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Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System （細胞外検出システム）

1 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 テクニカルマニュアル Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System （細胞外検出システム） 使用説明書（対象製品：N2420、N2421、N2422） この日本語マニュアルは英文マニュアルを翻訳したものですが、常に更新されるものではありません。最新の英文マ ニュアルについては以下のサイトよりご覧ください。www.promega.jp/resources/protocols/ より資料番号“TM523” を検索ください。 本システムの使用に関するご質問は、プロメガテクニカルサービスまで E メールでお問い合わせください： prometec@jp.promega.com 2 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System 1. 製品説明 ···················································································································· 3 2. 製品コンポーネントおよび保存条件 ················································································· 5 3. Nano-Glo® HiBiT Extracellular Assay プロトコール ···························································· 7 3.A. Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System の概要 ········································7 3.B. Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent の調製·····················································7 3.C. 細胞への Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent の添加の一般的プロトコール··········8 3.D. 高速測定のための代替プロトコール ····································································9 4. 代表的データ ·············································································································· 10 5. 関連製品 ···················································································································· 16 6. 付録 ························································································································ 16 6.A. Nano-Glo® HiBiT Extracellular Assay の概要 ························································16 6.B. 目的のタンパク質への HiBiT の付加·····································································17 6.C. アッセイパフォーマンスに対する発現レベルの影響·················································22 6.D. HiBiT コンストラクトのトランスフェクション·······················································23 6.E. 培地除去と 1×Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent 添加の代替プロトコール········24 6.F. リアルタイム測定の代替プロトコール ···································································25 6.G. 細胞外 HiBiT シグナルと溶解 HiBiT シグナルの比較 ··············································26 6.H. 一般的なアッセイコンポーネントの影響 ·······························································29 6.I. アッセイ感度の最大化·························································································34 6.J. トラブルシューティング ·····················································································35 6.K. 参考文献··········································································································38 3 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 1．製品説明 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System(a,b,c) では、混ぜて測定するだけのシンプルなアッセイプロトコールを 用いて、細胞膜で発現あるいは細胞外培地へ分泌した HiBiT タグ付きタンパク質を高感度で定量することができます。 HiBiT は 11 アミノ酸で構成されるペプチドタグで、目的のタンパク質の N 末端または C 末端に融合させるか、タンパク 質内部のアクセス可能な位置に挿入します。細胞表面上あるいは分泌された HiBiT タグ付きタンパク質の量は、基質とな る furimazine（フリマジン）、および NanoLuc Binary Technology（NanoBiT®、1）で使用される 2 つのサブユニットの うち、大きいサブユニットである Large BiT（LgBiT、図 1）が含まれる細胞非溶解性検出試薬を添加して測定します。低 い親和性（KD＝190 μM）で LgBiT に結合する Small BiT（SmBiT、11 アミノ酸）とは異なり、HiBiT は LgBiT に強 く結合し（KD＝0.7 nM）、複合体の形成を促進して明るく光る発光酵素を生成します。Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent 添加後に発生した発光の量は、細胞外の培地に接触可能な HiBiT タグ付きタンパク質の量と 7 桁にわたり比例し ます（図 2）。 目的タンパク質は、HiBiT 発現ベクターを用いて N 末端または C 末端に HiBiT タグを付加することができます。また別 の方法として、標準的な方法で HiBiT タグを既存の発現ベクターに付加することもできます。さらに CRISPR/Cas9 のよ うなゲノム編集ツールを使って HiBiT タグを内在性ローカスに付加することもできます。この CRISPR/Cas9 システムで は、タグのサイズが小さいため一本鎖のドナーDNA を用いて効率的な挿入が可能であり、明るいシグナルにより内因性発 現レベルの少ないタンパク質でも定量が可能となります。 4 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 図 1．Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System パネル A：Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent を哺乳細胞に添加することで、非溶解性試薬に含まれる細胞非透過 性の LgBiT タンパク質を供給します。細胞外の培地に供給された LgBiT は HiBiT タグに結合し、細胞表面上あるいは分 泌された HiBiT タグ付きタンパク質の量に比例した光を生じます。パネル B：Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent は、非溶解性バッファーに LgBiT Protein および基質を添加して調製します。この調製した試薬を細胞に添加して 2～10 分後の発光をルミノメーターで測定します。 5 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 1．説明（続き） 図 2．精製済み HiBiT タグ付きタンパク質の定量 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent を表示量の精製済み HaloTag®-HiBiT タンパク質に添加し（4）、2 分後の発光 を測定しました。赤色の線はバックグラウンドを引いたデータのベストフィットラインで、少なくとも 7 桁のリニアダイ ナミックレンジを確認できます（r 2＝0.9982）。エラーバーは n＝4 の標準偏差を示しています。 2．製品コンポーネントおよび保存条件 製品 サイズ カタログ番号 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System 10ml N2420 各システムには試薬 10 mL を調製するのに十分な量のコンポーネントが含まれています。本システムには 以下のコンポーネントが含まれます： • 10ml Nano-Glo® HiBiT Extracellular Buffer • 0.2ml Nano-Glo® HiBiT Extracellular Substrate • 0.1ml LgBiT Protein 製品 サイズ カタログ番号 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System 100ml N2421 各システムには試薬 100 mL を調製するのに十分な量のコンポーネントが含まれています。本システムに は以下のコンポーネントが含まれます： • 100ml Nano-Glo® HiBiT Extracellular Buffer • 2 × 1ml Nano-Glo® HiBiT Extracellular Substrate • 1ml LgBiT Protein 6 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 製品 サイズ カタログ番号 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System 10 × 100ml N2422 各システムには試薬 1,000 mL を調製するのに十分な量のコンポーネントが含まれています。本システム には以下のコンポーネントが含まれます： • 10 × 100ml Nano-Glo® HiBiT Extracellular Buffer • 5 × 4ml Nano-Glo® HiBiT Extracellular Substrate • 10 × 1ml LgBiT Protein 保存条件：Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System のコンポーネントは－20°C で保存してください。25°C 以 上で解凍してはいけません。Nano-Glo® HiBiT Extracellular Buffer は室温で 1 年間保存できます。Nano-Glo® HiBiT Extracellular Substrate および LgBiT Protein は－20°C で凍結しません。 