GoTaq® 2-Step RT-qPCR System

GoTaq® 2-Step RT-qPCR System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS A6010 Quick PR OTO COL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM337 をご覧ください。 Revised 2012/04 プロトコール概要 プロトコール RNAと逆転写反応プライマーの準備 1. RNAと逆転写反応用のプライマーを調製します。 構成成分 容量 RNA (up to 5μg/reaction) __μl Primer [Oligo(dT)15 Primer and/or 1μl Random Primer or 1μl gene-specific primer] __μl Nuclease-Free Water (up to a final volume of 10μl) __μl 最終容量 10μl 2. （オプション）必要に応じてRNAとプライマーを70℃で5分処 理したのち、4℃で5分して変性させます。 3. RNAとプライマーを逆転写反応を行うまで氷上で保存しま す。 GoScript™逆転写酵素によるcDNA合成 4. GoScript™ Reaction Mixを順番に試薬を加えて調製しま す。 構成成分 GoScript™ Reaction Mix Minus-Reverse Transcriptase Reaction Mix Free Water (to a final volume of 10μl) 1.5μl 2.5μl GoScript™ 5X Reaction Buffer 4μl 4μl MgCl2, 25mM 2μl 2μl PCR Nucleotide Mix, 10mM 1μl 1μl Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor 0.5μl 0.5μl GoScript™ Reverse Transcriptase 1μl 0μl 最終容量 10μl 10μl 5. GoScript™ Reaction Mixに、１-3で調製したプライマー ＋RNAを加えます。 6. 次のような温度でcDNA合成（逆転写反応）を行います。 ステップ 温度 時間 アニーリング(オプション) 25°C 5 分間 伸長 42°C 1 時間 不活性化 70°C 15 分間 温度は、変更可能です。詳細は英文マニュアルTM337を参照してください。 7. 合成したcDNAは4℃、または氷上で次の反応まで保存しま す。cDNAは、－20℃で保存できます。 GoTaq® qPCR Master MixによるcDNAの定量 8. cDNAと標準サンプルをNuclease-free waterで希釈しま す。 9. 調製したcDNAサンプル、また標準サンプルをそれぞれ10μlず つ反応プレートに加えます。テンプレートなしのコントロール用に は水（Nuclease-free Water）を加えます。 構成成分 逆転写反応 GoScript™ Reaction Mix or Minus-Reverse Transcriptase Reaction Mix 10μl RNA and reverse transcription primer prepared in Steps 1–3 10μl 最終容量 20μl RNA と逆転写用のプライマー をチューブ、またはプレートのウ ェ ル中 で混合 し 、熱変性 の 後、冷却します。 RGoScript™ Reaction Mix を調製し、RNA とプライマ ーを含んだサンプルに加えま す。 cDNA の合成 ・アニーリング ・伸長 ・酵素不活性化 ・冷却 合成した cDNA（必要に応じ て希釈）、コントロール、ス タンダードをプレート分注 します。 GoTaq qPCR Reaction Mix を調製し、cDNA などの鋳型が 入ったウェルに加えます。 リアルタイム装置にセットし て、qPCR 反応を行 いま す。 増幅解析、誘拐曲線、スタ ンダードカーブを取得して、 解析を行います。 GoTaq® 2-Step RT-qPCR System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS A6010 Quick PR OTO COL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM337 をご覧ください。 Revised 2012/04 10. GoTaq® qPCR Master Mixを室温に戻し、水、プライマー を加えてGoTaq® qPCR Reaction Mixを調製します。 構成成分 容量 GoTaq® qPCR Master Mix, 2X 25μl Nuclease-Free Water (to a final volume of 40 μl) __μl Forward and reverse qPCR primers1 __μl 最終容量 40μl 注1：CXRの添加が必要な機器（右表参照）を利用する場合には、100× CXR reference dye をあらかじめ2×GoTaq® qPCR Master Mixに1ml に対して100×CXR reference dye 20μl を先に加えてください。その後、1 サンプルあたり25.5μl 分注するなどの方法で行ってくだい。 注２: プライマーの濃度は、増幅する配列によって異なります。50-500nM で ご検討ください。 11. 40μlのGoTaq® qPCR Reaction Mixを、10μlのcDNAサ ンプル、標準サンプル、水（テンプレートなしのコントロール） が入ったウェルに分注します。軽く遠心します。 12. リアルタイムPCR装置の右表のようにフィルター、プログラムを設 定します。 13. 準備した反応プレートを装置にセットし、反応を行います。 14. 反応終了後に解析を行います。 CXR リファレンスダイの添加が不要な機種 Applied Biosystems 7500＆7500 Fast Real Time PCR Systems Stratagene Mx3000P® and Mx3005P® Quantitative PCR Systems Roche LightCycler® 480 Roche LightCycler 1.5 and 2.0 systems BioRad Chromo4™ Real-Time Detector BioRad CFX Real-Time PCR Detection Systems BioRad iCycler iQ5™ and MyCycler™ Eppendorf Mastercycler® ep realplex4 and realplex4 S Qiagen Rotor-Gene ™ Q, 3000, and 6000 CXR リファレンスダイの添加が必要な機種（終濃度 1X） Applied Biosystems 7000 Sequence Detection System Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System Applied Biosystems 7700 Sequence Detection System Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System Applied Biosystems StepOne® and StepOne®Plus Real-Time PCR Systems 機器のフィルター設定 検出フィルター： FAMTM, SYBR®（BRYT®） リファレンス波長： ROXTM（CXR） プログラムの設定（標準法と Fast 法） サイクル 数 標準プログラ ム Fast プログラム ホットスタートの活性 化 1 95℃、2 分 95℃、2 分 変性 40 95℃、15 秒 95℃、3 秒 アニーリング/伸長 60℃、60 秒 60℃、30 秒 解離 1 60–95℃ 60–95℃ ※プライマーや機種の違いによって温度等を変更する必要があるかもしれません。 Fast 法は、機種によって対応できない場合もあります。