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Lumit Guide

・ 低バックグラウンド＆広いダイナミックレンジ （サンプルの希釈不要） ・ 高価な専用測定装置は不要 （発光測定プレートリーダーで測定） ・ 標的タンパク質の定量から タンパク質間相互作用解析に ・ 様々なサンプル種、 96 ～ 384 ウェルフォーマットに対応 Lumit™ の 簡便性を是非 ご体感ください！ RentaMAX で 発光プレートリーダー 無償レンタル可能！ ※プロメガクラブへの 入会が必要　 Lumit™ イムノアッセイ 　 powered by NanoLuc technology 洗いのいらない ホモジニアス な発光免疫測定法 プロメガ株式会社 1 Lumit™ テクノロジー Lumit™ イムノアッセイの特長 Analyte Epitope 1 Epitope 2 LgBiT SmBiT NanoBiT® luciferase Lumit antibodies TM 高輝度NanoLuc® 酵素断片を利用した発光免疫検出技術 標的タンパク質の検出と定量は、特異性の高い抗体を利用したウェスタンブロッティングやELISA などのイムノアッセイが利用されま すが、洗浄操作やブロッキングなど煩雑な操作が求められます。Lumit™ テクノロジーは、マルチウェルプレートフォーマットで試薬を 加えるだけのホモジニアスイムノアッセイを実現できるので、操作がシンプルで自動化やハイスループットスクリーニングにも容易に適 応します。蛍光を利用したFRET 様のイムノアッセイに比べてもより簡便、広いダイナミックレンジ、低コストでの実施が可能で、基 礎研究から創薬研究を行う研究者にとって強力なツールとなります。 Lumit™ イムノアッセイの検出原理 Lumit™ の基本原理は 高輝度の NanoLuc® をスプリット した大小のフラグメントの再会合による発光活性化を 利用しています。Lumit™ イムノアッセイでは、これら の断片（ SmBiTとLgBiT）でそれぞれ標識した2つの 抗体を用います。標識抗体が被検体に直接または間 接的に結合することで、 SmBiT とLgBiT 断片が空間的 に近接し、NanoBiT® ルシフェラーゼとして再構成され ると、基質であるフリマジンの存在下で、非常に明る い発光が検出されます。この発光は、サンプル中に 存在する分析対象物の量に直接比例します。 特長 • 真のホモジニアスアッセイ：洗浄工程、ブロッキング、抗体の固定化が不要で、培地の除去も不要な“ 添加だけ”のステップ • ハイスピード：ステップ数が最小限で細胞培養プレートでの測定も可能 • 多検体処理：自動化にも容易に適応し、384 ウェルフォーマットにも対応 • 高品質データ：発光法の特性により高感度・広いダイナミックレンジを実現（サンプルの希釈不要） • プレートリーダーで測定：シンプルな発光測定機能でOK（高価な専用検出装置は不要） 対応フォーマット • 細胞培養サンプル（培養上清、細胞ライセ―ト） • 生化学アプリケーション • 血清・血漿（右ページ参照） アプリケーション • 生体試料中のタンパク質の定量化 • タンパク質と低分子化合物の競合結合研究 • タンパク質や低分子薬物スクリーニング • シグナル伝達経路の活性化測定 • タンパク質相互作用の解析 • ハイスループットスクリーニング（HTS） 分析対象物 LumitTM +検出試薬 検出 LumitTM 一次抗体または 二次抗体 + Lumit™ のワークフロー 希釈の不要な広いダイナミックレンジ Lumit™ イムノアッセイはダイナミックレンジが広いため、細胞モデルで放出されるサイトカインを検 出する場合の多くはレンジ内に収まるため、サンプルの希釈が不要。上記の実験では96 ウェルフォー マットでヒトPBMC （100,000 cells/well） よりサイトカインを放出させるために細胞刺激カクテルで処 理した。3 つのタイムポイントで細胞を含むウェルにLumit™ TNF- α reagent を直接添加した。 TNF- α 濃度は標準曲線より算出した。応答レベルは60 ～ 15,000pg/ml であり、サンプルの希釈を 必要としなかった。左グラフはLumit™ TNF- α（ Human）で作成した標準曲線 Lumit™ アニメーション 2 Luminescence [RLU] Untreated 70 % Maximal Stimulation Maximal Stimulation 0 20 40 1 x 105 2 x 105 3 x 105 4 x 105 5 x 105 6 x 105 0 60 80 100 Replicate Number IL-2 Z‘ = 0.8 Z‘ = 0.7 2 0 2500 5000 10000 20000 40000 80000 – 4 6 8 10 12 14 16 Fold change(Treated / non-treated) Phosphorylated STAT3 (Tyr705) Lumit™(Cellular System) 他社システム A 他社システム H Seeded cell number シンプル＆スピーディー：真のホモジニアスアッセイはLumit™ だけ 抗体の特異性を利用した測定法や検査法は現在でも広く利用されている基盤技術ですが、B/F 分離を必要 とするため操作が煩雑で、労力、時間がかかり、バラつきも大きくります。また、洗浄操作やステップ数の 多さにより自動化も容易ではありません。プロメガのLumit™ 法は培地の除去、洗浄操作が不要で、試薬 を追加するだけのシンプルステップ（ホモジニアスアッセイ）が特長であり、ELISA やウェスタンにくらべ 大幅に処理量を増やすことができます。さらにFRET 様のアッセイは、培地の除去ステップや長い待ち時 間が必要であると同時に、複雑な光学系を利用しているため、検出装置も高額で、アッセイ系の構築も容 易ではありません。Lumit™ 法は高輝度発光酵素断片の再会合を利用したシンプルなテクノロジーである ため、標準的な発光測定プレートリーダーで測定でき、標識やアッセイ構築も比較的容易です。 HTS 適合性の検証 ヒトPBMC を10000cells/well で384-well プレートに播種し、細胞刺激カクテ ルで24 時間処理した。24 時間、最大刺激量または70% 最大刺激量で処理 した。各条件において、試薬添加時の発光を94 レプリケートで測定した。 IL-2 放出について算出されたZ’ファクターは0.5を大幅に上回り、スクリーニン グへの応用が可能であることが示された。 他社ホモジニアス法との比較 細胞内のリン酸化STAT3 検出における各ホモジニアスイムノアッセイの検出 パフォーマンスを比較した。Lumit™ 法はA 法よりと同等以上のS/B 比を示し、 H 法よりも高い感度を示した。Lumit™ は培地の除去を伴わない完全なホモ ジニアスアッセイを実現でき、他のアッセイと同等以上のパフォーマンスを 示した。 Lumit™ アッセイは血清サンプルに適合しますか？ 特定のアッセイと血清サンプル中の分析対象物の予想濃度により異なります。血漿や血清には、測定に支障をきたし、シグナルを減少させる成分が含ま れています。これは、サンプルを希釈して干渉を軽減することにより、場合によっては緩和することができます。 Lumit™ SARS-CoV-2 RBD:hACE2 アッセイなど一部製品は血清サンプル用に設計されており、血清と互換性があります。血清のマトリックス効果を緩和する ために必要な希釈倍率は、分析対象物のレベルにより異なります。一方、サイトカイン、インスリンおよびグルカゴンアッセイなどほとんどのアッセイは、 細胞培養サンプル用に設計されています。これらの場合、健康なヒト血清中の分析物レベルは、血清のマトリックス効果を軽減するために必要な希釈倍 率で測定するには低すぎる可能性があるため、血清検体での測定には推奨されません。尚、ルーチンの細胞培養試料に使用される10％ FBS は Lumit™ 測定に干渉しません。 