関連製品 製品 サイズ カタログ番号 Nano-Glo® HiBiT Blotting System 100ml N2410 Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System 10ml 100ml 10 × 100ml N3030 N3040 N3050 HiBiT Control Protein 100μl N3010 HiBiT クローニングベクター ベクター名 クローニング フォーマット タグ オリエンテーション カタログ番号 pBiT3.1-N [CMV/HiBiT/Blast] MCS HiBiT-POI N2361 pBiT3.1-C [CMV/HiBiT/Blast] MCS POI-HiBiT N2371 pBiT3.1-secN [CMV/HiBiT/Blast] MCS IL6-HiBiT-POI N2381 pFC37K HiBiT CMV-neo Flexi® Vector Flexi POI-HiBiT N2391 pFN38K HiBiT CMV-neo Flexi® Vector Flexi HiBiT-POI N2401 pFN39K secHiBiT CMV-neo Flexi® Vector Flexi IL6-HiBiT-POI N2411 7 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 3．Nano-Glo® HiBiT Extracellular Assay プロトコール 3.A．Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System の概要 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System は、細胞外の培地に接触した HiBiT タグを定量します。このアッセイ では一般的に使用される細胞培養培地に 0～10%の血清を添加したものを使用することができ、DMEM、RPMI 1640、 McCoy’s 5A、MEMα、Opti-MEM® I、F-12、および CO2非依存培地で検証済みです。試薬は 22°C におけるシグナル半 減期が 60 分を上回るように処方されていますが、培地と血清の組み合わせが変わるとバックグラウンド、シグナル、また はシグナル減衰速度に影響を及ぼす可能性があります（セクション6Hを参照）。Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System に関する追加情報はセクション 6 でご確認いただけます。 低い光量で直線性のあるアッセイパフォーマンスを達成するためには、すべての測定値からバックグラウンド発光を引く 必要があります。一般的にバックグラウンド発光には以下の 2 つの主な発生源があります：1）furimazine 基質の自家発 光および LgBiT タンパク質と関連する低レベル活性に由来する試薬バックグラウンド、および 2）ルミノメーター由来の 機器バックグラウンド。試薬バックグラウンドは培地の種類により異なり、血清と細胞のいずれによっても上昇します（セ クション 6.H を参照）。したがって、存在量の少ないタンパク質の測定で最大限の正確さを達成するためには、同じ培地を 用いた非トランスフェクション細胞またはモックトランスフェクション細胞のサンプルを含めてアッセイバックグラウン ドを測定します。感度を最大限に高めるには、アッセイ前に培地を交換して血清量を減らします（セクション 6.I を参照）。 ウェル間のクロストークと放射光の吸収を最小限に抑えるために白色の組織培養プレートを使用します。使用するプレー トは発光測定装置に対応していることを確認してください。 3.B．Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent の調製 目的の実験を実施するのに必要な Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent の量を計算します。これは通常、ウェルに入 れる培地の総量と同量に、分注作業に要する余剰分を足した量となります。未使用のチューブに入れた適量の Nano-Glo® HiBiT Extracellular Buffer（室温）で LgBiT Protein を 1：100、Nano-Glo® HiBiT Extracellular Substrate を 1:50 に 希釈し、転倒混和します。 例えば、4 mL の Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent が必要な場合、4 mL の Nano-Glo® HiBiT Extracellular Buffer を 15 mL の遠心チューブに移し、40 μL の LgBiT Protein および 80 μL の Nano-Glo® HiBiT Extracellular Substrate を添加します。 8 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 備考： 1． LgBiT Protein の原液には、－20°C での凍結を防ぐためにグリセロールが添加されています。この溶液は粘度がある ためピペッティングが難しいことがあります。ゆっくりとピペッティングし、ピペットチップの外側に余分な溶液が 付着しないようにしてください。可能であればポジティブディスプレイスメント式ピペットを使用してください。 2． Nano-Glo® HiBiT Extracellular Substrate や LgBiT Protein がキャップやチューブの側面に溜まっている場合には、 チューブを軽くマイクロ遠心機にかけます。 3． Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent は使用するたびに新たに調製することをおすすめします。調製後は活性が 室温において 8 時間で約 15%、24 時間では約 60%低下します。未使用の調製後試薬は後で使用するために－80°C、 －20°C、または 4°C で保存できますが、調製直後の試薬と比べると性能は幾分低下します。4°C で保存する場合、調 製済み試薬は 24 時間での活性の低下が 20%未満となります。 3.C．細胞への Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent の添加の一般的プロトコール 1． セクション 3.B.の手順に従って Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent を調製します。 2． HiBiT タグ付きタンパク質を発現している哺乳類細胞が入ったプレートを 37°C のインキュベーターから取り出しま す。 オプション：温度差により引き起こされるウェル間のばらつきを最小限に抑えるために、プレートを室温に平衡化し ます（例えば、金属ブロック上に 5 分間置いておく）。 3． 各ウェルに入っている培養培地と同量の Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent を加え、混和させます。例えば、 100 μL の細胞培養培地に対して 100 μL の Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent を加えます。 備考：サンプルはゆっくりとピペッティングして混和させるか、プレートをオービタルシェーカー（300～500 rpm） に置いて 3～10 分混和させます。 4． 試薬添加 10 分後の発光を測定します。HiBiT タグをタンパク質配列中に挿入する場合、タンパク質末端にタグ付け する場合と比べて必要なインキュベーション時間が長くなる可能性があります。お使いの装置に固有の設定を用いて 発光を測定します。GloMax®装置で 96 ウェルプレートを使用する場合、測定時間（integration time）は 0.5～2 秒が 推奨されます。測定時間を延長すると、発現レベルが低い場合のデータクオリティが改善される可能性があります。 発光強度は、条件に左右されますが一般的には、十分に混和させたサンプルではシグナル半減期が 1～2.5 時間で減衰 します（図 8 のパネル B、図 9 のパネル B、および図 10 のパネル B を参照）。 9 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 備考： 1． 発光がサンプルに含まれる HiBiT タグ付きタンパク質の量と比例するためにアッセイバックグラウンドを引きます が、これは特に微量なタンパク質の測定で重要です。バックグラウンドコントロールとして非トランスフェクション 細胞またはモックトランスフェクション細胞を実験に含めます（セクション 6.I を参照）。 2． HiBiT が細胞外表面ループなどのタンパク質内部に位置する場合、LgBiT と HiBiT の平衡化に時間がかかることが あります。これを補うために、必要に応じて試薬インキュベーション時間を延長します。 3.D．高速測定のための代替プロトコール 本プロトコールでは、付着細胞の表面にある HiBiT タグを迅速に定量できます。細胞の生物学的状態が急速に変化してい る場合（細胞表面受容体のアゴニスト誘導性インターナリゼーションなど）に有用です。 1． HiBiT タグ付きタンパク質を発現している哺乳動物細胞が入ったプレートを 37°C のインキュベーターから取り出し ます。 2． 直ちに各ウェルに入っている培養培地と同量の Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent（室温）をゆっくりと分注 します（混ぜないでください）。HiBiT タグ付きタンパク質が LgBiT Protein および furimazine 基質と迅速に平衡化 されるようにするため、試薬は細胞培養培地よりもわずかに密度が高くなっています。以下の手順に従って室温また は 37°C のルミノメーター中でインキュベートします。 a． 室温ルミノメーターの場合：室温の試薬を添加後、発光測定までプレートは室温でインキュベートします。プレ ートは室温ルミノメーターの内部または外部（金属ブロックの上など）に置いて、すべてのサンプルを同じ温度 に平衡化し、温度勾配によるウェル間のばらつきを低減します。 b． 37°C ルミノメーターの場合：別の方法として、プレートを 37°C ルミノメーターに置いて細胞を 37°C に維持す ることもできます。試薬添加後、直ちにプレートをルミノメーター内に置き、発光測定までインキュベートしま す。プレートは試薬添加後に 37°C のインキュベーター内でインキュベートした後、ルミノメーターに移動する こともできます。プレート取り扱い中の温度変動を予防するために、96 ウェルプレートの内側の 60 ウェルのみ を使用することをおすすめします。37°C のインキュベーターから取り出したときにサンプル温度を維持できるよ うにするため、細胞をプレーティングする間、外側の空のウェルと内部の空いているウェルに 150 μL の滅菌バ ッファーをピペットで満たします。分注直前に試薬を 37°C に温めることは通常は不要であり、温めることで試 薬安定性に悪影響を及ぼすことになります。 3． 試薬添加 2～10 分後に発光を測定します。一般的に、反復実験間でのウェル間のばらつきを抑えて最大限の発光を得 るには 4 分間のインキュベーションで十分です。お使いの装置に固有の設定を用いて発光を測定します。GloMax®装 置で 96 ウェルプレートを使用する場合、測定時間（integration time）は 0.5～2 秒が推奨されます。短い測定時間で はプレートをより迅速に測定することにより、状態が急激に変化する実験系におけるプレート全体のばらつきが低減 する可能性があり、長い測定時間では低レベルの発現におけるデータクオリティが改善される可能性があります。 10 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 備考： 1． 十分に混和されたサンプルの発光強度はシグナル半減期が 1～2.5 時間となりますが、上記のように試薬をゆっくり と添加して混和させない場合はシグナル強度の変化がより急激になります。本プロトコールでは、シグナルは一般的 に試薬添加から 4 分後に最大になりますが、その後サンプルが混ざっていくに伴ってより急速に減衰し、シグナル半 減期が約 30 分になります。このような理由から、プレート上の最初の測定と最後の測定の間に発生するシグナル減 衰により引き起こされるばらつきを低減するために、測定時間を短縮してプレート全体の測定にかかる時間を最短に することをおすすめします。 2． 細胞表面の発現変化を評価する際、融合パートナーを伴う LgBiT/HiBiT 複合体のインターナリゼーションは一般的 にほとんど問題になりません。本プロトコールで使用される短いインキュベーション時間では LgBiT のインターナ リゼーションが最小限に抑えられます。さらに、インターナライズした LgBiT/HiBiT 複合体は細胞表面複合体より も大幅に活性が低下していることが多く、これは細胞表面のタンパク質と比べてエンドソームでは利用可能な基質が 少なくなっていることが原因であると考えられます。 4．