pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector Systems

Technical Manual pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector Systems カタログ番号 A1360, A1380, A3600, A3610 www.promega.co.jp 注意： この日本語マニュアルは製品に添付される英文マニュアルを翻訳したもの ですが、常に更新されるものではありません。最新の英文マニュアルについ ては以下のサイトをご覧ください。 作成日：2013年4月 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 1 pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector Systems カタログ番号 A1360, A1380, A3600, A3610 目次 I.はじめに. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 II. pGEM®-TおよびpGEM®-T Easy Vectorのマルチクローニング のマルチクローニング マルチクローニング配列とベクターマップ ベクターマップ. . . . . 3 A. マルチクローニング配列…………………………………………………………………………………………….3 B. pGEM®-T Vectorのマップおよびシークエンス基準部位…………………………………………………4 C. pGEM®-T Easy Vectorのマップおよびシークエンス基準部位…………………………………………5 III. キットの構成品および保存条件. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 IV. pGEM®-TおよびpGEM®-T Easy Vectorと2XRapid Ligation Bufferを用いた リガーゼ反応プロトコール. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 V. pGEM®-TおよびpGEM®-T Easy Vectorを用いた リガーゼ反応後 リガーゼ反応後の形質転換プロトコール. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7 VI. 考慮が必要な事項. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8 A. PCR産物の純度………………………………………………………………………………………………………….8 B. 平滑末端をもつPCR産物……………………………………………………………………………………………9 C. インサート：ベクターのモル比の最適化……………………………………………………………………..10 D. 組み換え体からインサートのスクリーニング……………………………………………………………..10 E. 実験コントロール…………………………………………………………………………………………………….11 VII. 組み換え体プラスミドDNAの単離. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12 VIII. 困ったときには・ ったときには・・・. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13 IX. 参考文献. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15 X. 付録. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16 A. pGEM®-T Vectorの配列情報および制限酵素で切断できる部位………………………………………16 B. pGEM®-T Easy Vectorの配列情報………………………………………………………………………………16 C. Bufferと試薬の組成…………………………………………………………………………………………………..17 I. はじめに pGEM® -TおよびpGEM® -T Easy Vector Systemsは、PCR産物からのクローニング目的のため の簡便なシステムです。これらのベクターは、pGEM® -5Zf(+)およびpGEM® -T Easy Vectorをそ れぞれEco RVで切断し、3’末端に1塩基チミジン(T)を付加しています。1塩基チミジンの3’突出 末端(以下、3’末端 T突出)は、ベクターのセルフライゲーションを妨げ、PCR産物を効率よく挿 入するために改善されているため、特定の熱安定性ポリメラーゼにより合成されたPCR産物の クローニングに適しています(1,2)。表1に示すとおり、これらのポリメラーゼは、鋳型とは非依 存的に増幅したDNA断片の3’末端にデオキシアデノシン(dA)を付加します(3,4)。 ハイコピー数のpGEM® -TおよびpGEM® -T Easy Vectorは、β-ガラクトシダーゼのα-ペプチドの コード領域内にあるマルチクローニングサイトの両側に、T7およびSP6のRNA ポリメラーゼ プロモーターの認識配列があります。PCR産物を挿入することでα-ペプチドが不活性化するた め、プレート上のコロニーのカラーセレクションにより組み換えクローンの同定ができます。2 つのベクターのマルチクローニングサイトの領域は、欠失導入作成のためのErase-a-Base® System(カタログ番号、E5750)を用いて簡便に調製することができます。 pGEM® -TおよびpGEM® -T Easy Vectorは、いずれもクローニングサイトの両側に制限酵素認識 部位を含んでいます。pGEM® -T Easy Vectorのクローニングサイトの両側には、制限酵素のEco RI、Bst ZI、Not Iの認識部位が存在するため、3つの制限酵素のうちのどれか1つの制限酵素で反 応させると、インサートの配列を切り出すことができます。pGEM® -T Vectorのクローニングサ イトの両側には、Bst ZIの認識部位があります。また、これらのベクターは、2種類の制限酵素 を用いた切断反応により、インサートの配列を切り出すこともできます。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 2 pGEM® -TおよびpGEM® -T Easy Vectorは、一本鎖DNA(ssDNA；Section III参照)を調製するため の線状ファージf1の複製起点を含んでいます。図1に示される下側のDNA配列が一本鎖DNAとし て合成されます。 pGEM® -TおよびpGEM® -T Easy Vectorは、PCR産物と結合させるために、2xRapid Ligation Bufferが含まれています。このBufferを用いた反応条件は、室温で1時間のインキュベーションで す。インキュベーション時間は、形質転換後のコロニー数を増やすために、延長させることがで きます。一般的には、4℃、一晩のインキュベーションにより、形質転換後のコロニーを最も多 く得ることができます。 