験に使用できる細胞（エフェクター 細胞 / ターゲット細胞 ）と検出試薬を入手することができ、発光による検出法により明瞭な結果を得ることができます。 活性化対象 作用機序 測定モード 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） T 細胞活性化 T 細胞活性化 発光 T Cell Activation Bioassay, IL-2 (J1651) 免疫チェックポイント阻害 PD-1/PD-L1 (J1250), CTLA-4 (JA3001), TIGIT/CD155 (J2201) LAG-3, 4-1BB 他 エフェクター T 細胞療法 （CAR-T） T Cell Activation Bioassay, NFAT (J1621) 他 NK 細胞活性化 ADCC ADCC Bioassay (G7015) マクロファージ活性化 ADCP ADCP Bioassay (G9901) 免疫増強 サイトカイン IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-17, IL-23, VEGF (GA2001), RANKL Bioassay プロトコル詳細: ・ ADCC アッセイ [資料番号 TM387] ・ T 細胞活性化アッセイ [資料番号 TM492] ・ PD-1/PD-L1 免疫チェックポイント遮断アッセイ [資料番号 TM468] 操作概要:（例）ADCC アッセイ ・ 白色 96 ウェルプレートにターゲット細胞（キットに付属）および抗体 （コントロール Anti-CD20 や実験抗体など）を分注 ・ エフェクター細胞（キットに付属）を分注して６時間インキュベート ・ 発光試薬を添加して 5～30 分後に GloMax®で測光 [GloMax® で “ADCC Reporter Bioassay” プロトコルを選択] ビデオ: 優れた特異性を示す ADCC Reporter Bioassay リツキシマブ､トラスツズマブ、コントロール培地（抗体なし）の段階希釈系列 をエフェクター細胞とともにターゲット細胞存在下あるいは非存在下で 37℃、6 時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を定量した。 ここがすごい ! ・ 発光レポーターによる再現性の高いアッセイ ・ エフェクター細胞調製不要 ・ その他のバイオアッセイも続々登場 ※その他のバイオロジックス ツールの最新情報は以下をご覧ください https://www.promega.jp/c/us/promotions/na-biologicsselector-page/ 細胞応答 15 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> ウイルス感染・細胞融合 [発光] 概要: LgBiT および HiBiT を発現させた 2 種類の細胞あるいは細胞とウイルスなどの組み合わせを用いて、それらが融合・感染すると HiBiT と LgBiT が自発的に会合して発光酵素となるため、基質添加にともなう発光を定量することで、細胞融合や感染の度合いが分かります。 HiBiT は 11 アミノ酸の短い発光タグなので、挿入配列の⾧さに制限のあるウイルスゲノムへの挿入や CRISPR-Cas9 によるゲノム編集を 応用することにより内在ローカスへの挿入が行えます。 操作概要:（例）HiBiT ・ LgBiT を安定発現する細胞、HiBiT を導入したウイルスまたは細胞を 作成する。 ・ LgBiT または HiBiT をそれぞれ発現する２種類の細胞を共培養、ま たは LgBiT 発現細胞に HiBiT 発現ウイルスを感染させる。 ・ 発光基質を添加し、GloMax®で測定 ※遺伝子改変・安定発現株作成受託についてはお問合せください。 参考情報: ウイルス感染: http://www.promega.co.jp/pdf/virus_Infectious_disease_research.pdf 細胞融合:http://www.promega.co.jp/pdf/kawara_1710_p4.pdf HiBiT テクノロジー: http://www.promega.co.jp/product/pm/HiBiT_technology/ ここがすごい ! ・ 極小発光タグを利用したウイルス感染または複製検出 ・ 発光酵素会合を利用した細胞融合検出 ・ アクセプター細胞への Exosome デリバリー 検出系にも応用可能 HiBiT LgBiT 試薬（発光基質） HiBiT テクノロジーによるウイルス感染・細胞融合の検出スキーム 細胞応答 16 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> 細胞内 タンパク質:タンパク質相互作用検出 [発光] [BRET] 概要: 免疫沈降 (IP)やプルダウンなどで見出したタンパク質:タンパク質相互作用 (PPI)について、生きた細胞内における PPI の再現性を確かめ ることは重要です。また生体内に近い条件で PPI 阻害剤などをスクリーニングすることが、適切な候補分子の探索には重要になります。これ まで細胞での PPI アッセイには FRET、BRET、スプリット GFP などが試されてきましたが、感度や操作性に問題があり、決定的な手法の開 発が待たれていました。プロメガの NanoBRET™（BRET 検出）または NanoBiT™（発光検出）技術を利用した 2 つのアプローチはこ れまでの問題を回避し、細胞内の複雑な環境下で PPI を検出するため、PPI を標的とした阻害剤のスクリーニングなどに最適です。 操作概要:（例） NanoBRET™ ・ 相互作用ペア タンパク質 A および タンパク質 B の遺伝子に PPI 検出用の タグとして NanoLuc®または HaloTag®を付加（N 末/C 末あるいは NanoLuc®/HaloTag®の最適な組合わせを検討する必要あり） ・ 細胞で融合タンパク質 A およびタンパク質 B を発現させる ・ 検出用の試薬を添加して GloMax® Discover などで BRET ま たは発光シグナルを検出 [GloMax® で “BRET: NanoBRET 618” プロトコルを選択] ※遺伝子改変・安定発現株作成受託についてはお問合せください。 