Rapid ResponseTM Reporter Vectorのご紹介

7 アブストラクト 転写活性の急速な変化に対するホタルおよびウミシイタケルシフェ ラーゼレポーターの応答性を高めるために、我々はタンパク質または タンパク質/mRNAの分解配列を持つ不安定型ルシフェラーゼレポータ ーを構築しました。これらのRapid ResponseTM レポーターの半減期は 60％以上短縮されています。そのため、転写率の急速な変化に対して 迅速でより高い度合いで応答します。その結果、レポーター発現の最 大誘導率到達時間が最大75%短くなるため、2次的影響に起因するアー ティファクトの発生リスクを低減すると考えられました。 イントロダクション ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼレポーターは、その感度 の高さや柔軟性、簡便性により細胞生物学や創薬アプリケーションで 転写活性のモニタリングに広く利用されています。さらに、ルシフェ ラーゼレポーター本来の安定性が比較的低いため（タンパク質半減期 約3時間）、転写の挙動は迅速に現れます。しかし、レポーターの応答 性は、潜在的な転写イベントにより数時間遅れることも事実です。 我々は、レポーターのパフォーマンスをさらに向上させるために、優 れた発現挙動を示すRapid ResponseTM Reporter Vectorを開発しまし た。これらのベクターには、ルシフェラーゼ遺伝子にタンパク質また はタンパク質/mRNA分解配列を遺伝子上で融合させて作製した不安化 ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼレポーターがコードされて います。分解効率が増加することにより、これらの不安化レポーター は急速な転写イベントに対して迅速に応答し、しばしばその応答の度 合いも大きくなりました。 応答率の向上 レポーターの不安定化がどのようにして急速な転写イベントに対す る応答性を高めたのか？レポーターアッセイを行う場合、細胞内に蓄 積された総レポータータンパク質に対して測定が行われます。この蓄 積は、タンパク質とmRNAの両方の安定性に規定される細胞内でのレ ポーター寿命に関連します。この寿命の間に転写率が変化する場合、 蓄積したレポーターは異なる転写率の集積を反映しています。タンパ ク質寿命が長くなれば、より多くの異なる転写率の集積プールがレポ ーターアッセイに利用されます。この集積過程は転写ダイナミクスの 変化に対する“吸収効果”があり、転写率変化の検出をより困難にし ます。これは、レポーターの寿命を低下させ、異なる転写効率の集積 プールを減少させることにより緩和することができます。このレポー ター挙動の改善により遺伝子発現のアップレギュレーションおよびダ ウンレギュレーションの両方を観察することができます。 各定量測定において、レポーターの寿命を0にまで低下させ、異なる 転写率の集積を完全に排除することが理想的です。アッセイを行う時 点の転写率のみが細胞内のレポータータンパク質の蓄積を表している ことになります。残念ながら、寿命が0であることは、同時に蓄積量も 0であることを示すため、レポーターを測定することはできません。そ のため寿命を短縮することで、アッセイで検出可能な量のレポーター を維持します。このような場合、感度の高い発光アッセイは有用であ るといえます。他のレポーター技術に較べ、測定可能なシグナルを減 少させることなく、ルシフェラーゼレポーターの細胞内での安定性を 飛躍的に低下させることができます。高い感度が得られるルシフェラ ーゼアッセイだからこそより劇的なレポーターのダイナミズムを観察 できるのです。 不安定化されたレポーターのデザイン Rapid ResponseTMレポーターを開発するにあたって、応答率、シグ ナルの度合いへの影響について数多くのタンパク質やmRNA分解配列 を評価しました。また、これらの分解配列の最適な配置（例：N末端、 C末端）についてもテストしました。PESTタンパク質分解配列(1)から なる配列と1つのmRNA分解配列（ARE）と2つのタンパク質分解配列 （CL1, PEST）(2-5) から構成される配列の2つが選ばれました。2種類の レポーター分解配列構成が選べるベクターを利用できることで、研究 者の研究デザインに適した応答率およびそれにともない低下するシグ ナル強度を選択できます。 当初 マウスオルニチンデカルボキシラーゼのC末端領域から単離さ れたPEST（1）は、リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H） など正に荷電した残基に挟まれた複数のプロリン（P）、グルタミン酸 （E）、セリン（S）、スレオニン（T）残基を含む40個のアミノ酸から構 成されています。