暗所で作業 & 測定まで 4 時間から 一昼夜静置 細胞の処理 培地の除去 細胞溶解剤添加 ドナー& アクセプター 検出試薬添加 シグナルの検出 Lumit™ FRET 様 ホモジニアスアッセイ ELISA サンプル調製 ブロッキング 洗浄（X3） サンプル添加 洗浄（X3） 1 次抗体添加 洗浄（X3） 2 次抗体添加 洗浄（X3） 検出試薬添加 シグナルの検出 3 － 5 時間 4 － 12 時間 細胞の処理 細胞溶解剤添加 Lumit™ 抗体添加 インキュベーション 検出試薬添加 シグナルの検出 0.5 － 2 時間 測定原理 3 多彩な検出フォーマット タンパク質定量 分析対象物 エピトープ1 エピトープ2 LgBiT標識二次抗体SmBiT標識二次抗体 分析対象物 エピトープ1 一次抗体（動物種A） 一次抗体（動物種B） エピトープ2 Tag 分析対象物分析対象物 AviTag™ ストレプトアビジン ビオチン IκBα IκBα IκBα P IκBα P C A C A B A B A Lumit™ テクノロジーは分析対象物を定量するための様々な測定フォーマットをサポートしています。 プロメガでは特定のサイトカインやその他の標的タンパク質を定量するために、SmBiT、LgBiT で標識した一次抗体および検出試薬 を含むターゲットキットをはじめ、抗体のラベリング試薬や ご自身でご用意された一次抗体を検出するための標識二次抗体なども用意 しています。 標的タンパク質の定量 リン酸化タンパク質（修飾タンパク質）定量 直接アッセイ １つの分析対象に対して異なるエピトープを認識する SmBiT またはLgBiT で 標識された２つの一次抗体を使用。 • 各種ターゲットキット（5 ページ） • 抗体標識キット（10 ページ） 標的タンパク質の非リン酸化部位に対する抗体2 種（A, B） とリン酸化部位に対する抗体（C）を組み合わせることで、 標的タンパク質の定量だけでなく、リン酸化状態も調べる ことができます。Lumit™ Immunoassay Cellular System を 用いればウェルあたりの細胞生存性を簡便な蛍光アッセイ 法で測定し、Lumit™ データーを補正することにより正確な 結果を得ることができます。 • Lumit™ Immunoassay Cellular System （一次抗体は不含） （7 ページ） タグ付加タンパク質のアッセイ 各種タグを付加した分析対象の検出にSmBiT またはLgBiT で標識された一次 抗体および抗タグ抗体（別売の標識抗体を利用可能）を使用。 • Anti-Tag （11 ページ） • 抗体標識キット（10 ページ） 間接アッセイ １つの分析対象対して２つの異なるエピトープを認識する 一次抗体とSmBiT またはLgBiT で標識された２つの二次抗体を使用。本フォーマットは細胞ライ セ―トに含まれるリン酸化タンパク質など翻訳後修飾を受けたタンパク質の検 出に適しています。一次抗体があれば、抗体の標識作業は不要です（別売の 標識二次抗体を利用可能）。 • Lumit™ Immunoassay Cellular System（ 一次抗体は不含）（ 7ページ） • SmBiT またはLgBiT 標識二次抗体（13 ページ） ビオチン付加タンパク質アッセイ ビオチンを付加した分析対象の検出にLgBiT で標識された一次抗体および SmBiT 標識ストレプトアビジン（別売の標識抗体を利用可能）を使用。 • Anti-Tag（11 ページ） • 抗体標識キット（10 ページ） 4 相互作用検出 + LgBiT SmBiT 相互作用タンパク質ペア 競合分析 ぺプチド抗体 低分子 タンパク質 化合物 相互作用 タンパク質 + Biotin 標識抗体 トレーサー LgBiT FcR SA SA LgBiT SmBiT 分析対象物抗体 誘導剤 SmBiT + LgBiT 相互作用タンパク質ペア Tag 1 Tag 2 Anti-Tag 1- LgBiT Anti-Tag 2- LgBiT 0.5 – 1 h 0.5 – 1 h 5 min + Anti-tag 抗体 + LumitTM 検出試薬 タグ付加タンパク質 相互作用 タンパク質の相互作用についても Lumit™ テクノロジーで解析することができます。これらの結合イベント（タンパク質：タンパク質 あるいはタンパク質：化合物）の検出や特性化に適したフォーマットをお選びいただけます。 Lumit™ シグナル減衰相互作用アッセイ in vitro で競合する分析対象物の効力を判定するために使用されます。 この生化学的アッセイフォーマットでは、目的のタンパク質相互作用ペアに対 するSmBiT およびLgBiT 標識一次抗体を用いて、競合分析対象物（阻害剤） の効力を判定することができます。競合分析物を添加すると、発光シグナル は減少します。このようなアッセイ方式は以下の製品で利用されています。 • Lumit™ SARS-CoV-2 RBD:hACE2 Assay（9 ページ） Lumit™ FcR Binding Immunoassay の測定形式 は、競合的なシグナル減衰アッ セイのもう一つの例です。このアッセイフォーマットでは、ビオチン化 FcR に SmBiT 標識ストレプトアビジン（SA-SmBiT）およびLgBiT 標識抗体トレーサー を結合させます。これにより、分析対象抗体のFcR に対する親和性を競合的 に測定することができます。標識抗体トレーサーの競合的置換により、FcR に 対する抗体（分析対象抗体）の親和性を測定することができます。 • Lumit™ FcR Binding Immunoassay （8 ページ） Lumit™ シグナル増加相互作用アッセイ Lumit™ シグナル増加アッセイは、目的のタンパク質：タンパク質ペアの相互 作用誘導剤の効力解析に使用されます。このフォーマットでは、SmBiT また はLgBiT で標識した一次抗体を誘導剤と同時に使用します。2 つのタンパク 質が相互作用することで発光シグナルが相対的に増加します。 • 抗体標識キット（10 ページ） タグ付加タンパク質間相互作用アッセイ 2 種類の異なる親和性タグを付加した目的タンパク 質ペアがあれば、別売のAnti-Tag 抗体を利用するこ とで簡単に Lumit™ タンパク質：タンパク質相互作用 アッセイを構築することができます。 • Anti-Tag （11 ページ） 相互作用阻害の検出（シグナルの減衰） 相互作用阻害の検出（シグナルの増加） タグ付加タンパク質の相互作用検出 用途 5 標的タンパク質定量（直接アッセイ） Lumit™ ターゲット イムノアッセイは、標的タンパク質に対する一次抗体を含むオールインワンのアッセイキットで、現在 サイトカイン、 HMGB1 および糖代謝ホルモンに対するキットを用意しています。プレートベースのホモジニアスなイムノアッセイで、発光法の高感 度な特長と広いダイナミックレンジにより、多くの場合サンプルの希釈が不要です。Lumit™ アッセイは、試薬を添加するだけの簡便 なステップによりロースループットはもちろんハイスループットでの処理時に特に威力を発揮します。 本キットには、標的タンパク質に特異的な2 種類の一次抗体が含まれており、 LgBiT およびSmBiT でそれぞれ標識されています。 また、スタンダードおよび検出試薬も添付されます。 細胞培養上清中の標的タンパク質の検出では 細胞培養プレートでそのまま、または上清を別プレートに移して測定することもできます。 両抗体が結合すると、NanoBiT® 酵素が再構成され、検出試薬の添加により、標的タンパク質量に比例した明るい発光シグナルが得 られます。 標的タンパク質定量キット：サイトカイン・HMGB1 ・ホルモン サイトカイン / HMGB1 エピトープ1 エピトープ2 LgBiT SmBiT NanoBiT® ルシフェラーゼ LumitTM 抗体 アッセイフォーマット LumitTM LumitTM + 抗体検出試薬 検出 + 分析対象物 分析対象物 細胞 オプション1：細胞を含む培地 オプション2：培養上清（別プレートに移動） ※ Lumit™ Insulin Immunoassay などカスタム製品として提供することができます。