Maxwell® RSC RNA FFPE Kit

技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 2017/Nov/07 Maxwell® RSC RNA FFPE Kit (カタログ番号 AS1440) 簡易マニュアル ご用意いただくもの ● サンプルチューブ (1.5ml遠心チューブ) ● 80℃設定のヒートブロック ● 56℃設定のヒートブロック ● ボルテックスミキサー ● ピペットマン(P-20、P-200、P-1000)とそれらのピペットチップ 試薬の準備 DNase I 1. 凍結乾燥品のDNase Iのバイアルに、275μlのNuclease-Free Waterを添加する。蓋をしてバイアルをおだやか に転倒混和し、内側に付着しているDNase Iもリンスします。ボルテックスはしないでください。 2. 使用後のDNase I溶液は、1回の実験で使用する分量に分注し、-20℃で保存してください。 凍結融解は3回以上行わないで下さい。-20℃で6か月は保存できます。 FFPE切片の準備 1. FFPE切片をサンプルチューブに移す。  スライドガラスに貼り付けている切片を利用する場合には、スライドガラスから清浄なカミソリでそぎ落と してください。切片は、タッピングや遠心によりサンプルチューブの底に落としてください。  組織切片は、トータルで2mm3まで(5~10μm厚で、20~200mm2のサイズ)を使うことができます。 2. 300μlのミネラルオイルを加え、10秒間のボルテックスで十分に撹拌する。 3. 80℃で2分間のインキュベーションする。その後、室温に戻す。この間に、手順4のmaster mixを調製する。 4. Lysis Buffer、Proteinase K、Blue Dyeを下表のよう調製し、master mixを作製する。 ※ master mixは調製後1時間以内にお使いください。取り置きはしないでください。 試薬 1サンプル サンプル数 合計 Lysis Buffer 224 μl n +2 224 x (n + 2) μl Proteinase K 25 μl n +2 25 x (n + 2) μl Blue Dye 1 μl n +2 1 x (n + 2) μl 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 2017/Nov/07 5. 室温に戻したサンプルに、250μlのmaster mixを加え、5秒間のボルテックスで十分に撹拌する。 6. 層の分離のため、10,000×g、20秒間の遠心を行う。  水層(青色の下層部分)にペレットが確認できる場合、ペレットを懸濁するために、水層をピペットでおだやか に撹拌してください。 7. サンプルチューブを56℃のヒーティングブロックに移し、15分間のインキュベーションを行う。 8. サンプルチューブを80℃のヒーティングブロックに移し、1時間のインキュベーションを行う。 9. サンプルをヒーティングブロックから取り出し、室温で15分間放置し、十分に冷ます。 10. 下表のように、DNaseカクテルを調製する。 試薬 1サンプル サンプル数 合計 MnCl2, 0.09M 26 μl n +2 26 x (n + 2) μl DNase Buffer 14 μl n +2 14 x (n + 2) μl DNase I 10 μl n +2 10 x (n + 2) μl 11. 水層(青色)の部分に、50μlのDNaseカクテルを加え、10回のピペッティングでよく撹拌する。 12. 室温(15~30℃)で15分間のインキュベーションを行う。 13. 最高スピードで2分間の遠心を行う。 14. 水層(青色)の部分を迅速に、Maxwell RSCのカートリッジのウエル #1に移す。  RNA抽出が困難なサンプル(例：皮膚など)では、サンプルをカートリッジのウエル#1に入れた後、そのまま 5分間のインキュベーションにより収量が増加することがあります。 カートリッジの準備 1. 検体数分のカートリッジをMaxwell® RSC/CSC Deck Tray に立て、順にそのアルミシールを剥がす。カートリ ッジの両端がカチッというまで、しっかりとセットする  カートリッジの側部に鋭利な箇所がありますので、取扱いには十分ご注意ください。  サンプル数が16以下の場合、Maxwell® RSC/CSC Deck Trayの中央部分をお使いください。 2. 同数のElution Tubeをセットし、50μlのNuclease-Free Waterを加える。  Elution Tubeを差し込む穴は、固定するため、挿入には少し押さえる必要があります。Elution Tubeは一番下 までグッと強く押し込んでください。 また、Elution Tubeのフタは絶対に閉めないでください。 3. カートリッジのウエル8に、プランジャーを置く。 4. (前章の手順14) 水層(青色)の部分を迅速に、Maxwell RSC のカートリッジのウエル #1に移す。 ウェル1は最も大きなウエルです。カートリッジラベルに一番 近く、Elution tubeからは最も遠い位置にあります。 5. Maxwell® RSC/CSC Deck TrayをMaxwell® RSC Instrument本体にセットし、精製操作をスタート。