酵母から単離された18個のアミノ酸から成るCL1配 列は、タンパク質の分解率を増加させることが示されました（2）。 mRNA分解配列AREは、AU-rich repeats（ARE）から構成される Herpesvirus saimiri small nuclear RNAの3’非翻訳領域に由来します。 AREは多くの初期応答遺伝子の3’非翻訳領域に存在し、mRNAの分解促 進作用を示します(3-5)。 発現効率を増加させるために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子お よびタンパク質分解配列のコドンを哺乳動物システムでの使用に合わ せて最適化しました。Rapid ResponseTM Reporter Vectorに存在する hRluc遺伝子は、プロメガのSynthetic Renilla Luciferase Reporter Vectorに認められるものと同じです。さらに、Rapid ResponseTMレポ ーターの信頼性を向上させるために、ホタル、ウミシイタケルシフェ ラーゼレポーター遺伝子およびCL1、PESTタンパク質分解配列に存在 する既知のコンセンサス転写因子結合サイトの多くを意図的に除去し ました。この結果得られた改変レポーター遺伝子をhluc+およびhRluc、 タンパク質分解配列をhCL1およびhPESTとして表しました。ARE mRNA分解配列は翻訳されないため、改変操作を加えませんでした。 A Rapid-Fire Solution By Brian D. Almond, Ph.D., Alex Zdanovsky, Ph.D., Marina Zdanovskaia, M.S., Dongping Ma, Ph.D., Pete Stecha, B.S., Aileen Paguio, M.S., Denise Garvin, M.S., and Keith Wood, Ph.D., Promega Corporation Rapid ResponseTM Reporter Vectorのご紹介 Prometech Journal www.promega.co.jp Number 14 2004 不安定化ルシフェラーゼレポーターをコードする Rapid ResponseTM Reporter Vectorにより最大誘 導率に達する時間が短くなり、ポジティブとネガテ ィブな結果の判別を容易にします。また、2次的影 響のリスクを低減する可能性があります。 8 不安定化レポーターの半減期の低下 レポーターの半減期を決定するために新しいルシフェラーゼ遺伝子 をpGL3-Control Vector（カタログ番号E1741）にクローニングし、 CHO細胞にトランスフェクションしました。トランスフェクション24 時間後、シクロヘキシミド（終濃度100µg/ml）を添加しました。特定 の時点で細胞を回収し、Luciferase Assay SystemおよびRenilla Luciferase Assay Systemを用いて相対発光ユニットを決定しました。 PEST分解配列が含まれることによりhRlucPの半減期は3時間から約 1時間になり、半減期が＞60%短縮されました。CL1, PESTおよび ARE の付加は、半減期に最も大きく影響しました。hRlucCPの半減期は、 80％以上短縮され0.4時間になりました（図1）。ホタルルシフェラーゼ ベースのRapid ResponseTM レポーターでも同様の結果が得られました （データ未掲載）。 反応までの時間が短縮し、その度合いも増加 不安定化ホタルルシフェラーゼおよび不安定化ウミシイタケルシフ ェラーゼをコードするそれぞれ2つのベクター、合計4つのRapid ResponseTM Reporter Vectorがご利用いただけます（図 2）。 pGL3(R2.1)- BasicおよびpGL3(R2.2)- Basic Vectorには、ホタルルシ フェラーゼがコードされており、それぞれhlucP+およびhlucCP+遺伝 子を含んでいます。同様に、phRG(R2.1)- BasicおよびphRG(R2.2)- Basic Vectorには、ウミシイタケルシフェラーゼがコードされており、 それぞれhRlucPおよびhRlucCP遺伝子が含まれます（図2）。 レポーターの安定性を低下させたことによる最大誘導到達時間の短 縮化について調べるために、複数のCRE（cAMP response element） を含むDNA断片をRapid ResponseTM Vectorにクローニングし、 HEK293細胞にトランスフェクションしました。