検出対象 タンパク質相互作用 (近接度) タンパク質相互作用 (直接的な相互作用) 測定モード（方式） BRET (生物発光共鳴エネルギー転移) 発光 （発光酵素断片の相補性） 特⾧ タグの大きさ 小さい 20 kDa（NanoLuc™）と 30 kDa （HaloTag®） 非常に小さい 11 アミノ酸（SmBiT）と 18 kDa （LgBiT） データ 2 波⾧の比率（低 %CV） RLU（相対発光強度） 試薬添加回数 2 1 検出機器 アッセイ GloMax® Discover BRET 対応ルミノメーター （適合フィルター要） GloMax® ルミノメーター（フィルター不要） イメージング 発光イメージングシステム（Olympus LV200 など）:相 互作用前後を観察可能 発光イメージングシステム（Olympus LV200 など）: 複合体のみ観察可能 可逆性（キネティックアッセイ可） ○ ○ 製品形態 キット（100 種類以上）、クローニングベクター、検出試薬 クローニングベクター、検出試薬 ベクター構築サービスもございます。 ライセンス費用（企業を含む） 試薬の購入のみ その他 その他 HaloTag 側を使ったプルダウン – 製品名（ カタログ番号: スタートキット ） NanoBRET™ (N1811) NanoBiT™ (N2014) 従来の BRET アッセイと NanoBRET™ のパフォーマンス比較 HaloTag® 618 Ligand が結合した FKBP-HaloTag® と FRB-NanoLuc® 存在 下でラパマイシンを加えると 2 つの融合タンパク質が相互作用を起こし、BRET を生じる （左図）。FKBP-YFP と FRB-Rluc8 による BRET システムとのデータ比較。 プロトコル詳細: ・ BRET PPI アッセイ (NanoBRET™ System) [資料番号 TM439] ・ 発光 PPI アッセイ (NanoBiT® System) [資料番号 TM461] ◀ NanoBiT™ とスプリットホタルルシフェラーゼの応答性の比較 NanoBiT™ タグまたはスプリットホタルルシフェラーゼタグを融合した FKBP および FRB を発現する HEK293 細胞にラパマイシン（上）または FK506（下）を添加した。 ここがすごい ! ・ 細胞ベースアッセイによる真の PPI を観測可能 ・ 従来の PPI から飛躍的に改良された S/N ・ “究極の” BRET と “簡便な” NanoBiT 発光 細胞内分子間相互作用 17 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> 細胞内 タンパク質:低分子相互作用検出 （Target Engagement）[BRET] 概要: 薬剤の標的分子への結合の選択性と親和性を理解することは、薬剤を評価するうえで重要なポイントとなります。これらを評価するにあた り、従来は単離精製した標的分子を用いたセルフリー系が用いられてきました。しかし、セルフリー系は、生体内での環境と大きく異なり、必ず しも薬剤の実際の効果環境を反映しているとは言えません。そこで、BRET を用いた評価系、Target Engagement が開発されました。 BRET のドナーとなる NanoLuc® ルシフェラーゼを融合させた標的タンパク質を発現した細胞に、BRET アクセプターとなる蛍光で標識し た膜透過性トレーサーを添加します。トレーサーが標的分子に結合すると BRET が起こり、アクセプターが光を発します。トレーサーを結合さ せた細胞に、非標識のテスト化合物を添加することで、競合阻害様式によりテスト化合物と標的タンパク質の結合選択性や親和性を評価 することができます。 検出対象 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） キナーゼ:化合物 相互作用 BRET NanoBRET™ トレーサー ( K-4 )、発光基質、 コントロール NanoLuc®融合発現ベクター NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay, K-4 (N2520) NanoBRET™ トレーサー ( K-5 )、発光基質、 コントロール NanoLuc®融合発現ベクター NanoBRET™ TE Intracellular Kinase Assay, K-5 (N2500) BET ブロモドメインタンパク質: 化合物 相互作用 NanoBRET™ トレーサー (BET BRD Tracer )、 発光基質、コントロール NanoLuc®融合発現ベクター NanoBRET™ TE Intracellular BET BRD Assay (N2130) HDAC:化合物 相互作用 NanoBRET™ トレーサー (HDAC Tracer)、 発光基質、コントロール NanoLuc®融合発現ベクター NanoBRET™ TE Intracellular HDAC Assay (N2080) ※各トレーサーに対応する NanoLuc® 融合標的タンパク質発現ベクターが別途必要です（ベクターについては各プロトコルを参照）。 操作概要:（例）NanoBRET TE Intracellular Kinase Assay ・ NanoLuc と標的タンパク質との融合タンパク質を発現する細胞を培養 ・ トレーサー（蛍光標識された化合物）を添加した後、未標識テスト化合 物を添加し、GloMax® で BRET を観察 [GloMax® で “BRET: NanoBRET 618” プロトコルを選択] ※遺伝子改変・安定発現株作成受託についてはお問合せください。 プロトコル詳細: ・ NanoBRET™ TE キナーゼ アッセイ (K-4) [資料番号 TM519] ・ NanoBRET™ TE キナーゼ アッセイ (K-5) [資料番号 TM520] ・ NanoBRET™ TE BET ブロモドメイン アッセイ [資料番号 TM478] ・ NanoBRET™ TE HDAC アッセイ [資料番号 TM483] DDR1-NanoLuc® 融合タンパク質発現 HEK293 細胞での NanoBRET™ トレーサー競合実験 BRET を用いた細胞内蛍光標識化合物結合試験（Target Engagement） ここがすごい ! ・ 細胞内で起こる真の化合物:タンパク質の相互作用 ・ タンパク質:低分子化合物 結合試験 ・ 化合物の滞留時間測定 （residence time） 細胞内分子間相互作用 18 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> 標的タンパク質 モニタリング（発現 / 分解 / 局在） [発光] 概要: 標的タンパク質の検出には抗体を用いたウェスタンブロッティングや ELISA が利用されてきました。しかし、タンパク質検出の成否は抗体の品質に大きく依存 します。また、ライセートの調製、ブロッティング、洗浄など煩雑な操作が必要なため、スループットに限界があります。