表1 熱安定性DNA PolymeraseによるPCR産物の特性比較 pGEM® -TおよびpGEM® -T Easy Vectorのアプリケーション のアプリケーション • PCR産物のクローニング • Erase-a-Base® Systemを用いたインサートDNAの一方向性欠失導入ベクターの構築 • 一本鎖DNAの産生 • 組み換え体の青/白カラーセレクション • 対向位置にあるプロモーターからのin vitro転写(Riboprobe® in vitro Transcription System 製品 マニュアルTM016 http://www.promega.com/tbs/tm016/tm016.pdfを参照) pGEM® -TおよびpGEM® -T Easy Vectorの参考文献 • Perincheri, S. et al. (2005) Hereditary persistence of α-fetoprotein and H19 expression in liver of BALB/cJ mice is due to a retrovirus insertion in the Zhx2 gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 396-401. Note: この実験では、さまざまなマウスのゲノムDNA断片を増幅し、pGEM® -TおよびpGEM® -T Easy Vectorにクローニングしています。Pfx Platinum Polymeraseで増幅したPCR産物は、 pGEM® -TおよびpGEM® -T Easy Vectorにクローニングする前に、70℃、30分間、0.2mM dATP を添加し、Taq DNA PolymeraseによりA-tailing反応を実施しています。マウスZhx2遺伝子を含 むORFは増幅され、導入遺伝子TTR-Afr1を集めるために、トランスサイレチン発現ベクターに 挿入前にシークエンスをしました。TTR-Afr1遺伝子は精製し、Zhx2導入遺伝子の発現が目的遺 伝子の抑制を回復させるかを確認するための試験に用いられました。 • Shin, H-J. et al. (2005) STAT4 expression in human T cells is regulated by DNA methylation but not by promoter polymorphism. J. Immunol. 175, 7143-50 Note: STAT4プロモーターの転写開始点を同定するために、Jurkat T細胞からTotal RNAを抽出 後にcDNA合成し、5’RACEを実施しました。増幅したPCR産物は、pGEM® -T Easy Vectorにク ローニングし、シークエンスによりインサートの配列解析をしました。 • Regue, M. et al. (2005) A second outer-core region in Klebsiella pneumoniae lipopolysaccharide. J. Bacteriol. 187, 4198-206. Note: この実験では、変異したKlebsiella pneuomoniae (肺炎桿菌)のLPSの主要生合成遺伝子群 waa遺伝子を構築しました。K. pneuomoniae由来のwaa遺伝子は、2種類のコアタイプを持ち、 これをPCRで増幅後、pGEM® -T Vectorへクローニングし、変異相補鎖解析に使用しました。 pGEM® -T Vectorの参考文献は、プロメガのホームページ(www.promega.com/citations)から調べ ることができます。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 3 II. pGEM®-TおよびpGEM®-T Easy Vectorのマルチクローニング のマルチクローニング マルチクローニング配列とベクタ ーマップ II.A. マルチクローニング配列 マルチクローニング配列 図1 pGEM® -TおよびpGEM® -T Easy Vectorのプロモーター配列およびマルチクローニング配列 上側のDNA配列は、T7 RNA Polymeraseにより合成されるRNA配列と同じです。下側のDNA配 列は、SP6 RNA Polymeraseにより合成されるRNA配列と同じです。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 4 II.B. pGEM®-T Vectorのマップおよびシークエンス基準部位 図2 pGEM® -T Vectorのマップおよびシークエンス基準部位 pGEM®-T Vector sequence reference points: T7 RNA polymerase transcription initiation site 1 multiple cloning region 10-113 SP6 RNA polymerase promoter (-17 to +3) 124-143 SP6 RNA polymerase transcription initiation site 126 pUC/M13 Reverse Sequencing Primer binding site 161-177 lacZ start codon 165 lac operator 185-201 β-lactamase coding region 1322-2182 phage f1 region 2365-2820 lac operon sequences 2821-2981, 151-380 pUC/M13 Forward Sequencing Primer binding site 2941-2957 T7 RNA polymerase promoter (-17 to +3) 2984-3 Note: インサートは、SP6 Promoter Primer (カタログ番号、Q5011)、T7 Promoter Primer (カタ ログ番号、Q5021)、pUC/M13 Forward Primer (カタログ番号、Q5601)またはpUC/M13 Reverse Primer (カタログ番号、Q5421)を用いてシークエンスできます。 ! 注意：Bst ZI (カタログ番号、R6881)による消化反応で、pGEM® -T Vectorに挿入したクローン を切り出すことができます。2種類の制限酵素による消化反応でもインサートを切り出すことが できます。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 5 II.C. pGEM®-T Easy Vectorのマップおよびシークエンス基準部位 図3 pGEM® -T EasyVectorのマップおよびシークエンス基準部位 pGEM®-T Easy Vector sequence reference points: T7 RNA polymerase transcription initiation site 1 multiple cloning region 10-128 SP6 RNA polymerase promoter (-17 to +3) 139-158 SP6 RNA polymerase transcription initiation site 141 pUC/M13 Reverse Sequencing Primer binding site 176-197 lacZ start codon 180 lac operator 200-216 β-lactamase coding region 1322-2182 phage f1 region 2380-2835 lac operon sequences 2836-2996, 166-395 pUC/M13 Forward Sequencing Primer binding site 2949-2972 T7 RNA polymerase promoter (-17 to +3) 2999-3 Note: インサートは、SP6 Promoter Primer (カタログ番号、Q5011)、T7 Promoter Primer (カタ ログ番号、Q5021)、pUC/M13 Forward Primer (カタログ番号、Q5601)またはpUC/M13 Reverse Primer (カタログ番号、Q5421)を用いてシークエンスできます。 ! 注意：Bst ZI (カタログ番号、R6881)、Eco RI(カタログ番号、R6011)またはNot I(カタログ番 号、R6431)による消化反応で、pGEM® -T Easy Vectorに挿入したクローンを切り出すことがで きます。2種類の制限酵素による消化反応でもインサートを切り出すことができます。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 6 III. キットの構成品および保存条件 製品 サイズ サイズ カタログ番号 pGEM® -T Vector System I 20回分 A3600 以下の試薬が含まれます。 • 1.2µg pGEM® -T Vector (50 ng/µl) • 12µl Control Insert DNA (4 ng/µl) • 100u T4 DNA Ligase • 200µl 2XRapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase 製品 製品 サイズ サイズ カタログ番号 pGEM® -T Vector System II 20回分 A3610 以下の試薬が含まれます。 • 1.2µg pGEM® -T Vector (50 ng/µl) • 12µl Control Insert DNA (4 ng/µl) • 100u T4 DNA Ligase • 200µl 2XRapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase • 1.2ml JM109 Competent Cells, High Efficiency (6×200µl) 製品 製品 サイズ サイズ カタログ番号 pGEM® -T Easy Vector System I 20回分 A1360 以下の試薬が含まれます。 • 1.2µg pGEM® -T Easy Vector (50 ng/µl) • 12µl Control Insert DNA (4 ng/µl) • 100u T4 DNA Ligase • 200µl 2XRapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase 製品 製品 サイズ サイズ カタログ番号 pGEM® -T Easy Vector System II 20回分 A1380 以下の試薬が含まれます。 • 1.2µg pGEM® -T Easy Vector (50 ng/µl) • 12µl Control Insert DNA (4 ng/µl) • 100u T4 DNA Ligase • 200µl 2XRapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase • 1.2ml JM109 Competent Cells, High Efficiency (6×200µl) 保存条件： カタログ番号A3610とA1380に含まれるコンピテントセルは、–65°C以下で保存し てください。それ以外のすべての試薬は、–15～–25°Cで保存してください。 IV. pGEM®-TおよびpGEM®-T Easy Vectorと2XRapid Ligation Bufferを用い たリガーゼ反応プロトコール 1. pGEM® -TおよびpGEM® -T Easy VectorとControl Insert DNAのチューブを軽く遠心し、内容物 をチューブの底へ集める。 2. 次に示すリガーゼ反応溶液を調製する。 Note: 0.5mlの低DNA結合性チューブ(例として、VWR カタログ番号、20170-310)を使用してく ださい。 ! 注意：2XRapid Ligation Bufferは、使用前によく攪拌してください。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 7 表1 リガーゼ反応組成 標準反応 ポジティブ コントロール バックグランド 2XRapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase pGEM® -TまたはpGEM® -T Easy Vector PCR産物 Control Insert DNA T4 DNA Ligase (3 Weiss units/µl) 5 µl 1 µl X µl – 1 µl 5 µl 1 µl – 2 µl – 1 µl 5 µl 1 µl -l – 1 µl 脱イオン化水を加えた最終液量 10 µl 10 µl 10 µl *PCR産物：ベクターのモル比は、最適化が必要な場合があります(Section VI.C参照) 3. リガーゼ反応溶液をピペッティングで攪拌したあと、室温で1時間インキュベートする。この 代わりに、4℃で一晩インキュベートすることもできます。 Notes: 1. pGEM® -TまたはpGEM® -T Easy Vectorのリガーゼ反応には、このシステムに付属しているプ ロメガのT4 DNA Ligaseだけを使用してください。他社で販売しているT4 DNA ligaseには、エ キソヌクレアーゼ活性があると、ベクターの3’末端のチミジンを除去してしまうことがあります。 2. 2XRapid Ligation BufferにはATPが含有しています。ATPは、温度変化によって分解してしま うため、凍結融解の繰り返しはなるべく避けてください。また、1回のbuffer調製の際に何度も 温度変化が生じるような条件下に置かないようにしてください。 3. 2XRapid Ligation Bufferは、使用前によく攪拌してください。 4.リガーゼ反応時間を長くすることで、形質転換できる数を増加させることができます。一般的 に、4℃で一晩インキュベーションしたときに、最大数の形質転換体を得ることができます。 V. pGEM®-TおよびpGEM®-T Easy Vectorを用いたリガーゼ反応後の形質転換 プロトコル 形質転換には、高効率コンピテントセル(1×108 cfu/µg DNA 以上)を使用してください。1塩基突 出のDNA断片のリガーゼ反応が不十分なことがあります。十分なコロニー数を得るためには、 形質転換効率が1×108 cfu/µg DNA(または、これ以上)のコンピテントセルを使用する必要があり ます(Section VI. E参照)。 プロメガではJM109 High Efficiency Competent Cells(カタログ番号、L2001)の使用を薦めます。 このコンピテントセルは、pGEM® -TまたはpGEM® -T Easy VectorのSystem IIに付属しています。 その他のコンピテントセルを使用することも可能ですが、アンピシリンによる薬剤セレクション と青/白カラーセレクションに適合できるものを選択してください。 JM109は、コンピテントセルの調製前にチアミン塩酸塩を添加したM9最小培地プレートで生育 させてください。これは、F’エピソームの存在、宿主のプロリン栄養要求性を補うproAB遺伝子、 青/白カラーセレクションに必要とされる(proAB)欠損とlacI q ZΔM15を選択するためです。もし、 プロメガで販売されているJM109 High Efficiency Competent Cells以外のコンピテントセルを使 用する場合、次に示す適切な形質転換プロトコルは重要です。