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HiBiT 実験 クイックスタートガイド

HiBiT 実験 クイックスタートガイド プロメガ株式会社 ステップ プラスミド精製 細胞に導入 発光測定 選択肢 • トランスフェクション グレード / エンド トキシンフリー • リポフェクション / エレクトロポレーション/ ウィルスベクター • 生細胞 /セルライセート/ ブロッティングメン ブレンに HiBiT Reagent を添加 • ルミノメーターで発光 測定（ブロッテッングは イメージャーで検出） サポート 対象製品 • PureYield™ Plasmid Mini （カタログ番号：A1223） Midi （カタログ番号：A2492） Maxi kits （カタログ番号：A2392） • ViaFect™ （カタログ番号：E4981, E4982） • FuGENE® HD （カタログ番号：E2311, E2312） 【試薬】 • Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System （カタログ番号：N3030） • Nano-Glo® HiBiT Blotting System （カタログ番号：N2410） • Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System （カタログ番号：N2420） 【検出機器】 • GloMax® プレート リーダー HiBiT 実験のワークフロー 以降の HiBiT 配列導入ガイド参照 ステップ 実験系選択 導入方法の選定 配列選定 配列作成 選択肢 【実験目的】 HiBiT タグタンパクを • 生細胞で検出 • 細胞ライセートから検出 • ブロッティングメンブ レン上で検出 【発現様式】 • 一過性発現 / 安定発現 • プロメガの HiBiT ベク ターに目的遺伝子を 入れる • 手持ちの目的遺伝子 発現ベクターに HiBiT を入れる • ゲノム編集用配列作製 • N 末端 /C 末端 • リンカー長 【作製】 • 自作 / 受託 / 核酸人工 合成 サポート 対象製品 • HiBiT Flexi® Vector（型番： N2391, N2401, N2411） • HiBiT MCS Vector（型番： N2361, N2371, N2381） • Flexi ORF クローン • 各種制限酵素 • Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System（型番： A9281） • LigaFast™ Rapid DNA Ligation System（型番： M8221） 自作 1 ～ 2 週間 受託 2 ～ 3 日 2 ～ 3 日 ベクター代金＋1 万円～ クローニング受託サービス 約 1ヶ月　10 万円～ 核酸人工合成受託 約 1 週間　数千円～ ゲノム編集用 核酸合成受託 約 1ヶ月　10 万円～ 2 1 HiBiT 発現ベクターへの標的遺伝子の組込み 2 保有する標的遺伝子発現クローンへの HiBiT の組込み 3 ゲノム編集による内在遺伝子への HiBiT の組込み a）Flexi® クローニング b）MCS クローニング ORF ORF HiBiT HiBiT HiBiT Flexi® Vector 標的遺伝子 発現クローン ゲノム HiBiT MCS Vector ● ORF クローン購入 ● HiBiT ベクター購入 ● Flexi® クローニング ● サブクローニング受託※ ● 配列の人工合成 / PCR ● アニーリング, 制限酵素 処理、ライゲーション ● 配列の人工合成 ● CRISPR / Cas9 法 ● HiBiT ベクター購入 ● PCR, 制限酵素処理、ライ ゲーション カタログ番号：N2391, N2401, N2411 カタログ番号：N2361, N2371,N2381 コスト ◯ ベクター代金 ＋ ORF クローン代金 約 6 万円～（またはクローニング費用 約 1 万円～［自作の場合］） 容易性 作業時間 ◎ 1 ～ 2 週間 コスト 核酸合成 約 1 万円～ ＋ クローニング 約 1 万円～ 容易性 ◯ 作業時間 約 1 週間 コスト ◯ 核酸人工合成費用　約 10 万円～ 容易性 ◯ 作業時間 ◯ 受託約 1 か月 コスト ◎ ベクター代金 ＋ クローニング費用 約 1 万円～ 容易性 ◎ 作業時間 ◎ 1 ～ 2 週間 HiBiT配列 HiBiT配列 標的遺伝子（自作の場合） or 約 20,000 ヒト遺伝子 Flexi® ORF Clone 標的遺伝子（自作の場合） クローニングビギナー向け クローニングに慣れている方向け ゲノム編集（内在レベルの発現を希望する方） ※オプション HiBiT 配列導入概要 ライセンスについて： ラベルライセンスの内容を承認いただく必要があります（従来のレポーターベクター等と同様）。 ラベルライセンスの内容を承認、登録していただく必要があります（1 分で終了する配列利用に関する簡単な登録です）。 タグ配列の合成については www.promega.co.jp/nanobitsynthesis/ でご登録ください。 3 1 プロメガ HiBiT 発現ベクターへの標的遺伝子の組込み （A）Flexi® クローニング（Flexi® ORF クローンを利用する場合） ① 目的遺伝子の選択 ② HiBiT Flexi® Vector（カタログ番号：N2391, N2401, N2411）および Flexi® ORF Clone を購入 ③ Flexi® Cloning System（カタログ番号：C8640, C9320, C8820）で Flexi クローニング （N 末端 and/or C 末端付加）※ ④ HiBiT 付加遺伝子発現クローン完成 ORF HiBiT Flexi® Vector ● ORF クローン購入 ● HiBiT ベクター購入 ● Flexi® クローニング ● サブクローニング受託※ カタログ番号：N2391, N2401, N2411 約 20,000 ヒト遺伝子 Flexi® ORF Clone ※オプション ラベルライセンスの内容を承認いただく必要があります（従来のレポーターベクター等と同様）。 