ImProm-IITM Reverse Transcriptase

Revised 4/03 Part #Impro-IIJ 技術的なお問合せは: e-mail: prometec@jp.promega.com • Tel: 03-3669-7980 • Fax: 03-3669-7982 簡易プロトコル A. RNAとプライマーの結合 1. 使用するRNAを氷上で解凍し、必要量を分注する（未使用分は速やか に冷凍庫に戻す）。 2. RNA(1μgまで)とcDNA primerをそれぞれ5μlのNuclease-Free Water(氷上) に加える。 3 チューブの蓋をきつく閉め、70℃、5分間加熱後、氷水中に5分間急冷 する。 4. 約10秒間遠心し、壁面などについた溶液を落とす。 （注）Reverse Transcription Mix (以下RT mix) を加えるまではチ ューブは閉めておくようにする。 B. 逆転写反応 20μlの反応系の場合（スケールアップ可能）。 1. 氷上で、以下に示すようにRT mixを調製する。 Nuclease-free water (最終的に15μlになるように加える) X μｌ ImPromII 5X Reaction Buffer 4.0 μｌ 25mM MgCl2 1.2-6.4 μｌ dNTP Mix （終濃度　0.5mM） 1.0 μｌ rRNasin Ribonuclease Inhibitor 20 unit ImProm-II Reverse Transcriptase 1.0 μｌ Final Volume 15 μｌ　 2. 穏やかに攪拌し、氷上へ置く。 3. ステップAで調製したRNAとプライマー結合物から5μlを氷上に用意し てあるRT mixに加える。 4. 必要に応じてMineral oilを反応液の液面上に加える。 5. 25℃、5分間 インキュベートする。 6. 42℃、60分間で第1鎖cDNAの合成を行う（温度は37-55℃の間で 調整可能）。 7. 70℃、15分間でReverse Transcriptaseを不活性化させる。 C. （参考）PCRによるDNA増幅 （弊社のTaq DNA Polymeraseをご使用の場合、詳細はプロトコル TM236, page 8-10をご覧下さい。） 1. PCRの反応に必要な試薬を滅菌した1.5mlチューブに加えてよく混合 し、氷上に保存する（以下 PCR Mixとする）。 2. 逆転写反応物（ｃDNA）をPCR Mixの入った氷上のチューブに加える。 （Nuclease-Free Waterで最終的に100 μｌになるように調整） 3. 溶液の蒸発による濃度変化を防ぐため、必要に応じてNuclease-Free のmineral oilを溶液上に加える。 4. あらかじめ94℃に設定したサーマルサイクラーへセットし、ＰＣＲ反 応を行う。（増幅反応前に94℃、2分の処理を行うHot Start法を推奨 しています。） 5. PCR反応後、サンプルを直ちに解析に用いない場合は、-20℃で保存し て下さい。 Additional protocol information is available in Technical Manual #TM236, available upon request from Promega or online at www.promega.com ImProm-IITM Reverse Transcriptase INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS A3801, A3802 AND A3803. Quick PROTOCOL 氷上でRT mixを調製� 逆転写反応� 氷上でPCR mixを調製� Hot StartによるPCR反応� RNAとprimerの結合� CAUTION !� 作業は氷上で行ってください。