形質転換体の選択は、LB/アンピ シリン/IPTG/X-Galプレートを使用してください(Section XI. C参照)。最もよい結果を得るために は、調製してから1ヶ月以上経過したプレートを使用しないでください。 JM109の遺伝子型：recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rK－,mK+), relA1,supE44, ∆(lac-proAB), [F´, traD36, proAB, lacI q Z∆M15] (5). 準備するもの (各試薬の組成は、Section XI. Cに記載しています) • LB プレート(アンピシリン/IPTG/X-Gal) • SOC培地 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 8 1. 各リガーゼ反応溶液あたり、2枚のLB (アンピシリン/IPTG/X-Galを含有)プレートと形質転換 効率を決定するためにさらに2枚のプレートを用意する。大腸菌をプレートに蒔種する前に室温 に平衡化しておく(ステップ10) 2. リガーゼ反応溶液を含むチューブを軽く遠心し、内容物をチューブの底へ集める。リガーゼ 反応溶液2µlを氷上に置いた滅菌済み1.5mlチューブに添加する(Note 1を参照)。コンピテントセ ルの形質転換効率を決定するために、制限酵素で消化していないプラスミドDNAを氷上に置い た別の滅菌チューブに添加する(Section VI. E参照) 3. JM109 High Efficiency Competent Cellsを保管場所から取り出し、融解するまで氷上に置く(約 5分間)。チューブを軽く叩いて、コンピテントセルを混合する。 ! 注意：コンピテントセルは非常に壊れやすいため、過剰なピペッティングによる混合は避けて ください。 4. コンピテントセル50µlをステップ2で調製したチューブに注意しながら添加する(形質転換効 率確認用のサンプルでは、コンピテントセルを100µl使用する)。 5. チューブを軽く叩いてよく攪拌し、氷上で20分間静置する。 6. 42℃の水浴に45～50秒間チューブを置き、コンピテントセルにヒートショックを与える。 7. チューブをすぐに氷上戻し、2分間静置する。 8. 室温になっているSOC培地 950µlをコンピテントセルとリガーゼ反応溶液の入ったチューブ へ添加する。制限酵素で消化していないプラスミドDNAを含むコンピテントセルの入ったチュ ーブには、900µlのSOC培地を添加する。(LB培地を代用できますが、生育するコロニー数が少 なくなります。) 9. 振とうさせながら(～150rpm)、37℃、1.5時間インキュベートする。 10. LB/アンピシリン/IPTG/X-Gal プレートに100µlの形質転換後の培養液を添加する。(形質転換 のコントロールについては、SOC培地で10倍に希釈した溶液をプレートに加えることを勧めま す。たくさんのコロニーが必要なときは、1,000xg、10分間遠心して、コンピテントセルを集め、 200µlのSOC培地に懸濁させてください。そして、2枚のプレートに100µlずつ添加してください。) 11. プレートを一晩、37℃でインキュベートする。(経験的に、1×108 cfu/µg DNAのコンピテン トセルを使用し、100µlをプレートに添加したときに、プレート1枚あたり約100個のコロニー確 認できます。長期間の培養または4℃でのプレートの保存(37℃、一晩のインキュベート後)は、 青コロニーの発色を促進させます。白コロニーには、一般的にインサートが挿入されていると考 えられますが、青コロニーとして存在することもあります。詳細な情報はSection VI. Dを参照し てください。) Notes: 1. 経験的に大きいサイズのポリプロピレンチューブ(17×100 mm、例えば、ファルコン、カタロ グ番号、2059)を使用すると、形質転換効率が増加します。いくつかのメーカーで販売されてい るチューブはDNAと結合し、その結果コロニー数が減少します。このようなチューブの使用は 避けてください。 2. β-ガラクトシダーゼ活性をもつコロニーは、β-ガラクトシダーゼ活性を持たないコロニーに比 べて生育が遅いため、一晩の培養による青コロニーは、直径が約1mm程度で、白コロニーより も小さくなります。 VI. 考慮が必要な事項 VI.A. PCR産物の純度 PCR反応の溶液は、リガーゼ反応に使用する前に、アガロースゲルで解析してください。 Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System(カタログ番号、A9281)を使用してアガロースゲル から、もしくはPCR産物から直接精製したPCR産物は、リガーゼ反応に用いることができます。 ピリミジンダイマーの形成を避けるために、短波長UVの照射時間をできるだけ短くしてくださ い。アガロースゲル内で、PCR産物のスメアリングや不必要なバンドが認められたときは、目 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 9 的のサイズのバンドを切り出し、Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up Systemで精製してくださ い。それでも目的のサイズのバンドが区別できないときは、ゲルろ過もしくはWizard® SV Gel and PCR Clean-Up Systemを使ってプライマーを除去してください。未精製のPCR産物をリガ ーゼ反応に使用できるかもしれませんが、プライマーダイマーや非特異的に増幅したPCR産物 の影響により、正しくインサートが挿入できた白コロニーの数が減少します。したがって、PCR 産物が挿入できたコロニーを同定するために、複数個のコロニーからスクリーニングする必要が あります。 VI.B. 平滑末端をもつ 平滑末端をもつPCR産物 Pfu DNA Polymerase(カタログ番号、M7741)、Pwo DNA Polymerase、Tli DNA Polymerase(カ タログ番号、M7101)のようなプルーフリーディング活性を持つ耐熱性DNA Polymeraseは、PCR 増幅反応で平滑末端断片を生成します。これらのPolymeraseを使って生成した平滑末端断片は、 図4で示されるように、A-tailing反応を行うことで、pGEM® -TおよびpGEM® -T Easy Vectorとリ ガーゼ反応ができます(6)。この方法を用いると、平滑末端では、複数のインサートが挿入して しまうのとは対照的に、1つのインサートだけを挿入することができます。さらに、T-ベクター クローニングは、脱リン酸化の必要がないため、ベクターのセルフライゲーションのバックグラ ンドが低くなります。 最適化したベクター：インサート比で実施することで、PfuおよびTli DNA Polymeraseをイン サートDNAの増幅に使用したときに、55～95%の組み換え体を得ることができます(表2)。 Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System(カタログ番号、A9281)、もしくは別の方法により ゲルから直接PCR産物の精製をすることは重要です。プルーフリーディング活性を持つPfu、 PwoおよびTli DNA Polymeraseで増幅したPCR産物の精製を行わないと、これらのポリメラー ゼにより、A-tailing反応で付加された3’-末端デオキシアデノシン、またはベクター由来の3’-末端 デオキシチミジンが、A-tailing反応とリガーゼ反応の間に脱離し、PCR産物は分解します。 