詳細については以下のプロメガクラブの 裏メニューサイトを参照ください。/special/club/high-tech/ 分析対象ダイナミックレンジ検出下限 サイトカイン Human IL-1ß 22 – 40000 pg / ml 10 pg / ml Mouse IL-1ß 11 – 40000 pg / ml 8 pg / ml Human IL-2 14 – 25000 pg / ml 13 pg / ml Human IL-4 14 – 25000 pg / ml 13 pg / ml Human IL-6 6 – 25000 pg / ml 6 pg / ml Human IL-10 18 – 25000 pg / ml 18 pg / ml Human IFN- γ 2 – 10000 pg / ml 2 pg / ml Human TNF- α 6 – 25000 pg / ml 6 pg / ml ダメージ関連分子パターン（HMGB1） Human/Mouse HMGB1 7 – 729 pg / ml （Hu） 1 ng / ml （Hu） 3 – 2187 pg / ml （Ms） 3 ng / ml （Ms） 糖代謝ホルモン Insulin ※ 58 – 46000 pg / ml 58 pg / ml Glucgon 3 – 7000 pg / ml 3 pg / ml サイトカイン＆ HMGB1 ホルモン サンプル種 培養細胞 分取した培養上澄 分取した培養上澄 サンプル量12.5 – 80 μl 5 – 50 μl フォーマットダイレクトアッセイ　（96 / 384 ウェルフォーマット） 操作性ホモジニアス（添加＆測定） 所要時間70 分以内 マルチアッセイ（オプション） Caspase-Glo® 1 In ammasome Assay （カタログ番号 G9951） Lumit™ アッセイの両方を使用し インスリン※とグルカゴンを同時に 分析することができます。並べて分析することで、より多くの 膵島 機能に関する情報を得ることができます。 Lumit™ ダイレクト検出法の概要 6 IFN- [pg/ml] γ 5000 4000 3000 2000 1000 0 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 log Blincyto® [g/ml] IFN-γ Luminescence [RLU] 1 x 105 2 x 105 3 x 105 4 x 105 0 10 100 1000 10000 Doxorubicin [nM] untreated cell background EC = 406 nM 50 HMGB1 T 細胞活性化マーカー IFN- γの検出 精製したCD8+ T 細胞（エフェクター細胞）に Raji B 細胞（ターゲット細胞） を加え、連続希釈 したBlincyto®（CD3 およびCD19 二重特異性T 細胞エンゲー ジャー）を混合した。Lumit™ IFN- γ Immunoassay を用いて、細胞存在下（上 清の移替えなし）で、エフェクター細胞から細胞培養上清へのIFN- γの放出 を分析した。 薬剤による免疫原性細胞死の誘導 マウスEL4 細胞をドキソルビシンで24 時間処理した。上清中のHMGB1 を Lumit™ HMGB1 Immunoassay を用いて、細胞存在下（上清の移替えなし）で 定量した。 灌流実験における分泌糖代謝ホルモンの測定 灌流チャンバー内の80 個のマウス膵島を2.7mM グルコース、次に10mM グルコースで、アミノ酸混合物と組み合わせて処理した。1 分毎に灌流液を 分取し、Lumit ™ アッセイを用いて10μl 灌流液を384 ウェルで測定した。（本 データは University of Wisconsin VA Hospital, Madison, WI, H. Foster および M. Merrins 両博士の好意により提供された。） 製品名カタログ番号サイズ サイトカイン Lumit™ IL-1 β Human Immunoassay W6010 100 ウェル分 W6012 500 ウェル分 W6011 1000 ウェル分 Lumit™ IL-1 β Mouse Immunoassay W7010 100 ウェル分 W7012 500 ウェル分 W7011 1000 ウェル分 Lumit™ IL-2 Human Immunoassay W6020 100 ウェル分 W6022 500 ウェル分 W6021 1000 ウェル分 Lumit™ IL-4 Human Immunoassay W6060 100 ウェル分 W6062 500 ウェル分 W6061 1000 ウェル分 Lumit™ IL-6 Human Immunoassay W6030 100 ウェル分 W6032 500 ウェル分 W6031 1000 ウェル分 製品名カタログ番号サイズ Lumit™ IL-10 Human Immunoassay W6070 100 ウェル分 W6072 500 ウェル分 W6071 1000 ウェル分 Lumit™ IFN- γ Human Immunoassay W6040 100 ウェル分 W6042 500 ウェル分 W6041 1000 ウェル分 Lumit™ TNF- α Human Immunoassay W6050 100 ウェル分 W6052 500 ウェル分 W6051 1000 ウェル分 ダメージ関連分子パターン Lumit™ HMGB1 Human/Mouse Immunoassay W6110 100 ウェル分 W6112 500 ウェル分 糖代謝ホルモン Lumit™ Glucagon Immunoassay Kit W8020 100 ウェル分 W8022 500 ウェル分 ※ 96 ウェルプレートで換算 価格、プロトコルなどはこちら プレデザイン キット 7 タンパク質定量（間接アッセイ法：細胞内タンパク質） Lumit™ Immunoassay Cellular System は、細胞内のキナーゼシグナル伝達経路解析のために、幅広い市販の一次抗体で検証 された免疫検出システムです。アッセイキットには、溶解バッファー、標識済み Lumit™ 二次抗体、および検出試薬が含まれています。 リン酸化タンパク質などに対する一次抗体（別途必要）と組み合わせることで、シグナル伝達経路の解析が容易に行えます。現在まで に、このフォーマットは、リン酸化に焦点を当てた細胞ライセートでの細胞シグナル伝達解析で広く検証されています。以下の表にまと めた様々なターゲットやパスウェイの検出アプリケーションも増え続けています。各アプリケーションノートには、プロトコルと使用する 市販品の一次抗体の情報が記載されています。 細胞内・修飾タンパク質 検出キット PPOI P POI POI P ATP ADP キナーゼ + POI パスウェイの活性化 ライセート 抗体の添加 インキュベーション ＆ 検出 室温で20分 室温で 60-90分 + 細胞溶解剤 抗体ミックス 一次抗体 Anti-POI 動物種B Anti-P-POI 動物種A + LumitTM 二次抗体 Anti- 動物種A (LgBiT) Anti- 動物種B (SmBiT) + LumitTM 検出試薬 検出 1 2 3 4 細胞生存性測定用 蛍光基質 （オプション） Luminescence (RLU) Arti cial Unit Cell Number, ×1000 4 10,000 8,000 6,000 4,000 2,000 0 1×107 1.125×107 1.25×107 1.375×107 1.5×107 7 14 21 28 35 42 49 56 p-I B: Lumit™ Immunoassay p-I B: Western Blot p-I B  GAPDH Luminescence (RLU) Arti cial Unit Cell Number, ×1000 4 250,000 200,000 150,000 100,000 50,000 0 2×107 4×107 6×107 8×107 1×108 7 14 21 28 35 42 49 56 Total I B: Lumit™ Immunoassay Total I B: Western Blot Total I B  GAPDH 本製品は LgBiT または SmBiT であらかじ め標識された2 種類の二次抗体と2 種 類の一次抗体を混合する間接Lumit™ 検 出フォーマットを採用しています。