代表的データ アゴニストによる刺激後のβ2 アドレナリン受容体インターナリゼーションのモニタリング β2 アドレナリン受容体（β2AR）は 7 回膜貫通型の G タンパク質共役型受容体（GPCR）であり、アドレナリンおよび 合成アゴニストが結合して生物体におけるさまざまな生理学的反応を引き起こします。アゴニストの結合により促進性 G タンパク質（Gs）の活性化が引き起こされ、細胞内 cAMP の増加とプロテインキナーゼ A の活性化が促進されます。シ グナルは下流ターゲットのリン酸化反応を介して伝播し、受容体のリン酸化がβアレスチン 2 のリクルートメントを引き 起こします。βアレスチン 2 の結合により受容体は G タンパク質から脱共役し、クラスリン媒介エンドサイトーシスが促 進され、その後ほとんどの受容体は迅速に細胞膜へとリサイクルされます。 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System では、GPCR の活性化およびインターナリゼーションを定量化できま す。β2AR をモデルシステムとして使用して、完全アゴニストおよび部分アゴニストのパネルによる処理後に内在性 HiBiT-β2AR および過剰発現した HiBiT-β2AR をモニタリングしました。HiBiT はリンカーなし、または 10 アミノ酸 の Gly/Ser 配列を結合した状態で開始メチオニンの後に挿入しました（図 3）。さまざまな発現レベルを達成するためにさ まざまな量のプラスミド DNA をトランスフェクションし、これらの条件を安定発現および内在性遺伝子座からの発現と 比較しました。内因性発現については、CRISPR/Cas9 遺伝子編集アプローチを用いて迅速に細胞プールを作成し（5）、そ の後個々のクローンを単離しました。 予測どおり、β2AR の既知のアゴニストは受容体インターナリゼーションを促進し、その作用強度の順位には予測どおり の差がありました。また、部分アゴニストであるサルブタモールおよびサルメテロールではインターナリゼーションの程 度において予想された低減が確認されました（7）。これらの実験は、アゴニスト処理済み細胞を 37°C、5% CO2のインキ ュベーターから取り出してから 5 分以内に実施しました。内因性発現、安定発現、および少量 DNA の一過性トランスフ ェクションでは、多量の DNA をトランスフェクションしたものと比べて大きな応答（fold response）が得られました（セ クション 6.C）。一般的に、発現レベルが低い方が受容体インターナリゼーション実験に適しています。 11 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 4．代表的データ（続き） 図 3．アゴニストによる刺激後の HiBiT-β2AR のインターナリゼーション パネル A：安定トランスフェクションした HEK293 細胞のプールは、CMV プロモーターより HiBiT-GGSGGGGSGG-β 2AR を発現するコンストラクトを用いて作製しました。細胞はさまざまなリガンドの滴定で 30 分間処理した後、NanoGlo® HiBiT Extracellular Reagent を各ウェルに添加し、セクション 3.D のプロトコールに従って 4 分後に発光を測定し ました。バックグラウンドを引いた発光値は無処理細胞に対して補正しました。パネル B：HEK293 細胞は、キャリア DNA で希釈した CMV HiBiT-β2AR 発現コンストラクトをさまざまな量で一過性トランスフェクションしました。これらの細 胞をパネル A の安定トランスフェクションしたプールおよび内在性遺伝子座から HiBiT-β2AR を発現する HEK293 クロ ーンと比較しました。細胞は 96 ウェルプレートにプレーティングし、翌日、イソプロテレノールの滴定で 30 分間処理し ました。Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent をすべてのウェルに添加し、4 分後にセクション 3.D のプロトコール を用いて発光を測定しました。バックグラウンドを引いた発光値をプロットしてさまざまな発現レベルを明らかにしまし た。パネル C：パネル B の実験の発光を補正したものをイソプロテレノール無添加のコントロールに対してプロットしま した。エラーバーは n＝6 の標準偏差を表しています。 12 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 アゴニストによる刺激後の上皮増殖因子受容体インターナリゼーションのモニタリング 上皮増殖因子受容体（EGFR）は、EGF ファミリーの増殖因子が結合する受容体型チロシンキナーゼ（RTK）です。アゴ ニストの結合は受容体自己リン酸化および SH2 ドメインを持つアダプタータンパク質のリクルートメントを引き起こし、 その結果、下流のシグナル伝達経路が活性化されます。活性化した受容体はクラスリン媒介エンドサイトーシスを経て、 その後細胞膜へとリサイクリングされるか、後期エンドソーム／リソソームの中で分解されます。 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System では、RTK の活性化およびインターナリゼーションを定量化できま す。例として、EGFR をモデルシステムとして用いて、EGF 処理後に内在性 HiBiT-EGFR および過剰発現した HiBiTEGFR のインターナリゼーションをモニタリングしました。HiBiT タグはネイティブシグナルペプチドと成熟 EGFR と の間に挿入しましたが、場合によってはネイティブシグナルペプチドと IL-6 シグナルペプチドを置き変えました。一部の クローンでは、短い Gly/Ser リンカーで HiBiT と成熟 EGFR を融合させました。CMV または HSV-TK をプロモーター とする発現コンストラクトはキャリア DNA で希釈して、細胞にトランスフェクションする際に発現レベルを低下させま した。得られた結果は CRISPR/Cas9 遺伝子編集アプローチを用いて内在性遺伝子座からの HiBiT-EGFR の発現と比較し て、迅速に細胞プールを作製しました（5）。 予測どおり、EGF は HiBiT-EGFR の受容体インターナリゼーションを促進しました（図 4）。これらの測定は、アゴニス ト処理済み細胞を 37°C、5% CO2 のインキュベーターから取り出してから 5 分以内に実施しました。細胞表面での発現に おける最大の倍率低下は内因性発現を用いた場合に確認され、発光は 10 倍以上減少しました。 13 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 4．代表的データ（続き） 図 4．EGF 刺激後の HiBiT-EGFR のインターナリゼーション パネル A：HeLa 細胞はキャリア DNA で希釈した CMV プロモーターを持つ発現コンストラクト（0.005 ng／ウェル）または HSV-TK プロモーターを持つ発現コンストラクト（0.05 ng／ウェル）で一過性トランスフェクションしました。一過性トラン スフェクションは CRISPR 由来の細胞プールを用いた内在性遺伝子座からの発現と比較しました。発現コンストラクトでは、 HiBiT タグはネイティブシグナル配列の直後に挿入するか、ネイティブシグナル配列と IL-6 シグナル配列および HiBiT と置 き換えました。細胞は 96 ウェルプレートにプレーティングし、翌日、EGF の滴定で 30 分間処理しました。Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent をすべてのウェルに添加し、4 分後にセクション 3.D のプロトコールを用いて発光を測定しました。バ ックグラウンドを引いた発光をプロットし、上記 4 条件下での平均発現レベルはほぼ同じであることが確認されました。パネ ル B：パネル A の実験で得られた発光を補正し、EGF 無添加のコントロールに対してプロットしました。トランスフェクショ ンで使用したプラスミドコンストラクトは一過性 CMV、IL-6 シグナル＝CMV/IL6-HiBiT-GSSG-EGFR (25–1210)、一過性 CMV、ネイティブシグナル＝CMV/EGFR(1–24)-HiBiT-GSSG-EGFR (25–1210)、および一過性 TK、IL-6 シグナル＝HSVTK/IL6-HiBiT-GSSGEGFR (25–1210)。エラーバーは n＝6 の標準偏差を表しています。 PCSK9-HiBiT の分泌 プロタンパク質転換酵素サブチリシン・ケキシン 9 型（PCSK9）は、小胞体において自己タンパク質分解プロセシングを 経た後、細胞膜へと運ばれ分泌されます。分泌された PCSK9 は LDL 受容体の分解を促進し、PCSK9 の機能喪失型変異 は冠動脈疾患からの防御と関連しています。例えば、C679X 変異は、タンパク質分解活性を低下させずに分泌を阻害する ミスフォールディングを引き起こします（2）。一方、プロテアーゼドメインの触媒ヒスチジンで H226A の変異を発生さ 14 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 せると、自己タンパク質分解が妨げられ、タンパク質分泌が阻害されます（6）。 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System は、細胞から培地を除去するなどの複数のステップが不要で、HiBiT タグを付けた目的のタンパク質の分泌を数分以内に定量できるため、分泌タンパク質の発現、プロセシング、または輸送 を変化させる化合物のハイスループットスクリーニングに最適です。さらに、Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System を用いれば目的タンパク質の総量を平行して測定することができるためタンパク質発現の変化をタンパク質輸送の変化と 区別することが可能になります。 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System を用いて培地に分泌された PCSK9-HiBiT の量をモニタリングし、 Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System を用いて総タンパク質レベルを経時的に評価しました。野生型タンパク質を分 泌不全の変異型および分泌を阻害するためにブレフェルジン A（BFA）処理した変異型と比較しました。HEK293 細胞は、 バルクで CMV プロモーターを持つ発現コンストラクトを一過性トランスフェクションしました。その翌日、細胞を解離 させ、再懸濁し、BFA または溶媒コントロールで迅速に処理するためにプレーティングしました。時間ゼロにおいて、細 胞溶解アッセイでは PCSK9 のすべての型で目的タンパク質総量のレベル（細胞内外の和）がほぼ同じであることが確認 されたにもかかわらず、PCSK9 の変異型ではアッセイバックグラウンドレベルに近い細胞外発光シグナルを生成してお り、野生型タンパク質では、バックグラウンドをはるかに上回る発光シグナルが確認されました。これは、培地交換や細 胞洗浄では細胞外 HiBiT シグナルがすべて除去されるわけではないという一般的な観察結果を示しています。このシグナ ルは損傷細胞や細胞片に含まれるタンパク質、細胞の外側に結合したタンパク質、または残留する培地に含まれるタンパ ク質により引き起こされている可能性があります。HiBiT タグ付きタンパク質の分泌速度またはその程度の差を測定する 実験の場合、誘導性発現系は細胞処理前に細胞外での蓄積を低減させることでこのようなタンパク質バックグラウンドを 低下させるために有用である可能性があります。 図 5 で分かるように、野生型 PCSK9 からの細胞外シグナルは、タンパク質の発現と分泌に伴って経時的に徐々に増加し ています。しかしながら、BFA 処理は、溶解アッセイで測定されたようにタンパク質発現にほとんど影響を与えずにタン パク質の分泌を効果的に阻害しています。同様に、このタンパク質の変異型では実験の間に細胞外シグナルの蓄積がほと んど確認されません。変異型タンパク質の総量は経時的にほとんど変化しませんが、これは細胞内のタンパク質レベルが 実験開始時にすでにほぼ定常状態レベルに達していたためであったと考えられます。 15 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 4．代表的データ（続き） 図 5．PCSK9-HiBiT 分泌に対するブレフェルジン A または変異の影響 HEK293 細胞は、野生型配列または分泌を阻害してタンパク質の小胞体への蓄積を引き起こす変異（H226A または C679X） を持つ CMV/PCSK9-HiBiT 発現コンストラクトで一過性トランスフェクションしました。トランスフェクション細胞は 解離、洗浄し、培地に再懸濁してプレーティングした後、直ちに時間ゼロにおいて溶媒コントロールまたは分泌を阻害す るための 1 μM のブレフェルジン A（BFA）で処理しました。