プロメガの HiBiT 発光ペプチドタグ（11 アミノ酸）ならば、標準的なクローニング操作（または CRISPR によるゲノム編集）を１度行えば、抗体を必要とせず、発光試薬を添加するだけの高感度 で簡便な標的タンパク質の定量が可能になります。 操作概要:HiBiT ・ HiBiT ベクターへの標的遺伝子クローニングあるいは PCR により既存発現ベクターに HiBiT 配列を導入 し、細胞にトランスフェクション（※短いタグなのでゲノム編集 により内在標的遺伝子にノックインすることも容易） ・ 標的タンパク質の発現あるいは分解、局在変化させ る刺激、薬剤を添加 ・ 細胞外用検出試薬または細胞内検出試薬を添加 して GloMax® で測光する。 ※遺伝子改変・安定発現株作成受託についてはお問合せください。 プロトコル詳細: ・ 発光 細胞内タンパク質検出システム (Nano-Glo® HiBiT Lytic ) [資料番号 TM516] ・ 発光 細胞外タンパク質検出システム (Nano-Glo® HiBiT Extracellular ) [資料番号 TM523] ・ 発光 ブロッティングタンパク質検出システム (Nano-Glo® HiBiT Blotting) [資料番号 TM524] 参考文献 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30540463 検出対象 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） 細胞内タンパク質 発光 細胞溶解成分と LgBiT および発光基質を含む Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System (N3030) 細胞外タンパク質 （膜タンパク質、分泌タンパク質） LgBiT と発光基質を含む Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System (N2420) ブロッティング膜上のタンパク質 LgBiT と発光基質およびブロッティングバッファーを含む Nano-Glo® HiBiT Blotting System (N2410) ここがすごい ! ・ 細胞内タンパク質の定量（Lytic Detection） ・ 膜タンパク質または分泌タンパク質の定量 (Extracellular Detection) ・ HiBiT 融合受容体のインターナリゼーションの検出 ・ 標的タンパク質分解化合物 (PROTAC : Proteolysis Targeting Chimera など) の探索（参考文献参照） ・ 簡便なウェスタンブロッティング様の検出 細胞表面の膜タンパク質や分泌タンパク質の発光定量の概要 目的タンパク質に付加された HiBiT と試薬に含まれる LgBit との強い親和性により発光酵素が再構成される。 各種アゴニスト刺激に伴う HiBiT-β2AR インターナリゼーション の検出 HiBiT を付加したβ2AR が CMV プロモーターにより安定発現する HEK 293 細胞を構築した。表示の様々なリガンドで 30 分間処理 した後に Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent を添加 し、4 分後に発光を測定した（発光値は未処理細胞の値で補 正）。 細胞標的タンパク質発現・分解検出 19 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> セルベース ELISA [発色] 概要: セルベース ELISA は細胞ベースのイムノアッセイであり、細胞内に含まれる特定のタンパク質を抗体および発色試薬により検出・定量します。様々な化合物 や薬物が細胞内の標的タンパク質の発現に与える影響を検出することができます。プロメガでは HRP 標識 2 次抗体あるいは簡便な発色試薬 TMB One Solution（G7431）などを販売しています。 検出対象 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） HRP 発色 基質。 便利な 1 液タイプ TMB One Solution (G7431) ニワトリ IgY 抗体 発色 (HRP) ELISA 用二次抗体 Anti-Chicken IgY, HRP (G1351) ヤギ IgG 抗体 Donkey Anti-Goat IgG HRP (V8051) ウサギ IgG 抗体 Anti-Rabbit IgG (H&L) HRP (W4011) マウス IgG 抗体 Anti-Mouse IgG HRP (W4021) ヒト IgG 抗体 Anti-Human IgG HRP (W4031) 操作概要: ・ 細胞を各ウェルで培養し、テスト化合物などで処理 ・ 培地を除去して、クエンチング、ブロッキングなどを行う ・ 一次抗体につづき HRP 標識二次抗体を結合させる ・ TMB One Solution を添加し、GloMax® (450nm) で測定 [GloMax® で “ELISA (Abs 450)” プロトコルを選択] 細胞標的タンパク質発現・分解検出 20 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> リン酸化（修飾）タンパク質定量 [発光] 概要: 遺伝子発現、酵素活性、タンパク質合成・転移などの細胞内応答は多様な細胞内シグナル経路の活性化を通じて調節されています。その 中でも特定のキナーゼによる標的タンパク質のリン酸化は重要なノード（結節点）となり、上流の活性化イベントが下流の細胞応答へと受 け渡されます。細胞ベースでこれらのシグナルイベントをモニタリングすることは正常な細胞のふるまいと疾患ステイタスの理解に重要です。現 在、タンパク質の検出や翻訳後修飾（例. リン酸化）分析では ELISA やウエスタンブロットなどのイムノアッセイが汎用されていますが、これ らの方法は洗浄操作など非常に煩雑で HTS も困難です。プロメガの NanoBiT® 発光アッセイ技術を用いた SmBiT/LgBiT で標識され た 2 次抗体を用いれば、洗浄操作のいらない簡便で高感度なアッセイが行えます。 操作概要: ・ 培養細胞にテスト化合物などを添加し、シグナルパスウェイを活性化 ・ 細胞を溶解 ・ 抗体ミックスを添加し、90 分程度インキュベート ・ Nano-Glo® 検出試薬を添加し、GloMax® で測光 本アッセイの詳細についてはお問合せください。 