実験 のワークフロー ①目的のシグナル伝達 経路を活性化するために細胞を処理。生 存細胞数の正規化が必要な場合、付属 の細胞生存性測定用蛍光基質（GF-AFC） の利用が可能。②ジギトニンベースの細 胞溶解バッファーを添加し、細胞をウェ ル内で溶解。③抗体ミックスを添加④室 温で 60 ～ 90 分間インキュベートした後、 Lumit™ 検出試薬を添加し、発光シグナ ルを測定。 ウエスタンブロッティングと Lumit ™ システムによる I κ B αリン酸化および総タンパク質の検出 様々な個数の MCF-7 細胞 を播種（3500 – 56,000）し、 37 °C, 5% CO2 で一昼夜インキュベーションした。細胞は MG132 （20 μM, 1 h） で前処理した後に TNF α（50 ng/ml, 30 min）で処理（または未処理） し、同じ一次抗体を用いて Lumit™ Immunoassay Cellular System ま たは ウェスタンブロッティングでリン酸化 I κ B α を検出した（A パ ネル）。Total I κ B α の検出では MG132 による前処理を行わずに、 同じ一次抗体を用いて Lumit™ Immunoassay Cellular System または ウェスタンブロッティングを行った（B パネル）。ホモジニアスな Lumit™ システムを用いれば ウエスタンブロッティングと同様のデー タがより簡便、迅速に得られ、さらにより少量の細胞で定量性の高 い結果を取得できます。 A パネルB パネル 標的タンパク質シグナル経路トータル タンパク質 リン酸化 タンパク質 適応 セット※ AKT ［キット有］ PI3K/mTOR/AKT ○ ○ Set 1 BCL6 B-cell シグナル○ × Set 1 BTK ［キット有］ B-cell 受容体× ○ Set 1 c-Jun JNK × ○ Set 1 CREB PKA/CREB ○ ○ Set 1 ER（エストロゲン受容体） エストロゲン○ × Set 1 ERK1 ［キット有］ ERK × ○ Set 1 I κ B α［ キット有］ NF- κ B ○ ○ Set 1 JNK JNK × ○ Set 1 SMAD1 BMP ○ ○ Set 1 SMAD2 TGF-ß ○ ○ Set 2 STAT1 JAK/STAT ○ ○ Set 1 STAT2 JAK/STAT × ○ Set 1 STAT3 ［キット有］ JAK/STAT ○ ○ Set 1 4E-BP1 mTor × ○ Set 2 ß-catenin WNT ○ ○ Set 2 p65 NF- κ B ○ ○ Set 2 RB （網膜芽細胞腫抑制因子） 細胞周期○ ○ Set 2 製品名カタログ番号サイズ Lumit™ Immunoassay Cellular System – Starter Kit W1220 200 ウェル分 Lumit™ Immunoassay Cellular System – Set 1 ※ W1201 100 ウェル分 W1202 1000 ウェル分 W1203 10000 ウェル分 Lumit™ Immunoassay Cellular System – Set 2 ※ W1331 100 ウェル分 W1332 1000 ウェル分 W1333 10000 ウェル分 ※ Set 1：LgBiT 標識 抗マウス抗体 / SmBiT 標識 抗ウサギ抗体の Lumit™ 二次抗体セット、Set 2： SmBiT 標識 抗マウス抗体 / LgBiT 標識 抗ウサギ抗体の Lumit™ 二次抗体セット。 最新の価格、アプリケーションリスト、 プロトコルなどはこちら 二次抗体 検出キット （一次抗体不含） Lumit™ Immunoassay Cellular System の概要 キット有：リン酸化型認識抗体を含むプレデザインキットが利用可能です。 詳細については右QR コードのページをご覧ください。 8 タンパク質相互作用検出（競合アッセイ法） 抗体医薬の効果は、Fab フラグメントと標的抗原との結合活性だけでなく、Fc フラグメントとFc レセプターとの結合活性にも依存し ます。例えば、Fc フラグメントの新生児Fc 受容体（FcRn）への親和性は抗体の半減期に影響し、Fc γ受容体（Fc γ R）への結合 親和性は、ADCC（抗体依存性細胞傷害）やADCP（抗体依存性細胞貪食）などの細胞エフェクター機能を誘発する能力に影響す ると考えられています。そのため、治療用抗体の開発においては、Fc 受容体に対する試験を実施する必要があります。 Fc 受容体結合アッセイ ビオチン 分析対象抗体 hFcRn SmBiT ストレプトアビジン 標識抗体 トレーサー LgBiT [Analyte Ab] Luminescence [RLU] IC50 Tracer binding [%] 50 100 0 -4 -2 0 2 4 log IgG [nM] FcγRIIIa (F158) anti-hCD20-hIgG1fut anti-hCD20-hIgG1NQ anti-hCD20-hIgG1 Tracer binding [%] 100 50 0-2 0 2 4 6 log Panitumumab [nM] 1 h oxidation 24 h oxidation 6 h oxidation 3 h oxidation Untreated 本アッセイは LgBiT-標識 ヒトIgG1（LgBiT標識抗体トレーサー）およびSmBiT-標識ストレプトアビジン＋ビオチン化 ヒト Fc γ R / FcRn [ 細胞外ドメイン] （ hFc γ R またはhFcRn- ビオチン- ストレプトアビジン-SmBiT）で構成されています。分析対象抗体の非存在下では、トレーサーが標識されたhFc γ R またはhFcRn に結合 しているため最大の発光シグナルを生じます。分析対象抗体が存在すると、トレーサーとの競合により、濃度に依存したシグナルの低下が観察されます。 Fc γ R 結合アッセイ Lumit™ Fc γ R Binding Immunoassay は、ヒトFc レセプターと抗体 （またはFc 融合タンパク質）の相互作用を測定する新しい洗浄不 要のホモジニアス発光競合アッセイです。溶液中で測定できるた め、固定化によるアーチファクトを回避することができます。これ らのアッセイは、抗体医薬の開発において、抗体の最適化および 抗体の力価測定に使用されます。 糖鎖による抗体：FcRIIIa（ F158） の親和性変化 Lumit™ Fc γ RIIIa（ F158） Binding Immunoassay は抗体の糖鎖状態評価に使用した。抗体の 非フコシル化（ 抗 hCD20-hIgG1fut）または非 グリコシル化（抗hCD20-hIgG1NQ）による IC50 シフトが検出された。 FcRn 結合アッセイ Lumit™ FcRn Binding Immunoassay は、ヒト新生児 FcRn とFc タン パク質との相互作用を測定する、ホモジニアスな洗浄不要の競合 アッセイです。溶液ベースのフォーマットにより、固定化による実 験的アーチファクトを回避することきます。このアッセイは、抗体 医薬の開発において、FcRn との結合性を最適化して、抗体半減 期の評価・調整に使用することができます。また、抗体の酸化状 態の測定や、抗FcRn ブロッキング抗体の検出にも使用されます。 