プレーティングと処理後のさまざまな時点において、複製 プレートを 37°C インキュベーターから取り出し、Nano-Glo® HiBiT Extracellular または Lytic Reagent を各ウェルに添 加しました。セクション 3.D のプロトコールに従って 10 分後に発光を測定しました。パネル A：Nano-Glo® HiBiT Extracellular Assay で得られた未処理の発光は、野生型 PCSK9 ではタンパク質の発現および分泌に伴い経時的に増加し ましたが、BFA が効果的に分泌を阻害しました。変異型タンパク質はいずれも細胞外タンパク質のレベルが非常に低く、 試薬バックグラウンドとほぼ同じでした。パネル B：Nano-Glo® HiBiT Lytic Assay で得られた未処理の発光から、BFA が野生型 PCSK9 のタンパク質発現は阻害せず、分泌のみを阻害することが確認できます。時間ゼロにおいて、PCSK9 の 変異型は野生型 PCSK9 レベルとほぼ同じレベルで存在していますが、総タンパク質量は実験の間ほとんど変化していま せん。パネル C：バックグラウンドを引いた細胞外シグナル（Nano-Glo® HiBiT Extracellular Assay で得られたシグナ ル）と溶解シグナル（Nano-Glo® HiBiT Lytic Assay で得られたシグナル）の比は、野生型 PCSK9 では最初は増加します が、2 時間後、ほぼすべてのタンパク質が細胞外にあり、比較的一定した高い値となります。同様に、このタンパク質の変 異型は時間が経っても細胞内にとどまるため、シグナル比は低いレベルで比較的一定のままです。野生型 PCSK9 を BFA 処理することで細胞内タンパク質の蓄積が増加するため、シグナル比は変異型に近い値になるまで経時的に低下し続けま す。エラーバーは n＝6 の標準偏差を表しています。 16 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 5．関連製品 6．付録 6.A．Nano-Glo® HiBiT Extracellular Assay の概要 膜タンパク質の細胞表面発現における変化は、生物学的調節機構および環境変化に対する細胞応答において大きな役割を 果たします。しかしながら、細胞膜におけるタンパク質の量を細胞内に貯蔵されているものと区別して正確に定量するこ とは困難です。細胞表面発現の変化をモニタリングする際に一般的に使用されるアプローチは細胞ベースの ELISA です が、これは細胞の固定、そして抗体結合や洗浄などの複数のステップを必要とする労力のかかる手順であり、ウェル間の ばらつきが大きくなり、スループットが低下します。さらに、このプロセスでは内因性発現レベルでタンパク質を検出す るための高品質の抗体が必要です。 11 のアミノ酸で構成される High BiT（HiBiT）ペプチドタグは一般的に使用されているエピトープタグに匹敵します。細 胞非透過性 Large BiT（LgBiT、17.6 kDa）と併用することで、細胞表面発現あるいは分泌した HiBiT タグ付きタンパク 質は 7 桁のリニアダイナミックレンジにわたり高感度で定量されます（図 2）。細胞ベースの ELISA と対照的に、NanoGlo® HiBiT Extracellular Assay ではハイスループットスクリーニングに適したシンプルなアッセイプロトコールを用い て内因性発現レベルの HiBiT タグ付きタンパク質を 5 分以内で定量できます。 ルシフェラーゼは、幅広いダイナミックレンジと高い感度を持つため、遺伝子発現レベルとタンパク質レベルのモニタリ ングで広く使用されています。NanoLuc®ルシフェラーゼは、他のレポータータンパク質よりもさらに明るく、汎用性を高 めるために開発された 19.1 kDa の改変酵素です（3）。NanoLuc®ルシフェラーゼはその後、Nano-Glo® Binary Technology （NanoBiT®）と呼ばれる 2 つの分子を用いた構造的相補システムの基盤として使用されました。このシステムにおいて、 LgBiT サブユニットは単独ではほとんど活性がありませんが、11 アミノ酸ペプチドと結合することで酵素相補性が引き起 こされ、それにより NanoLuc®ルシフェラーゼ活性がほぼ完全に回復します（1）。Small BiT（SmBiT）と呼ばれるこの 低親和性ペプチドは、単独では LgBiT と容易に相互作用しないため、NanoBiT® PPI System を用いた融合パートナーの タンパク質間相互作用の研究に使用できます。対照的に、HiBiT ペプチドは高い親和性（約 1 nM）で LgBiT と自然に結 合します。 17 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 6.A．Nano-Glo® HiBiT Extracellular Assay の概要（続き） したがって、HiBiT はサイズが小さくタンパク質機能に対する影響が小さいため、タンパク質のタグとして最適です。 HiBiT が Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent に含まれる過剰量の LgBiT タンパク質に高い親和性で結合すること により、HiBiT タグはタンパク質発現レベルを定量するための明るい発光酵素になります。 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System は、生細胞の非溶解アッセイフォーマットで細胞非透過性 LgBiT タン パク質にアクセス可能な HiBiT タグを迅速に定量するためにデザインされました。明るいシグナルで内因性発現レベルの 様々なタンパク質を定量でき、7 桁のダイナミックレンジで大量に過剰発現されたタンパク質も確実に定量できます（図 2、3、5）。HiBiT シグナルは安定で、一般的なシグナル半減期は 1～2.5 時間です（ [条件に依存]、 図 6）。Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System は細胞表面あるいは分泌された HiBiT タグ付きタンパク質を測定し、Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System はサンプルに含まれる HiBiT タグ付きタンパク質の総量を定量します（カタログ番号 N3030、N3040、N3050）。さらに、HiBiT タグ付きタンパク質は Nano-Glo® HiBiT Blotting System（カタログ番号 N2410） を用いて SDS-PAGE 後にメンブレン上で検出することもできます。 図 6．Nano-Glo® HiBiT Extracellular Assay のシグナル減衰動態。図 2 の精製済み HaloTag®-HiBiT の滴定におけるシ グナル減衰動態を示しています。エラーバーは n＝4 の標準偏差を表しています。 6.B．目的のタンパク質への HiBiT の付加 マルチクローニングサイト（MCS）ベクター 目的の遺伝子（GOI）は標準的なクローニングプロトコールに従ってHiBiTを持つベクターpBiT3.1-N［CMV/HiBiT/Blast］、 pBiT3.1-C［CMV/HiBiT/Blast］、および pBiT3.1-secN［CMV/HiBiT/Blast］に導入することができます。図 7 は、各ベ クターの MCS に含まれる特有の制限酵素サイトを示しています。XhoI サイトおよび SacI サイトは、POI を HiBiT タグ と融合させる Gly/Ser リンカー内に存在します。XhoI サイトは標準的な 8 Gly/Ser リンカーを導入するために使用でき、 SacI サイトは最小のリンカー（Gly-Ser-Ser-Gly）を導入する際に使用できます。その他の制限酵素サイトを使用するとよ り長いリンカー配列が得られます。リンカーやネイティブシグナル配列後の HiBiT タグ付加に関する詳細情報は、「他の 発現ベクターへの HiBiT の付加」のセクションをご覧ください。HiBiT コード配列を変えず、HiBiT が Nano-Glo®検出 試薬と併用される限り、これらのベクターから HiBiT タグや ORF を他の発現系へと移し換えることができます。 18 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 表 1 は、HiBiT タグに最も近い 4 つの制限酵素サイトをそれぞれ選んで、異なるリンカー長が得られた場合に生成される 融合タンパク質のリストです。PCR プライマーをデザインする際には、表 2 に記載されるヌクレオチド配列を組み入れて 正しいインフレームのタンパク質とリンカー配列を発現させます。pBiT3.1-N［CMV/HiBiT/Blast］Vector と pBiT3.1- secN ［ CMV/HiBiT/Blast ］ Vector の場合、 3’ プ ラ イ マ ー に 終 止 コ ド ン が 含 ま れ る よ う に し ま す 。 pBiT3.1-C ［CMV/HiBiT/Blast］Vector の場合、5’プライマーに開始コドン ATG が含まれるようにします。これらのベクターは、バ クテリアのカナマイシン耐性遺伝子および哺乳類細胞のブラストサイジン耐性遺伝子を持っています。pBiT3.1-secN ［CMV/HiBiT/Blast］Vector には、HiBiT タグと POI の前に IL-6 シグナル配列 N 末端が含まれており、タンパク質の効 率的な分泌または細胞膜ターゲティングが促進されます。pBiT3.1-secN［CMV/HiBiT/Blast］Vector の場合、切断される ネイティブシグナル配列に続く残基で始まるように 5’PCR プライマーをデザインします。こうすることで、ネイティブシ グナル配列は強力な IL-6 シグナルに置き換えられ、これがシグナルペプチドの切断後、N 末端に HiBiT を持つ成熟タン パク質を残します。 図 7．MCS エントリーベクターにおいて使用可能な制限酵素サイト 19 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 6.B．目的のタンパク質への HiBiT の付加（続き） 表 1．pBiT3.1 Vectors の SacI、XhoI、EcoRI、または BamH サイトと関連するリンカー配列。 表 2．pBiT3.1 Vectors の MCS に含まれる制限酵素サイトのプライマー配列。 5’末端の N ヌクレオチドは、確実に効率的な制限酵素消化を行うために付加する 5～10 個の塩基を表しています。 GOI＝目的の遺伝子、RC GOI＝目的の遺伝子の逆相補鎖 20 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 Flexi® Entry Vector Flexi® Vector System では、N 末端や C 末端に融合させるために複数の Flexi® Vector 間でタンパク質コード配列を持つ 単一の DNA インサートを迅速に移し換えることができます。Flexi® Vector Systems Technical Manual（#TM254）に 記載の指示に従ってタンパク質コード配列を pFC37K HiBiT Vector、pFN38K HiBiT Vector、または pFN39K secHiBiT CMV-neo Flexi® Vector にクローニングします。Flexi® Vector には汎用される致死遺伝子 barnase が含まれて おり、目的のクローンを生存させるにはこれをインサートに置き換えなければなりません。この致死性により、ベクター バックボーン間でタンパク質コード領域を高い効率で確実に移し換えることができます。barnase 遺伝子を置換せずに、 プラスミド増殖やタンパク質発現で一般的に使用される菌株において Flexi® Vector を増殖させることは不可能です。 HiBiT Flexi® Vector は、バクテリアのカナマイシン耐性遺伝子および哺乳類細胞のブラストサイジン耐性遺伝子を持っ ています。pFN39K secHiBiT CMV-neo Flexi® Vector には、タンパク質の効率的な分泌または細胞膜ターゲティングの ために、HiBiT および POI の前に IL-6 シグナル配列 N 末端が含まれています。このベクターの PCR プライマーをデザ インする際、HiBiT タグが成熟タンパク質の N 末端に付加されるようにネイティブシグナル配列は除去します。HiBiT コード配列を変えず、HiBiT が Nano-Glo®検出試薬と併用される限り、これらのベクターから HiBiT タグや ORF を他 の発現系へと移し換えることができます。 