発現タンパク質の高感度発光検出法 Nano-Glo® HiBiT Protein Detection System

11アミノ酸 効く！ 極小 HiBiT Nano-Glo® HiBiT Protein Detection System ★ CRISPR / Cas9 ゲノム編集による HiBiT ノックインプロトコル ★ HiBiTクイックスタートガイド or マルチウェルプレート ブロッティング 付録つき 抗体の いらない 発現タンパク質の高感度発光検出法 プロメガ株式会社 ● 生細胞で“生きたまま”タンパク質定量が可能（生細胞アッセイ） ● 小さなタグ（11 アミノ酸）：ウィルスゲノム挿入やゲノム編集への応用 ● 抗体不要で迅速・簡便に溶液中、ブロッティングメンブレン上のタンパク質定量が 可能（細胞溶解アッセイ） 近年、生きた細胞を用いて生理現象を“ありのまま”検出したいというニーズが高まっており、特に ライブセルでの実験系、ゲノム編集によるタンパク質の機能解析など、より内在的な解析法が求め られています。プロメガは抗体を用いること無くこれまで実現が難しかった“生きたまま”の 細胞で もタンパク質定量が可能な画期的な発光タグシステムを開発しました。HiBiT system は 11 アミノ酸 のペプチドタグと、それに結合する相補的な NanoLuc® ルシフェラーゼ断片と基質を用いた発光法に よって目的タンパク質を検出する技術です。すでに実用化されているタンパク質検出タグとして、ア フィニティータグ（His、c-Myc、FLAG 等）や GFP 等の蛍光タンパク質が知られていますが、簡便性、 親和性、アプリケーション、ランニングコストの面で長所と短所があるため、実験により使い分ける 必要がありました。HiBiT system はタンパク質定量に関して、これらいずれの点においても高い性能 を持ち、これまで難しいとされた様々な実験系を実現できる世界初の新規発光タグシステムです。 名古屋大学　医学部保健学科　理学療法学専攻　亀高 諭 先生 亀高先生は骨格筋が再生する際に見られる筋芽細胞の融合現象の定量化の手法を探しておられました。細胞 融合のモニタリングにはこれまで GFP や RFP などの蛍光タンパク質が一般的でした。2 つの細胞にそれぞれ の蛍光タンパク質を発現させ、細胞融合によりそれらが merge し、ダブルポジティブな細胞をイメージング により細胞融合を評価する系です。ただしこの手法は基本的にはイメージングでの定量であるため、定量性 やスループットに限界がありました。今回 HiBiT をご紹介したところ、細胞融合により発光定量ができる点に 注目頂き、これまで実現できなかった細胞融合の定量化手法としてご検討頂くことになりました。 筋芽細胞の細胞融合の定量化（HiBiT Intracellular Detection） HiBiT 開発までの道のり 2012 年、プロメガはより明るく小さい新規のルシフェラーゼとして NanoLuc® ルシフェラーゼを開 発しました。これにより従来のレポーター遺伝子アッセイの高感度化だけでなく、タンパク質レポー ターとして新たなアプリケーションにも展開できるようになりました。 2015 年、大小 2 つの NanoLuc® 断片の相補性を利用した NanoBiT® System をタンパク質間相互作用 の解析ツールとして開発しました。この技術により、これまで難しかった生細胞でのタンパク質間 相互作用を高感度に定量できるようになりました。開発の過程で大きな断片であるLarge BiT （LgBiT） [ 約 18KDa] と相補性を持つ小さなペプチド断片（11 アミノ酸）をスクリーニングし、最も親和性の 低い断片（Kd=190 µM）を Small BiT（SmBiT）として NanoBiT® に採用しました。さらに、最も高い 親和性を有するペプチド（Kd=700 pM）を HiBiT と名づけ、発現タンパク質を高感度に検出するため の発光タグとして様々なアプリケーションについて検討を行いました。 アルファテスターのご協力 HiBiT は不可能を可能にする新しいタンパク質検出方法として広範な用途への利用が考えられ、多く の方にテスターとしてご意見を賜りました。日本国内でも 30 名以上のテスターの方に種々のテスト 実験をして頂き、頂いたフィードバックをもとに製品開発の参考にさせて頂きました。そのうちの 3 名のテスター参加者への導入エピソードをご紹介致します。 