PureYield™ RNA Midiprep System
1
作成日：
注意：
この日本語マニュアルは製品に添付される英文マニュアルを翻訳したもの
ですが、常に更新されるものではありません。最新の英文マニュアルについ
ては以下のサイトよりご覧ください。
Quick PROTOCOL
技術的なお問合せは：
e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-5614-6097 Revised 08/06
＊注意：この製品の使用には、スイングローターが必要です。RNA を取り扱いますので、必ず手袋を着用し、無菌操作で行ってください。
器具は、RNase フリーのプラスチック製を使用し、再利用は避けてください。
<試薬の調製>
キットサイズ β-メルカプトエタノール添加量
2 回分; ｶﾀﾛｸﾞ番号 Z3742
5ml RNA Lysis Buffer (RLA). 100µl
10 回分; ｶﾀﾛｸﾞ番号 Z3740
50ml RNA Lysis Buffer (RLA). 1ml
50 回分; ｶﾀﾛｸﾞ番号 Z3741
100ml RNA Lysis Buffer (RLA) 2ｍｌ
キットサイズ 95％エタノール添加量
2 回分; ｶﾀﾛｸﾞ番号 Z3742
11.8ml concentrated RNA
Wash Solution (RWA)
20m
10 回分; ｶﾀﾛｸﾞ番号 Z3740
206ml concentrated RNA
Wash Solution (RWA)
350ml
50 回分; ｶﾀﾛｸﾞ番号 Z3741
206ml concentrated RNA
Wash Solution (RWA)
350ml
<ライセートの調製>
各サンプルでの前処理
・組織サンプル
＊注意：RNA Lysis Solution(RLA)は氷上（4℃）で冷やす。
1. β-メルカプトエタノールを添加した氷冷 RNA Lysis Buffer (RLA)を組織サンプルに加える。
2. RLA を含んだ重量を測定し、表 1 の条件を満たすようにサンプル量を調整する。（150mg/ml 以下が望ましい）
3. できるだけ手早く組織をホモジナイズする。
＊注意：ホモジナイズの際、泡立てたり、溶解が不十分な場合は、RNA 収量の低下の原因になります。
4. 氷上(4℃)で 10 分間インキュベーションして完全に溶解する。脾臓サンプルなど核酸や細胞残渣を多く含み、細胞溶
解の際、粘性が高いサンプルの場合には、RLA を 2 倍量になるように添加し、十分に溶解する。
5. クリアーライセートの調製ステップに進む。
・培養細胞サンプル
＊注意：1 × 107
cells から最大 5 × 107 cells までの細胞数から RNA の精製ができるが、表 1 の最大ライセート濃度を超えないように
注意する。回収した細胞をすぐに使用しない場合は、-70℃に保管する。
＊注意：RNA Lysis Solution(RLA) は氷上（4℃）で冷やす。
1. 1～5 × 107
cells を 50ml 遠心チューブを用いて、300 × g で 5 分間 (4～23°C)遠心して細胞を集める。上清を捨
て、25ml の滅菌氷冷 PBS を添加し、穏やかに細胞を洗浄して、再度 300 × g で 5 分間 (4～23°C)遠心して細胞を
集める。上清を捨てて、細胞ペレットを氷上に置く。
2. 2mｌのβ-メルカプトエタノールを添加した氷冷 RNA Lysis Buffer (RLA)を細胞ペレットに加えボルテックスを行う。細
胞塊が残る場合は、ホモジナイザーなどを用いて手早く、完全に細胞を溶解する。泡立てないように操作を行い、氷
上で 10 分間インキュベーションして完全に溶解させる。
＊注意：ホモジナイズの際、泡立てたり、溶解が不十分な場合は、RNA 収量の低下の原因になります。
3. クリアーライセートの調製ステップに進む。
・その他のサンプル
PureYield™ RNA Midiprep System は、サンプルの溶解方法を最適化することで、細菌、酵母、植物組織、血液など
様々なサンプルからトータル RNA を精製できる。詳しくは TM279 セクション VIII を参照。
（ホルマリン固定やパラフィン包埋サンプルなどからの RNA 精製には適していません。）
RNA Lysis Solution (RLA)
＊注意：β-メルカプトエタノールを添加した RNA
Lysis Buffer (RLA)は 4℃で、1 ヶ月は安定に保存
できます。長期間にわたって使用する場合は、
RLA を分注し、使用時に 20µl/ml になるようにβメルカプトエタノールを添加してください。
RNA Wash Solution (RWA)
＊注意：95％エタノールを添加した RNA
Wash Solution (RWA)は、しっかりとフタを閉
めて、室温で保存してください。
PureYield™ RNA Midiprep System
I NSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z3740 AND Z3741
<用意するもの>
・70℃ ヒートブロック あるいは ウォーターバス
・15ml, 50ml ポリプロピレン チューブ
・スイングローター（50ml チューブ用）
2
Quick PROTOCOL
技術的なお問合せは：
e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-5614-6079 Revised 08/06
表 1. 推奨するライセートの最大濃度
サンプルの種類
マウス 1 尾(30g)あたりの各
組織重量（参考情報） 最大サンプル処理量
組織ライセートの
最大濃度
肝臓 940mg 300mg 150mg/ml
腎臓 210mg 200mg 100mg/ml
筋肉 — 300mg 150mg/ml
脾臓 90mg 150mg 75mg/ml
心臓 150mg 300mg 150mg/ml
脳 463mg 300mg 150mg/ml
肺 200mg 300mg 150mg/ml
培養細胞 —- 5 × 107
cells 2.5 × 107
cells/ml
細菌 —- 1 × 1010 cells 5 × 109
cells/ml
植物組織 —- 300mg 150mg/ml
酵母 —- 5 × 108
cells 2.5 × 108
cells/ml
血液 —- 20ml —-
クリアーライセートの クリアーライセートの調製
＊注意：サンプルから調製したライセートは、必ずクリアーライセートの調製を行ってください。
＊注意：サンプル量を変更する場合は、サンプル量と試薬量の比を変えないでください。
1. 15mｌのディスポーサブルのフタ付きチューブに前処理したサンプル 2mｌを入れる。
＊注意：溶解液の液量が 2ml の倍数でない場合は、適切な量の RNA Lysis Buffer を加えて、2ml の倍数にする。
2. RNA Dilution Buffer (青色) 4ml を加えて、3～4 回転倒混和した後、ボルテックスで混合する。
3. 白色の Clearing Agent を均一の懸濁液になるまでボルテックスで混合する。
＊注意：チューブを逆さまにして混合されていない部分がないように確認してください。この操作は数分かかることがあります。
＊注意：Clearing Agent は、時間がたつにつれて元の状態に戻りますので、サンプルに添加する前に、再度ボルテックスします。よく混合されてい
れば、スムーズにピペットで溶液を取ることができます。容器を軽く叩き、上下に転倒混和して、Clearing Agent resin が容器の底に凝集して
いないことを確認してください。
＊注意: Clearing Agent Resin が完全に懸濁していない場合、total RNA の収量が低下し、回収した RNA にゲノム DNA が混入します。
4. Clearing Agent 1ml を添加し、2～3 回転倒混和後、均一になるまでボルテックスで混合する。
＊注意：RNA Dilution Buffer と Clearing Agent をあらかじめ混ぜておくことは避けてください。Clearing Agent は、白い粉末を形成することがあ
り、こぼれ落ちた場合は、湿ったペーパータオルで集めて無害な廃棄物として処理できます。
5. サンプルを 70℃のヒートブロックに 5 分間置く。
＊注意: ヒートブロックにサンプルを置く前に、70℃になっていることを確認してください(許容温度範囲：65～75℃)。加熱後のサンプルは、凝集し
た沈殿物を形成します。サンプルと Clearing Agent の混合物を低温で加熱すると、サンプルにゲノム DNA が混入します。
6. 室温に少なくとも 5 分間放置してサンプルを冷却する。
＊注意: Clearing Column にサンプルをアプライする前に冷却が不十分な場合、精製した RNA にゲノム DNA が混入します。
7. 新しい手袋を着用して、50ml コレクションチューブの上に Clearing Column をセットする。
8. サンプルが均一の溶液になるようにボルテックスなどで十分に撹拌する。
9. Clearing Column にサンプルをアプライする。室温（22～25℃）2,000xg、2 分間遠心する。
＊注意:サンプルの残渣は、Clearing Column のメンブレン上に塊として残ります。青緑色のクリアーライセートがコレクションチューブに得られ、こ
のクリアーライセートに RNA が含まれます。
10. Clearing Column を捨てる。コレクションチューブに残渣ペレットが見られるようであれば、クリアーライセートだけを新しい 50ml
チューブに移す。
11. 遠心法もしくは吸引法のプロトコールに進む。
PureYield™ RNA Midiprep System
I NSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z3740 AND Z3741
3