HaloTag® Mammalian Protein Detection and Purification Systems,日本語簡易プロトコル

HaloTag® Mammalian Protein Detection and Purification Systems INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS G6790, G6795, G6799 Quick PR OTO COL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM348 をご覧ください。 Revised 2012/06 2 x 108個の細胞からの HaloTag®タンパク質精製 ＜細胞溶解＞ 1. 細胞ペレットを 5ml の HaloTag® Purification Buffer に懸濁する。 2. 100l の 50X Protease Inhibitor Cocktail を加える。 3. 氷上で超音波処理する。 ＊その他の細胞溶解法は英文マニュアル#TM348 をご覧ください。 4. ライゼートを遠心（10,000xg、15 分間、4℃）し、上清を回収する。 ＜レジンの平衡化＞ 5. 600l の HaloLink™ Resin を遠心チューブに移す。 6. 遠心（1,500×g、5 分間）し、上清を捨てる。 7. レジンを 5 回洗浄する。 a. 5ml の HaloTag® Purification Buffer を加え、5 分混合する。 b. 1500×g、 5 分間遠心し、上清を捨てる。 ＜結合＞ 8. ライゼートを平衡化したレジンに加える。 9. 室温（22-25℃）で 90 分混合する。 10. 遠心（1,500×g、5 分間）し、上清をサンプルとして別チューブに移し保存しておく。 ＜洗浄＞ 11. レジンを 3 回洗浄する。 a. 5ml の HaloTag® Purification Buffer を加え、室温で 10 分混合する。 b. 1500×g、 5 分間遠心し、上清を捨てる。 ＜HaloTag®の切断＞ 12. 9l の HaloTEV Protease と 291l の HaloTag® Purification Buffer を混合す る。 13. レジンに加え、室温（22-25℃）で 90 分混合する。 ＜溶出＞ 14. 遠心（1,500×g、5 分間）し、上清をサンプルとして別チューブに移す（Elution 1）。 15. レジンに 300l の HaloTag® Purification Buffer を加え、室温（22-25℃）で 30 分混合する。 16. レジンをスピンカラムに移し、遠心（10,000xg、15 秒間）し、上清を別チューブに移す （Elution 2）。 17. Elution 1 と Elution 2 を遠心（10,000xg、1 分間）し、新しいチューブに移す。 超音波処理で 細胞溶解（氷上） HaloLink™Resin を 平衡化 レジンを 洗浄 x5 90 分間 インキュベート HaloLink™Resinに ライゼートを加える 洗浄 x3 HaloLink™Resin に HaloTag® Purification Buffer を加える HaloTEV Protease を 加える 90 分間 インキュベート Elution 1 を 回収する 30 分間 インキュベート Elution 2 を 回収する HaloTag® Mammalian Protein Detection and Purification Systems INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS G6790, G6795, G6799 Quick PR OTO COL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM348 をご覧ください。 Revised 2012/06 HaloTag®融合タンパク質の検出 蛍光ラベリング HaloTag®融合タンパク質を HaloTag® TMRDirect™ Ligand で蛍光ラベリングする ことで、迅速・簡単にタンパク質発現量や精製効率をチェックできます。 1. HaloTag® TMRDirect™ Ligand stock solution (100M)を DMSO で 2 倍 に希釈し、50M のｗorking solution を作製する。遮光して-20℃で保存する。 ＊PBS で希釈することもできますが、保存ができなくなります。 2. 10l の HaloTag®融合タンパク質を含むライゼートに、19l の HaloTag® Purification Buffer と 1l の 50M HaloTag® TMRDirect™ Ligand 加える。 ＊ライゼートの代わりに等量の非結合分画を使用することもできます。 3. 遮光し、室温で 15 分間インキュベートする。 4. 10l の 4x SDS gel loading buffer を加え、70℃で 3 分間加熱する。 5. 10l を SDS ポリアクリルアミドゲルに供す。 6. 電気泳動後、蛍光イメージャー（Typhoon®など）でスキャン（励起波長 532nm、 蛍光波長 580nm）し、バンドの蛍光強度を定量する。 HaloTag® TMRDirect™ Ligand を希釈して、 50M のｗorking solution を作製する。 ラ イ ゼ ー ト 、 HaloTag® Purification Buffer 、 HaloTag® TMRDirect™ Ligand を合わせる。 室温で 15 分間インキュベートする。 4x SDS gel loading buffer を加える。 70℃で 3 分間インキュベートする。 SDS ポリアクリルアミドゲルに供する。 ゲルをスキャンする（532Ex、580Em）