手 順 ※リンカーは下図の配列が付加される。 POI: protein of interest ベクター名 融合タンパク質 pFC37K HiBiT CMV-neo Flexi® Vector POI-VSQGSSGGSSG-HiBiT pFN38K HiBiT CMV-neo Flexi® Vector HiBiT-GSSGGSSGAIA-POI pFN39K secHiBiT CMV-neo Flexi® Vector IL6-HiBiT-GSSGGSSGAIA-POI HiBiT Flexi® Vector のリンカー配列 HiBiT 配列導入ガイド （B） MCS クローニング（ご自身で準備された遺伝子をマルチクローニングサイト［MCS］より 挿入される場合） ORF HiBiT MCS Vector ● HiBiT ベクター購入 ● PCR, 制限酵素処理、 ライゲーション カタログ番号：N2361, N2371,N2381 標的遺伝子 ラベルライセンスの内容を承認いただく必要があります（従来のレポーターベクター等と同様）。 ① 目的遺伝子の選択 ② ご自身の遺伝子クローンや cDNA を準備 ③ PCR and/or 制限酵素処理により目的遺伝子 ORF を単離※ ④ Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System（カタログ番号：A9281）で精製 ⑤ HiBiT MCS Vector（カタログ番号：N2361, N2371, N2381）と ORF を LigaFast™ Rapid DNA Ligation System（カタログ番号：M8221, M8225）ライゲーション、クローニング ⑥ HiBiT 付加遺伝子発現クローン完成 手 順 ※右図の制限酵素サイト、下図のリンカー配列を参照。 4 HiBiT 配列導入ガイド ベクター名 融合タンパク質 MCS 制限酵素サイト pBiT3.1-N [CMV/HiBiT/Blast] Vector HiBiT-GSSG-POI SacI HiBiT-GSSGGSSG-POI XhoI HiBiT-GSSGGSSGGNS-POI EcoRI HiBiT-GSSGGSSGGNSGGGS-POI BamHI pBiT3.1-C [CMV/HiBiT/Blast] Vector POI-GSSG-HiBiT SacI POI-GSSGGSSG-HiBiT XhoI POI-GNSGSSGGSSG-HiBiT EcoRI POI-GSGGNSGSSGGSSG-HiBiT BamHI pBiT3.1-secN [CMV/HiBiT/Blast] Vector IL6-HiBiT-GSSG-POI SacI IL6-HiBiT-GSSGGSSG-POI XhoI IL6-HiBiT-GSSGGSSGGNS-POI EcoRI IL6-HiBiT-GSSGGSSGGNSGGGS-POI BamHI pBiT3.1 Vector の SacI, XhoI, EcoRI, BamHI サイトでのリンカー配列 pBiT3.1 Vector の MCS で利用できる制限酵素サイト 14289MA pBiT3.1-N [CMV/HiBiT/Blast] Vector pBiT3.1-C [CMV/HiBiT/Blast] Vector pBiT3.1-secN [CMV/HiBiT/Blast] Vector 5´…GCCATGGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCGGGAGCTCCGGTGGCTCGAGCGGTGGGAATTCTGGT GGAGGATCCGGTGGAGCTAGCGGAAGATCTGGTTCTAGAGGTCAAGCTTCGGGGGTTTAAACCTGCAGGCAT…3´ EcoRI EcoRI HiBiT HiBiT HiBiT XhoI XhoI SacI SacI XhoI EcoRI NheI NheI BamHI BamHI BglII XbaI BglII PmeI PmeI SbfI HindIII HindIII SacI BamHI NheI BglII XbaI PmeI SbfI HindIII 5´…GGGGCGATCGCAACAAGCTTCGGGAAGATCTGGAGCTAGCGGCGGGGGATCCGGTGGGAATTCTGGCTCGAGCGG TGGGAGCTCCGGTGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCTAAGTTTAAACGGCC…3´ SgfI 5´…GCCATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGGCCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTGCC TTCCCTGCCCCAGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCGGGAGCTCCGGTGGCTCGAGCGGTGGGAATTCTGG TGGAGGATCCGGTGGAGCTAGCGGAAGATCTGGTTCTAGAGGTCAAGCTTCGGGGGTTTAAACCTGCAGGCAT…3´ IL-6 signal sequence IL-6 signal sequence POI: protein of interest 5 （A） HiBiT 挿入予定位置に制限酵素切断配列がある場合 〈oligo のデザイン例〉 ① ライセンス承認登録 www.promega.co.jp/nanobitsynthesis/ ② 手持ちの目的遺伝子発現ベクターへの HiBiT の挿入位置を決定 ③ インサート作製用 oligo のデザインおよび発注 手 順 ※ Linker は考慮していない。 HiBiT 配列導入ガイド 2 保有する標的遺伝子発現クローンへの HiBiT の組込み HiBiT 制限酵素配列 HiBiT 配列 制限酵素配列 ラベルライセンスの内容を承認、登録していただく必要があります（1 分で終了する配列利用に関する簡単な登録です）。 