クローニング効率を最適化するために、A-tailing反応およびリガーゼ反応に使用するDNA量は、 精製したPCR産物の分子量に合わせて調整します。短いDNA断片、もしくは非常によく増幅し たPCR産物のように、DNAのモル濃度が高いときは少量のPCR産物をこれら2つの反応に使用し てください。しかし、長鎖DNA、もしくは増幅効率があまり良くないPCR産物のように、DNA のモル濃度が低いときは、大容量のPCR産物をこれら2つの反応に使用してください。プロメガ では、精製したPCR産物の1～7µlをA-tailing反応およびリガーゼ反応に使用しました(Section VI. C 「インサート：ベクターのモル比の最適化」を参照してください)。組み換え体は、青/白カラ ーセレクションにより同定され、その70～100%は、正しい長さのPCR産物が挿入できていまし た。A-tailingしていないPCR産物を使用したコントロール試験では、組み換え体は確認されませ んでした。このコントロール結果から、かなりの割合でA-tailing反応とTaq DNA Polymeraseに よる3’末端 デオキシアデノシン付加したPCR産物がpGEM® -T Easy Vectorに挿入できることを 確認しました。 表2 異なるDNA Polymeraseで増幅したPCR反応から、A-tailing反応操作での比較 %組み換え体1 24℃、1時間のリガーゼ反応(標準法) 4℃、16時間のリガーゼ反応(代替法) Polymerase 542bp 1.8kb 542bp 1.8kb Pfu DNA Polymerase Tli DNA Polymerase 65～84%2 68～77%4 31～55%3 37～65%5 81～95%2 85～93%4 50～75%3 60～81%5 PCR産物は、PfuまたはTli DNA Polymeraseにより生成し、A-tailing反応後、GEM® -T Easy Vectorとリガー ゼ反応を実施した。リガーゼ反応後の溶液2µlをJM109コンピテントセルへ形質転換し、LB/アンピシリン /IPTG/X-Gal プレートに蒔いた。 1 %組み換え体＝プレートに生育した白コロニーと青コロニーの割合。PCR産物はA-tailing反応前にWizard® PCR Preps DNA Purification Systemで精製した。 2.試験したインサート：ベクターのモル比は、5：1、3：1、1：1。A-tailing反応に用いたPCR産物の容量：1～2µl 3. 試験したインサート：ベクターのモル比は、3：1、2：1、1：1。A-tailing反応に用いたPCR産物の容量：3～7µl 4. 試験したインサート：ベクターのモル比は、3：1、2：1、1：1。A-tailing反応に用いたPCR産物の容量：1～2µl 5. 試験したインサート：ベクターのモル比は、2：1、1：1。A-tailing反応に用いたPCR産物の容量：4～7µl プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 10 プルーフリーディングポリメラーゼ(例えば、Pfu DNA Polymeraseなど) により増幅後の精製したPCR産物1～7µlを準備する。 ↓ Taq DNA Polymeraseの10x Reaction Buffer(MgCl2含有)を1µl添加する。 ↓ 終濃度が0.2mMとなるようにdATPを添加する。 ↓ 5ユニットのTaq DNA Polymeraseを添加する。 ↓ 終容量が10µlとなるように脱イオン化水を添加する。 ↓ 70℃、15～30分間インキュベートする。 ↓ プロメガのpGEM® -TまたはpGEM® -T Easy Vectorとリガーゼ反応に1～2µlを使用する。 図4 Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System(カタログ番号、A9281)で精製した平滑末端 PCR産物のA-tailing反応とT-ベクタークローニングの操作手順 VI.C. インサート：ベクターのモル比の最適化 pGEM® -TまたはpGEM® -T Easy Vector Systemは、Control Insert DNA：ベクターのモル比が 1：1のときが最適です。しかし、8：1、または1：8のモル比を用いたときでもクローニングは 成功します。まず最初に、PCR産物のモル比の最適化条件を検討する必要があるかもしれませ ん。3：1から1：3のモル比は、初期のパラメーターとして適切でしょう。PCR産物の濃度は蛍 光測定法(7)を用いるか、アガロースゲル上にあるDNAマーカーと比べて推定してください。 pGEM® -TまたはpGEM® -T Easy Vectorは、DNA鎖長がおよそ3kb、DNA濃度が50ng/µlとして提 供しています。リガーゼ反応に添加する適切なPCR産物(インサート)の量を計算するために、以 下の式を使用してください。 ベクターDNA量(ng) x インサートの鎖長(kb) ベクターの鎖長(kb) x インサート：ベクター(モル比) ＝インサートDNA量(ng) インサート：ベクターのモル比計算例： 3.0kbのベクター50ngへ0.5kbのインサートを挿入するときに、インサート：ベクターのモル比 が3：1の条件では、どれくらいの量のPCR産物をリガーゼ反応に添加すればよいですか？ 50 ng ベクター量 x 0.5kb インサート 3 3.0kbのベクター x 1 ＝25 ng インサートDNA量 インサート：ベクターのモル比を1：1の条件で、同じパラメーターを使用した場合、8.3ngのイ ンサート(0.5kb)が必要になります。 VI.D. 組み換え体からインサートのスクリーニング スクリーニング β-ガラクトシダーゼコード領域内にインサートを組み込むことによる、pGEM® -Tまたは pGEM® -T Easy Vectorのクローニングから得られた組み換え体は、IPTG/X-Galが含まれるプレ ート上に認められるカラーセレクションにより同定されます。しかし、pGEM® -TまたはpGEM® -T Easy Vectorに挿入されたPCR産物の特徴は、コンピテントセルの形質転換の後に得られる青/ 白コロニー数の比に大きく影響を受けます。大部分のPCR産物を含むクローンは、白コロニー となりますが、PCR産物がlacZ遺伝子内の翻訳領域内でクローニングされたときは、青コロニー になることがあります。このようなときのインサートDNA断片は、3の倍数の塩基長となってお り(3’末端 A突出を含む)、インサート配列に終止コドンが含まれていません。2kbまでのインサ ートDNA断片を翻訳領域内に挿入して、青コロニーとなっている報告例があります。 PCR産物が3の倍数の塩基長ではなく、増幅過程で変異が起こらないとしても(例として、欠失、 または点変異など)、pGEM® -TまたはpGEM® -T Easy VectorにDNA断片を挿入したサンプルを形 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 11 質転換したコンピテントセルで青コロニーを示すことがあります。 pGEM® -TまたはpGEM® -T Easy Vector Systemに付属しているControl Insert DNAは、 pGEM® -luc Vector DNA(カタログ番号、E1541)由来の542bpの断片です。この配列は、すべて6 つのリーディングフレーム内に複数の終止コドンを含むように変異導入し、コントロール反応に おける青コロニーのバックグランドが低くなるようにしています。