NanoLucってなになになーに？
レポーターアッセイについては なになになーに？ のVol.1で復習できるよ！ www.promega.co.jp/naninani/ と の なになになーに？ ほたるん エビビン NanoLucって Vol.5 こんにちは、ほたるんさんエビビンさん。 レポーターアッセイ始めました！ もちろんルシフェラーゼのシステムです。 でも私の細胞はトランスフェクション効率が 低くて、コントロールとの差が見えません。 あきらめるしかないのでしょうか？ Q プロ メガ子より ホタルルシフェラーゼ NanoLuc 北アメリカ産ホタル 由来 トビオキヒオドシエビ 61kDa（単量体酵素） 分子量 19kDa（単量体酵素） ATP、酸素、基質（ルシフェリン） 光るのに必要なもの 酸素、基質（フリマジン） 556nm 発光波長 460nm 1 明るさ （比活性；ホタルを 1とした場合） 100 以上 数えきれないよ！ レポーターアッセイの実績 伸び盛りだよ！ トランスフェクション効率が低いってことは、ちょっとの細胞しかルシフェラーゼを発現しないって こと、つまり光が少なくて差が見えにくくなってしまうんだね！そんなときはもっと強力に光る ルシフェラーゼ「NanoLuc」を使ってシグナルを強くすれば、トランスフェクション された細胞が少なくても十分にデータがとれるよ！ A とっても明るいルシフェラーゼ「NanoLuc」で シグナルを上げればいいんです！ 比べて VS 見てみよう もっと詳しく NanoLucってどんなルシフェラーゼ？ どちらも ルシフェラーゼなのに、 いろいろ違うのね ホ N この違いのおかげで ホタルルシフェラーゼで難しかったことが、 NanoLucでできるようになったんだ！ 小さめ 青っぽい 明るい ATPいらない ナノルック プロメガ株式会社 ネバークライ!! 細胞の中での居場所が 見られるよ！ ※「発光顕微鏡」で観察するよ！ （オリンパス社 LV200 など） ※ RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay（カタログ番号 G9711） トランスフェクション効率が低い場合 NanoLucここがナイス！ ● トランスフェクション効率が低い細胞を使ってる人 ● 発現量少なめの遺伝子を調べている人 ● 実験に使える細胞がちょっとしかない人 目的タンパク質の遺伝子に NanoLuc の遺伝子をつなぐよ！ 新しい細胞生存性アッセイができたよ！※ 今までレポーターアッセイが難しかった人も、 できるようになったよ！ ウイルスゲノムに 組み込めるよ！ 調べたいタンパク質に 融合しちゃう！ ルシフェラーゼ ベクター ちょっとだけ入った 細胞の中では 少なすぎると暗いホタルルシフェラーゼは あるかどうかわかりにくいね！ でも明るい NanoLuc なら、 はっきりあることが わかるね！ NanoLuc が光れば 細胞が生きてる タンパク質が分解される タイミングを発光値 を測ることで調べら れるよ！ 入ったベクターが 少ないので、ルシ フェラーゼの生産 量も少ないね！ トランスフェクション 小さめ！ 明るい！ ATPいらない！ インフルエンザウイルスで 実績があるんだって 目的 タンパク質 N N N N 基質がミソ フリマジン 使えない 使える 光る 培地に加える （NanoLucの基質） + 化学修飾 化学修飾がとれる フリマジン 細胞生存性アッセイといえば CellTiter-Glo 2.0 だよね！ だけど、ときには ATP 以外のもので生存性を調べたい場合だってあるワケ！ 生きた細胞に取り込まれ、 還元されると… しかも !! 細胞を生かしたまま、72 時間まで 何回も測定し続けられるよ！ 「還元能」を生きた 細胞の目印として測定 しているんだ！ CellTiter-Glo 2.0 については なになになーに のVol.4 ？ で復習できるよ！ www.promega.co.jp/naninani/ ネバーギブアップ 1 2 目的タンパク質の遺伝子 NanoLuc 遺伝子 ルシフェラーゼ遺伝子 ルシ 還元 ホタルのルシフェラーゼより高性能な BRET 解析ができる！ 目的タンパク質と他のタンパク質がくっつくか、またはすごく近くに存在するか どうかを調べる方法だよ！プロはこういうのを「タンパク質間相互作用」って言ってるね！ A Q Q タンパク質がくっつくかどうかなんて、なんで調べるんですか？ FRETよりBRETの方が良いのかしら？ 蛍光タンパク質を光らせる方法 これを「タンパク質間相互作用」の実験に応用すると 多くのタンパク質は、他のタンパク質とくっついてはじめ て機能を発揮するよ！だからどんな相手とくっつくか調べ ることは、タンパク質の機能を知ることにつながるんだ！ A BRET は励起光いらずなのが良いところ！ ①励起光で細胞を傷める心配がないよ！ ②細胞の中には他にも蛍光物質がたくさん！ 励起光をあてると光っちゃって、検出のジャマになるんだ！ NanoLucここがナイス！ 質問です！ 答えるよ！ 答えるよ！ BRET（ブレット） 解析に良いね！ 特別な波長の光「励起光」 があたると光るね！ 蛍光タンパク質の蛍光エネル ギーが、さらに他の蛍光タン パク質を光らせるよ！FRET （フレット）っていう現象だね！ それぞれのタンパク質に、 ルシフェラーゼと蛍光タン パク質を融合させるよ！ 蛍 光 が 検 出 で き たら、 タンパク質がくっついた か、すごく近づいた証拠 くっつかなければ蛍光は 出ないよ！ ルシフェラーゼの発光エネルギー で蛍光タンパク質を光らせること もできるんだ！ 明るい！ 青っぽい！ 目的 タンパク質 生きた細胞で検出できるんだ！ 1 2 3 蛍光タンパク質 励起光 励起光 エネルギー ルシフェラーゼ エネルギー これが BRET 他のタンパク質 BRET は「生物発光 共鳴エネルギー転移」 （Bioluminescence Resonance Energy Transfer） の略だよ！ プロメガかわら版で プロフェッショナル による BRET の 体 験談が読めるよ！ www.promega.co.jp/ pdf/kawara1607_ p7.pdf まめちしき NanoLucなら 明るい 発光エネルギーが強いから、蛍光タンパク質を光らせるパワーも強い 青っぽい 蛍光タンパク質が出す光の波長と離れているから、蛍光検出のジャマになりにくい またまた 質問です！ 製品名 サイズ カタログ番号 新定価 クラブ価格（￥） Nano-Glo® Luciferase Assay 10ml N1110 23,000 18,000 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System 10ml N1610 39,000 31,000 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay/pNL1.1.TK Bundle 1 セット N1521 80,000 40,000 Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay/pGL4.54 [luc2/TK] Bundle 1 セット N1541 80,000 40,000 使ってみようNanoLuc BRETの場合も だいたいこんな 感じだよ！ NanoLucならうまくいきそうな気がする！ レポーターアッセイするなら何が必要なの？ ホタルルシフェラーゼのときと同じでオッケー！ 3 NanoLuc を 光らせる試薬 4 光を測定する ルミノメーター 細胞 2 細胞にベクターを入れるための トランスフェクション試薬 NanoLuc 好きな 転写調節領域 を入れられるよ！ シグナル応答配列入り のも売ってるよ 転写調節領域と NanoLuc を 1 つなげたベクター トランス フェクション 必要なもの お得に試すなら 黄金の3ステップ ステップ 1 ステップ 2 ステップ 3 プロメガクラブ 入会 NanoLuc ベクター Nano-Glo® お得にゲット RentaMAX で ルミノメーター 借りちゃおう！ あきらめていた実験に NanoLuc で 再びトライ！！ ルミノメーターが なければ RentaMAX で 借りられるよ！ 機器貸出しの RentaMAX については www.promega.co.jp/ rentamax BRET したい人は こっちも 見てね！ またまた プロメガ クラブで お得 !! プロメガクラブに入会で だけど NanoLuc は さすがにお高い… おやっ !? まさか…!! その他キット、NanoLuc ベクターもお得！ トランスフェクション試薬もお得にトライ！ テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982 ● E-Mail : prometec@jp.promega.com PK1610-02B 販売店 プロメガクラブ Web site：www.promega.co.jp/promegaclub.html プロメガ株式会社 本 社 〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所 〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2016年10月現在のものであり予告なしに変更することがあります。