標的遺伝子 発現クローン HiBiT配列 ● 配列の人工合成 / PCR ● アニーリング, 制限酵素 処理、ライゲーション ④ oligo をアニーリング、または PCR 増幅する ⑤ ベクターおよびインサートを制限酵素処理し、Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System（カタログ 番号：A9281）で精製 ⑥ LigaFast™ Rapid DNA Ligation System（カタログ番号：M8221, M8225）でベクターに HiBiT の配列を 組み込む ⑦ 組み替えたベクターを大腸菌にトランスフォーメーション ⑧ HiBiT 付加遺伝子発現クローン完成 Forward ：NNNNNXXXXXXNNNNNNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXNNNNNNXXXXXXNNNNN Reverse ：NNNNNXXXXXXNNNNNNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXNNNNNNXXXXXXNNNNN 6 HiBiT 配列導入ガイド （B）HiBiT 挿入予定位置に制限酵素切断配列がない場合 In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社）を使用する例 ① ライセンス承認登録 www.promega.co.jp/nanobitsynthesis/ ② 手持ちの目的遺伝子発現ベクターへの HiBiT の挿入位置を決定 ③ インサート作製用 oligo のデザインおよび発注※ 手 順 ※ PCR で増幅の場合はプライマー発注。 タカラバイオ社 HP より ④ oligo をアニーリング、または PCR 増幅する ⑤ ds-oligo として、Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System（カタログ番号：A9281）で精製 ⑥ In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社）でベクターに HiBiT の配列を組み込む ⑦ 組み替えたベクターを大腸菌にトランスフォーメーション ※ N はベクターと相同な 15 塩基。Linker は考慮していない。 HiBiT 配列 Forward ：NNNNNNNNNNNNNNNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXNNNNNNNNNNNNNNN Reverse ：NNNNNNNNNNNNNNNXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXNNNNNNNNNNNNNNN 〈例〉 7 HiBiT 配列導入ガイド 3 ゲノム編集による内在遺伝子への HiBiT の組込み CRISPR/Cas9 ゲノム編集による HiBiTノックインプロトコールを参照ください。www.promega.co.jp/hibitcrispr/ ■ CRISPR/Cas RNA セット crRNA と tracrRNA のセット 価格：30,000 円 納期：1 週間 ～ ■ sgRNA 3 種：70,000 円 納期：1 週間 ～ ■ Cas9 タンパク質 価格：100 µg / 22,000 円 ■ Donor DNA 塩基数：201 ～ 500 nt 価格：50,000 円 納期：20 営業日 ゲノム HiBiT配列 ● 配列の人工合成 ● CRISPR / Cas9 法 ① ライセンス確認登録 ② ゲノム上のターゲット配列確認 ③ crRNA のデザインおよびガイド RNA（crRNA ＋ tracrRNA） のデザインおよび発注 手 順 ④ HiBiT Donor DNA template のデザインおよび発注 ●ゲノム編集用の試薬・核酸等 約 10 万円～ ※以下は（他社）参考例です。 HiBiT Find regions of identity for donor DNA. Use 50–80 nucleotides upstream and downstream of insert site. Position the HiBiT sequence symmetrically between homology arms. This facilitates the CRISPR homologous recombination. Order donor DNA template. Request a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN). For example, IDT Ultramer DNA Oligonucleotide. Access to HiBiT Sequences 3. Design and order HiBiT donor DNA template 5′ Exon Exon Exon 3′ UTR 3′ Single-Stranded Oligodeoxynucleotide ~80nt Homology Arm HiBiT Stop Codon Homology Arm 5′ 33nt HiBiT Sequence TGA ~80nt 3′ Introduce a silent mutation in the PAM sequence of the donor DNA template to avoid recutting. Prepare ribonucleoprotein (RNP) complex. Anneal the crRNA to tracrRNA (IDT) to form guide RNA. Incubate purified Cas9 with guide RNA to form RNP complex. Deliver RNP and donor DNA to cell by electroporation. We have successfully electroporated commonly used cell lines (e.g., HeLa, U2OS, HepG2, HEK 293) suspended in Nucleofector Reagent using the cell line-specific program on the 4D-Nucleofector. 