酸化による抗体： FcRn の親和性の低下 パニツムマブを0.3% H2O2 で1 － 24 時間処 理し、メチオニン酸化を誘導した。Lumit™ FcRn Binding Immunoassay で用量依存的な 抗体：FcRn 親和性の低下を検出した。 Fc γ R / FcRn 結合アッセイ サンプル種 抗体 Fc タンパク質 サンプル量25 μl 濃度幅4 ng / ml ～ 4 μg / ml フォーマットシグナル減衰アッセイ （96 / 384 ウェルフォーマット） 操作性ホモジニアス（添加＆測定） 所要時間70 分以内 製品名カタログ番号サイズ FcRn 結合アッセイ Lumit™ FcRn Binding Immunoassay W1151 100 ウェル分 W1152 1000 ウェル分 Fc γ R 結合アッセイ Lumit™ Fc γ RI Binding Immunoassay CS3041A01 100 ウェル分 Lumit™ Fc γ RIIa （H131） Binding Immunoassay CS3041A02 100 ウェル分 Lumit™ Fc γ RIIa （R131） Binding Immunoassay CS3041A03 100 ウェル分 Lumit™ Fc γ RIIIa （V158） Binding Immunoassay CS3041A04 100 ウェル分 Lumit™ Fc γ RIIIa （F158） Binding Immunoassay CS3041A05 100 ウェル分 ※ CS から始まる番号はカスタム品です。 価格、プロトコルなどはこちら FcRn 結合アッセイFc γ R 結合アッセイ プレデザイン キット Lumit™ Fc γ R / FcRn Binding Immunoassay の概要 9 rFc mFc スパイク RBD hACE2 SmBiT LgBiT RBD:ACE2 阻害剤 ペプチド低分子化合物 タンパク質 mAb / Nab タンパク質相互作用検出（競合アッセイ法） Lumit™ SARS-CoV-2 RBD:hACE2 イムノアッセイは、SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD）とヒト アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）タンパク質との相互作用を検出します。この相互作用は宿主細胞の感染に不可欠であるため、 治療介入の重要なターゲットとなります。この生化学的アッセイは、RBD:hACE2 相互作用阻害剤のスクリーニングに使用され、血漿 または血漿中の中和抗体（NAb）をモニターするための代替中和試験として機能します。 SARS-CoV-2 タンパク質間相互作用アッセイ 0.0001 0.01 1 100 10000 Anti-SARS-CoV-2 Spike Antibody [nM] Neutralization [%] 0 20 40 60 80 100 120 β γ wt α PCR positive Pre-COVID-19 Neutralization [%] -120 -60 -30 P<0.0001 Specificity = 100% Sensitivity = 78% -90 0 60 30 90 120 Lumit™ SARS-CoV-2 RBD:hACE2 イムノアッセイは、組換 えウサギ Fc-RBD （rFc-RBD） およびマウス Fc-hACE2 （mFc-hACE2） 融合タンパク質を使用しています。抗ウ サギ-SmBiT 抗体および抗マウス-LgBiT 抗体でそれぞれ 認識されます。相互作用に負の影響を与える分子は、 Lumit™ による発光シグナルを減衰させます。 RBD:ACE2 PPI Activity [%] 0 20 40 60 80 100 120 Inhibition: strong partial weak / no Ctrl Anti-Spike Antibodies SARS-CoV-1 SARS-CoV-2 1 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 SARS-CoV-2 変異体に対する抗体中和効果のモニタリング SARS-CoV-2 変異体に対する抗SARS-CoV-2 スパイク抗体の中和能を比較し た。野生型と比較すると、α変異体に固有のRBD 変異は中和に大きな影響を 与えなかったが、β変異体およびγ変異体のRBD 内の変異は、抗SARS-CoV-2 スパイク抗体の中和能をほぼ完全に消失させた。 患者由来試料における中和抗体の検出 米国ウィスコンシン州マディソンのプレパンデミック検体（n = 43）および PCR 陽性血漿検体（n = 41）のコーホート分析。サンプル希釈液（1:20）は、 他のアッセイ成分を加える前に、RBD-rFc とともに室温で30 分間プレインキュ ベーションした。閾値は30% の中和に設定され、アッセイ特異度100%、アッ セイ感度78% を示した。 治療用抗体候補のスクリーニング SARS-CoV-1または-2に対する市販の抗体/ 抗体断片15種のミニライブラリー を単回投与でスクリーニングした。データは抗体なし対照（Ctrl 1）で正規化 した。抗体は、RBD:CoV-1、CoV-2 に対する阻害効果によってグループ分けし た。RBD:ACE2 相互作用を強く阻害するもの、部分的阻害、弱/ 無阻害に分 類した。抗SARSCoV-2 ヌクレオキャプシド抗体の使用で、アッセイの特異性 を確認した。 製品名カタログ番号サイズ Lumit™ SARS-CoV-2 Spike RBD:hACE2 Immunoassay [wt] CS3163B01 200 ウェル分 CS3163B02 2000 ウェル分 SARS-CoV-2 RBD N501Y （rabbit Fc） [ α ] CS3163B01C 40 μl CS3163B02C 400 μl SARS-CoV-2 Spike RBD K417N, E484K, N501Y （rabbit Fc） [ β ] CS3163B01D 40 μl CS3163B02D 400 μl SARS-CoV-2 Spike RBD K417T, E484K, N501Y （rabbit Fc） [ γ ] CS3163B01E 40 μl CS3163B02E 400 μl 価格、プロトコルなどはこちら プレデザイン キット Lumit™ SARS-CoV-2 RBD:hACE2 Immunoassay の概要 10 Ab-LgBiT 抗体バッファー 交換 (Ab) アミン反応性 HaloTag®リガンド Cl Cl SE SE Cl SE Cl SE = スクシンイミジルエステル = クロロアルカン Cl Cl Cl Cl Cl Cl 1.5 h HaloTag® リガンドで標識結合確認 1 2 3 Ab-SmBiT HaloTag®-LgBiT HaloTag®-SmBiT HT 16 h HT SDS-PAGE + クーマシー染色 HaloTag®-SmBiT HaloTag®-LgBiT 未標識抗体 標識抗体 アクセサリー（抗体標識） SmBiT および LgBiT をご希望の抗体やタンパク質に結合させ、独自の Lumit™ イムノアッセイを開発できるように設計された標識 キットです。標識反応には、特殊なHaloTag® タンパク質とクロロアルカンリガンド（HaloTag® リガンド）が生理的条件下で共有結 合するHaloTag® 標識技術を利用しています。標識は2 段階のプロセスで行われ、①アミン反応性の HaloTag® スクシンイミジルエ ステル（O4）リガンドで抗体／タンパク質上のリジンアミノ酸の一級アミンと反応　② HaloTag® リガンドで標識された抗体を、 HaloTag®-LgBiT または HaloTag®-SmBiT と共にインとキュベートして抗体に共有結合体をさせます。③ 標識反応の成否を SDS-PAGE およびCBB 染色により確認します。 