PCR 産物を Flexi® Vectors へクローニングする方法にはいくつかのオプションがあります： • HiBiT を N 末端に付加する場合（pFN38K HiBiT Vector および pFN39K secHiBiT CMV-neo Flexi® Vector）、TM254 のセクション 4 に記載されるプロトコールに従います。 • HiBiT を C 末端に付加する場合（pFC37K HiBiT CMV-neo Flexi® Vector）、TM254 のセクション 4.B のステップ 2 でアクセプターである Flexi® Vector を消化する際に、代わりにセクション 5.B のステップ 3 の Flexi® Vector 消化プ ロトコールを使用します。Carboxy Flexi® Enzyme Blend は、アクセプターFlexi® Vector の C 末端に付加する場合 にのみ使用します。 • まずタンパク質コード配列を pF4A CMV Flexi® Vector（カタログ番号 C8481）にクローニングし、配列を確認後、 ORF を HiBiT Flexi® Vector に移し換えます。 PCR プライマーをデザインする際、SgfI 認識サイトと開始コドンの間には 1 塩基を追加するようにしてください。インサ ートを C 末端融合に使用する場合、タンパク質コード領域の最後に停止コドンを入れてはいけません（TM254 のセクシ ョン 9.A を参照）。 弊社の Flexi ORF Clone リソース（www.promega.co.jp/flexiclone/index.html）には、ドナーの Flexi® DNA として使用 できるかずさ DNA 研究所提供のすぐ使えるコンストラクトが 10,000 近く含まれています。かずさ DNA 研究所から得ら れたすべてのコンストラクトは PCR 不要で直接 HiBiT Flexi® Vectors に移し換えできます。 21 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 表 3．HiBiT Flexi® Vectors と関連付けられているリンカー配列。 6.B．他の発現ベクターへの HiBiT の付加（続き） 他の発現ベクターへの HiBiT の付加 HiBiTタグは、PCRを用いた方法や遺伝子合成法により既存のタンパク質発現コンストラクトに直接付加できます。HiBiT タグを合成する権利は、以下のサイトの「Terms and Conditions of Use（使用条件）」を確認・承諾していただくことで取 得していただけます( www.promega.co.jp/nanobitsynthesis/ )。HiBiT タグは、ペプチド配列を変えず、HiBiT が NanoGlo® 検出試薬と併用される限り、あらゆる発現系へと移し換えることができます。 HiBiT 発現コンストラクトをデザインする際、目的のタンパク質と HiBiT との間のリンカーのサイズを小さくしたり、排 除したりすることもできます。様々なタンパク質に融合した HiBiT タグが確実にアクセスできる状態にするために、8 残 基の Gly/Ser リンカーを使用しています。しかしながら、ほとんどの場合ではリンカーを 2～3 残基に短縮したり、完全に なくした場合でも HiBiT タグの機能は大幅には損なわれないことを確認しています。目的のタンパク質に成熟タンパク質 から切断される N 末端シグナル配列がある場合、HiBiT タグをシグナル切断サイトの直後に配置して成熟タンパク質の N 末端に HiBiT を融合させることができます。 場合によっては、HiBiT タグをタンパク質のいずれかの末端ではなくタンパク質内部にうまく挿入できる場合もあります。 内部の HiBiT タグが効果的に LgBiT と相補（結合）するかどうかは、主にそのアクセスのしやすさに左右され、タンパ ク質構造とタグ配置により異なります。HiBiT タグは、内部に配置される場合、効率的な相補には拡張した立体構造を取 ることが必要となるため、HiBiT のいずれかの端にリンカー配列が必要になることがあります。HiBiT を小さなループに 配置すると、立体構造のゆがみが発生し、シグナル強度が低下する可能性があります。一般的に、内部タグからのシグナ ルは多少低下しており、LgBiT との平衡化に時間がかかります。内部タグ付けタンパク質を初めて使用する場合には、試 薬添加後 3 時間までは発光をモニタリングして、測定に最適なインキュベーション時間を決定することをおすすめします。 内在性遺伝子座における HiBiT の CRISPR/Cas9 ノックイン HiBiT はサイズが小さく明るいため、タグを内在性遺伝子座に導入（ノックイン）するための CRISPR/Cas9 を用いたゲ ノム編集に最適なタグとなります。HiBiT から発生する明るい発光により、内因性レベルで発現したタンパク質の測定が 容易になります。内在性タンパク質を HiBiT でタグ付けすることで、過剰発現によるアーチファクトが発生せず、生理学 的に関連性のある生物学的応答をより多く観察することができます（図 3 および図 4 を参照）。 HiBiT 配列はわずか 33 ヌクレオチド長であるため、HiBiT タグを挿入するための相同組換え修復を一本鎖 DNA オリゴ ヌクレオチドで行うことができ、DNA コンストラクトの作製が不要になります。ガイド DNA（gDNA）と Cas9 タンパ ク質を持つリボ核タンパク質粒子（RNP）をドナーssDNA と共に細胞内へエレクトロポレーションで導入して HiBiT を 22 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 高い効率で挿入することができます。この挿入の結果は、Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System により 1～ 2 日で測定できます（5）。HiBiT を内在性タンパク質に付加するための CRISPR/Cas9 の使用についての詳細情報はプロ メガテクニカルサービスにお問い合わせください。HiBiT タグをドナーssDNA 上で合成する権利は、以下のサイトの 「 Terms and Conditions of Use （ 使 用 規 約 ）」 を 確 認 ・ 承 諾 し て い た だ く こ と で 取得していただけます ( www.promega.co.jp/nanobitsynthesis/ )。 6.C．アッセイパフォーマンスに対する発現レベルの影響 発現レベルの変化は、主に酵素シグナル動態と観察される生物学的応答という 2 つの形でアッセイパフォーマンスに影響 を与えます。Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System では、幅広い濃度範囲にわたりグロー型発光シグナルが 維持され、十分に混和されたサンプルではシグナル半減期が 1～2 時間になります。しかしながら、シグナル半減期は HiBiT が極度に高濃度の場合には著しく低下することがあり、その原因としては基質の急激な枯渇が考えられます（図 6 を参照）。 この範囲のサンプルでは、低濃度のサンプルと同程度の経時的な相対的光出力レベルが維持されません。サンプルの HiBiT 濃度が極度に高い可能性が疑われる場合には、Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent の添加後、シグナル減衰速度を 経時的にモニタリングします。急激な基質枯渇を引き起こす HiBiT 濃度は通常、96 ウェルフォーマットの検出で使用さ れるルミノメーターのリニアダイナミックレンジに近いか、これを上回っています。 これとは逆に、HiBiT が超微量の場合、シグナルが試薬バックグラウンドに近くなるため測定が難しくなります。これに よりウェル間のばらつきが増大する可能性があります。このような状況では、得られる値が HiBiT 濃度に比例するように バックグラウンド発光を差し引く必要があります。細胞と培地はいずれもバックグラウンドに影響を与えるため、適切な バックグラウンドコントロールは、HiBiT タグ付きタンパク質を発現しない細胞を同じ培地で増殖させたものとなります。 アッセイバックグラウンド近くで感度を最大限にする方法についての詳細情報はセクション 6.H および 6.I をご覧くださ い。 HiBiT タグ付きタンパク質が本来の内在性タンパク質と同じ挙動を示すために、正確な測定に十分に高いシグナルを維持 しながら、タンパク質は低レベルで発現させます。タンパク質が非常に高レベルで発現すると、内在性結合パートナーに 対する化学量または調節機構の変化により不適切に制御されることになる可能性があります。図 3 および図 4 は、HiBiT タグ付きタンパク質の過剰発現が高まることで処理に対する応答（fold response）がいかに低下するかを示しています。 対照的に、HiBiT タグの CRISPR/Cas9 ノックインを用いて内在性レベルでタンパク質を発現することにより非常に良好 な応答が得られるようになりますが、これは内在性タンパク質に対する適切な化学量が維持されるからであると考えられ ます。 HiBiT/LgBiT 複合体は明るいため、通常、タンパク質は内在性レベルでモニタリングできます。CMV のような強力なプ ロモーターより HiBiT タグ付きタンパク質を発現する DNA コンストラクトを一過性トランスフェクションする場合に は、DNA コンストラクトをキャリア DNA（Transfection Carrier DNA［カタログ番号 E4881］など）で 1000 倍以上に 希釈することをおすすめします。トランスフェクションに最適な DNA 量は、使用する細胞の種類およびトランスフェク ション効率により異なります。発現コンストラクトを少量でトランスフェクションすることは、高レベルの酵素により急 激に基質が枯渇したり、ルミノメーターの直線検出範囲を超えたりしないようにするのに有用です。さらに重要なことと して、発現コンストラクトを希釈するということは、生物学的に適切に制御されるためにタンパク質がより生理学的レベ 23 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 ルに近い存在量で発現されるということを意味します。しかしながら、CMV 発現コンストラクトの希釈ではすべての細胞 で均一な低い発現レベルが達成されず、むしろ発現レベルの分布を低下させ、広げる傾向があります。そのため、発光の 大部分はタンパク質を高レベルで発現する少数の細胞に由来している可能性があります。HiBiT タグ付きタンパク質をよ り均一で低レベルに発現させるためには、以下の方法を取ることができます：1）TK や PGK などの弱いプロモーターま たは CMV を欠失させた発現コンストラクトを一過性トランスフェクションさせる、2）CMV 発現コンストラクトを安定 トランスフェクションさせ、発現レベルの低いクローンを選択する、または 3）タンパク質の内在性遺伝子座に HiBiT タ グを付加するために CRISPR/Cas9 を使用する。 6.D．HiBiT コンストラクトのトランスフェクション 以下のプロトコールは、CMV プロモーターを用いて HiBiT タグ付きタンパク質を発現させるコンストラクトを 96 ウェ ルプレートで一過性トランスフェクションする場合に推奨されます。プレーティング前に細胞を脂質および DNA と混合 する方法やバルクトランスフェクション、リプレーティングなど別のプロトコールも使用できますが、ここでは取り上げ ません。セクション 6.C で記載したように、HiBiT アッセイの最適化では簡単に測定できるシグナルと予測される生物学 的応答の両方を達成する発現レベルを決定することが必要になるかもしれません。一般的に使用されている培養細胞では、 CMV 発現コンストラクトを 1 ウェルあたり 0.5 ng または 0.05 ng の濃度でトランスフェクションすることをおすすめし ます。以下のプロトコールは、1 ウェルあたり 5～0.005 ng の濃度で発現コンストラクトをトランスフェクションするた めにキャリア DNA で発現コンストラクトを希釈する方法です。弱いプロモーターを持つコンストラクトの場合、DNA を 増量して最適化することができるかもしれません。 1． 白色の 96 ウェル組織培養プレート（例：Corning カタログ番号 3917）にウェルあたり全量 100 μL の細胞を入れま す。 2． 37°C、5% CO2のインキュベーターで 16～24 時間インキュベートして細胞を付着させます。 3． Transfection Carrier DNA（カタログ番号 E4881）および HiBiT 発現コンストラクトを Opti-MEM® I Reduced Serum Medium（Life Technologies カタログ番号 11058）でそれぞれ 6.25 ng/μl に希釈します。 4． 下の表に記載されるように、6.25 ng/μl の Transfection Carrier DNA 溶液で発現コンストラクトを段階希釈します。 5． 目的の細胞種に適した脂質：DNA 比で FuGENE® HD Transfection Reagent または ViaFect™ Transfection Reagent を添加します。