細胞を内在性アドレナ リンレセプターのアゴニスト、イソプロテレノール ハイドロクロライ ド（ISO）で誘導し、ルシフェラーゼ発現を測定しました。不安定化ウ ミシイタケレポーター（hRlucPまたはhRlucCP）の発現に対する最大 誘導到達時間はhRlucコントロールに較べ短縮されていました。hRluc コントロールは8時間で最大誘導に達したのに対して、hRlucCPおよび hRlucPではそれぞれ3時間と4.5時間でした（図3, パネルA）。 不安定化ホタルルシフェラーゼレポーターの最大誘導到達時間は同 様に短縮化されました。コントロールホタルルシフェラーゼ（hluc+） の最大誘導到達時間が6時間であったのに対し、不安定化レポーター （hlucCP+およびhlucP+）の最大誘導時間はそれぞれ1.5および3時間で した（図3, パネルB）。 最大誘導到達時間の短縮に加え、不安定化レポーターにより、反応 の度合いも増加しました。ウミシイタケベースのRapid ResponseTMレ ポーターでは反応性の度合いを67％以上増加させました（図3, パネル A）。ホタルベースのRapid ResponseTM レポーター（hlucP+および hlucCP+）では102％以上増加させました（図3, パネルB）。 Prometech Journal www.promega.co.jp Number 14 2004 Rapid ResponseTM Reporter Vectorのご紹介… continued 4544MA Increased Protein Degradation Firefly Luciferase hPEST Firefly Luciferase hCL1 hPEST ARE Renilla Luciferase hPEST hRlucCP Renilla Luciferase hCL1 hPEST ARE hRlucP hlucCP+ hlucP+ phRG(R2.2)-Basic phRG(R2.1)-Basic pGL3(R2.2)-Basic pGL3(R2.1)-Basic Vector Reporter Gene Gene Design Increased Protein and mRNA Degradation Vector Reporter Gene Gene Design 4541MA 0 20 40 60 80 100 120 Time Post-Cycloheximide Addition (hours) Percent Reduction hRluc hRlucP hRlucCP 0 1 5 2 4 3 6 図2. Rapid ResponseTM レポーター遺伝子の構成 図1. ウミシイタケベースのRapid ResponseTM レポーター におけるレポーター半 減期の低下 レポーターの半減期を決定するためにRapid ResponseTM レポーターおよびコント ロール改変ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をpGL3-Control Vector（カタログ 番号E1741）にクローニングし、CHO細胞にトランスフェクションした。トラン スフェクション24時間後、シクロヘキシミド（終濃度100µg/ml）を各ウェルに添 加した。特定の時点で細胞を回収し、Renilla Luciferase Assay System（カタロ グ番号E2810）で相対発光ユニットを決定した。 4542MA 0 5 10 15 20 25 30 012345678 Time (hours) Induction hRluc hRlucP hRlucCP 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 Time (hours) Induction cAMP hluc+ hlucP+ hlucCP+ 1 8 2 3 4 5 6 7 A. B. 図3. Rapid ResponseTM レポーターの最大誘導到達時間 最大誘導を決定するために複数のCRE（cAMP Response Element）を含むDNA断片を4種類のRapid ResponseTM Reporter Vectorおよびhluc+または hRlucレポータ ー遺伝子を含むpGL3-Basic Vector（カタログ番号E1751）にクローニングした。CREを含むこれらのベクターをHEK293細胞へトランジェントにトランスフェクシ ョンした。