参考文献 http://www.promega.co.jp/slas トータルおよびリン酸化 IkBα 検出による NF-kB パスウェイ活性化 MCF 細胞を TNFαで 0-30 分処理（ +/- MG132）した。 プロテアソーム阻害剤により IkBαの分解とリン酸化 IkBαの蓄積が検出された。 NanoBiT や NanoBRET テクノロジーを利用すればプレートベースで 様々なフォーマットのイムノアッセイを設計することが可能です（詳細に ついては弊社までお問合せください。）。 シグナル伝達 & タンパク質修飾 21 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> プロテインキナーゼ活性測定 (in vitro) [発光] 概要: ADP-Glo™ Kinase Assay は、キナーゼ反応で生成する ADP を発光法により測定するキナーゼアッセイシステムです。ADP はキナーゼ により ATP に変換され Ultra-Glo™ Luciferase により発光シグナルが生じます。発光シグナルはキナーゼ活性と正の相関性を有します。 このシステムは広範な精製キナーゼの活性に対する化合物の影響を測定する際に有効で、1 次スクリーニングおよびキナーゼ選択性のプロフ ァイリングにも利用することができます。また、ADP-Glo™ Kinase Assay は最大 1mM ATP を使用して ADP を生成するあらゆる酵素 （例. キナーゼ、ATPase）の活性をモニタリングすることができます。ADP-Glo™ Kinase Assay は広いダイナミックレンジを有し、低い ATP/ADP 変換率においても高いシグナルを生じるため、成⾧因子受容体チロシンキナーゼなど活性の低いキナーゼのスクリーニングにも最 適です。このアッセイ法では擬陽性も低く、Zb値は 0.8 以上を示します。 検出対象 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） ADP （キナーゼ, ATPase 活性） 発光 最もシンプルで高感度な ADP 生成活性測定 ADP-Glo™ Kinase Assay（V6930） 操作概要:ADP-Glo™ Kinase Assay ・ 384 ウェルプレートでキナーゼ反応を実施 ・ ADP-Glo™ Reagent を添加し、室温で 40 分間インキュベート ・ Kinase Detection Reagent を添加し、室 温で 30- 60 分間インキュベート ・ GloMax® で測光 [ GloMax® で “ADP-Glo” プロトコルを選択] プロトコル詳細: ・ 発光 キナーゼアッセイ (ADP-Glo™ Kinase Assay) [資料番号 TM313] 様々なキナーゼ活性を検出 できるユニバーサルな ADP-Glo™ ここがすごい ! ・ 高感度で簡便な in vitro キナーゼアッセイ ・ ADP を生成するあらゆる酵素活性を測定可能 ・ キナーゼ阻害剤スクリーニングのグローバルスタンダード ADP-Glo™ System の測定原理 ADP-Glo™ が付属するプロテインキナーゼ（170 種類以上）については以下をご覧ください。 www.promega.co.jp/keslist.html ※その他、キナーゼプロファイリングシステムおよび脂質キナーゼアッセイセットにつ いてはお問合せください。 シグナル伝達 & タンパク質修飾 22 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> cAMP リアルタイム/エンドポイントアッセイ [発光] 概要: cAMP は Gas および Gai タンパク質を介した GPCR のシグナル伝達に関与する重要なセカンドメッセンジャーです。プロメガは細胞内に バイオセンサーを発現させるリアルタイムアッセイ（GloSensor™）と、細胞を溶解し酵素カップリング反応により cAMP を検出する cAMPGlo の 2 つを用意しています。1）GloSensor™ 技術をベースにしたリアルタイムアッセイ法では、ホタルルシフェラーゼの内部に cAMP 結 合タンパク質の一部を挿入するための遺伝子改変が施されたベクターを生細胞に導入します。発現したバイオセンサーに cAMP が結合す ると、構造が変化して発光量が増加します。この生細胞アッセイは cAMP を通じたシグナル伝達のカイネティックスやモジュレーションの研究 に最適です。2）cAMP-Glo™ Max Assay は細胞内の cAMP を発光シグナルとして測定するホモジニアスなハイスループットアッセイシ ステムです。このアッセイの原理は、cAMP がタンパク質キナーゼ A（PKA）ホロ酵素活性を刺激し、ルシフェラーゼ反応に利用可能な ATP が減少することにより発光が抑えられることに基づきます。cAMP 標準曲線を用いることにより発光レベルから cAMP 濃度が決定され ます。 操作概要:（例）GloSensor ・ pGloSensor™-22F を HEK293 などの細胞にトランスフェクション ・ GloSensor™ cAMP Reagent を含む培地を添加し、室温で 2 時 間インキュベート ・ テスト化合物を添加し、各タイムポイントで GloMax® で測光 [GloMax® で “GloSensor-cAMP” プロトコルを選択] プロトコル詳細: ・ 発光 リアルタイム cAMP アッセイ（GloSensor™ cAMP Assay) [資料番号 TM076] ・ 発光 エンドポイント cAMP アッセイ（cAMP-Glo™ Max Assay) [資料番号 TM0347] 検出対象 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） cAMP （リアルタイム） 発光 cAMP 検出発光センサー（cAMP が結合する改変 ルシフェラーゼ) 発現ベクター pGloSensor™-22F cAMP Plasmid (E2301) cAMP 検出発光センサー用 発光基質 GloSensor™ cAMP Reagent (E1290) cAMP （エンドポイント） ホモジニアス高感度 cAMP アッセイ cAMP-Glo™ Max Assay (V1681) アロステリック cAMP バイオセンサー 生細胞におけるシグナルのカイネティクスと可逆性を示す。cAMP バイオセンサーを一過 性に発現する HEK293 細胞を 10mM イソプロテレノール（ISO）または 10mM フォルスコリン（FSK）それぞれ単独で処理した。変調を加える細胞は、10 μM ISO, 10 μM プロプラノール（PRO）および 10 μM FSK で連続的に処理した。 