Lumit™ 抗体標識キット 0.1 1 10 100 1000 10000 0 1 2 3 4 1,000 10,000 100,000 1,000,000 CHO HCP Lumit™ vs ELISA CHO HCP conc. (ng/ml) Absorbance (450nm) RLU (Background Substracted) Lumit™ ELISA Serum Sample Signal/Background 262 15 797 15 281 37 388 93 591 125 937 127 303 149 895 168 299 185 48 223 684 245 663 264 803 290 027 324 023 378 033 378 Serum Sample Signal/Background 045 380 032 422 047 507 011 606 034 644 025 727 725 780 036 818 039 846 029 985 041 1015 030 1064 044 1151 957 1276 035 1343 031 3330 アプリケーション例 遺伝子治療ワークフローにおいて、利用する宿主細胞由来タンパク質の生産 物への残存モニタリングは不可欠であり、品質管理のチェック項目にもなって います。これまでELISA で行っていた煩雑な作業をLumit™ なら効率化させる ことができます。 Lumit™ アッセイの血清サンプル測定例として、ネコ血清サンプル中のネコ カチオン性 トリプシノーゲン（dFCT） の検出を行った。 抗宿主タンパク質抗体を用いた Lumit™ と ELISA 法の比較 市販のAnti-CHO HCP 抗体をLumit™ Labeling Kit で標識し、ELISA 法とCHO 宿 主タンパク質アッセイについて比較をを行なった。Lumit™ 法の検出感度は FDA で許容されるHCP レベル内（1-100 ng/ml）でであった。 ネコ血清をサンプルとしたネコカチオン性トリプシノーゲン（dFCT）の Lumit™ による測定 抗dFCT ポリクローナる抗体をLumit™ Labeling Kit を用いてSmBiT または LgBiT で標識し、96 ウェルプレートの各ウェルあたり各20 μl のpAb-SmBiT お よびpAb-LgBiT、10 倍希釈したネコ血清20 μl を用いて測定し、すべての血清 サンプルよりdFCT を検出した。 製品名カタログ番号サイズ Lumit™ Immunoassay Labeling System VB2500 1 kit ※大量の抗体標識の受託、アッセイ構築なども承ります（14 ページ参照）。 価格、プロトコルなどはこちら アクセサリー 11 タグ付加タンパク質間 相互作用 Tag 1 Tag 2 Anti-Tag 1- LgBiT Anti-Tag 2- LgBiT 0.5 - 1 h 0.5 - 1 h 5 min + Anti-tag 抗体 + LumitTM 検出試薬 アクセサリー（Anti-Tag, Streptavidin） タンパク質間またはタンパク質：低分子相互作用アッセイ、タグ付加タンパク質検出 Anti-Tag Lumit™ 試薬には、一般的な親和性質タグ（例：His-、Flag®-、GST- タグ、ヒトFc）に対する SmBiT またはLgBiT 標識抗体および これらで標識したストレプトアビジンなどを揃えています。これらの試薬により、タンパク質：タンパク質相互作用（PPI） の研究およびこれらの相互作用を調節する分子のスクリーニングに利用できる生化学的アッセイを容易にセットアップすることができま す。さらに、タンパク質と低分子の相互作用についても、シンプルな競合ベースのHTS 対応フォーマットで解析することができます。 Anti-Tag 抗体：各種親和性タグ検出用 抗体/ タンパク質 10 100 1000 0.0 0.5 1.0 [KRAS], nM normalized RLU WT G12C G12D G12V WT G12C G12D G12V 0.01 0.1 1 10 0.0 0.5 1.0 [AMG510], uM Normalized RLU 0 10 20 30 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 [Cbl-b-GST], nM RLU - ATP + ATP 1 10 0 20 40 60 80 100 120 [unlabeled ubiquitin], uM Percent activity RBD-cRAF KRAS His GTP GST Anti-His-LgBiT Anti-GST-SmBiT ユビキチンビオチン ストレプトアビジン-LgBiT Anti-GSTSmBiT GST Cbl-b タンパク質：タンパク質相互作用 2 つの異なるタグが付加されたタンパク質ペアをインキュベートし、オプションとして 目的の相互作用を調節する化合物を加えます。その後、SmBiT またはLgBiT で標識した Lumit™ 抗タグ抗体を添加した後にLumit™ 検出試薬を加え、発光シグナルをプレートリーダーで測定します。AviTag™ タグ付きタンパク質やビオチン化 タンパク質を使用する場合、SmBiT またはLgBiT 標識された 抗タグ抗体の1 つをストレプトアビジン-LgBiT/-SmBiT に置き換えることができます。 KRAS 変異の違いによるRBD-c-RAF 親和性とAMG510 による阻害に対するの評価 （A） KRAS-6His（WT または変異体）の濃度を上げるとRBD-c-RAF-GST 相互作用が生じ、SmBiT またはLgBiT 標識抗体を用いてプローブすると 発光シグナルが増加した。（B） AMG510 はKRAS（G12C）/RBD-c-RAF 相互作用を特異的に阻害するが、野生型および他のKRAS 変異体にはほとん ど影響を及ぼさなかった。濃度は各ウェルの最終濃度。 Cbl-b の自己ユビキチン化の測定 （A） ATP 存在下における Cbl-b-GST ユビキチン化の濃度依存的な増加により、発光シグナルが増加する。このプロセスはATP 依存的であるため、 ATP 非存在下では低いバックグラウンドシグナルが見られる。（B） 未標識ユビキチンの希釈系列は、ビオチン化ユビキチンと競合し、濃度依存的 な発光の減少をもたらすために使用された。正規化した RLU データは、ビオチン化ユビキチンでの反応で得られた最大生物発光シグナルを 100% とし、未標識ユビキチン添加によるシグナルの低下率を算出した。 10 100 1000 0.0 0.5 1.0 [KRAS], nM WT G12C G12D G12V WT G12C G12D G12V 0.01 0.1 1 10 0.0 0.5 1.0 [AMG510], uM Normalized RLU （A） （B） （A） （B） Anti-Tag を用いたタンパク質相互作用解析の概要 12 セレブロン 複合体 BRD3 (BD2) GST FLAG® PROTAC BTK ビオチン- トレーサー ストレプト アビジン His 低分子 化合物 タンパク質と低分子化合物の相互作用 ビオチン化低分子化合物（トレーサー）とタグ付きタンパク質を必要とします。トレーサーとターゲットタンパク質の相互作用は、 SmBiT またはLgBiT 標識抗タグ 抗体 とストレプトアビジン-LgBiT/-SmBiT を用いて検出されます。未標識化合物を加えると、ターゲットタンパク質に結合するトレーサー化合物が競合置換される ため発光シグナルが減少します。 PROTAC によるタンパク質：タンパク質 相互作用の誘導モニタリング PROTAC dBET1 および dBET6 によるセレブロン E3 リガーゼと BRD3 （BD2） の複合体形成能を Lumit™ イムノアッセイで評価した。GST タグおよび FLAG®タグを付加したリコンビナントBRD3（ BD2）（ 6.25 nM） およびセレブロン（ 6.25 nM） を、それぞれ異なる濃度の PROTAC と60 分間インキュ ベートした。