Control Insert DNAで得られ た結果は、個々のユーザーが使用するPCR産物の基準に当てはまらないかもしれません。 VI.E. 実験コントロール 実験コントロール プロメガでは、以下に示すコントロールの実施を強く推奨します。これらは、pGEM® -Tまた はpGEM® -T Easy Vector Systemの性能を正確に調べるために必要とされています。 陽性コントロール 陽性コントロール Section IVとSection Vで述べられているControl Insert DNAを使ったリガーゼ反応とこれを形 質転換する方法を実施してください。このコントロールは、リガーゼの反応が効率よく進行して いるかを確認することができます。一般的に、1×108 cfu/µg DNAの形質転換効率を持つコンピテ ントセルを用いたときに、およそ100個コロニーが確認でき、このなかの10～40%が青コロニー となります。60%以上が白コロニーとなっているはずです。Control Insert DNAは、白コロニー となるように設計しています。しかし、インサートDNAによっては、白コロニーにならないこ ともあります(Section VI. D.参照)。陽性コントロールリガーゼ反応から得られた青コロニーのバ ックグランドは、3’末端 T突出ではない場合、もしくはpGEM® -TまたはpGEM® -T Easy Vector が直鎖状に切断されていないときに起こります。これらの青コロニーは、形質転換の内部標準と して使用できます。コロニーが全く生育していない場合は、形質転換が失敗しています。青コロ ニーだけが生育していた場合は、リガーゼ反応が失敗しています。陽性コントロール反応で白コ ロニー数が50%以下となった場合は、リガーゼ反応条件が完全に最適化されていません。 Control Insert DNAの濃度は4ng/µlです。2µl(4ng/µl)のDNA量は、10µlのリガーゼ反応液内で、 50ngのpGEM® -TまたはpGEM® -T Easy Vector Systemと1：1のモル比となっています。 バックグランドコントロール バックグランドコントロール Section IVに記載されているように、インサートを添加していない50ngのpGEM® -Tまたは pGEM® -T Easy Vectorのリガーゼ反応を準備してください。そして、Section Vに記載されてい る方法で形質転換を実施してください。このコントロールは、3’末端 T突出の欠失または pGEM® -TまたはpGEM® -T Easy Vectorから得られるバックグランドの青コロニーの数を決定す ることができます。Section Vで推奨されている方法であれば、1×108 cfu/µg DNAの形質転換効 率を持つコンピテントセルを用いたときに、10～30個の青コロニーが観察されます(同じ条件下 では、1×107 cfu/µg DNAのコンピテントセルでは、1～3個の青コロニーとして、1×109 cfu/µg DNA のコンピテントセルでは、100～300個の青コロニーが観察されます)。PCR産物を用いた標準反 応で得られた青コロニー数とコントロール試験で得られたバックグランドの青コロニーの数を 比較してください。PCR産物を用いたリガーゼ反応がバックグランドコントロール反応よりも 非常に多くの青コロニーを産出している場合は、これらの青コロニーの中に組み換え体が含まれ ていると考えられます(Section VI. D参照)。 形質転換コントロール 形質転換コントロール 環状プラスミド(pGEM® -TまたはpGEM® -T Easy Vectorは、直鎖状になっているため、使用し ないでください)を形質転換し、コンピテントセルの形質転換効率を確認し、cfu/µg DNAを計算 してください。もし形質転換効率が 1×106 cfu/µg DNAより低いときは、新しいコンピテントセ ルを準備してください(コンピテントセルはプロメガで販売しています)。もし、JM109 High Efficiency Competent Cells(カタログ番号、A3610または、A1380のpGEM® -TまたはpGEM® -T Easy Vector System IIにそれぞれ付属しています)を使用しない場合は、少なくとも1×106 cfu/µg DNAの形質転換効率を持つコンピテントセルが、アンピシリン薬剤耐性セレクションによる青/ 白カラーセレクションに適合できることを確認してください。 形質転換効率の 形質転換効率の計算例 0.1ngの環状プラスミドDNAで形質転換した後のコンピテントセル100µlに、900µlのSOC培地 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 12 を添加する(0.1ng DNA/ml)。この量から、さらにSOC培地で10倍希釈し(0.01ng DNA/100µl)、2 枚のプレートに100µlを蒔種する(0.001ng DNA/100µl)。もし、200個のコロニー(2枚のプレート の平均値)が得られた場合、形質転換効率はどれくらいになりますか？ 200 cfu 0.001 ng ＝2 x 105 cfu/ ng ＝2 x 108 cfu/ µg DNA VII. 組み換え体プラスミドDNAの単離 組み換え体プラスミドDNAの単離のために、標準的なプラスミドミニプレップの操作を行うこ とができます。プロメガのProtocols and Application GuideのDNA Purification Chapter部分にプ ラスミドDNA精製法の概要が記載されています(8)。簡便で信頼性のある方法として、Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System(カタログ番号、A1330)があります。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 13 VIII. 困ったときには 困ったときには・・・ ここに記載のない疑問点については、プロメガテクニカルサービス部までお問い合わせください。 E-mail： prometec@jp.promega.com 症状 症状 原因 原因および改善点 コロニーが全く形成されない 形質転換時に問題が生じたか、コンピテントセルが形質 転換能を失っています。バックグラウンドコントロール (インサートなしのリガーゼ反応)をチェックする(Section VI. E参照)。通常10～30個の青いコロニーが確認できま す。 高い形質転換効率を持つコンピテントセル(1×108 cfu/µg DNA以上)を用いてください。pGEM® -5Zf(+) Vectorなど の環状プラスミドを用いた形質転換効率を試験し、薬剤 セレクションを実施してください。Section V. Aのガイド ラインによると、1×108 cfu/µg DNAのコンピテントセル では、通常100個程度のコロニーを形成します。したがっ て、1×108 cfu/µg DNA未満のコンピテントセルからは、 コロニーは確認できないでしょう(Section VI. E参照)。 Control Insert DNAを用いた試験での白いコロニー形成率 が10%以下 2X Rapid Ligation Bufferの希釈が不適切です。2X Rapid Ligation Bufferは、10µl反応あたり5µl添加します。 生育した全コロニー数が多く、白コロニーが全く認めら れないときは、コンピテントセルの形質転換効率が高く (1×109 cfu/µg DNA)、リガーゼ反応に問題があるかもしれ ません。