Maxwell® RSC Plant RNA Kit

pg. 1 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 Maxwell® RSC Plant RNA Kit (カタログ番号 AS1500) 簡易マニュアル 注意：キットを受け取りましたら、1-Thioglycerolを取り出し、キット箱は室温で保存してください。 取り出した1-Thioglycerolは2～10℃で保存してください。 ご用意いただくもの • ボルテックスミキサー • ピペットマン (P-20、P-200、P-1000)とそれらのチップ • アイスブロックまたは氷 • ホモジナイザーもしくは組織破砕装置 試薬の準備 １－Thioglycerol/Homogenization Solutionの調製 1. 1mlのHomogenization Solutionあたり20μlの1-Thioglycerolを添加する。 RNA抽出の工程において、1サンプルあたり、200μlの1-Thioglycerol/Homogenization Solutionを使用します。 1-Thioglycerolは還元剤であり、2-MEの代わりに利用します。1-thioglycerolは毒物には該当しません。 2. 1-Thioglycerol/Homogenization Solutionは使用するまで氷上にて冷やしておく。 1-Thioglycerol/ Homogenization Solutionは2-10℃で保存してください。30日まで安定です。 DNase I 1. 凍結乾燥品のDNase Iのバイアルに、275μlのNuclease-Free Waterを添加する。蓋をしてバイアルをおだや かに転倒混和し、内側に付着しているDNase Iもリンスします。ボルテックスはしないでください。 2. 試薬の視認性を上げるため、5μlのBlue Dyeを添加する。 3. 使用後のDNase I溶液は、1回の実験で使用する分量に分注し、-20℃で保存してください。 凍結融解は3回以上行わないで下さい。-20℃で6か月は保存できます。 植物組織からのTotal RNA抽出の手順 1. 植物組織を液体窒素中で、粉末状になるまで十分に破砕する。 2. 粉末状にしたサンプルを、20～100mgを1.5ml遠心チューブに移す。 3. 600μlの氷冷した1-thioglycerol/Homogenization Solutionを加え、十分にボルテックスする。 4. 先切りしたチップを用いて、400μlのライセートを新しい1.5ml遠心チューブに移す。 ※ ライセートを保存する場合には、この時点で-70℃保存する。 5. 200μlのLysis Bufferを添加し、15秒間ボルテックスする。 6. 室温で10分間のインキュベーションを行う。 7. 14,000✕g、2分間の遠心を行う。 Note: ステップ4において、先切りしたチップがない場合には、先に遠心(14,000✕g、2分間)を行った後に、 400μlのライセートを新しい1.5ml遠心チューブに移してもよい。 pg. 2 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 カートリッジの準備 1. 検体数分のカートリッジをMaxwell® RSC/CSC Deck Trayに立て、順にそのアルミシールを剥がす。 カートリッジの両端がカチッというまで、しっかりとセットする 注意：サンプル数が16より少ない場合には、Maxwell® RSC/CSC Deck Trayの中央部分をお使いください。 2. 同数のElution Tubeをセットし、50μlのNuclease-Free Waterを加える。 Nuclease-Free Waterは30～100μlを加えることができます。ただし、30μの場合、磁性ビーズの持ち込みの割 合が高くなることが予想されるため、標準として50μl Nuclease-Free Waterでの溶出をお勧めします。 また、Elution Tubeのフタは絶対に閉めないでください。 3. カートリッジのウエル8に、プランジャーを置く。 4. 5μlのDNase I 溶液をカートリッジのウエル4(黄色い試薬の入ったウェル)に添 加する。 DNase I溶液は、粘性があり、壁面に沿って自然に液中に落下しないので、ウエル 4内の液に直接加えてください。 5. 約600μlのライセート全部をカートリッジのウェル1に添加する。 ウェル1は最も大きなウエルです。カートリッジラベルに一番近く、Elution tubeからは最も遠い位置です。 6. Maxwell RSC Instrumentを起動し、Startに続いて、『Plant RNA／AS1500』を選択する。 7. Maxwell® RSC/CSC Deck Trayを、Maxwell® RSC本体にセットし、精製操作をスタートする。 製終了後の操作 1. Maxwell RSC® Instrumentのドアを開け、Elution Tubeのフタを閉める。 2. Maxwell® RSC/CSC Deck Trayを取り出し、Elution Tubeを適切に保管する。 3. Maxwell RSC® Instrumentのドアを閉める。カートリッジとプランジャーを廃棄する。