24時間後、レポーター遺伝子を発現させるためにトランスフェクションした細胞を100µM RO（RO-20-1724）および1µM ISO（イソプロテレノールハイ ドロクロライド）で処理した。RO（100µM）のみを加えたウェルのサブセットを非誘導コントロールとした。細胞を回収、溶解し、以下のようにアッセイした。 パネルA. ウミシイタケベースのレポーターを含む細胞は、ルシフェラーゼ活性測定のためにRenilla Luciferase Assay System（カタログ番号E2810）を用いた。パ ネルB. ホタルベースのルシフェラーゼレポーターを含む細胞は、ルシフェラーゼ活性測定のためにLuciferase Assay System（カタログ番号E1500）を用いた。ま た、cAMPを分析するためにCorrelate-EIA Directed cyclic AMP assay（Assay Designs, Inc）を利用した。すべてのケースで、誘導したウェルから得た相対発光ユ ニットの値を非誘導ウェルからの値で割ったものを誘導倍率として算出した。 Prometech Journal www.promega.co.jp Number 14 2004 9 Rapid ResponseTMレポーターは不安定化されているため、レポータ ーアッセイにおける光の強度は減少します（図4）。この低下は、使用 する細胞株や不安定化レポーター、トランスフェクションされた細胞 がステイブルまたはトランジェントの違いによっても変動します。ス テイブルに発現する細胞株の場合、単離された最も明るい細胞（細胞 あたりで最大の相対発光ユニットを示すもの）のいくつかはRapid ResponseTMレポーターを発現するものでした（データ未掲載）。他の不 安定化されたレポーターでも同様の結果が観察されています（6, 7）。 光強度の低下が顕著であるかどうか、アッセイ感度の点からも評価す る必要があります。ホタルおよびウミシイタケの発光アッセイでは非 常に低いバックグラウンドシグナルしか生じないので、通常ほとんど の実験条件でRapid ResponseTM レポーターの感度は充分です。 薬理学的結果との合致 Rapid ResponseTM レポーターの反応が、生理的条件下で用いた場合 の非不安定化型レポーターと同様であることを示すために、CRE、neo およびhluc+、hlucP+、hlucCP+のいずれかを含むベクターをHEK293 細胞にトランスフェクションしました。ネオマイシンにより選別した 後、ルシフェラーゼを安定に発現するクローンを単離しました。ISOの 濃度を上げながら細胞をインキュベーションし、ISO添加後2、4、6時 間後にルシフェラーゼ活性についてテストしました（図5）。hlucP+お よび hlucCP+の最も早い時点（2時間）のデータは、hluc+の6時間の 時点のデータと非常に類似していました。ISOの用量反応曲線の類似性 は、細胞による同様の薬理学的反応を示していました。 ルシフェラーゼレポーターの不安定化により、我々は最大誘導到達 時間を短縮化し、ホジティブとネガティブの結果における判別能力を 向上させ、2次的影響によるリスクを低減しました。今までのところ、 この実験では転写率と細胞内生理イベントとの間の相互作用は不変性 を維持していました。 結　論 Rapid ResponseTM レポーター技術は、タンパク質またはタンパク質 /mRNA分解配列の付加により不安定化されたホタルおよびウミシイタ ケルシフェラーゼレポーターにより構成されています。これらの不安 定化レポーターは、転写率の変化に対する応答性が早くなると共にそ の度合いも大きくなります。Rapid ResponseTM レポーターの急速な応 答率は、一過性の細胞内イベントとそれに対する応答との連動性を高 め、実験結果に干渉する2次的イベントに関するリスクを低減します。 急速な応答率は、スクリーニングアプリケーションにおけるアッセイ のスループットを増加させることができます。これらの改良はレポー ター発現と連動する生理的条件に影響を与えません。 10 参考文献 1. Rogers, S., Wells, R. and Rechsteiner, M. (1986) Science 234, 364–8. 2. Gilon, T., Chomsky, O. and Kulka, R.G. (1998) EMBO J 17, 255–68. 3. Fan, X.C., Myer, V.E. and Steitz, J.A. (1997) Genes Dev. 11, 2557–68. 4. Lagnado, C.A., Brown, C.Y. and Goodall, G.J. (1994) Mol. Cell. Biol. 14, 7984–95. 