109 cfu/µg DNAのコンピテントセルを用いた陽性 コントロールのリガーゼ反応で、白コロニー数が70～ 90%、1,000個のコロニーが得られるでしょう。もし、リ ガーゼ反応条件が最適化されていない、もしくは失敗し ているときは、生育している全コロニー数は多くなりま すが(1×109 cfu/µg DNAのコンピテントセル使用で300個 程度です)、白コロニー数が少ないか、ゼロになります。 以下のリガーゼ反応失敗のコメントを参照してくださ い。 リガーゼ反応が失敗しています。リガーゼBufferの活性が 低くなっています。2X Rapid Ligation Bufferには、ATP が含有していて、温度変動に伴って分解します。凍結融 解の繰り返しは避け、1回に使用する量を新しいチューブ に分注してください。リガーゼやBufferの活性を試験する ためには、～20ngのDNAマーカー(例えば、Lambda DNA/Hind III Markers、カタログ番号、G1711)を準備して ください。リガーゼ反応を実施したDNAと未実施のDNA をアガロース電気泳動で比較し、高分子量物質として DNA断片がセルフライゲーションしていることを確認し てください。 1塩基T突出が欠失し、ベクターの平滑末端によるセルフ ライゲーション由来の青コロニーが白コロニーよりも多 く生育しています。1塩基T突出を分解するヌクレアーゼ の導入は避けてください。このシステム付属しているT4 DNA Ligaseだけを使用してください。このリガーゼは、 エキソヌクレアーゼ活性が最小となっています。 Control Insert DNAを用いた試験での白コロニ ー形成率が60%以下 2X Rapid Ligation Bufferの希釈が不適切です。2X Rapid Ligation Bufferは、10µl反応あたり5µl添加します。 1塩基T突出が欠失し、ベクターの平滑末端によるセルフ ライゲーション由来の青コロニーが白コロニーよりも多 く得られています。1塩基T突出を分解するヌクレアーゼ の導入は避けてください。このシステム付属しているT4 DNA Ligaseだけを使用してください。このリガーゼは、 エキソヌクレアーゼ活性が最小となっています。 リガーゼ反応温度が高すぎます。高い反応温度(28℃以上) では、バックグラウンドが高くなり、組み換え体は少な くなります。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 14 VIII. 困ったときには 困ったときには・・・(続き) PCR産物を用いた試験による結果、白コロニ ーが全く形成されない、もしくは白コロニー 数が少ない 2X Rapid Ligation Bufferの希釈が不適切です。2X Rapid Ligation Bufferは、10µl反応あたり5µl添加します。 リガーゼ反応時間が不十分です。反応を一晩実施すると、 最もよい結果が得られます。 PCR産物に含まれる夾雑物により、リガーゼ反応が阻害 されています。PCR産物を陽性コントロールと混合し、 阻害物の存在を確認してください。PCR産物中に反応阻 害物が確認された場合は、PCR産物を精製してください。 PCR産物に3’末端A付加がありません。表1に要約されて いるとおり、すべての熱安定性DNA Polymeraseが、3’末 端A付加することはありません。平滑末端断片を適切な polymeraseとdATPにより処理し、A-tailing反応を実施し てください。 UV照射によるピリミジンダイマー形成のために、PCR産 物がサブクローニングできませんでした｡これは、ゲルか らの切り出しによるDNA精製と共通の問題です。この場 合のDNAを作り直す方法はありません。なるべく、UV照 射の時間は短くしてください。UV照射量を減少させるた めに、光源とゲルの間にガラスプレートを使用してくだ さい。可能であれば、PCR産物を確認するときは、長波 長UVだけを使用してください。 PCR産物はサブクローニングされていますが、lacZ gene が機能しています。PCR産物のリガーゼ反応よる青コロ ニー数が、バックグラウンドコントロールの青コロニー 数よりも多い場合、青コロニーの中に、インサートが含 まれていることがあります。青コロニーと薄い青色のコ ロニーをスクリーニングしてください(Section VI. C参 照)。 インサート：ベクターのモル比が最適化されていません。 PCR断片の精製度と量をアガロース電気泳動で確認し、 インサート：ベクターのモル比を最適化してください (Section VI. C参照)。 調製されたPCR産物の中にプライマーダイマーが含まれ ているかもしれません。プライマーダイマーがpGEM® -T およびpGEM® -T Easy Vectorにクローニングされていま すが、サイズが小さいために、制限酵素による消化反応 やアガロース電気泳動では確認できません。このリガー ゼ反応では、バックグランドコントロールよりも青コロ ニーが多く確認されます。PCR産物をアガロースゲル切 り出しにより精製してください。 さまざまな鎖長のPCR産物が生成され、pGEM® -Tおよび pGEM® -T Easy Vectorにクローニングされています。必 要とする鎖長のPCR産物をアガロースゲル切り出しによ り精製してください。 DNAの組み換えが起きています。DNAの組み換えがラン ダムに起こっているかを調べるために、1つのクローンを 確認してください。もし、目的のクローンが、ランダム に組み換わって存在しているときは、いくつかのクロー ンもスクリーニングにより同定してください。すべての クローンで同じ組み換えが起きているときは、修復欠損 株(例えば、SURE® cells)を使用してください。組み換え 現象が低減されます。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 15 VIII. 困ったときには 困ったときには・・・(続き) PCR産物を用いた試験による結果、白コロニ ーだけを形成する(青コロニーなし) アンピシリンが失活しているため、アンピシリン感受性 の菌が増殖しています。アンピシリンプレートを適切に 調製しているか確認し、1ヶ月以内に使用してください。 アンピシリンの活性を試験するために、アンピシリンを 添加する箇所とアンピシリンを添加しない箇所にプレー トを分割し、アンピシリン感受性株をプレートへ接種し てください。 大腸菌株(例えば、JM109)がF’エピソームを失っていま す。バックグランドコントロールを確認してください。 これらが青コロニーでない場合、F’エピソームを失ってい ることが考えられます(適切なプレートが用いられ、lacIq Z ΔM15が形質転換した菌体のF’に位置したと仮定し場 合)。コンピテントセルがこのシステムに使用するために、 適切に調製されているか確認してください(Section V参 照)。 プレートが青/白スクリーニングに適合していません。バ ックグランドコントロールを実施してください。もし、 青コロニーが認められない場合、アンピシリン /IPTG/X-Galプレートを調製してください。プレートの質 が疑わしいときは、新たに調製したプレートを使用して ください。 目的とするPCR産物を含むクローン数が十分 に存在していない PCR産物のA-tailing反応が不十分です。PCR産物を精製 後、A-tailing反応を実施してください(9-11)。サンプルを 精製し、プロトコルにしたがって操作を進めてください。 インサート：ベクターのモル比が最適化されていません。 PCR断片の精製度と量をアガロース電気泳動で確認し、 インサート：ベクターのモル比を最適化してください (Section VI. C参照)。 