ここがすごい ! ・ 高感度な細胞内 発光 cAMP アッセイ ・ 新規なセンサーを細胞に導入すればリアルタイムアッセイが可能 ・ 細胞を溶解するエンドポイントアッセイなら 30 分でアッセイ完了 D1 受容体を発現する HEK293 細胞における SCH23390 の IC50 決定 384 ウェルプレートの各ウェルに細胞を 3000 個ずつ添加した。細胞は 100nM のアゴニスト, SKF38393 存 在下で表示量のアンタゴニスト SCH23390 で処理した。ネガティブコ ントロール反応では SCH23390 の代 わりにアルプレノロールを用いた。測定は cAMP-Glo™ MaxAssay を使用。 シグナル伝達 & タンパク質修飾 23 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> カルシウム測定 (Fluo-4, Fluo-8) [蛍光] 概要: カルシウムはシグナル伝達、筋収縮、神経伝達物質制御など重要な役割を果たしており、細胞内の様々なプロセスはカルシウムイオンにより コントロールされているためカルシウムの定量は必要です。特に細胞内のカルシウム濃度を測定することで、薬剤標的として知られる GPCR や イオンチャネルの活性状態を測定することができるため、創薬スクリーニングにも応用されています。GloMax® Discover System のスピー ドと感度は細胞内カルシウムレベル測定用の蛍光カルシウムプローブの使用に理想的です。 操作概要: ・ 96 ウェルプレートに細胞を播種し、24 時間後に Fluo-4 AM また は Fluo-8R AM のストック溶液を添加し 1～2 時間程度静置 ・ 蛍光色素溶液をバッファーで交換し、余分なプローブを除 ・ GloMax® でイオノマイシンまたは ATP をインジェクション ・ カイネティックモードまたはループモードで Blue Fluorescent module (Excitation: 475nm, Emission: 500–550nm)で 蛍光測定 ※ Fluo-4, Fluo-8 はプロメガでは販売していません。 プロトコル詳細: 蛍光 カルシウム応答モニタリング [資料番号 AN324] Fluo-4 AM および GloMax® Discover を用いてイオノマイシン刺激に よる HCT116 細胞のカルシウムフラックスのモニタリング イオノマイシン希釈系列 100μl インジェクション（50μl/秒）に伴うカルシウム応 答。カルシウム応答は増加するイオノマイシン濃度にともない上昇した。 シグナル伝達 & タンパク質修飾 24 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> エピジェネティクス関連酵素活性 [発光] 概要: エピジェネティクス異常はがんを始めとする多くの疾患に関与していることが分かってきており、エピジェネティック制御にかかわる分子は重要な創 薬ターゲットとして注目を集めています。ヒストンアセチル化制御にかかわるヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤をはじめ、ヒストンメ チル化・脱メチル化酵素やそれらの制御因子をコントロールする薬剤の開発が急ピッチで進められています。ここではエピジェネティック制御タン パク質のうち、メチル化・アセチル化関連酵素の高感度発光アッセイをご紹介します。 マーカー 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） メチル基転移酵素活性 発光 in vitro アッセイ（酵素）。メチル基転移酵素反応 で SAM から生成した SAH を発光法により検出 MTase-Glo™（V7601） JumonjiC ヒストン脱メチル化酵 素 （JMJC）活性 in vitro アッセイ（酵素）。酵素カップリング反応で 生成したコハク酸を発光法により検出 Succinate-Glo™ JmjC Demethylase/Hydroxylase Assay (V7990) ヒストン脱 アセチル化酵素 （HDAC）活性 クラス I および II 細胞、酵素などのサンプルを使用可。蛍光法よりも 10-100 倍高感度。阻害剤 トリコスタチン A 添付 HDAC-Glo I/II Assay (G6420) クラス IIa 細胞、酵素などのサンプルを使用可。蛍光法よりも 100 倍以上高感度。 HDAC-Glo Class IIa Assay (G9560) クラス I 酵素 2 HDAC-Glo 2 Assay (G9590) NAD+-依存性ヒストン脱アセチル化酵 素 クラス III（SIRT） in vitro アッセイ（酵素）。蛍光法よりも 10-100 倍高感度。 SIRT-Glo™ Assay (G6450) 操作概要:(例) MTase-Glo ・ 96 ウェルプレートの各ウェルに酵素液 (MTase-Glo™ Reagent を含む) 、テス ト化合物を添加し 10 分インキュベート ・ SAM を添加、混和して反応開始させ、インキュベート ・ MTase-Glo™ Detection Solution を添加、混和して 60 分インキュベート ・ GloMax® で測光 [GloMax® で “MTase-Glo” プロトコルを選択] プロトコル詳細: ・ 発光 メチル基転移酵素活 アッセイ (MTase-Glo™) [資料番号 TM453] ・ 発光 JmjC 脱メチル化酵素アッセイ (Succinate-Glo™) [資料番号 TM488] ・ 発光 HDAC I/II アッセイ (HDAC-Glo™ I/II) [資料番号 TM335] ・ 発光 HDAC IIa アッセイ (HDAC-Glo™ IIa) [資料番号 TM407] ・ 発光 HDAC 2 アッセイ (HDAC-Glo™ 2 ) [資料番号 TM406] ・ 発光 SIRT アッセイ (SIRT-Glo™ ) [資料番号 TM336] EZH2 酵素複合体反応における GSK126 の IC50 の決定 EZH2 酵素複合体、SAM、完全⾧のヒストン 3 タンパク質および表示 濃度の GSK126 を 384 ウェルプレートに分注し、30°Ｃ、60 分間イン キュベートした後に MTase-Glo™ Assay を行った。 ここがすごい ! ・ “添加-混和-測定” だけの簡便なプロトコル ・ 蛍光法に比べ高感度な発光アッセイ ・ 発光時間も⾧いのでハイスループットスクリーニングにも最適 シグナル伝達 & タンパク質修飾 25 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> レポーターアッセイ（高感度 & 標準）＜デュアル＞[発光] 概要: デュアルルシフェラーゼアッセイシステムはトランスフェクション効率や細胞数の補正を行うための内部標準用のレポーターと実験レポーターを同 じサンプルより取得し、より正確なデータを得るためのアッセイシステムです。