Luminescance (RLU) HiBiT : 700 pM Spontaneous complementation Facilitated complementation e.g., protein interactions Native : 900 nM SmBiT : 190 µM 104 -12 -9 -6 -3 105 106 107 図 1. スクリーニングより得られたペプチドと LgBiT との 親和性 レポーターのウィルスゲノムへの導入（HiBiT Intracellular Detection） 大阪大学微生物病研究所　分子ウイルス分野　福原崇介 先生 福原先生はハイスループットなスクリーニング系構築のための、様々なウイルスを利用した変異ウイルスレ ポーター作製を研究しておられました。問題点として、小型ウイルスでは Firey などの大きなルシフェラーゼ の挿入は困難であるという点がありました。そんな中、小型のレポーターとして NanoLuc® をご使用頂き、C 型肝炎ウイルスなどの小型ウイルスへの導入が可能であることを検証頂いておりました。さらに今回、ペプチ ドレベルまで最小化した HiBiT をご紹介し、これまでレポーターの挿入が不可能であった多くのウイルスにレ ポーターの導入が可能になるとの声を頂き、検証して頂いております。 HiBiT Protein Detection PPI LgBiT SmBiT （11 a.a.） （17.6kDa） （11 a.a.） high afnity low afnity 発現タンパク質検出法に革命！ ～極小の発光タグでありのままのタンパク質機能解析を～ 東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科　システム発生・再生医学研究分野　松島隆英 先生 松島先生はこれまで分泌タンパク質の細胞外での定量に様々な手法を検討されていました。ELISA assay や質量分析の手法では相性のよい抗体が必要、また HTS に向かないなどの問題がありました。そこで、 NanoLuc® 融合タンパク質を用いた実験系をご紹介し、特に HTS での簡便な実験系ができるようになりま した。さらに今回 HiBiT をご紹介し、より内在的な解析のための CRISPR / Cas9 system によるゲノム編集が 可能になり、培養細胞だけでなく最終的には究極的な”生きたまま”の実験系であるマウス in vivo 解析 へと展開して頂いています。 ハイスループットかつ“生きたまま”の分泌タンパク質定量（HiBiT Extracellular Detection） CRISPR Cas9 HiBiT を付加した タンパク質として発 現した膜タンパク 質・分泌タンパク質 等を細胞を生かし た ま ま 定 量 す る。 検出試薬に含まれる LgBiT は細胞膜非透過性なので細胞表面のタンパク 質または細胞外への分泌タンパク質のみ検出できる。シンプルな添加・ 検出フォーマットにより、受容体の細胞内移行、受容体のリサイクリング、 タンパク質分泌、細胞膜移行をリアルタイムで測定可能。 アプリケーション例 ● GPCR 受容体の生細胞での内在化定量 2 種類の細胞あるいは細胞とウィルスなどの組み合わせで、それぞれの細 胞に LgBiT、HiBiT を発現させ、それらが融合すると自発的に会合し、基質 添加により発光定量する。挿入配列の長さに制限のあるウィルスゲノムや CRISPR / Cas9 によるゲノム編集に応用することにより、内在性ゲノム、ウィ ルスゲノム中の遺伝子のマーカーとして利用可能。 アプリケーション例 ● ウイルス感染あるいは複製（極小 HiBiT がウイルスゲノムへの挿入に好適） ● 細胞融合 ● アクセプター細胞への Exosome デリバリー ● 生細胞での細胞内タンパク質の定量 細胞内タンパク質会合による細胞融合、ウイルス感染の検出 HiBiT Intracellular Detection HiBiT の特徴とアプリケーション HiBiT システムのベースとなる HiBiT は大きさがわずか 11 アミノ酸であり、高い親和性（Kd = 約 1 nM）で LgBiT と結合して NanoLuc® を再構成し、強い発 光を生じます。この非常に明るい光により過剰発現させることなく内在レベルで発現する目的タンパク質の定量化が可能であり、CRISPR 等のゲノム編集 技術と組み合わせて内在ローカスにこの HiBiT タグを埋め込むことで実質的にあらゆるタンパク質の発現をモニタリングすることができます。また、 SDSPAGE で分離した HiBiT タグ付きタンパク質をブロッティングし、LgBiT を含む検出試薬を添加するだけでフェムトグラムレベルの感度でタンパク質を検出 することがきます。