4. Deliver guide RNA, donor DNA and Cas9 • We typically use 1ul of 100uM donor DNA template with 10ul RNP for 20ul of cell suspension. COMPONENT 100µM tracrRNA 100µM crRNA Nuclease-Free Duplex Buffer Total a. Combine the following in a PCR tube: b. Heat at 95°C for 5 minutes and cool to room temp on bench top. 1. Prepare 24µM tracrRNA:crRNA duplex. VOLUME 12µl 12µl 26µl 50µl COMPONENT 20µM Cas9 24µM trRNA:crRNA Total a. Combine 100pmol Cas9 and 120pmol tracrRNA:crRNA: Note: To avoid precipitation, add the Cas9 very slowly to the tracrRNA:crRNA and swirl with pipette tip b. Allow RNP to form for 10–20 minutes at room temperature. 2. Prepare RNP complexes (sufficient for 200,000 cells) VOLUME 5µl 5µl 10µl 3. Design and order HiBiT Donor DNA template 4. Deliver guide RNA, donor DNA and Cas9 Find regions of identity for donor DNA. Use 50–80 nucleotides upstream and downstream of insert site. Position the HiBiT sequence symmetrically between homology arms. This facilitates the CRISPR homologuous recombination. Prepare ribonucleoprotein (RNP) complex. complex. 1. Prepare 24µM tracrRNA:crRNA duplex. a. Combine the following in a PCR tube: b. Heat at 95℃ for 5 minutes and cool to room temperature on bench top. COMPONENT 100µM tracrRNA 100µM crRNA Nuclease-Free Duplex Buffer Total VOLUME 12µl 12µl 26µl 50µl COMPONENT 20µM Cas9 24µM trRNA:crRNA Total VOLUME 5µl 5µl 10µl 2. 200,000 cells). a. Combine 100pmol Cas9 and 120pmol tracrRNA:crRNA: Order donor DNA template. Request a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN). For example, IDT Ultramer DNA Oligonucleotide. Obtain synthesis rights and access HiBiT sequence: www.promega.com/HiBiT-synthesis Introduce a silent mutation in the PAM sequence of the donor DNA template to avoid recutting. 2 Note: To avoid precipitation, add the Cas9 very slowly to the tracrRNA:crRNA and swirl with pipette tip. b. Allow RNP to form for 10–20 minutes at room temperature. Adding HiBiT Tag to an Endogenous Gene Using CRISPR Protocol PROTOCOL: Adding HiBiT Tag to an Endogenous Gene Using CRISPR 1. Identify target and find genomic sequence Ensure you have the complete genomic sequence that includes the coding region for the 5´ and 3´ UTR. In NCBI these RefSeq numbers start with NG or NC. • We recommend choosing guides based on PAM sites within 30nt of the start or stop codon. • Order the crRNA without including the PAM sequence. • Remember, Cas9 will cut 3nt upstream of the PAM sequence. Download full genomic sequence. NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene Ensembl: http://useast.ensembl.org Find region for HiBiT insertion. Create C-terminal fusions