Nano-Glo™ Luciferase Assay
Nano-Glo™ Luciferase Assay INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS N1110, N1120, N1130, N1150 Quick PR OTO COL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM050 をご覧ください。 Revised 2012/04 Nano-Glo™ Luciferase Assay Reagent の作成（用事調製） 1. Nano-Glo™ Luciferase Assay Substrateをピペッティングで混合する。 2. Nano-Glo™ Luciferase Assay Bufferを融解する。 3. Nano-Glo™ Luciferase Assay Substrateに対して50倍量のNano-Glo™ Luciferase Assay Buffer を混合する。例えば10mlのReagentが必要な場合、10mlのbuffer に200μlのAssay Substrateを 加える（用事調製）。 A. 標準型プロトコール 1. Nano-Glo™ Luciferase Assay Reagent およびサンプル（細胞） をインキュベーターから出し、5-10 分間静置して室温に戻す。 2. 培地に対して等量の Nano-Glo™ Luciferase Assay Reagent を加え、緩やかに混合する。 3. 3 分間インキュベートする。 4. ルミノメーターで発光値を測定する。 B. 分泌型プロトコール 1. Nano-Glo™ Luciferase Assay Reagent を 5-10 分間静置して室温に戻す。 2. プレートをインキュベーターから出し、緩やかに振盪あるいは、Orbital Shaker を用いて 100rpm で 2 分間振盪する。 3. 培地 (5–20μl) を測定用の 96-well plate に移す。 4. 蒸留水、脱イオン水または培地を 100μl/well になるように加える。 5. ウェルに 100μl の Nano-Glo™ Luciferase Assay Reagent を加え、混合する。 6. 3 分間インキュベートする。 7. ルミノメーターで発光値を測定する。 Nano-Glo™ Luciferase Assay INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS N1110, N1120, N1130, N1150 Quick PR OTO COL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM050 をご覧ください。 Revised 2012/04 [プロトコール例] pNL3.2.NF-B-RE [NlucP/NF-B-RE/Hygro] Vectorを用いてTNF-による応答刺激を検出 用意するもの • HEK 293細胞 • 0.05% (w/v)トリプシン • DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (DMEM/FBS) • Tumor necrosis factor- (TNF) (Sigma T0157), 10μg/ml solution in PBS containing 1mg/ml BSA • Nano-Glo™ Luciferase Assay System (Cat. # N1110) • Transfection reagent (参考：FuGENE® HD Transfection Reagent, Cat. # E2311) • pNL3.2.NF-B-RE[NlucP/NF-B-RE/Hygro] Vector Day 1: 細胞の播種 1. HEK 293細胞を約75%コンフルエントまで培養する。 2. トリプシン処理で細胞を剥がし、15,000 viable cells/100μl DMEM/FBSの濃度に調製する。 3. 96-well plateに100μlずつ播種する。 4. 37°C CO2インキュベーターで一晩培養する。 Day 2: トランスフェクション 1. トランスフェクション試薬（参考： FuGENE® HD Transfection Reagent, Cat.# E2311)を用 いて、pNL3.2.NF-κB-RE [NlucP/NF-κB-RE/Hygro] Vectorを細胞に導入する。 （条件例）FuGENE® HD Transfection Reagent：DNA=3：1、0.1µg DNA/well 2. 37°C CO2インキュベーターで一晩培養する。 Day 3: TNFαによる誘導および発光測定 1. 1X induction solutionと1X control solutionを調製する。 • 1X induction solution：10μg/ml TNF-を最終濃度20ng/ml in DMEM/FBSになるように調製 する。 • 1X control solution：DMEM/FBS. 2. ウェルから培地を除き、1X induction solution または 1X control solutionに交換する。 3. 37°C CO2インキュベーターで5時間培養する。 4. ルシフェラーゼ活性をNano-Glo™ Luciferase Assay System (Cat.# N1110)で測定する。 5. 以下のようにFold Induction（誘導倍率）を計算する。 Fold Induction = Average relative light units of induced cells Average relative light units of control cells