従来はトランスフェクション効率の補正などにβガラクトシダーゼや GFP などが利用されていましたが検出系が分かれるため煩雑でした。プロメガは基質の異なる発光酵素２種（ホタル & ウミシイタケ）を用 いて、簡便な連続測定が行えるデュアルシステムを初めて採用し、安定発現株を作成することなく、非常に高感度で信頼性のあるデータを 得ることができるようになりました。さらに、より高感度な NanoLuc® ルシフェラーゼとホタルルシフェラーゼを組合わせれば、内部補正以外の 利用（実験レポーター X2 や 転写活性 + タンパク質発現）も可能です。また、従来のレポーターアッセイといえば特定の応答配列/プロ モーターを利用した ”ジェネティックレポーター” による転写活性の測定でしたが、近年では NanoLuc® やその断片を標的タンパク質に融合 させて、タンパク質の発現・分解を観察する ” プロテインレポーター” としての応用例が増えています。 検出ルシフェラーゼ 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） NanoLuc & ホタル 発光 (デュアル) 最高感度の NanoLuc® ⾧時間発光タイプ Nano-Glo® Dual-Luciferase® (N1610) ホタル & ウミシイタケ ⾧時間発光タイプ Dual-Glo® Luciferase (E2920) 短時間発光タイプ。⾧年の実積。 Dual-Luciferase® (E1910) 操作概要:（例）NanoGlo® Dual-Luciferase® ・ 細胞を培養し、薬剤添加などの刺激を与える ・ ONE-Glo™ EX Luciferase Assay Reagent を添加し、混和。3 分 後に GloMax® ルミノメーターで測光（培地除去 & 洗浄不要）。 ・ NanoDLR™ Stop & Glo® Reagent を添加し、混和。10 分後に GloMax®で測光（培地除去 & 洗浄不要）。 [GloMax® で “NanoDLR” プロトコルを選択] 遺伝子改変・安定発現株作成受託についてはお問合せください。 プロトコル詳細: ・ ⾧時間発光 高感度 NanoLuc® & ホタル デュアルレポーターアッセイ (Nano-Glo® Dual-Luciferase® ) [資料番号 426] ・ ⾧時間発光 ホタル & ウミシイタケ デュアルレポーターアッセイ (Dual-Glo® ) [資料番号 058] ・ 発光 ホタル & ウミシイタケ デュアルレポーターアッセイ (Dual- Luciferase® ) [資料番号 040] ◀ おすすめポイント ”高感度” (トランス フェクションが 困難でも OK) NanoDLR™または Dual-Glo®アッセイより得られたデータの 変動係数（CV）の比較 同一サンプルからの抗酸化応答配列 (ARE) および熱ショック応答配 列 (HSE) からの応答と細胞生存性マルチアッセイ HepG2 細胞に pNL[NlucP/ARE/Hygro] および pGL4.41[luc2P/HSE] をトランス フェクションした後、tBHQ で処理し O/N で インキュベーションした。 CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay で細胞生存性を測定した 後、HSE および ARE 応答を NanoDLR™ assay で測定した。 ここがすごい ! ・ 最新の NanoLuc® はホタルの 100 倍の感度 ・ トランスフェクションの難しい初代培養細胞や幹細胞などでのレポータ ーアッセイも可能に ・ 転写活性だけでなく、NanoLuc®融合タンパク質の発現も一発アッ セイ 転写活性（レポーターアッセイ） 26 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> レポーターアッセイ（高感度 & 標準）＜シングル & リアルタイム＞[発光] 概要: シングルルシフェラーゼレポーターアッセイは主に安定発現細胞株を用いた実験で利用され、薬剤のスクリーニングなどに汎用されます。新しい NanoLuc® ルシフェラーゼはホタルルシフェラーゼの約 100 倍の感度を有しており、よりミニチュア化したアッセイフォーマットにも対応します。リ アルタイムアッセイ用の基質も提供しており、経時的なシグナル応答やタンパク質量変化をモニタリングすることも可能です。 検出ルシフェラーゼ 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） NanoLuc® （または NanoBiT® などスプリット NanoLuc®にも適応 可能） 発光 (シングル) エンドポイント（細胞溶解）。 Nano-Glo® (N1110) リアルタイム（生細胞）。発光時間 2 時間 Nano-Glo® Live Cell (N2011) リアルタイム（生細胞）。発光時間 72 時間程度 Nano-Glo® Vivazine™ (N2580) リアルタイム（生細胞）。発光時間 数日程度 Nano-Glo® Endurazine™ (N2570) ホタル エンドポイント（細胞溶解）。実績豊富 ONE-Glo® EX (E8110) 操作概要:（例）Nano-Glo® ・ NanoLuc®を安定発現する細胞を構築 ・ テスト化合物で処理 ・ 細胞溶解成分を含む Nano-Glo® Luciferase Assay Reagent を添加 ・ GloMax®で側光 [GloMax® で “Nano-Glo” プロトコルを選択] 遺伝子改変・安定発現株作成受託についてはお問合せください。 プロトコル詳細: ・ 発光エンドポイント NanoLuc® レポーターアッセイ (Nano-Glo®) [資料番号 TM369] ・ 発光リアルタイム NanoLuc® レポーターアッセイ (Nano-Glo® Live Cell) [資料番号 T9FB195] ・ 発光リアルタイム NanoLuc® レポーターアッセイ (Vivazine™ / Endurazine™) [資料番号 TM550] ・ 発光エンドポイント ホタル レポーターアッセイ (ONE-Glo® EX) [資料番号 TM432] ここがすごい ! ・ 最新の NanoLuc® はホタルの 100 倍の感度 ・ トランスフェクションの難しい初代培養細胞や幹細胞などでのレポータ ーアッセイも可能に ・ 生細胞をモニタリングするリアルタイムアッセイ用試薬も 高感度な NanoLuc® とホタル/ウミシイタケとの発光レベ ルの比較 NanoLuc® は Nano-Glo®、ホタルは ONE-Glo®、ウミシイ タケは Renilla-Glo™ で測定した。 