before stop codon Generate N-terminal fusions after start codon PROTOCOL: Adding HiBiT Tag to an Endogenous Gene Using CRISPR Page 1 of 3 2. Design crRNA and order guide RNA (crRNA + tracrRNA) Select a region to search for guide RNA. Start with 40 nucleotides upstream (for N-terminal fusions) and downstream (for C-terminal fusions) of insert site. Use an online program to identify guide RNA. We suggest using one of the following sites: http://chopchop.cbu.uib.no/ http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design/ Order 3–5 different guide RNAs. We recommend Protospacer Adjacent Motif (PAM) sites downstream of stop codon for C-terminal fusions and upstream of start codon for N-terminal fusions. Order a duplex guide (crRNA and tracrRNA). For example, the IDT Alt-R CRISPR-Cas9 system. Stop Codon PAM crRNA GAPDH ATGGCTAGGTACCGTCATCCGCAATGGCTAGGTAAGTCCGCTATGGATAGGTACC 2. Design crRNA and order guide RNA (crRNA + tracrRNA) Select a region to search for guide RNA. Start with 40 nucleotides upstream (for N-terminal fusions) and downstream (for C-terminal fusions) of insert site. Use an online program to identify guide RNA. We suggest using one of the following sites: http://chopchop.cbu.uib.no/ http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysistools/sgrna-design/ Order 3–5 different guide RNAs. We recommend Protospacer Adjacent Motif (PAM) sites downstream of stop codon for C-terminal fusions and upstream of start codon for N-terminal fusions. Order a duplex guide (crRNA and tracrRNA). For example, the IDT Alt-R CRISPR-Cas9 system. We recommend choosing guides based on PAM sites within 30nt of the start or stop codon. Order the crRNA without including the PAM sequence. Remember, Cas9 will cut 3nt upstream of the PAM sequence. 1. Identify target and find genomic sequence Ensure you have the complete genomic sequence that includes the coding region for the 5´ and 3´ UTR. In NCBI these RefSeq numbers start with NG or NC. • We recommend choosing guides based on PAM sites within 30nt of the start or stop codon. • Order the crRNA without including the PAM sequence. • Remember, Cas9 will cut 3nt upstream of the PAM sequence. Download full genomic sequence. NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene Ensembl: http://useast.ensembl.org Find region for HiBiT insertion. Create C-terminal fusions before stop codon Generate N-terminal fusions after start codon PROTOCOL: Adding HiBiT Tag to an Endogenous Gene Using CRISPR Page 1 of 3 2. Design crRNA and order guide RNA (crRNA + tracrRNA) Select a region to search for guide RNA. Start with 40 nucleotides upstream (for N-terminal fusions) and downstream (for C-terminal fusions) of insert site. Use an online program to