5. Zubiaga, A.M., Belagco, J.G. and Greenberg, M.E. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2219–30. 6. Corish, P. and Tyler-Smith, C. (1999) Protein Engineering 12, 1035–40. 7. Li, X. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 34970–5. プロトコル ◆ Rapid Response™ Reporter Vectors Technical Manual #TM242, Promega Corporation. (www.promega.com/tbs/tm242/tm242.html) 製品案内 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） pGL3(R2.1)-Basic Vector 20µg E6431 48,000 pGL3(R2.2)-Basic Vector 20µg E6441 48,000 phRG(R2.1)-Basic Vector 20µg E6451 48,000 phRG(R2.2)-Basic Vector 20µg E6461 48,000 Prometech Journal www.promega.co.jp Number 14 2004 RapidResponseTM Reporter Vectorのご紹介… continued 4543MA 0 20 40 60 80 100 120 0.1 1 10 100 1,000 ISO (nM) Percent of Maximum Luminescence hlucCP+ (2 hours) hlucP+ (2 hours) hluc+ (6 hours) 4540MA 2.0 2.3 51.0 203.0 1 10 100 1,000 hlucP+ hlucCP+ Percent Expression of luc+ CHO NIH3T3 18.6 10.3 3.2 0.6 0 1 10 100 hRlucP hRlucCP Percent Expression of hRluc CHO NIH3T3 A. B. 図4. CHOおよびNIH3T3細胞におけるRapid ResponseTM レポーターの発現 pGL3-Control Vector（カタログ番号E1741）に存在するluc+遺伝子は、hlucP+, hlucCP+, hRluc, hRlucP, hRlucCPのいずれかのレポーター遺伝子で置換した。作 製されたベクターおよびpGL3-Control Vectorはそれぞれ第2のレポーター（トラ ンスフェクションコントロール）とともにCHOおよびNIH3T3細胞にコトランス フェクションした。パネルAおよびBで使用されたトランスフェクションコントロ ールはそれぞれphRL-TK（カタログ番号E6241）とpGL3-Control（カタログ番号 E1741）Vector。トランスフェクション24時間後、Passive Lysis Buffer（カタロ グ番号E1941）を用いて細胞を採取し 、Dual-Luciferase® Assay System（カタロ グ番号E1910）を用いて相対発光ユニットを決定した。相対発光ユニットはトラ ンスフェクションコントロールで補正した。ルシフェラーゼ酵素の蓄積に対する 不安定化配列の影響は、コントロールに対する％として示した。パネルA：CHO およびNIH3T3細胞にトランスフェクションしたluc+（pGL3-Control Vector）に 対するhlucP+またはlucCP+の発現％。パネルB：CHOおよびNIH3T3細胞にトラ ンスフェクションしたhRlucに対するhRlucPまたはhRlucCPの発現％。 図5. Rapid ResponseTM レポーターの薬理学的作動薬のプロファイル CRE, neoおよびhluc+, hlucP+, hlucCP+ のいずれかを含むベクターを用いてステ イブルに発現するHEK293細胞を作製した。96ウェルプレートに細胞を播種し、 様々な濃度のイソプロテレノールハイドロクロライド（ISO）で2, 4, 6時間イン キュベーションした。コントロール用のウェルは未処理。インキュベーション後、 Bright-GloTM Luciferase Assay System（カタログ番号E2610）を用いてルシフェ ラーゼ活性を測定した。3つのデータセットの平均値を直線で結んだ。