室温で 10 分間インキュベートします。 注記：推奨される脂質：DNA 比については、FuGENE® HD データベース（www.promega.com/resources/tools/fugenehd-protocoldatabase/）をご参照ください。 6． 脂質：DNA 混合物 8 μL を各ウェルに添加します。プレートを 2～3 秒間手で回して混和させます。 7． プレートを 37°C、5% CO2のインキュベーターで 20～24 時間インキュベートします。 24 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 6.E．培地除去と 1×Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent 添加の代替プロトコール 付着細胞から培地を除去し、1×Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent で置換することは、以下の場合に有用です： ・ シグナルがアッセイバックグラウンドに近く、シグナル／バックグラウンド比を高くすることが求められる場合（セ クション 6.H および 6.I を参照）。 ・ 細胞表面での発現を測定する前に培地に含まれる 1 つ以上の成分（受容体アゴニストなど）を除去することが必要で ある場合。 1． セクション 3.B の記載に従って Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent を調製します。 2． 調製した試薬に PBS などの最小限の緩衝液が含まれる生理食塩溶液を等量加え、転倒混和します。これが 1×reagent となります。 3． HiBiT タグ付きタンパク質を発現する哺乳動物細胞を含むプレートを 37°C インキュベーターから取り出します。 4． 付着細胞に影響を与えたり乾燥させたりせずに（吸引などの手段で）各ウェルから培地を除去します。 5． プレートのウェルに 1×reagent を適量加えます。一般的に、元のサンプル量の 1～2 倍の量の 1×reagent を加える ことをおすすめします。 6． 室温で 10 分間インキュベートして LgBiT と HiBiT を平衡化させます。HiBiT タグがタンパク質配列内にある場合、 タンパク質末端にタグがある場合と比べて長いインキュベーション時間が必要になる場合があります。お使いの装置 の設定を用いて室温で発光を測定します。GloMax® 装置で 96 ウェルプレートを使用する場合、測定時間（integration time）は 0.5～2 秒が推奨されます。測定時間を延長すると、発現レベルが低い場合のデータクオリティが改善される 可能性があります。発光強度は一般的に、シグナル半減期 1～2.5 時間で減衰します。 備考： 1． 1×reagent の添加後、プレートを 37°C で 10 分間インキュベーションしてから 37°C ルミノメーターで発光を測定 することもできます。 2． HiBiT が細胞表面タンパク質に融合されていない場合であっても、培地交換または細胞洗浄によりすべての細胞外 HiBiT シグナルを除去することは困難であるかもしれません。これについては多数の潜在的な原因が考えられ、例え ば透過性膜を持つ死細胞や損傷細胞の存在、細胞の外側に結合したままになっているタンパク質、または別の形でプ レートと結合したままになっているタンパク質などがあります。誘導性発現系は細胞処理前に細胞外蓄積を低減させ ることでこのようなタンパク質バックグラウンドを低下させる可能性があります。 25 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 6.F．リアルタイム測定の代替プロトコール 場合によっては、細胞外 HiBiT レベルの変化を単一エンドポイントで測定するのではなく経時的に測定することが必要に なるかもしれません。例えば、タンパク質の輸送や分泌速度の変化は規定の培地で 1～2 時間の期間にわたり測定すること ができます。以下のプロトコールは、Nano-Glo® HiBiT Extracellular Buffer の代わりに細胞培養培地で作製された 1× reagent を加える方法です。 1． 適量の HEPES 緩衝培地をプレートに入っている培地と交換します。これは通常、全ウェルに含まれる培地の総量に 分注に要する追加分を足した量となります。シグナル／バックグラウンド比とシグナル安定性を最適化するために、 培地に添加する血清量は最小限に抑えます（セクション 6.H および 6.I を参照）。 2． 未使用の容器に適量の培地で LgBiT Protein を 1：200、Nano-Glo® HiBiT Extracellular Substrate を 1：100 に希 釈し、転倒混和させて 1×reagent を作製します。例：1×reagent の必要量が 4 mL の場合、緩衝培地 4 mL をディ スポーザブル容器に移し、LgBiT Protein を 20 μL、Nano-Glo® HiBiT Extracellular Substrate を 40 μL 加えま す。 備考：分注直前に試薬を 37°C に温めることは通常は不要であり、温めることで試薬安定性に悪影響を及ぼすことに なります。 3． HiBiT タグ付きタンパク質を発現する哺乳動物細胞を含むプレートを 37°C インキュベーターから取り出します。 4． 付着細胞に影響を与えたり乾燥させたりせずに（吸引などの手段で）各ウェルから培地を除去します。 6.F．リアルタイム測定の代替プロトコール（続き） 5． プレートのウェルに 1×reagent を適量加えます。一般的に、元のサンプル量の 1～2 倍の量の 1×reagent を加える ことをおすすめします。 6． 目的の温度（通常、37°C または室温）に設定したルミノメーターにプレートを装着し、必要な時間（最長 2 時間）に わたる発光を測定します。一般的に、10～15 分後にはプレート温度は安定し、LgBiT と HiBiT は平衡化しています。 この時点の後に発生するシグナル変化は、細胞外 HiBiT タグ付きタンパク質レベルの変化と酵素-基質系の自然なシ グナル減衰速度の変化の組み合わせによるものです。HiBiT レベルの変化を経時的に定量するには、HiBiT タグ付き タンパク質の量が変化しないコントロールウェルに対してノーマライズしてこのシグナル減衰を考慮に入れます。 備考： 1． HiBiT タグ付きタンパク質の細胞内位置から細胞外位置への輸送速度を測定する場合、t＝0 をシグナル平衡化後の最 初の時点として設定することをおすすめします。これは通常、試薬添加から 10～15 分後です。この値をその後の測定 値から引くことで、実験測定中に細胞表面へと輸送された HiBiT タグ付きタンパク質からのシグナルが得られます。 シグナル減衰を把握するため、実験値のノーマライゼーションのために細胞外 HiBiT タグ付きタンパク質を一定量で 含むサンプルを含めます。 2． 場合によっては、事前に LgBiT を結合することで HiBiT タグ付きタンパク質のインターナリゼーションをリアルタ イムで測定できます。リアルタイム測定用プロトコールに従って、シグナルを平衡化させ、インターナリゼーション 26 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 を促進する受容体アゴニストまたはその他の化合物を添加した後、溶媒コントロールに対するシグナルの変化をモニ タリングすることをおすすめします。LgBiT は HiBiT タグ付きタンパク質と共にインターナリゼーションすることが 予想され、furimazine 基質も細胞透過性であるため、この複合体は多くの場合、インターナリゼーションの際に活性 が大幅に低下することが確認されます。これによりインターナリゼーションのリアルタイム測定が実現します。発光 値を化合物添加前の値（または直近数回分の測定値の平均値）で割ってウェルあたりでノーマライズすることは、細 胞数、発現レベル、またはその他の要因が原因のばらつきを低減するのに効果的です。ウェルあたりの応答（fold response）を算出することで、細胞表面発現のわずかな変化を正確に測定できます。 3． 特定の状況下では、LgBiT Protein を細胞とインキュベートする時間を延長し、終点測定直前に基質を添加すること が必要になるかもしれません。例えば、平衡化時間の延長が必要な内部 HiBiT タグを含むタンパク質の輸送を測定す る場合、実験開始時に LgBiT を含み基質は含まない培地で細胞培地を置換します（例：100 倍希釈の LgBiT Protein が含まれる HEPES 緩衝培地を等量）。必要な時間経過後、LgBiT を含まない 2×reagent（基質を Nano-Glo® HiBiT Extracellular Buffer で 50 倍希釈したもの）を等量加え、混和させ、セクション 3.C のステップ 4 に従って 10 分後 の発光を測定します。 4． HiBiT が細胞表面タンパク質に融合されていない場合であっても、培地交換または細胞洗浄によりすべての細胞外 HiBiT シグナルを除去することは困難であるかもしれません。これについては多数の潜在的な原因が考えられ、例え ば透過性膜を持つ死細胞や損傷細胞が存在すること、細胞の外側に結合したままになっているタンパク質、または別 の形でプレートと結合したままになっているタンパク質などがあります。誘導性発現系は細胞処理前に細胞外蓄積を 低減させることでこのようなタンパク質バックグラウンドを低下させる役に立つ可能性があります。 6.G．細胞外 HiBiT シグナルと溶解 HiBiT シグナルの比較 細胞表面上あるいは培地に分泌された HiBiT タグ付きタンパク質の量を測定する際、サンプルに含まれる細胞外タンパク 質量と総タンパク質量の比率について興味を持つかもしれません。これは細胞外タンパク質レベルの変化が輸送効率の変 化によるものなのか、タンパク質の発現や分解によるものなのかを判断する上で特に重要です。細胞外 HiBiT シグナルと 全 HiBiT シグナルを両方測定するには、複製ウェルに細胞溶解試薬を追加する、または細胞外側定後に界面活性剤を添加 して同じウェル内でマルチプレックス定量する 2 つの方法が考えられます。 複製ウェルにおける Nano-Glo® HiBiT Lytic Reagent と Extracellular Reagent の比較 Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System（カタログ番号 N2030、N2040、N2050）はサンプルに含まれる HiBiT タグ付 きタンパク質の全量を測定するのに最適な方法です。Extracellular Reagent と Lytic Reagent を複製ウェルに添加し、 Technical Manual（TM516）のセクション 3.C に記載されるプロトコールに従って、水平に振とうして混和させ、10 分 後に発光を測定します。さまざまな培地と組み合わされたバッファー条件の違いにより、各試薬では特定量の HiBiT から 異なる量の光が発生します。このようなシグナルの明るさの違いは、HiBiT Control Protein（カタログ番号 N3010）など の 100%細胞外の HiBiT タグ付きタンパク質をアッセイ培地で希釈したもの（例えば 100 pM）から得られるシグナルを 比較することで補正できます。 27 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 実験サンプルに含まれる HiBiT タグ付きタンパク質の細胞外画分を測定するには、Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent および Lytic Reagent を以下の種類のサンプルが含まれる複製ウェルに添加します： 1． “バックグラウンド”：HiBiT を発現しない非トランスフェクション細胞 2． “テスト”：HiBiT タグ付きタンパク質を発現する実験細胞 3． “コントロール”：100%細胞外 HiBiT（培地中の HiBiT Control Protein） “テスト”サンプルに含まれる細胞外タンパク質の画分は、“バックグラウンド”を引いた細胞外測定値と溶解測定値の比 を算出し、細胞外試薬の場合と比較した溶解試薬に含まれる“コントロール”サンプル（100%細胞外 HiBiT）のシグナル における倍率変化（fold difference）を掛けて決定します： ［（細胞外“テスト”－ 細胞外“バックグラウンド”）／（溶解“テスト”－ 溶解“バックグラウンド”）］×［（溶解“コ ントロール”－ 溶解“バックグラウンド”）／（細胞外“コントロール”－ 細胞外“バックグラウンド”）］ 例：目的の HiBiT タグ付きタンパク質（POI）のトランスフェクション細胞からの分泌の程度は、Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent と Lytic Reagent 中でのシグナルを比較することで調べられています。