RealTime-Glo™ & ReliaPrep™ RNA Cell Miniprep system multiplex assay

技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 www.promega.co.jp RealTime-Glo™ & ReliaPrep™ RNA Cell Miniprep system multiplex assay INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS G9711, G9712, G9713, Z6010, Z6011 and Z6012 1. 細胞培養表面処理済みの 96well 白クリアボトムプレートもしくはソリッドプレートに 任意の細胞数で 50μL ずつ播種する。 また、バックグラウンドとして、細胞を含まない培地だけの well も準備する。 2. 翌日、下記の表を参考に RealTime-Glo™とテスト化合物を含む培地を調製する。 Component volume x サンプル数 = 合計 培地, 2x テスト化合物 49.8 μL MT Cell Viability Substrate 0.1 μL NanoLuc® Enzyme 0.1 μL Final volume per sample 50 μL 3. 50μL の RealTime-Glo™試薬とテスト化合物を含む培地を細胞に添加する。 4. 37℃インキュベーターにて、10 分以上培養する。 5. 任意のタイムポイントにて、発光測定する （72 時間まで繰り返し測定可能）。 6. RealTime-Glo™の発光測定終了後、培養プレートを 37℃インキュベーターに戻してお く。 7. ReliaPrep™ RNA Cell Miniprep System で使用する 4 種類の試薬、バッファーを準備 する： BL+TG Buffer： BL buffer に対して、1/100 量の 1-Thioglycerol (TG) を添加。 Column Wash Solution： 95% エタノールを添加。 RNA Wash Solution： 95% エタノールを添加。 DNaseI：DNase 粉末のバイアルに Nuclease-Free Water を添加。 8. インキュベーターより、培養プレートを取出し培地を除く。滅菌済みの冷却した PBS 100μL を各 well に加え、細胞を洗浄する。 9. PBS を除き、BL+TG Buffer 100μL を加える。7-10 回ほどピペッティングを行った後に、 Cell Lysate を回収し、滅菌済みの遠心チューブに移す。 10. 100% イソプロパノール 35μL をサンプルに加え、5 秒間ボルテックス。 11. ミニカラムを Collection Tube をセット。サンプルを加えて室温で遠心(12,000 – 14,000 x g、30 秒間)。 12. Collection Tube に貯まった液を捨てて、再度ミニカラムをセットし、500μL の RNA Wash Solution をカラムに加えて、室温で遠心 (12,000 – 14,000 x g、30 秒間)。 13. 下記の表を参考に、必要な量の DNase Incubation mix を調製する。 Solution volume x サンプル数 = 合計 Yellow Core Buffer 24 μL 0.09M MnCl2 3 μL DNase I enzyme 3 μL 14. DNase Incubation mix を 30μL、カラムに添加して、室温で 15 分間インキュベーショ ンする。 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 www.promega.co.jp この Quick Protocol は TM431、TM370 を基に作成された簡易型のプロトコルです。 最新、詳細なプロコトルについては www.promega.com/protocols/をご覧ください。 Revised 04/15 15. DNaseI の反応終了後、そのまま 200μL の Column Wash Solution をミニカラムに加え て遠心 (12,000-14,000 x g、15 秒間)。 16. ミニカラムを新しい Collection Tube に移し替えて、300μL の RNA Wash Solution を 加えて、遠心 (12,000-14,000 x g、2 分間)。 17. ミニカラムを溶出用の Elution Tube に移し替える。溶出用の Nuclease-Free Water を ミニカラムに加えて、遠心 (12,000-14,000 x g、1 分間)。 18. 溶出された RNA は、-70℃で保管する。 （その他の情報） ・ RealTime-Glo™は細胞の種類により、細胞数の測定範囲が異なります。 このため、RealTime-Glo™のマニュアルを参考に、あらかじめ予備実験を行い、測定でき る細胞数を決定してください。 ・ ステップ 1 で細胞を 100uL ずつ播種し、ステップ 2 の前に培地を 50uL 除去することも可 能です。