検出には、Lumit™ Anti-GST-LgBiT 、 Lumit™ Anti FLAG®-SmBiT と Lumit™ Immunoassay Detection Reagent A を使用した。 タンパク質：低分子相互作用の検出と特性解析 ブルトン型チロシンキナーゼ（BTK）に対する各種キナーゼ阻害剤の相対的結合親和性を競合型 Lumit™ イムノアッセイで測定した。リコンビナン トHisタグ付きBTK（ 5 nM） を、ビオチン化イブルチニブ（ トレーサー; 37.5 nM） および濃度の異なるキナーゼ阻害剤（ 0.003 - 5000 μM） とともに、 撹拌しながら60 分間インキュベートした。サンプルをストレプトアビジン-LgBiT とLumit™ Anti-6His-SmBiT の混合液とともに30 分間インキュベー トし、Lumit™ Immunoassay Detection Reagent A を添加することにより、並行状態におけるトレーサー結合BTK の割合が検出された。 製品名カタログ番号サイズ Lumit™ Anti-6His-LgBiT and -SmBiT CS332211 各20 μl Lumit™ Anti-GST-LgBiT and -SmBiT CS332212 各20 μl Lumit™ Anti-FLAG®-LgBiT and -SmBiT CS332213 各20 μl Lumit™ Anti-Human IgG-LgBiT and -SmBiT CS332214 各20 μl Lumit™ Streptavidin-LgBiT and -SmBiT CS332215 各20 μl ※検出には Lumit™ Detection Reagent A をご使用ください。 GST またはHis タグ付加キナーゼ（370 種以上）も販売中！ 価格、プロトコルなどはこちら アクセサリー 1 10 100 1000 10000 PROTAC [nM] Fraction of max 0 0.5 1.0 dBET1 dBET6 100 80 60 40 20 0 10-3 10-2 10-1 100 101 102 103 104 Compound [nM] Tracer binding [%] Ibrutinib Ponatinib Foretinib Bosutinib Dasatinib 1 10 100 1000 10000 PROTAC [nM] Fraction of max 0 0.5 1.0 dBET1 dBET6 100 80 60 40 20 0 10-3 10-2 10-1 100 101 102 103 104 Compound [nM] Tracer binding [%] Ibrutinib Ponatinib Foretinib Bosutinib Dasatinib キナーゼの詳細はこちら /kinases 13 アクセサリー（二次抗体 ＆ 検出試薬） SmBiT/ LgBiT 標識 二次抗体 Lumit™ 二次抗体は、IgGに対するポリクローナルSmBiT, LgBiT 標識抗体で、分析対象物の検出のための間接イムノアッセイフォー マットの開発をサポートします。このポリクローナル二次抗体は、ロバで免疫され、固定化抗原を用いてイムノアフィニティー精製され た後にSmBiT またはLgBiT を結合させたものです。IgGの重鎖および軽鎖に対する種特異的な反応性（ マウス、ウサギ、ヤギ）が 確認されています。 これらの二次抗体を用いたLumit™ イムノアッセイには別途、異なる動物種で作製された2 種類の一次抗体（例：マウス抗分析対象 物質抗体とウサギ抗分析対象物質抗体）を用意する必要があります。準備した一次抗体と Lumit™ 二次抗体と組み合わせて、抗体ミッ クスを作成し、 2 ～ 3 組の一次抗体をテストします（推奨）。アッセイに使用する最適な組み合わせと濃度 アッセイに使用する最適な組 み合わせと濃度は、チェッカーボード実験により決定されます。 Lumit™ イムノアッセイ検出試薬（ 発光基質） Lumit™ イムノアッセイ検出試薬は、オリジナルの Lumit™ イムノアッセイの開発にご利用いただけます。3 種類の試薬（A、B、C） があり、異なる条件下での分析物の検出が可能です。検出試薬A は細胞や血清がない状態、検出試薬B はFBS（最大10%）を含 む細胞培養上清やインタクト細胞の存在下で使用されます。溶解した細胞中のタンパク質の定量には、Lumit™ Immunoassay Lysis and Detection Kit に含まれるDetection Reagent C をお勧めします。 二次抗体 検出試薬 イムノアッセイ反応バッファー 二次抗体 一次抗体 Anti- 2 動物種B Anti- 1 動物種 エピトープ エピトープ A Anti- 動物種A (LgBiT) Anti- 動物種B (SmBiT) or インタクトな 細胞 細胞 ライセート 製品名カタログ番号サイズ Lumit™ Anti-Mouse Ab-LgBiT W1021 30 μl W1022 300 μl Lumit™ Anti-Mouse Ab-SmBiT W1051 30 μl W1052 300 μl Lumit™ Anti-Rabbit Ab-LgBiT W1041 30 μl W1042 300 μl Lumit™ Anti-Rabbit Ab-SmBiT W1031 30 μl W1032 300 μl Lumit™ Anti-Goat Ab-LgBiT W1061 30 μl W1062 300 μl Lumit™ Anti-Goat Ab-SmBiT W1071 30 μl 抗体ミックスの調製方法 W1072 300 μl Detection Reagent A • in vitro サンプル • 細胞を含まないサンプル • 血清なしサンプル Detection Reagent B • 培養上清サンプル • 血清含有サンプル • 細胞ありまたは含まない 　サンプル Detection Reagent C • 細胞溶解サンプル 　（ライセ―ト） 価格、プロトコルなどはこちら 価格、プロトコルなどはこちら 製品名カタログ番号サイズ Lumit™ Immunoassay Detection Reagent A VB2010 500 ウェル分 VB2020 5000 ウェル分 VB2030 50000 ウェル分 Lumit™ Immunoassay Detection Reagent B VB4050 100 ウェル分 VB4060 1000 ウェル分 Lumit™ Immunoassay Lysis and Detection Kit （※ Lumit™ Detection Reagent C を含む） W1231 100 ウェル分 W1232 1000 ウェル分 W1233 10000 ウェル分 アクセサリー 14 プロメガのTailored R&D Solutions（カスタムサービスチーム）は、ターゲット検出のためのLumit™ テクノロジーの採用をサポー トする様々なサービスオプションを提供しています。ご希望の Lumit™ アッセイが存在しない場合、抗体標識のカスタムプロジェクト やフルアッセイ開発をサポートいたします。 サービス内容 ・ 抗体のカスタム標識：お客様にご提供いただいた抗体を、Lumit™ アッセイ 用にSmBiT またはLgBiT で標識致します。これはLumit™Labeling Kit を補 完するもので、プロメガ社がお客様に代わって標識作業を承ります（1mg よりお見積り）。 　 ※ アッセイの最適化は本サービスには含まれません。 ・ Lumit™ Assay カスタム構築（一次抗体）： Lumit™ アッセイ構築もお手伝 いいたします。プロメガが一次抗体を選択し、抗体を標識、標的スタンダー ド（リコンビナント）を決定いたします。さらに、標識抗体を最適化してアッ セイのリニアレンジを提示いたします。