非トランスフェクション細 胞および培地中の精製済み HiBiT Control Protein も比較のためにプレートに含められており、以下の発光データが得ら れます： 0.0647 × 0.500 = 0.0323、つまり POI の 3.2%は分泌されています。 6.G．細胞外 HiBiT シグナルおよび溶解 HiBiT シグナルの比較（続き） 複製ウェルの比較のための Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent への界面活性剤の添加 総 HiBiT タグ付きタンパク質を測定するには Nano-Glo® HiBiT Lytic Reagent を使用することをおすすめしていますが、 発光測定値を簡単に比較するために同じバッファー条件で溶解タンパク質測定と細胞外タンパク質測定を実施することも 可能です。その場合、調製した Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent に少量の界面活性剤を添加して 2×lytic reagent を作製することができます。 高濃度の界面活性剤は HiBiT シグナルを阻害しますが、シグナル阻害がほとんど発生しない比較的穏やかな界面活性剤条 件で多数の細胞内コンパートメントに LgBiT Protein がアクセスできる状態になります。これにより、複製ウェルにおけ る細胞外タンパク質と総タンパク質の測定値をより直接的に比較することが可能になります。例えば、試薬に 200 μg/mL のジギトニンを追加しても HiBiT シグナルはほとんど阻害されませんが、一般的に LgBiT を細胞質および小胞体などの 細胞内コンパートメントに含まれるタンパク質と平衡化するには十分です。 28 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 最終濃度の低い Triton® X-100 も通常、HiBiT シグナルを大幅に阻害することなく多数の細胞内コンパートメントを透過 処理することができます。例えば、Triton® X-100 の 10%（v/v）原液を調製済み Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent で 100 倍に希釈し、細胞に対する最終濃度が 0.05%（v/v）になるようにします。 試薬バックグラウンドは界面活性剤の有無により大幅に異なることが多いため、非トランスフェクション細胞を使って各 試薬のバックグラウンドを測定します。界面活性剤を追加することでシグナル減衰速度にも影響が及ぶ可能性があるため、 コントロールサンプルから得られるシグナルはインキュベーションが長くなるに伴いばらつき始めることがあります。 細胞溶解でジギトニンを使用するプロトコールの例： 1． セクション 3.B のプロトコールに従って必要量の Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent を調製します。半量を別 の容器に移して lytic reagent を作製します。 2． 2×溶解試薬を作製するには、ジギトニンを試薬中の最終濃度が 0.2 mg/mL になるように添加します（例：20 mg/mL のジギトニン原液を DMSO［カタログ番号 G9441］で 100 倍希釈）。この濃度は HiBiT シグナルにほとんど影響を与 えません。 3． セクション 3.Cのプロトコールに従って、細胞外試薬および 2×溶解試薬を同一プレートの複製ウェルに添加します。 サンプルにはバックグラウンドを測定するための非トランスフェクション細胞、そして HiBiT Control Protein など の 100%細胞外のコントロールサンプルを含めます。 4． 前のセクション「細胞外 HiBiT シグナルと溶解 HiBiT シグナルの比較.」で説明した方法で細胞外タンパク質画分を 測定します。この濃度のジギトニンで 100%細胞外コントロールのシグナルが変化しない場合、その後のプレートで はノーマライゼーションが不要であるかもしれません。 同一ウェルにおける細胞外測定と溶解測定のマルチプレックス 調べている目的のタンパク質およびその細胞内局在化によっては、連続的な細胞外側定と溶解測定を同一ウェルで行うこ とができます。このアプローチでは、セクション 3.C のプロトコールを用いて Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System を実施します。室温で 10 分間インキュベートし、細胞外シグナルを測定した後、界面活性剤の濃縮原液を各ウェ ルに添加して細胞を溶解します。サンプルを混和させて 10 分以上インキュベートした後、発光を再度測定します。一般に 界面活性剤を添加すると試薬バックグラウンドシグナルが変化するため、両方の測定値から試薬バックグラウンドを引き ます。2 回の測定間のシグナル減衰のため、100%細胞外コントロールサンプルでは、界面活性剤によるシグナル阻害がな くても、溶解条件下においてシグナルの低下が確認されます。このウェルごとのノーマライゼーションにより実験のばら つきの一部の原因（細胞数や発現レベルなど）は低減しますが、複製ウェルに 2×reagent を添加する場合と比べてウェル 間の溶解におけるばらつきが増加する可能性もあります。 膜透過処理を酵素阻害と釣り合わせる際の考慮事項に関する上のセクションをご確認ください。最終濃度が 100 μg/mL のジギトニンまたは 0.05%の Triton® X-100 が得られるように 10X または 20X の水溶性界面活性剤原液を添加すること で、多くの場合、HiBiT シグナルを大幅に阻害することなく HiBiT タグ付きタンパク質を効果的に遊離させることができ ます。Mammalian Lysis Buffer（カタログ番号 G9381）は、20X の界面活性剤原液として HiBiT シグナル阻害を最小限 に抑えて多数の細胞内コンパートメントを効果的に溶解させるのに最適です。効果的な混和は、完全な細胞溶解を達成し ウェル間のばらつきを低減させるのに重要です。HiBiT タグ付きタンパク質の細胞外画分を測定するために、前のセクシ 29 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 ョンに記載した分析を実施します。100% 細胞外コントロールは、界面活性剤による HiBiT シグナルの阻害と 2 回の測定 間のシグナル減衰の両方を補正するのに役立ちます。 6.H．一般的なアッセイコンポーネントの影響 培養培地 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System は多くの一般的な培養培地で使用できるようにデザインされています が、さまざまな培地の成分の違いにより発光シグナルの強度および持続時間が影響を受ける可能性があります（図 8）。こ のような違いは一般的に小さく、アッセイの有用性を低下させるものではありません。特に注目すべきこととして、培地 に含まれるフェノールレッドは光を吸収することにより発光シグナルをわずかに低下させます。Opti-MEM® I Reduced Serum Medium や McCoy’s 5A などの一部の培地では、この試薬を使用するとバックグラウンド発光が高くなり、シグナ ル／バックグラウンド比が低下することがあります。ほぼ同じ条件において比較されるようにするために適切な調整が必 要です。 30 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 6.H．一般的なアッセイコンポーネントの影響（続き） 図 8．シグナル強度、シグナル安定性、およびバックグラウンドに対する培地の種類の影響。精製済み HaloTag®-HiBiT タンパク質（最終濃度 100 pM）は、10%ウシ胎児血清を添加または無添加の条件下でさまざまな細胞培養培地に希釈しま した。パネル A：Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent 添加 10 分後に発光を測定しました。パネル B：2 時間にわた り室温で発光を複数回測定しました。シグナル半減期はデータを単一指数曲線にフィッティングして決定しました。パネ ル C：HaloTag®-HiBiT タンパク質を含まないさまざまな培地に試薬を添加して試薬バックグラウンドを測定しました。 パネル D：100 pM の HaloTag®-HiBiT タンパク質のシグナル／バックグラウンド比は、10 分後のシグナルを HiBiT なし のバックグラウンド発光で割って算出しました。エラーバーは n＝4 の標準偏差を示しています。 31 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 血清 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent は、発光シグナルに対する影響が最小限の 0～10%の血清と併用するようにデ ザインされています（図 9、パネル A）。シグナル半減期は血清によりわずかに低下する可能性がありますが、発光は 1～ 2 時間安定です（図 9、パネル B）。血清は HiBiT が不在の場合、試薬発光バックグラウンドを上昇させますが（図 9、パ ネル C）、これは基質の自己発光が増加し、少量の LgBiT Protein が活性化されるためです。微量の HiBiT タグ付きタン パク質を測定する場合、培地に含まれる血清レベルを下げることが有用になることがあります（セクション 6.I を参照）。 図 9．シグナル強度、シグナル安定性、およびバックグラウンドに対する血清の影響。ウシ胎児血清（FBS）、仔ウシ血清、 またはウマ血清を 0.1 mg/mL BSA キャリアを添加した DMEM で段階希釈しました。パネル A：HaloTag®-HiBiT タンパ ク質（100 pM）を血清濃度の異なる培地に希釈し、Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent 添加 10 分後に発光を測定 しました。パネル B：2 時間にわたり室温で発光を複数回測定しました。シグナル半減期はデータを単一指数曲線にフィ ッティングして決定しました。パネル C：HaloTag®-HiBiT タンパク質非存在下で各濃度の血清に Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent を添加して試薬バックグラウンドを測定しました。エラーバーは n＝4 の標準偏差を示しています。 32 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 有機溶媒 有機溶媒は細胞に添加するために化合物を可溶化する際に使用されるため、アッセイ中に存在している可能性があります。 3%までの濃度の DMSO、エタノール、およびメタノールはアッセイの強度、シグナル動態、またはバックグラウンドにほ とんど影響を及ぼしません（図 10）。 図 10．シグナル強度、シグナル安定性、およびバックグラウンドに対する有機溶媒の影響。 DMSO、エタノール、およびメタノールを 0.1 mg/mL の BSA キャリアを添加した DMEM で段階希釈しました。パネル A：HaloTag®-HiBiT タンパク質（100 pM）を溶媒濃度の異なる培地に希釈し、Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent 添加 10 分後に発光を測定しました。パネル B：2 時間にわたり室温で発光を複数回測定しました。シグナル半減期はデー タを単一指数曲線にフィッティングして決定しました。パネル C： HaloTag®-HiBiT タンパク質非存在下で各濃度の溶媒 に Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent を添加して試薬バックグラウンドを測定しました。エラーバーは n＝4 の標 準偏差を示しています。 33 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 アッセイバックグラウンドを上昇させる要因 Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent には、サンプルに含まれる HiBiT タグを直ちに飽和させるのに十分な濃度の LgBiT Protein が含まれています。HiBiT ペプチドは LgBiT 発光を 108倍以上活性化することができますが、ある程度は 他のペプチドやタンパク質配列が LgBiT に結合して活性化させる可能性もあります。一般的に、これは HiBiT よりはる かに低い親和性と活性倍率で発生しますが、LgBiT を活性化させるペプチドやタンパク質が高濃度で含まれているとアッ セイバックグラウンドが上昇する可能性があります。