Maxwell® RSC miRNA Plasma and Serum Kit

pg. 1 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 Maxwell® RSC miRNA Plasma and Serum Kit (カタログ番号 AS1680) 簡易マニュアル ご用意いただくもの • ボルテックスミキサー • ピペットマン (P-20、P-200、P-1000)とそれらのチップ • 37℃に設定したヒートブロックインキュベーター 試薬の準備 DNase I 1. 凍結乾燥品のDNase Iのバイアルに、275μlのNuclease-Free Waterを添加する。蓋をしてバイアルをおだや かに転倒混和し、内側に付着しているDNase Iもリンスします。ボルテックスはしないでください。 2. 試薬の視認性を上げるため、5μlのBlue Dyeを添加する。 3. 使用後のDNase I溶液は、1回の実験で使用する分量に分注し、-20℃で保存してください。 凍結融解は10回まで活性を維持できます。-20℃で6か月は保存できます。 サンプルの調製手順 A. A. 血漿および血清 1. 100~500μlの血漿および血清を1.5ml遠心チューブに移す。 血漿および血清の液量が100μl以下の場合、Nuclease-Free Waterを100μl加えてください。 2. 80μl Proteinase K Solutionと230μl Lysis Buffer Cを加え、5秒間のボルテックスにより十分に撹拌する。 3. 37℃で15分間のインキュベーションを行う。この間に、カートリッジの準備を行う。 B. エクソソームサンプル 1. 200μlまでのWaterまたはPBS以外のバッファーに懸濁したエクソソームサンプルを1.5ml遠心チューブに移 す。 ※ サンプル量が200μl以下の場合、Waterを加えて、200μlとなるように調製してください。 ※ エクソソームがPBSに懸濁されている場合、75μl以上のPBSの持ち込みは収量低下につながります。 2. 80μl Proteinase K Solutionと230μl Lysis Buffer Cを加え、5秒間のボルテックスにより十分に撹拌する。 ※エクソソームがLysis Buffer Cに懸濁されている場合、まず、合計で230μl Lysis Buffer Cとなるように、 Lysis Buffer Cを加えてください。さらに、200μl Waterと80μl Proteinase K Solutionを加えてください。 例：100μl エクソソームを懸濁したLysis Buffer C + 130μl Lysis Buffer C + 200μl Water ＋ 80μl Proteinase K Solution 3. 37℃で15分間のインキュベーションを行う。この間に、カートリッジの準備を行う。 pg. 2 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 カートリッジの準備と精製工程 1. 検体数分のカートリッジをMaxwell® RSC/CSC Deck Trayに立て、順にそのアルミシールを剥がす。 カートリッジの両端がカチッというまで、しっかりとセットする 注意：サンプル数が16より少ない場合には、Maxwell® RSC/CSC Deck Trayの中央部分をお使いください。 2. 同数のElution Tubeをセットし、50μlのNuclease-Free Waterを加える。 Elution Tubeはグッと強く一番下まで押し込んでください。 Nuclease-Free Waterは30～100μlを加えることができます。ただし、30μの場合、磁性ビーズの持ち込みの割 合が高くなることが予想されるため、標準として50μl Nuclease-Free Waterでの溶出をお勧めします。 また、Elution Tubeのフタは絶対に閉めないでください。 3. カートリッジのウエル8に、プランジャーを置く。 4. 10μlのDNase I 溶液をカートリッジのウエル4(黄色い試薬の入 ったウエル)に添加する。 DNase I溶液は、粘性があり、壁面に沿って自然に液中に落下しな いので、ウエル4内の液に直接加えてください。 5. インキュベーション後、ライセート全量をカートリッジのウェル1に添加する。 ウエル1は最も大きなウエルです。カートリッジラベルに一番近く、Elution tubeからは最も遠い位置にありま す。 6. Maxwell® RSC/CSC Deck TrayをMaxwell® RSC Instrument本体にセットし、精製操作をスタートする。 精製終了後 1. Maxwell® RSC/CSC Deck Trayを取り出す。Elution Tubeのキャップを閉め、適切に保管する。 磁性体ビーズの混入がみられた場合、10,000×gで2分間の遠心操作により除くことができます。 2. カートリッジおよびプランジャーを廃棄する。