Maxwell® RSC miRNA Tissue Kit

pg. 1 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 Maxwell® RSC miRNA Tissue Kit (カタログ番号 AS1460) 簡易マニュアル 注意：キットを受け取りましたら、1-Thioglycerolを取り出し、キット箱は室温で保存してください。 取り出した1-Thioglycerolは2～10℃で保存してください。 ご用意いただくもの • ボルテックスミキサー • ピペットマン (P-20、P-200、P-1000)とそれらのチップ • アイスブロックまたは氷 • ホモジナイザーもしくは組織破砕装置 試薬の準備 １－Thioglycerol/Homogenization Solutionの調製 1. 1mlのHomogenization Solutionあたり20μlの1-Thioglycerolを添加する。 RNA抽出の工程において、1サンプルあたり、200μlの1-Thioglycerol/Homogenization Solutionを使用します。 1-Thioglycerolは還元剤であり、2-MEの代わりに利用します。1-thioglycerolは毒物には該当しません。 2. 1-Thioglycerol/Homogenization Solutionは使用するまで氷上にて冷やしておく。 1-Thioglycerol/ Homogenization Solutionは2-10℃で保存してください。30日まで安定です。 DNase I 1. 凍結乾燥品のDNase Iのバイアルに、275μlのNuclease-Free Waterを添加する。蓋をしてバイアルをおだや かに転倒混和し、内側に付着しているDNase Iもリンスします。ボルテックスはしないでください。 2. 試薬の視認性を上げるため、5μlのBlue Dyeを添加する。 3. 使用後のDNase I溶液は、1回の実験で使用する分量に分注し、-20℃で保存してください。 凍結融解は10回まで活性を維持できます。-20℃で6か月は保存できます。 組織からのmiRNA抽出の手順 1. 冷却した200μlの1-Thioglycerol/Homogenization Solution中で、組織片が見えなくなるまで、すばやくホ モジナイズし、さらに15～30秒のホモジナイズする。 サンプルが泡立ってしまった場合は、サンプルを氷上に静置してください。カートリッジでのホモジネート最大処 理量は200μlです。必要であれば、サンプルにhomogenization solutionを加えて最終的なホモジネートの容量を 200μlに調製してください。 2. 200μlのLysis Buffer、200μlのLytic Enhancerおよび30μlのProteinase K Solutionを添加し、20秒間ボ ルテックスする。 3. 室温で10分間のインキュベーションを行う。この間に、次頁にしたがい、カートリッジの準備を行う。 2019 年 11 月 1 日 改定 pg. 2 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 カートリッジの準備と精製工程 1. 検体数分のカートリッジをMaxwell® RSC/CSC Deck Trayに立て、順にそのアルミシールを剥がす。 カートリッジの両端がカチッというまで、しっかりとセットする 注意：サンプル数が16より少ない場合には、Maxwell® RSC/CSC Deck Trayの中央部分をお使いください。 2. 同数のElution Tubeをセットし、60μlのNuclease-Free Waterを加える。 Elution Tubeを差し込む穴には、赤色のシリコンリングがありますので、Elution Tubeはグッと強く押し込んでく ださい。 Nuclease-Free Waterは30～100μlを加えることができます。ただし、30μの場合、磁性ビーズの持ち込みの割合 が高くなることが予想されるため、標準として60μl Nuclease-Free Waterでの溶出をお勧めします。 また、Elution Tubeのフタは絶対に閉めないでください。 3. カートリッジのウエル8に、プランジャーを置く。 4. 10μl のDNase I 溶液をカートリッジのウエル4(黄色い試薬の入 ったウェル)に添加する。 DNase I溶液は、粘性があり、壁面に沿って自然に液中に落下しな いので、ウエル4内の液に直接加えてください。 5. 約630μlのライゼート全量をカートリッジのウェル1に添加する。 ウェル1は最も大きなウエルです。カートリッジラベルに一番近く、Elution tubeからは最も遠い位置にあります。 6. Maxwell® RSC/CSC Deck TrayをMaxwell® RSC Instrument本体にセットし、精製操作をスタートする。 精製終了後 1. Maxwell® RSC/CSC Deck Trayを取り出す。Elution Tubeのキャップを閉め、適切に保管する。 磁性体ビーズの混入がみられた場合、10,000×gで2分間の遠心操作により除くことができます。 得られたRNAは、長期保存では-70℃に保存してください。24時間以内に使用するときには-20℃保存できます。 2. カートリッジおよびプランジャーを廃棄する。