このような活性化の可能性は、そのアッセイ条件により Nano-Glo® HiBiT Lytic Reagent よりも Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent で顕著になるかもしれません。 HiBiT タグ付きタンパク質を発現しない細胞は、培地だけの場合と比べるとアッセイバックグラウンドを上昇させます（図 11）。このバックグラウンドは通常、100 fM の HiBiT から得られるシグナル量を下回ります。培地に血清が存在すること でもバックグラウンドレベルは上昇します（図 8、パネル C）。 サンプルに高濃度のペプチドを添加する場合（ペプチドライブラリーのスクリーニングなど）、HiBiT に似たペプチドが LiBiT Protein を活性化させることが確認されるかもしれません。このような LgBiT の活性化は、細胞や HiBiT の非存在 下でNano-Glo® HiBiT Extracellular Reagentにペプチドを添加する二次アッセイを実施することで簡単に確認できます。 小分子は LgBiT Protein を活性化させる可能性がありますが、初期のライブラリースクリーニング結果ではそのような化 合物は非常にまれであることが示唆されています。 図 11．アッセイバックグラウンドに対する細胞数の影響。CHO 細胞、HEK 293 細胞、HeLa 細胞、または U2OS 細胞を 解離させ、カウントし、DMEM 培地に段階希釈しました。96 ウェルプレートに滴定量の細胞を移した後、Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent を添加し、10 分後に発光を測定しました。バックグラウンドを差し引いた発光をプロットしまし た。エラーバーは n＝4 の標準偏差を示しています。 34 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 6.I．アッセイ感度の最大化 HiBiT タグ付きタンパク質が非常に低いレベルで存在する場合、最も正確な測定はシグナルを上昇させ、バックグラウン ドを低下させることで達成できます。HiBiT シグナルがサンプルに含まれる HiBiT タグ付きタンパク質の量と確実に比例 しているようにするため、アッセイバックグラウンドを差し引きます。このバックグラウンドは、ルミノメーターの機器 バックグラウンド、furimazine 基質の自己発光、内因性 LgBiT 活性、およびサンプルに含まれるタンパク質、ペプチド、 またはその他の化合物による LgBiT の非特異的活性化で構成されます。適切なバックグラウンドコントロールは、同じ培 地で増殖した HiBiT タグ付きタンパク質を発現しない同数および同じ種類の細胞から成ります。これらのバックグラウン ドコントロール細胞に試薬が添加された際に得られる発光を引くことで、ウェル内の HiBiT タグ付きタンパク質の量に比 例した値が得られます。 フェノールレッドを含まない細胞培地を選択することで、さらに高いシグナルを達成できます（図 8、パネル A を参照）。 培地に含まれる血清の量を低減または除去し、バックグラウンドの低い培地を選択することで、アッセイバックグラウン ドを低下させます（図 8、パネル C を参照）。お使いのワークフローで可能な場合には、実験中または実験終了時に培地を 除去し、フェノールレッドおよび血清が含まれない培地と交換することを検討します。また別の方法として、Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent は 2×reagent であるため、これを PBS で 1：1 に希釈して得られた 1×reagent を目的の 時点において培地除去後にウェルに添加することができます（セクション 6.E のプロトコールを参照）。この方法は、接着 細胞で HiBiT タグ付きタンパク質の細胞表面発現を測定する場合にのみ可能であり、分泌タンパク質や浮遊細胞には使用 できません。 35 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 6.J．トラブルシューティング 本マニュアルで取り上げられていない質問については、弊社またはお近くの販売代理店にお問い合わせください。連絡先 情報は www.promega.jp をご覧ください。 E-メール：prometec@jp.promega.com 症状 原因およびコメント プレート全体でシグナル勾配がある、シグナル が急激に低下する サンプルが事前に十分に混和されていない場合、シグナルが急速に低 下することがあります。試薬添加後 30 秒間水平振とうしてサンプル を十分に混和させるか、プレートの測定にかかる時間を短縮する（測 定時間の短縮など）か、この両方の方法を実施します。 急激なシグナル減衰が確認された 基質は HiBiT シグナルが高いと急激に枯渇します。トランスフェクシ ョンする DNA 量を減らす、トランスフェクションベクターで弱いプ ロモーターを使用する、またはウェルあたりの細胞数を減らすことに より、タンパク質発現レベルを低下させます。 小分子またはペプチドのライブラリーに偽ヒ ットの原因となる LgBiT 活性化因子が含まれ ている可能性がある 細胞または HiBiT の非存在下で化合物が LgBiT を活性化するかどう かを調べるための二次スクリーニングを実施します。推定される活性 化因子のバッファー溶液を Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent に添加します。この実験では、活性化が HiBiT タグ付き POI と無関 連であるかどうかが確認されます。 小分子またはペプチドのライブラリーに偽ヒ ットの原因となるルシフェラーゼ阻害物質が 含まれている可能性がある HiBiT Control Protein（カタログ番号 N3010）の 100 pM バッファー 溶液を用いて細胞の非存在下で二次スクリーニングを実施します。タ ンパク質を Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent に加えて阻害が HiBiT タグ付き POI と無関係であるかどうかを判断します。ディスペ ンサーや試薬を HiBiT サンプルで汚染しないようにします。 36 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 6.J．トラブルシューティング（続き） 症状 原因およびコメント HiBiT が含まれないサンプルで高いバックグ ラウンドシグナルが確認される HiBiT 検出感度は高いため、HiBiT タグ付きタンパク質を含むサンプ ルにより試薬や分注ラインが汚染されないようにします。例えば、 HiBiT タグが含まれる細胞ライセートを自動注入システムで分注した 場合、洗浄後であっても少量のタンパク質がディスペンサーの表面に 吸着している可能性があります。このタンパク質はその後分注される Nano-Glo® HiBiT Extracellular Reagent などの他の溶液の中に少量 ずつ放出されるかもしれません。こうして、移行した HiBiT タグのた めにアッセイのバックグラウンドが上昇する可能性があります。他の 場所や材料が汚染されないようにするために、HiBiT Control Protein を取り扱う際には注意します。汚染とバックグラウンドシグナルの上 昇を最小限に抑えるために、HiBiT Control Protein を含む溶液の分注 では使い捨ての器具を使用することをおすすめします。 バックグラウンド発光は細胞、血清、または特定の培地により上昇す ることがあります。試薬バックグラウンドを低下させる方法に関する アドバイスはセクション 6.H および 6.I をご覧ください。 シグナルが低すぎて正確に測定できない 血清濃度の低いフェノールレッド無添加の培地に切り替えてシグナル ／バックグラウンド比を上昇させます。培地を除去して、PBS で 1： 1 に希釈した 1×reagent に交換することを検討します。細胞を一過性 トランスフェクションする場合、使用する発現コンストラクトの量を 増やします。 所定の融合パートナーまたはタグ配置の特性によっては、HiBiT タグ へのアクセスしやすさが特に低下し、補完と発光が低下することがあ ります。HiBiT を他方のタンパク質末端に付加するか、タンパク質と HiBiT タグの間のリンカー長を変えてみてください。 処理に対する生物学的応答が低い HiBiT タグ付き POI の発現が多すぎる可能性があります。キャリア DNA で発現コンストラクトを希釈する、弱いプロモーターに切り替え る、または HiBiT タグ付きタンパク質を内在性レベルで発現するため に CRISPR/Cas9 を使用することを検討します。 プレート間のばらつきが大きい 試薬添加後の経過時間を同じにしてプレートを測定します。各プレー トで条件が同じになっていることを確認します（培地、細胞数、温度 など）。一連のプレートをノーマライズするのに使用できる共通コント ロールサンプルを各プレートに含めます。 37 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 どちらの末端もタグ付けに使用できない HiBiT をアクセス可能な表面ループでタンパク質内部に付加します。 シグナルおよび LgBiT との平衡化速度は、末端タグの場合に比べて低 下する可能性があります。HiBiT の両端にリンカー（GSSGGSSG な ど）を付加することは、タンパク質のアクセスしやすさを高める役に 立ちます。 細胞内にあるべき HiBiT タグ付きタンパク質 からアッセイで強いシグナルが得られる 通常の細胞培養条件下では、ある程度の細胞溶解は一般的です。HiBiT タグ付きタンパク質は溶解した細胞から培地へと放出されたり、細胞 片の中にある LgBiT に結合したりすることがあります。一過性トラン スフェクションした細胞では、HiBiT タグ付きタンパク質を大量に過 剰発現する亜集団は溶解する可能性が高く、基本条件下で細胞外に放 出されるウェル内の総タンパク質量の割合が高くなることがありま す。細胞を洗浄することはあまり効果的ではなく、それどころか HiBiT シグナルを含む細胞残余物や細胞片はウェルに結合したままであるた め細胞外バックグラウンドを除去するには逆効果となるかもしれませ ん。 輸送または分泌の実験で最初に得られるシグ ナルが高すぎる 細胞処理の開始時にすでに細胞外にある HiBiT タグ付きタンパク質 から得られる基本シグナルは不要なバックグラウンドとなる可能性が あります。細胞洗浄や培地交換ではこの問題を完全に解決することは できないかもしれません。誘導性発現系を使用することで処理前にタ ンパク質蓄積が低減されるため、特定の条件下でのタンパク質輸送の 程度を測定するのに役立つ可能性があります。 38 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 Tel. 03-3669-7980 E-mail. prometec@jp.promega.com TM523J · 2017/10 6.K．参考文献 1. Dixon, A.S. et al. (2016) NanoLuc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chem. Biol. 11, 400–8. 2. Zhao, Z. et al. (2006) Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. Am. J. Hum. Genet. 78, 514–23. 3. Hall, M.P. et al. (2012) Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem. Biol. 7, 1848–57. 4. Los, G.V. et al. (2008) HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem. Biol. 3, 373–82. 5. Schwinn, M.K. et al. (2017) CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. Manuscript submitted. 6. Seidah, N.G. et al. (2003) The secretory proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase 1 (NARC-1): Liver regeneration and neuronal differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 928–33. 7. January, B. et al. 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