さまざまな鎖長のPCR産物が生成され、pGEM® -Tおよび pGEM® -T Easy Vectorにクローニングされています。必 要とする鎖長のPCR産物をアガロースゲル切り出しによ り精製してください。 IX. 参考文献 1. Mezei, L.M. and Storts, D.R. (1994) Purification of PCR products. In: PCR Technology: Current Innovations, Griffin, H.G. and Griffin, A.M., eds., CRC Press, Boca Raton, FL, 21. 2. Robles, J. and Doers, M. (1994) pGEM®-T Vector Systems troubleshooting guide. Promega Notes 45, 19-20. 3. Clark, J.M. (1988) Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucl. Acids Res. 16, 9677-86. 4. Newton, C.R. and Graham, A. (1994) In: PCR, BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford, UK, 13. 5. Messing, J. et al. (1981) A system for shotgun DNA sequencing. Nucl. Acids Res. 9, 309-21. 6. Knoche, K. and Kephart, D. (1999) Cloning blunt-end Pfu DNA Polymerase-generated PCR fragments into pGEM®-T Vector Systems. Promega Notes 71, 10-13. 7. Haff, L. and Mezei, L. (1989) Amplifications 1, 8. 8. Protocols and Applications Guide, Online Edition (2005) Promega Corporation. (www.promega.com/paguide/) 9. Kobs, G. (1995) pGEM®-T Vector: Cloning of modified blunt-ended DNA fragments. Promega Notes 55, 28-29. 10. Kobs, G. (1997) Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM®-T Vector Systems. Promega Notes 62, 15-18. 11. Zhou, M.-Y., Clark, S.E. and Gomez-Sanchez, C.E. (1995) Universal cloning method by TA strategy. BioTechniques 19, 34-35. プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 16 X. 付録 X.A. pGEM®-T Vectorの配列情報および制限酵素で切断できる部位 pGEM® -T Vectorは、環状のpGEM® -5Zf(+) Vector(GeneBank® Accesstion No. X65308)からの 誘導されてます。 pGEM® -5Zf(+) Vectorの配列は、ホームページに情報があります。：www.promega.com/vectors pGEM® -T Vectorは、pGEM® -5Zf(+) VectorのEco RVの認識部位(position : 51)で切断し、3’末 端にTを付加しています。 各種制限酵素の認識部位は、英文マニュアルpg.21～22のTable 3およびTable4を参照してくだ さい。 X.B. pGEM®-T Easy Vectorの配列情報 pGEM® -T Easy Vectorの配列は、ホームページに情報があります。：www.promega.com/vectors pGEM® -T Easy Vectorは、Eco RVの認識部位(position : 60)で切断し、3’末端にTを付加してい ます。 各種制限酵素の認識部位は、英文マニュアルpg.23～24のTable 6およびTable7を参照してくだ さい。 プロメガ株式会社 テクニカルサービス部 TEL:03-3669-7980, prometec@jp.promega.com 17 X.C. Bufferと試薬の組成 IPTG ストック溶液(0.1M) 1.2g IPTG 終容量が50mlとなるように水を添加する。 フィルターろ過後、4℃で保存する。 X-Gal (2ml) 100mg 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 2mlのN,N’-dimethyl formamideで溶解し、アル ミホイルで遮光し、－20℃保存する。 LB培地 (1リットル) 10g Bacto®-tryptone 5g Bacto®-yeast extract 5g NaCl NaOHでpH7.0に調整する。 アンピシリンを アンピシリンを含むLBプレート 1リットルのLB培地に15gの寒天を添加する。 50℃になるまで培地が冷めたら、終濃度 100µg/mlとなるようにアンピシリンを添加す る。85mmのペトリ皿に30～35mlの培地を注ぐ。 アガロースが固まったら、4℃、1ヶ月間まで、 室温では、1週間まで保存できる。 アンピシリン/IPTG/X-Gal プレート 上記のアンピシリンを含むLBプレート調製し、 0.5mMのIPTGと80µg/mlのX-Galをこのプレー トに添加する。あるいは、100mMのIPTG100µl と50mg/mlのX-Gal 20µlをアンピシリンを含む LB培地に塗布し、使用前に37℃、30分間静置し、 LBプレート表面に吸着させる。 SOC培地 (100ml) 2.0g Bacto®-tryptone 0.5g Bacto®-yeast extract 1ml 1M NaCl 0.25ml 1M KCl 1ml 2M Mg2+ stock, filtersterilized 1ml 2M glucose, filter-sterilized Bacto®-tryptone、Bacto®-yeast extract、NaCl、KCl を97mlの蒸留水に添加し、攪拌して溶解させる。滅 菌後、室温に冷却する。2M Mg2+と2M glucoseを終 濃度が20mMとなるように、それぞれ添加する。終 容量が100mlとなるように滅菌水を添加する。pH は、7.0になっていることを確認する。 2M Mg2+ ストック溶液 20.33g MgCl2 • 6H2O 24.65g MgSO4 • 7H2O 100mlの滅菌水を添加する。フィルター滅菌する。 2X Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase (システムに付属) 60mM Tris-HCl (pH 7.8) 20mM MgCl2 20mM DTT 2mM ATP 10% polyethylene glycol (MW8000, ACS Grade) 1回に使用する量を分注して－20℃に保存する。 (凍結融解の繰り返しは避けてください。) TYP ブロス (1リットル) 16g Bacto®-tryptone 16g Bacto®-yeast extract 5g NaCl 2.5g K2HPO4