Maxwell TM 16 Polyhistidine Protein Purification Kit Protocol

作成日： 注意： この日本語マニュアルは製品に添付される英文マニュアルを翻訳したもの ですが、常に更新されるものではありません。最新の英文マニュアルについ ては以下のサイトよりご覧ください。 ・・ Hisタグ Hisタグ Hisタグ Hisタグ Maxwell™16 Pol庫istidine P『otein Pu『ificationKit Protocol INSlRUCTIONS FOR USE OF PROOUCTS応1⑮ PROTOCOL Maxwell111 16 lnstrument(AS1000) とMaxwell111 16 Polyhistidine Protein Purification Kit(AS1060)を用いた］］タグ あるいはHQ タグタンパク質自動精製におけるサンプル調製では、サンプルの種類や量によって、次の点にご注意ください。 詳しいプロトコールの内容は、製品プロトコールTM285 をご参照ください。 表1 このシステムを用いて精製したあるいは HQ タグタンパク質の収量 サンプルの種類サンプル量収量 バクテリア培養液 哺乳類培養細胞 昆虫培養細胞 20 O.D,600 sx 106 個 5×106 個 300ｵg SOｵg SOｵg 表2 最大サンプル処理量 サンプルの種類 バクテリア培養液 哺乳類培養細胞 昆虫培養細胞 哺乳類および 昆虫培養細胞上清 処理能力 20 O.D.500 ※ 1 5×106 個まで※ 1, 2 5x 106 個まで※ 1, 2 1m| ※ 2 ※ 1 : ~4 O.D.500 のバクテリア培養液および2×106 個以上の細胞 は、サンプルの粘性を低下させるためDNase I を加える。 サンプルの調製 ※2: 血清を含む培養細胞および培養上清は、非特異的な吸着を減 らすため、wash buffer に200-SOOmM NaCl を加える。 あるいはHQ タグタンパク質を発現するバクテリア培養液は、0.D.6Oo が0.4-0.6 の時期にIPTG （終濃度1mM) を添加して、 発現誘導を行い、37℃で3 時間あるいは25℃で一晩培養する。培地をブランクとして、培養液の吸光値を測定し、サンプルとする。 注意：バクテリア培養液および培養細胞は、細胞をそのままwell #1 に加えるよりも、遠心操作によりペレットにし100mM HEPES (pH 7.5)で再懸濁 した方が精製度および収量ともに良くなる場合あります。 注意：バクテリア培養液は、目的タンパク質を十分にフォールディングさせるために培養終了後、4 ℃で3-16 時間さらにインキュベーションすること で、より効率よく精製できるかもしれません。 ＜庫タグタンパク質の精製＞ バクテリア培養液 標準的なバクテリア培養(O.D.soo く4 の培養液） 0.D.6oo<4 の培養液の1m| 、または、1ml の培養液を遠心操作によりペレットにし、100mM HEPES (pH 7.5)で再懸濁したものをサ ンプルとして、Maxwell 16 カートリッジのwell #1 に加える。 注意： plysS やplysE を含む細菌株の場合、O.D.500 く4 であっても、Dnase 処理が必要になるかもしれません。 高密度に培養したバクテリア培養(O.D.600 こ4 の培養液） 培養液の1m| 、または遠心後に100mM HEPES (pH 7.5)でペレットを再懸濁したものをMaxwell16 カートリッジのwell #1 に加え、 さらに10-50μg/ml DNase (2-10μ1 の5mg/ml DNase I)を加える。 注意： 1 個のカートリッジにつき、20 O.D.500 まで処理できます。 哺乳類培養細胞および昆虫培養細胞 5x106 個までの培養細胞をMaxwell 16 カートリッジのwell#1 に加える。また、血清に由来するバックグラウンドを減らすため、well#3 ~#6 に含まれるwash buffer に200-500mM NaCl (40-100μ1 の5M NaCl)を加える。 注意： 2x1Q6 個以上の細胞をサンプルとする場合には、サンプル1ml あたり2-10μ1 の5mg/ml DNase I を加える。 哺乳類および昆虫細胞培養上清 培養上清1ml をサンプルとして、Maxwell 16 カートリッジのwell #1 に加える。また、血清に由来するバックグラウンドを減らすため、 well #3~#6 に含まれるwash buffer に200-500mM NaCl (40-100μ1 の5M NaC|)を加える。 < HQタグタンパク質の精製＞ バクテリア培養液 0.D. 600 こ4 の場合には、サンプルの粘性を低下させるため2-10μ1 の5mg/ml DNase I を加える。バックグラウンドを減らし、HQ タグ タンパク質の精製度を高めるため、well #1 に含まれるサンプルおよびwell #3~#6 に含まれるwash buffer に200-SOOmM NaCl (40-100μ1 のSM NaCl)を加える。 注意： 1 個のカートリッジにつき、200.D.6oo まで処理できます。.' ' 0 " 技術的なお問合せは： Revised 7/0 6 e-mail:~ Tel: 03-3669-7980 Fax: 03-5614-6097 ・・ 溶出されたHis/HQ タグ タンパク質。 Maxwell™16 POIVhistidine P『otein Pu『ilicalionKil P『OTOCOL INS1RUCllONS FOR USE OF PRODUCTS応1⑱ PROTOCOL Maxwelln1 16 lnstrument(AS 1000) によるHisタグタンパク質精製 奥側 ＂冒厚＂＇ 畑曲 i.., ” 手前（ドア）側 1. カートリッジの密閉シーr-5 ルをはがす。 2. それぞれのカートリッ ジのウエル番号7 に プランジャーを挿入 し、ウエル番号1 に サンプルを加える。 注意：プランジャーの向きにご注意ください。 青色のElution Tube に300ul のMagneHisTM Elution Bufferを加える。 4. Maxwell 16 の電源を ON にし、Research Mode (Rsch) を確認す る。 5. "Run" を選択して、 【Run/Stop 】ボタンを押 す。 6. "Protein’' を選択して、 【Run/Stop 】ボタンを押 す。 技術的なお問合せは ---••••---I..~ 、•-一.... ...,.--- I ｷ .•一- 7. Protein のプロトコールが 選択されていることを確認 して、【Run/Stop 】ボタンを 押す。 8. ドアを開けて、【Run/Stop 】 ボタンを押す。 9. カートリッジをMaxwell 16 の トレイに移す。Elution Tube をMaxwell 16 のelution tube slot に差し込む。 10. 【Run/Stop 】ボタンを押し、 ドアを閉める。 11. Maxwell 16 が精製工程 を開始する。 I-ｷｷｷｷ.. - 鼻L.,. 直 12. 精製工程の終了後、ドアを開けて、ロッドにぶ ら下がっているプランジャーを落とす。 【Run/Stop】ボタンを押す。 13. Elution Tube をMagnetic Elution Tube Rack に移 し、 を保存容器に移す n゜- Revised 7/0 6 e-mail: ~a.com Tel: 03-3669-7980 Fax: 03-5614-6079