お客様には標識抗体、スタンダード、 プロトコールが提供されます（Lumit™ 検出試薬は含まれません）。 ・ Lumit™ Assay カスタム構築（二次抗体）：お客様より異なる動物種由来の 一次抗体のペアをご提供いただきます。プロメガのLumit™ Immunoassay Cellular System のSet 1 または Set 2 を用いてテストを実施いたします。 プロジェクト完了後、お客様にデータレポートを提供いたします。 NanoBiT® & NanoBRET™ Protein : Protein Interaction Assay 高輝度 NanoLuc® ルシフェラーゼを分割したSmBiT およびLgBiT 断片の相補 性を利用したNanoBiT® あるいは蛍光標識 HaloTag® のBRET を細胞で検出 するNanoBRET™ タンパク質間相互作用研究試薬 NanoBRET™ Target Engagement Assay NanoLuc ® と蛍光標識化合物の結合性をBRET を利用して検出します。生細胞 における真の結合特性（化合物親和性、標的占有率、滞留時間など）を理解 することができます。 In Vitro でのタンパク質解析結果を細胞ベースアッセイで検証することは、より生体内に近いタンパク質の動態を観察できるため検証実 験に最適です。以下のアッセイはNanoLuc® 発光酵素あるいは SmBiT（HiBiT）ペプチドとLgBiT 断片の相補性を利用したタンパ ク質相互作用あるいはタンパク質検出法を利用しています。 受託サービス（Tailored R&D Solutions） 細胞ベースアッセイもNanoLuc® テクノロジー ※ プロメガの受託サービスでは NanoBRET™ ゃNanoBiT® PPI アッセイ など細胞ベースのアッセイ を行うための ベクター・細胞構築やアッセイ最適化、化合物テストなども承ります。 FLAG is a trademark of Sigma-Aldrich Co. LLC. AviTag is a trademark of Avidity, LLC. For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures. アッセイ構築（一次抗体）サービス例 1. ご希望のアッセイについてお打ち合わせ （標的タンパク質、動物種、アッセイするサンプルのタイプなど） 2. 複数のモノクローナル二次抗体の候補を選別 3. 標的のスタンダード（リコンビナート）の決定 4. お客様とプロメガ両社による同意の上、作業範囲記述書（ SOW: Statement of Work） を作成 5. 複数の候補抗体を購入 6. 購入した複数の抗体を標識し、リコンビナントのスタンダードを検 出するための抗体ペアの組み合わせをスクリーニング 7. 有望な抗体ペアについて標識抗体の濃度を最適化し、リニアレン ジを提示 8. アッセイの構築に成功した場合、アッセイ試薬、プロトコルガイダン スをお客様に提供し、お客様ご自身の細胞モデルでアッセイ性能 を検証 ※ 本カスタムアッセイ構築サービスの費用についてはお見積りいたします。作業の詳 細については SOW に明示されます。 ※ 納期： 8 － 10 週間（抗体の入手など問題が無い場合のSOW 締結後からのリードタ イム） ※ 構築したアッセイにご満足いただき、標識抗体がさらに必要な場合、弊社に再度ご 依頼いただくことも、プロメガの Lumit™ labeling kit を用いてご自身で抗体を標識す ることもできます。 ※ サービス内容や費用については予告なく修正、変更する場合がありますので予め ご了承ください。 受託 NanoBRET™ Target Engagement Assay の概要 検出システム イムノアッセイ、細胞での発現タンパク質検出や相互作用解析も測定可能！ プロメガは生物発光を利用した高い感度と操作性に優れたアッセイ試薬を提供しており、GloMax® シリーズは試薬の性能を最大限に 引き出し、広いシグナルレンジ & 低いバックグランドでの測定が可能になります。付属のタブレットで直感的に操作でき、プロメガのアッ セイプロトコールがインストール済みなので、すぐに実験を開始することができます。この超高感度なプレートリーダーでレポーターアッ セイ、細胞増殖試験をはじめ、各種酵素活性測定を行うことができます。更に GloMax® Discover は発光測定、蛍光および発色測 定に加えBRET アッセイが可能なマルチモードリーダーで、プロメガの試薬と組み合わせれば、同一ウェルから得られる情報量を効率 的に増やすことができます（マルチアッセイ：蛍光 & 発光測定など）。 アプリケーション ※以下記載のないものは発光測定法 タンパク質検出＆タンパク質相互作用 • Lumit™ • ELISA （発色・蛍光） • HiBiT • NanoBiT® • NanoBRET™（ BRET） 細胞アッセイ • 細胞生存・毒性試験 • アポトーシス • 免疫原性細胞死 • オートファジー • 代謝物（グルコース、グルタミン etc） • デュアル & シングルレポーターアッセイ 酵素/ 核酸アッセイ • キナーゼ • P450 • DNA/RNA （蛍光） 発光プレートリーダー 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 –0.2 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 Inhibitor (μM) IL-1β (ng/ml) Beyond range of ELISA 4PL 3rd polynomial 2nd polynomial 搭載アプリケーションとアップグレード 機種発光蛍光 吸光 BRET and FRET 可視光UV / 可視光 GloMax® Discover GM3000 ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ GloMax® Explorer GM3500 ✔ ✔ ✔ 後付け可能 （UV / 可視光ユニット GM3560） 後付け可能 （BRET / FRET 用GM3570） GloMax® Explorer GM3510 ✔ ✔ 後付け可能 （可視光ユニットGM3520） GloMax® Navigator GM2000 ✔ ※ GloMax® Explorer では吸光ユニットやBRET/FRET 用 ユニットによる後付けアップグレードが可能。 ※ GloMax® Navigation は96 ウェルフォーマットのみ（384 非対応） Lumit™ ＋ GloMax® でより正確な IC50 値決定 阻害剤 MCC950 をマウスマクロファージに添加して IL-1 β放出の阻害効果を調べた。ダイナミックレンジの広 い Lumit™ では一回の測定で低濃度阻害剤のデータも 取得でき、使いやすいGloMax 分析プログラムでイムノ アッセイ標準曲線のフィッティングに適した2 次曲線を選 択し、より正しいIC50 を求めることができた（近年の論 文ではイムノアッセイでは標準曲線として汎用される4PL よりも2 次曲線が適していることが報告されている）。 検出Lumit™ の簡便性を 是非ご体感ください！ RentaMAX で発光プレートリーダー 無償レンタル可能！ ※プロメガクラブへの入会が必要 テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982　● E-Mail : prometec@jp.promega.com PK2212-03P 販売店 プロメガ株式会社 本　　　社　〒103-0001 東京都中央区日本橋小伝馬町1-5 PMO日本橋江戸通 Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所　〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2023 年1 月現在のものであり予告なしに変更することがあります。