ReliaPrep™ FFPE Total RNA Miniprep System

ReliaPrep™ FFPE Total RNA Miniprep System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z1001, Z1002 Quick PROTOCOL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM353 をご覧ください。 Revised 2017/4 試薬の調製 事前調製 ・Wash Solution（3ml/30ml）に 95-100%エタノール(12ml/120ml)を加えます。 →室温で保存します。 ・凍結乾燥されている DNaseI 1vial に、Nuclease-Free Water を加えて溶解します。ボルテックス禁止。 →分注して 凍結保存（-20℃）します。 ・Lysis Buffer (LBA) (1ml/30ml)に Blue Dye (10μl30μ)を加えます。 →室温で保存します。 用時調製 ・DNase 反応液（1 サンプルあたり）: DNase 10µl + DNase Buffer 7µl + MnCl2 13µl ＝30µl その他準備するもの ・100% Isopropanaol ・80℃ ヒートブロック ・56℃ ヒートブロック ・1.5ml 遠心チューブ / 遠心機 （室温で遠心します） プロトコール (キシレンを使わない方法) ① パラフィン切片(10-100µm 分)を遠心チューブに移して、ミネラルオイルを加えます。 • 切片の合計:50 µm以下の場合には、300μlのミネラルオイルを加えます。 • 切片の合計:50 µm以上の場合には, 500μlのミネラルオイルを加えます。 ② 80℃ 1 分間インキュベートします。 ③ ボルテックスします。 ④ 100µl の Lysis Buffer を加えて混合後、10,000×g, 15 秒間 遠心します。 ⑤ 二層に分離した下層（水層）に 10µl の Proteinase K を加えて、ピペッティングして混ぜます。 ⑥ 56℃ 15 分 →80℃ 1 時間 → on ice 1 分 → 室温 2 分 とインキュベートします。 ⑦ 下層に用事調製した DNase 溶液を 30µl 加えて、ピペッティングして混ぜます。 ⑧ 室温（20-25℃）で 15 分間インキュベートします。 ⑨ 325µl の BL Buffer、200µl の 100% Isopropanol を加えて ボルテックスします。 ⑩ 10,000×g, 15 秒間 遠心します。 ⑪ ReliaPrep™ FFPE Binding Column（カラム）を Collection Tube にセットします。 ⑫ 下層（水層、青色の着色のある層）をカラムに移して、10,000×g, 30 秒間 遠心します。 （少量の上層（油層）の持ち込みは、精製に影響しません） ⑬ Collection Tube に貯まったフロースルーを捨て、カラムを再度 Collection Tube にセットします。 ⑭ 500µl の Wash Solution をカラムに加えて、10,000×g, 30 秒間 遠心します。 ⑮ フロースルーを捨て、再度 500µl の Wash Solution をカラムに加えて、10,000×g, 30 秒間 遠心します。 ⑯ フロースルーを捨て、カラムの蓋を閉じて 16,000×g, 3 分間 遠心して、カラムを乾燥させます。 ⑰ カラムをキットに添付 Elution Tube にセットして、30-50µl の Nuclease-Free Water を加えます。 ⑱ 16,000×g, 1 分間 遠心して、RNA を溶出します。溶出した RNA は、-20℃もしくは-70℃で保存します。 ReliaPrep™ FFPE Total RNA Miniprep System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z1001, Z1002 Quick PROTOCOL 技術的なお問合せは： e-mail: prometec@jp.promega.com・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982 詳細なプロトコールは、英文マニュアル #TM353 をご覧ください。 Revised 2017/4 プロトコール (キシレンを使う方法) ① パラフィン切片(10-100µm 分)を遠心チューブに移します。 ② 1ml の 100%キシレンを加えて、ボルテックスしたのち、最高速で 2 分間遠心します。 ③ ペレットを崩さないようにキシレンを除きます。 ④ 1ml の 95-100％エタノールを加えてボルテックスしたのち、最高速で 2 分間遠心します。 ⑤ ペレットを崩さないようにエタノールを除き、再度最高速で 30 秒間遠心し、残存するエタノールを除きます。 ⑥ ペレットを 37℃、5-15 分間乾燥させます。 ⑦ 100µl の Lysis Buffer を加えて混合します。 ⑧ 10µl の ProteinaseK を加えて、ピペッティングして混ぜます。 ⑨ 56℃ 15 分 →80℃ 1 時間 → on ice 1 分 → 室温 2 分 とインキュベートします。 ⑩ 用事調製した DNase 反応液を 30µl 加えて、ピペッティングして混ぜます。 ⑪ 室温（20-25℃）で 15 分間インキュベートします。 ⑫ 325µl の BL Buffer、200µl の 100% Isopropanol を加えて ボルテックスします。 ⑬ 10,000×g, 15 秒間 遠心します。 ⑭ ReliaPrep™ FFPE Binding Column（カラム）を Collection Tube にセットします。 ⑮ ⑬の上清を⑭で準備したカラムに移し替えて、10,000×g, 30 秒間 遠心します。 ⑯ Collection Tube に貯まったフロースルーを捨て、カラムを再度 Collection Tube にセットします。 ⑰ 500µl の Wash Solution をカラムに加えて、10,000×g, 30 秒間 遠心します。 ⑱ フロースルーを捨て、再度 500µl の Wash Solution をカラムに加えて、10,000×g, 30 秒間 遠心します。 ⑲ フロースルーを捨て、カラムの蓋を閉じて 16,000×g, 3 分間 遠心します。 ⑳ カラムをキットに添付されている Elution Tube にセットして、30-50µl の Nuclease-Free Water を加えます。 21 16,000×g, 1 分間 遠心して、RNA を溶出します。溶出した RNA は、-20℃もしくは-70℃で保存します。