さらに、細胞を溶解することなく HiBiT タグタンパク質の細胞表面発現、膜受容体の内在化、また分泌タンパク質を数分で測定する こともできます。シンプルな 1 回試薬添加のアッセイプロトコールなのでハイスループットアプリケーションにも最適です。 キーポイント 明るい 高輝度 NanoLuc® の 発光 シンプル 抗体不要、標準的 なルミノメーター 小さなタグ（11 アミノ酸） 対象タンパク質への影響が 最小限、ゲノム編集に最適 4 融合、感染 ※本アプリケーションでは2つの細胞にそれぞれLgBiT、HiBiTを発現させる。 メンブレン SDS-PAGE + Blotting + 詳細については お問合せください HiBiT 付加タンパク質を発現させた細胞を溶解し、SDS-PAGE 泳動、メン ブレン転写する。メンブレンに LgBiT および NanoLuc® 基質を含む試薬を 添加し、目的タンパク質をバンドとして検出する。 ● 試薬を 1 回添加するだけのシンプルな手順 ● 30 分以内に実験完了 ● 抗体不要・特異的 : シグナルは HiBiT と LgBiT の結合でのみ検出 →非特異的バンドは検出されない ※ 100ml は 10 ブロット分に相当 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） ブロッティングタンパク質発光検出システム Nano-Glo® HiBiT Blotting System 100ml N2410 36,000 細胞ライセートのタンパク質定量 HiBiT Lytic Detection 目的タンパク質に HiBiT を付加し、細胞内で発現させ、細胞溶解成分を 含む試薬（LgBiT、NanoLuc® 基質を供給）を添加して発光測定する。 ※ HiBiT タグの導入方法については次のページをご覧ください。 ● 試薬を 1 回添加するだけのシンプルな手順 ● 10 分以内に実験完了 ● 7 桁以上の広いダイナミックレンジ（30kDa タンパク質で 10fg-100ng） トランスフェクション またはゲノム編集 目的タンパク質 HiBiT HiBiT 融合タンパク質の 細胞内発現 NanoLuc® 基質 細胞溶解剤 LgBiT 1 log RLUs log moles HaloTag-HiBiT Protein Background-subtracted RLUs Raw RLUs Detection of Purified Proteins -20 -19 -18 -17 -16 -15 -14 -13 -12 -11 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） HiBiT ベクター（MCS クローニング） pBiT3.1-N［CMV/HiBiT/Blast ］Vector 20 µg N2361 73,000 pBiT3.1-C［CMV/HiBiT/Blast ］Vector 20 µg N2371 73,000 pBiT3.1-secN［CMV/HiBiT/Blast ］Vector 20 µg N2381 73,000 HiBiT ベクター（Flexi® クローニング） pFC37K HiBiT CMV-neo Flexi® Vector 20 µg N2391 73,000 pFN38K HiBiT CMV-neo Flexi® Vector 20 µg N2401 73,000 pFN39K secHiBiT CMV-neo Flexi® Vector 20 µg N2411 73,000 コントロールタンパク質 HiBiT Control protein 10 月発売予定 N3010 お問合下さい タグの導入 2 ブロッティングメンブレン上でのタンパク質定量 HiBiT Blotting 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 細胞溶解タンパク質発光検出システム Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System 10 ml N3030 26,000 100 ml N3040 150,000 10×100 ml N3050 1,180,000 3 生細胞の膜タンパク質、分泌タンパク質の定量 HiBiT Extracellular Detection 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 細胞外タンパク質発光検出システム Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System 10 ml N2420 28,000 100 ml N2421 175,000 10×100 ml N2422 1,350,000 ※ 10ml は 96 プレートフォーマットで 100 ウェル分に相当 ※ Detection System および Blotting System にはベクターは含まれません。 ※ 10ml は 96 プレートフォーマットで 100 ウェル分に相当 各 HiBiT ベクターには N 末付加、C 末付加および分泌型（sec）を揃えています。 ● HiBiT 発現ベクターへの標的遺伝子の組込み ● 保有する標的遺伝子発現クローンへの HiBiT 配列の組込み ● ゲノム編集による内在遺伝子への HiBiT 配列の組込み a）Flexi® クローニング b）MCS クローニング CRISPR / Cas9 ゲノム編集による HiBiT 配列導入 HiBiT 配列は 33 塩基にコードされるご極小のペプチドタグ（11 アミノ酸）なので、従来法のように HiBiT ベクターへ目的遺伝子をクローニングするだけで なく、短いエピトープタグなどと同様にお手元の標的遺伝子発現クローンへ PCR 法や遺伝子合成により簡便に付加することもできます。また、CRISPR / Cas9 などのゲノム編集技術により内在遺伝子に融合させることも可能です。 CRISPR / Cas9 ゲノム編集技術を用いて内在ローカスに HiBiT 配 列を導入することにより、強力なプロモーターで一過的に過剰 発現させる場合に比べ多くの場合応答性が向上し、ありのまま のタンパク質発現解析が可能になります。 ライセンスについて： ラベルライセンスの内容を承認いただく必要があります（従来のレポーターベクター等と同様）。 ラベルライセンスの内容を承認、登録していただく必要があります（1 分で終了する配列利用に関する簡単な登録です）。 ● HiBiT ベクター購入 ● 制限酵素による消化 ● ライゲーション ● プライマー設計 & 注文 ● 消化 & ライゲーション ● CRISPR / Cas9 法 HiBiT Flexi® Vector HiBiT MCS Vector 標的遺伝子発現 クローン ゲノム ● ORF クローン購入 ● HiBiT ベクター購入 ● サブクローニング受託 コスト 容易性 作業時間 内在 レベル 発現 ○ ◎ ー ◎ ◎ ◎ ー ○ ー ○ ○ ○ Flexi® ORF Clone （約 20,000ヒト遺伝子） 標的遺伝子 HiBiT配列付加 （PCRベース or 合成遺伝子） HiBiT配列付加 （ゲノム編集技術） CRISPR / Cas9 ゲノム編集による HiBiT ノックインプロトコル http://www.promega.co.jp/hibitcrispr/ 各発現コンストラクトによる 応答性の違い HeLa 細胞に CMV または PGK プロ モーターを含む HIF1A-HiBiT 発 現 コンストラクトを一過的にトランス フェクションまたは CRISPR/Cas9 に より内在ローカスに HiBiT を導入し、 1,10-フェナントロリンによる応答性 を調べた。 14287MA 1 10 100 Normalized Luminescence (RLU) 50ng CMV/HIF1A-HiBiT 5ng CMV/HIF1A-HiBiT 0.5ng CMV/HIF1A-HiBiT 0.05ng CMV/HIF1A-HiBiT 5ng PGK/HIF1A-HiBiT Endogenous HIF1A-HiBiT clone Log10[1,10-phenanthroline], M 0 –7 –6 –5 付録 より詳細な HiBiTクイックスタートガイドについては www.promega.co.jp/hibitquick/ をご覧ください。 付録 HiBiT 配列導入ガイド タグ配列の合成については www.promega.co.jp/nanobitsynthesis/ でご登録ください。 テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982　● E-Mail : prometec@jp.promega.com PK1709-03B 販売店 日本語 Web site：www.promega.jp プロメガ株式会社 本　　　社　〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所　〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2017年9月現在のものであり予告なしに変更することがあります。