Nano-Glo® Live Cell Assay System、Endurazine™、 Vivazine™ の発光カイネティクス比較 転写活性（レポーターアッセイ） 27 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> タンパク質定量 (Bradford Assay/ BCA Assay) [発色] 概要: GloMax® Discover System では Pierce 社の 660nm Protein Assay を用いて迅速、正確に溶液中のタンパク質濃度を測定でき ます。このアッセイは Coomassie® ベースのブラッドフォード アッセイよりも直線性に優れ、多くの界面活性剤や還元剤など汎用試薬の濃 度が高くても測定することが可能です。このアッセイでは吸収極大が 660 nm にシフトする酸性条件下 特殊な色素-金属複合体がタンパ ク質に結合します。この赤茶色の色素-金属複合体はタンパク質に結合すると緑色に変わります。660nm Protein Assay のプロトコルは GloMax® にプリインストールされているため (“Bradford Assay”として)、すぐにアッセイを開始することができます。GloMax® Discover System を用いた場合の測定レンジは 125–2,000µg/ml です。 GloMax® Discover System と Pierce 社 BCA Protein Assay を組合わせることで広範なレンジのタンパク質定量を行えます。ビシ ンコニン酸法 (BCA)はアルカリ条件下でタンパク質により Cu+2 が Cu+1 へ還元される原理に基づいています。BCA と Cu+1 の組合わせに より、562nm に吸収を持つ紫色の産物を生じ、この産物量はサンプル中のタンパク質量に依存します。個々のタンパク質は呈色強度が異 なるため、タンパク質定量の際にはこの点について考慮しなければなりません。温度、界面活性剤、塩および様々なバッファー成分が本アッセ イに影響を与えます。BCA Protein Assay (Abs 560) のプロトコルは予め GloMax® にプリインストールされているため (“BCA Protein Assay”として)、すぐにアッセイを開始することができます。GloMax® Discover System を用いた場合の測定レンジは 25– 2,000µg/ml です。 操作概要: タンパク質定量 (例:Pierce 社 660nm Protein Assay [ Thermo Scientific Cat.# 22660] ) ・ 調整したスタンダードなどを用いて標準曲線を作成 ・ スタンダード、未知濃度サンプル、ブランクを 96 ウェルプレートにそれぞれ 10µl 添加 ・ 各ウェルに Protein Assay Reagent 150µl を添加 ・ プレートをカバーしてプレートシェーカーで中速 1 分程度撹拌し、室温で 5 分間静置 ・ 600nm での吸光度を GloMax® で測定 [GloMax® で “Bradford Assay (Abs 600)” プロトコルを選択] プロトコル詳細: ・ 発色 660nm Protein Assay [資料番号 AN247] ・ 発色 BCA Protein Assay [資料番号 AN246] GloMax® Discover を用いたブラッドフォードタンパク質 アッセイ 希釈した BSA スタンダード (125–2,000µg/ml)を Pierce 660nm Protein Assay に加え GloMax® Discover System を用い て吸光度を測定した。 タンパク質 & 核酸定量 28 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> 2 本鎖 DNA 定量 for NGS (QuantiFluor) [蛍光] 概要: NGS 解析に要求される核酸の精製度は高く、使用する核酸の量も正確でなければいけません。プロメガの QuantiFluor® 試薬なら添加 して測定するだけのフォーマットで、低濃度の dsDNA でも簡便に測定できます。NanoDrop など 吸光度 (260nm) 測定法に比べ低濃 度サンプルでの感度は飛躍的に向上します。この蛍光色素は dsDNA に特異性が高く、ssDNA、RNA、タンパク質やその他の化合物への 結合は最低限です。イルミナ社 (HiSeq/miSeq) などの NGS システムにも適合します。 検出対象 測定モード 特⾧ 製品名（ カタログ番号: 最小サイズ ） 2 本鎖 DNA 蛍光 サンプルと混ぜるだけの簡単操作 QuantiFluor® ONE dsDNA System（E4871） 操作概要:QuantiFluor® ONE dsDNA System ・ QuantiFluor® ONE dsDNA Dye を 96 ウェルプレートに分注 ・ ブランク、スタンダード、未知濃度サンプルをプレートに分注し、 5 分間インキュベート ・ GloMax® で蛍光測定 [GloMax® で “QuantiFluor ONE dsDNA” プロトコルを選択] プロトコル詳細: ・ QuantiFluor® ONE dsDNA System [資料番号 TM405] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29305766 96 ウェルプレートフォーマットでの dsDNA 標準曲線 96 ウェル（200µl アッセイフォーマット）で Lambda DNA を使用 した。 タンパク質 & 核酸定量 29 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> ルシフェラーゼ免疫沈降システム (LIPS : luciferase lmmunoprecipitation systems) [発光] 概要: 自己抗原と感染性病原体に対する抗体のプロファイルを理解し、定量化するための技術開発は、病気のメカニズムの解明や新しい疾患マ ーカーの発見につながる可能性があります。ルシフェラーゼ免疫システムを（LIPS）として知られる方法を用いて自己抗原や病原体抗原に 対する患者血清の抗体応答をプロファイリングすることができます。