identify guide RNA. We suggest using one of the following sites: http://chopchop.cbu.uib.no/ http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design/ Order 3–5 different guide RNAs. We recommend Protospacer Adjacent Motif (PAM) sites downstream of stop codon for C-terminal fusions and upstream of start codon for N-terminal fusions. Order a duplex guide (crRNA and tracrRNA). For example, the IDT Alt-R CRISPR-Cas9 system. Stop Codon PAM crRNA GAPDH ATGGCTAGGTACCGTCATCCGCAATGGCTAGGTAAGTCCGCTATGGATAGGTACC 1. Identify target and find genomic sequence Ensure you have the complete genomic sequence that includes the coding region for the 5´ and 3´ UTR. In NCBI these RefSeq numbers start with NG or NC. • We recommend choosing guides based on PAM sites within 30nt of the start or stop codon. • Order the crRNA without including the PAM sequence. • Remember, Cas9 will cut 3nt upstream of the PAM sequence. Download full genomic sequence. NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene Ensembl: http://useast.ensembl.org Find region for HiBiT insertion. Create C-terminal fusions before stop codon Generate N-terminal fusions after start codon PROTOCOL: Adding HiBiT Tag to an Endogenous Gene Using CRISPR Page 1 of 3 2. Design crRNA and order guide RNA (crRNA + tracrRNA) Select a region to search for guide RNA. Start with 40 nucleotides upstream (for N-terminal fusions) and downstream (for C-terminal fusions) of insert site. Use an online program to identify guide RNA. We suggest using one of the following sites: http://chopchop.cbu.uib.no/ http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design/ Order 3–5 different guide RNAs. We recommend Protospacer Adjacent Motif (PAM) sites downstream of stop codon for C-terminal fusions and upstream of start codon for N-terminal fusions. Order a duplex guide (crRNA and tracrRNA). For example, the IDT Alt-R CRISPR-Cas9 system. Stop Codon PAM crRNA GAPDH ATGGCTAGGTACCGTCATCCGCAATGGCTAGGTAAGTCCGCTATGGATAGGTACC 1. Identify target and find genomic sequence Download full genomic sequence. NCBI: https://ncbi.nlm.nih.gov/gene Ensembl: http://useast.ensembl.org Find region for HiBiT insertion. Create C-terminal fusions before stop codon Generate N-terminal fusions after start codon Ensure you have the complete genomic sequence that includes 5’ and 3’ UTR. In NCBI these RefSeq numbers start with NG or NC. Adding HiBiT Tag to an Endogenous Gene Using CRISPR Protocol 1 テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982　● E-Mail : prometec@jp.promega.com 販売店 日本語 Web site：www.promega.jp プロメガ株式会社 本　　　社　〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所　〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2017年9月現在のものであり予告なしに変更することがあります。