Maxwell® RSC Genomic DNA Kit (カタログ番号 AS1880) 簡易マニュアル

Maxwell® RSC Genomic DNA Kit (カタログ番号 AS1880) 簡易マニュアル ご用意いただくもの • ボルテックスミキサー • ピペットマン (P-20、P-200、P-1000)とそれらのチップ • 1.5～2.0ml遠心チューブ • 56℃に設定したヒートブロック、サーモミキサー • Nuclease-Free Water 細胞ペレット、組織用 • 1×Phosphate Buffered Saline (PBS) 細胞洗浄用 組織からのDNA抽出 サンプル量：5～50mg 1. サンプルをチューブに入れる。 2. 300l Nuclease-Free Waterを加える。 3. 30l Proteinase K Solutionを加える。 4. 10秒間のボルテックスにより十分に攪拌する。 5. 300l Lytic Enhancer (LE2)を加える。 6. 10秒間のボルテックスにより十分に攪拌する。 7. 56℃に設定したヒートブロックに、サンプル/試薬を加えたチューブをセットし、 1～16時間 処理する。 ＊サーモミキサー使用時（回転速度:1,500rpm）で2時間まで ＊ブロックヒートインキュベータ使用時 16時間まで 8. 10秒間のボルテックスにより十分に攪拌する。 9. 遠心（15,000g×5分） 10. 上清を新しいチューブへ移す。 11. 300l Lysis bufferを加える。 12. 10秒間のボルテックスにより十分に攪拌する。 pg. 2 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 細胞からのDNA抽出 サンプル量：尿: 15～50ml、羊水: 1～5ml、末梢血単核細胞 (PBMC): 5×104～ 5×106 cells、培養細胞：5×102～5×106 cells 細胞ペレットの用意 1. サンプル (5×10 2～5×106 cells)を遠心（2,000g×20分）し、上清を除去する。 2. 1×PBSを加え、懸濁させたのち、遠心（2,000g×20分）し、上清を除去する。 （尿の場合は、750l 1×PBSを懸濁したのち、遠心する。） ライセートの調製 1. 300l Nuclease-Free Waterを細胞ペレットが入ったチューブ加え、懸濁する。 2. 30l Proteinase K Solutionを加える。 3. 10秒間のボルテックスにより十分に攪拌する。 4. 300l Lytic Enhancer (LE2)を加える。 5. 300l Lysis bufferを加える。 6. 10秒間のボルテックスにより十分に攪拌し、均一な状態になっていることを確認する。 7. 56℃に設定したヒートブロックに、サンプル/試薬を加えたチューブをセットし、 20分 処理する。 8. 10秒間のボルテックスにより十分に攪拌する。 全血/Buffy coatからのDNA抽出 サンプル量：全血、Buffy coat: 50～300l （白血球数が、4×106～10×106 cells/ml血液のサンプルの場合） ＊Buffy coatの場合は、溶出Bufferを200lで実施することを推奨します。 サンプルの用意 サンプルは、15～30℃5分間、十分にロータリー、シェーカーなどで攪拌し、 均一な状態にしておく。 ライセートの調製 1. 30l Proteinase K Solutionをチューブに加える。 2. サンプルを加える。 ＊凝固した血液・脂肪分が含まれないようにする。 3. 10秒間のボルテックスにより十分に攪拌する。 4. 300l Lytic Enhancer (LE2)を加える。 5. 300l Lysis bufferを加える。 6. 10秒間のボルテックスにより十分に攪拌し、均一な状態になっていることを確認する。 7. 56℃に設定したヒートブロックに、サンプル/試薬を加えたチューブをセットし、 20分 処理する。 8. 10秒間のボルテックスにより十分に攪拌する。 pg. 3 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 骨髄細胞（Bone Marrow Aspirate）からのDNA抽出 サンプル量：50～300l ＊Buffy coatの場合は、溶出Bufferを200lで実施することを推奨します。 サンプルの用意 サンプルは、15～30℃ 30分間、十分にロータリー、シェーカーなどで攪拌し、 均一な状態にしておく。 ライセートの調製 1. 30l Proteinase K Solutionをチューブに加える。 2. サンプルを加える。 ＊凝固したものが含まれないようにする。 3. 10秒間のボルテックスにより十分に攪拌する。 4. 300l Lytic Enhancer (LE2)を加える。 5. 300l Lysis bufferを加える。 6. 10秒間のボルテックスにより十分に攪拌し、均一な状態になっていることを確認する。 7. 56℃に設定したヒートブロックに、サンプル/試薬を加えたチューブをセットし、 20分 処理する。 8. 10秒間のボルテックスにより十分に攪拌する。 スワブからのDNA抽出 サンプル量：1～2 Swabs Lytic Enhancer / Proteinase K溶液の調製 1サンプルあたり、300l Lytic Enhancer (LE2)と30l Proteinase K Solutionを混ぜ たのち、10秒間ボルテックスし、よく混合しておく。 ライセートの調製 1. 1～2本のスワブの先端を入れる。 2. 330l Lytic Enhancer/Proteinase K溶液を加える。 3. 56℃に設定したヒートブロックに、サンプル/試薬を加えたチューブをセットし、 20分 処理する。 4. 300l Lysis bufferを加える。 5. 10秒間のボルテックスにより十分に攪拌し、均一な状態になっていることを確認する。 pg. 4 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 カートリッジの準備 1. 検体数分のカートリッジをMaxwell® RSC/CSC Deck Trayに立て、順にアルミシールを剥がす。 カートリッジの両端がカチッというまで、しっかりとセットする 注意：サンプル数が16より少ない場合には、Maxwell® RSC/CSC Deck Trayの中央部分をお使いく ださい。 2. 同数のElution Tubeをセットし、50～200μlのElution Bufferを加える。 サンプル量に合わせて、適切な溶出液を設定してください。 Elution Tubeのフタは絶対に閉めないでください。 3. カートリッジのウエル8に、プランジャーを置く。 4. サンプル全量を、カートリッジのウェル1に添加し、 5～10回、ピペティングにより攪拌する。 ウェル1は最も大きなウエルです。カートリッジラベルに一番近く、Elution tubeからは最も遠い位 置にあります。 *脂肪分や組織残渣などの固形物が混入しないように、遠心後の上清（水層）のみを加える。 5. 15μlのRNase Solutionをウェル3に添加する。 6. Maxwell RSC Instrumentを起動し、Startから『Genomic DNA ／AS1880』を選択する。 7. Maxwell® RSC/CSC Deck Trayを、Maxwell® RSC本体にセットし、精製操作をスタートす る。 精製終了後の操作 1. Maxwell RSC® Instrumentのドアを開け、Elution Tubeのフタを閉める。 2. Maxwell® RSC/CSC Deck Trayを取り出し、Elution Tubeを適切に保管する。 3. Maxwell RSC® Instrumentのドアを閉める。カートリッジとプランジャーを廃棄する。