汎用性が高いプレートリーダーを用いた方法であり、ELISA 法よりも高感 度であるため、抗原に対する体液性血清学的応答プロファイルの取得に有用です。プロメガの NanoLuc® はこれまでに LIPS で利用され てきたホタルやウミシイタケルシフェラーゼに比べ 100 倍の感度が引き出されるため、従来では検出困難であった抗体の検出や、少量のサン プルでの検出も可能です。 操作概要: ・ “NanoLuc® – 抗原” 発現ベクターの作製および動物細胞への導入、ライセートの 調製 ・ 血清に“NanoLuc® – 抗原”を含むライセートを反応させ、プロテイン A / G ビーズに より IgG 分子を捕捉/分離 ・ 洗浄後、NanoLuc®基質を添加して GloMax® で測定 本アッセイの詳細についてはお問合せください。 参考文献: https://www.jove.com/video/1549/lips?language=Japanese https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29305766 各社 プロテイン G 担体による抗体精製の比較 LIPS 法の概要 調製した NanoLuc®-抗原 (Ag) と血清サンプルを反応させ、得られた NanoLuc®-抗原-抗体をプロテイン A / G ビーズで回収し、発光を測定。 自己抗体検査（研究用） 30 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> ●カスタムプロトコル GloMax® プレートリーダーにはプロメガの多くのプロトコルが事前にインストールされていますが、オリジナルのプロトコルも直観的 に作成し、発光/蛍光/吸光を組合わせたマルチアッセイなども簡単に設定することができます。 Abs: 吸光測定 [ フィルター選択、リファレンス波⾧設定など ] Fluo: 蛍光測定 [ 励起・蛍光フィルター選択、測定スピードなど ] Lumi: 発光測定 [ 測定時間、フィルター選択 など ] Ratio: BRET/FRET 測定 [ 測定時間、フィルター選択、測定スピード など ] Wait: インキュベーション (温度コントロールなし) [時間] Heat: ヒーティング [温度] Inject: インジェクター [時間] Shake: プレート振とう [時間、回転数、撹拌方式、振幅] Prompt: メッセージを表示 [その他、プレートの取り出し] Loop: 作成したプロトコルを任意の回数繰り返す [繰り返し数、インターバル時間] （次ページ参照） Kinetics: 継時的測定のため、Kinetics による測定 [測定回数、インターバル時間] （次ページ参照） 1. ホーム画面より [ PROTOCOLS ] → [NEW PROTOCOL] をクリックし “PROPERTIES” のウィンドウで、プロトコル名を設定 2. カスタムプロトコルの画面で左のプロトコルのアイコンを、 右側のプロトコル画面へドラッグ&ドロップする (プロトコル は、上から下の順番で実行①→③)。 < ↑PROPERTIES 画面> < ↑カスタムプロトコル 画面> ＜ プロトコルアイコンと設定項目 > ① ② ③ 3. 各プロトコルの画面で測定条件の詳細を設定して保存。 < ↑ プロトコル 画面> ※ カスタムプロトコルについては操作マニュアルをご覧ください。 プロトコルアイコン ② カスタムプロトコル 31 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> ウエル単位で経時的な測定を行いたい場合に使用:設定したプログラムをウエルごとに繰り返し実施するモードで、 Kinetics の中に、実施したいプロトコルアイコンを入れるだけです。 Kinetics プログラム実施時は、下記のように各ウエル内にカイネティクスのグラフが表示される。 各ウエルを選択すると、下記のように測定値を表示する。 ＜ Loop プロトコル ＞ プレート単位で経時的な測定を行いたい場合にはループプロトコルを使用します。 設定したプログラムをプレート単位で繰り返し実施するモードで、Loop の中に、実施したいプロトコルアイコンを挿入するだけです。 ＜ Kinetics プロトコル画面 ＞ 32 < 製品の価格、詳細およびプロトコルについては www.promega.jp より上記の ”カタログ番号” または“資料番号”で検索ください。> ●プロメガクラブ MAX プロメガのルミノメーター、プレートリーダーなどをお持ちのユーザー様を対象にしたクラブで、機器のソフト・ファームウエアのアップデ ート情報や新しいアプリケーションなどをお知らせいたします。さらに、MAX 会員番号をご利用いただくことで、プロメガクラブの通 常特典および MAX 会員様専用の優遇特典を受けることができます。 会員条件:弊社機器（Maxwell/GloMax シリーズ等）ご購入者 プロメガｸﾗﾌﾞ MAX の詳細、MAX 会員番号の入手方法などについては以下のサイトをご覧ください。 www.promega.co.jp/kikiclub/ ●保守点検サービス プロメガ株式会社では機器購入後 1 年間の保証期間以降に引き続き加入する機器サービスプランをご用意しています。 これにより、お客様の突然の修理費用負担の低減、メンテナンス費用の年間計画に貢献します。期間満了後いつでも契約は 更新でき、同時に複数年契約することも可能です。装置のライフサイクル全般にわたって、維持管理費を抑え、かつ安心して 装置を使用していただくことができます。お客様が安心して装置を使用し続けることができる環境づくりのために下の３つのプラン を用意しております。 1. 保守メンテナンス:定期点検、部品代、作業費を含むトータルサポートを提供します。 2. パーツ契約メンテナンス:部品代、作業費をカバーすることによって突然の費用発生をなくします。 3. 定期点検:年 1 度の機器点検を行うことにより故障を未然に防止します。 4. IQ & OQ :GMP、GLP 設備に要求される IQ、OQ のドキュメント、サービスともにご用意しております。 ※詳細については弊社までお問合せ下さい。 機器サポートクラブ プロメガ株式会社 技術的お問合せ、カスタム製品については テクニカルサービス部（ TEL: 03-3669-7980 E-mail: prometec@jp.promega.com ）までお寄せください。 製品の価格・在庫状況については カスタマーサポート部（ TEL: 03-3669-7981 ）までお寄せください。 ※製品の仕様やその他の掲載情報については 2019 年 6 月現在のものであり、予告なしに変更することがあります。 保守点検 1000 PK1907-06B