RealTime-Glo™ & NAD/NADH-Glo™ multiplex assay

技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 www.promega.co.jp 1. 細胞培養表面処理済みの 96well 白クリアボトムプレートもしくはソリッドプレートに 任意の細胞数で 50μL ずつ播種する。 また、バックグラウンドとして、細胞を含まない培地だけの well も準備する。 2. 翌日、下記の表を参考に RealTime-Glo™とテスト化合物を含む培地を調製する。 Component volume x サンプル数 = 合計 培地, 2x テスト化合物 49.8 μL MT Cell Viability Substrate 0.1 μL NanoLuc® Enzyme 0.1 μL Final volume per sample 50 μL 3. 50μL の RealTime-Glo™試薬とテスト化合物を含む培地を細胞に添加する。 4. 37℃インキュベーターにて、10 分以上培養する。 5. 任意のタイムポイントにて、発光測定する （72 時間まで繰り返し測定可能）。 6. RealTime-Glo™の発光測定終了後、培養プレートを 37℃インキュベーターに戻してお く。 7. NAD/NADH-Glo™ Detection Reagent を調製する。 Luciferin Detection Reagent の調製： Reconstitution Buffer と Luciferin Detection Reagent を室温に戻す。 Luciferin Detection Reagent のボトルに Reconstitution Buffer を全量加え、ゆっくり混 ぜ、Luciferin Detection Reagent を溶かす。 NAD/NADH-Glo™ Detection Reagentの調製： Luciferin Detection Reagent を室温に戻す。 Reductase と Reductase Substrate を NAD Cycling Substrate を室温で溶かし、使用す るまで氷中においておく。 275μL の滅菌水を NAD Cycling Enzyme のバイアルに加え、ゆっくりと混ぜ、NAD Cycling Enzyme を溶かす。溶解後は氷中においておく。 下記の表を参考に、NAD/NADH-Glo™ Detection Reagent を調製する。 例) Component Volume x サンプル数 = 合計 Luciferin Detection Reagent 1 mL Reductase 5 μL Reductase Substrate 5 μL NAD Cycling Enzyme 5 μL NAD Cycling Substrate 25 μL 各試薬を加えたのち、5 回転倒混和を行う。 RealTime-Glo™ & NAD/NADH-Glo™ multiplex assay INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS G9711, G9712, G9713, G9071 and G9072 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 www.promega.co.jp この Quick Protocol は TM431、TM399 を基に作成された簡易型のプロトコルです。 最新、詳細なプロコトルについては www.promega.com/protocols/をご覧ください。 Revised 04/15 8. 培養プレートをインキュベーターから取り出し、室温に戻したのちに培地を除く。新し い培地もしくは PBS 50μL を各 well に加える。 9. NAD/NADH-Glo™ Detection Reagent 50μL を各 well に加え、プレートシェーカー等で 穏やかに 1 分間撹拌し、細胞を溶解する。 10. 30-60 分間、室温にてインキュベートした後、発光シグナルを測定する。 （その他の情報） ・ RealTime-Glo™は細胞の種類により、細胞数の測定範囲が異なります。 このため、RealTime-Glo™のマニュアルを参考に、あらかじめ予備実験を行い、測定でき る細胞数を決定してください。 ・ ステップ 1 で細胞を 100uL ずつ播種し、ステップ 2 の前に培地を 50uL 除去することも可 能です。