ReliaPrep™ RNA Miniprep System Quick Guide

操作ステップ Cell Tissue 細胞 非線維性組織 線維性組織 サンプル破砕 Dilution Buffer 添加 組織ホモジネート 清澄化 100％イソプロパ ノール添加 カラム結合 メンブレン洗浄 DNase処理 メンブレン洗浄① メンブレン洗浄② メンブレン洗浄③ ＆乾燥 溶出 プロメガ株式会社 日本語Web site : www.promega.jp ReliaPrep™ RNA Miniprep System Quick Guide Cell: Z6010 10preps, Z6011 50preps, Z6012 250preps Tissue: Z6110 10preps, Z6111 50preps, Z6112 250preps BL+TG Buffer添加 ７〜10回ピペッティング 1×102~5×105 100μl 5×105~2×106 250μl 2×106~5×106 500μl LBA+TG Buffer添加 ホモジナイズ ≦5mg 250μl >5mg 500μl 1×102~5×105 35μl 5×105~2×106 85μl 2×106~5×106 170μl ≦5mg 85μl >5mg 170μl ミニカラムをCollection Tubeにセット 上清をミニカラムに分注 12,000~14,000g x 30sec〜1min. 室温 （チューブ内廃液を捨てる） 500μl RNA Wash Solution 添加 12,000~14,000g x 30sec. 室温 （チューブ内廃液を捨てる） 30μl DNase–Incubation Mix 添加 インキュベーション 15min. 室温 200μl Column Wash Solution 添加 12,000~14,000g x 15sec. 室温 500μl RNA Wash Solution 添加 12,000~14,000g x 30sec. 室温 （チューブ内廃液を捨てる） ※ミニカラムを新しいCollection Tubeにセット 300μl RNA Wash Solution 添加 12,000~14,000g x 2min. 室温 ※ミニカラムをElution Tubeにセット 15 ~30μl Nuclease Free Water 添加 12,000~14,000g x 1min. 室温 ≦5mg 170μl >5mg 340μl 100％イソプロパノール添加 ボルテックス ５sec 14,000g x 3min. 室温 上清を新しいチューブに分注 試薬の調製 ◎BL+TG Bufferの調製 BL Bufferに対し1/100量の1-Thioglycerol (TG) を添加。BL+TG Bufferは、2-10℃で30日間保存 可能。 ◎LBA+TG Bufferの調製 LBA Bufferに対し1/50量の1-Thioglycerol (TG) を添加。LBA+TG Bufferは、2-10℃で30日間保 存可能。 ◎RNA Wash Solutionの調製 カタログ番号 95％ エタノール添加量 Z6012/Z6112 350ml Z6011/Z6111 60ml Z6010/Z6110 20ml ◎Column Wash Solutionの調製 カタログ番号 95％ エタノール添加量 Z6012/Z6112 36.0ml Z6011/Z6111 7.5ml Z6010/Z6110 1.5ml ◎DNase-Incubation Mixの調製 (用時調製) Yellow Core Buffer 24µl 0.09M MnCl2 3µl DNase I 溶液*1 3µl *1DNase I溶液の調製（事前調製） Nuclease Free Water添加量 (/DNaseI vial). Z6011/Z6012 Z6111/Z6112 Z6010/Z6110 80µl ※穏やかに撹拌して溶解 (ボルテックス不可) -20℃保存(分注推奨) 275µl カタログ番号 (※サンプル数分用意) RNA Dilution Buffer(RDB)添加 ボルテックス 10sec インキュベーション 1min. 室温 ≦5mg 250μl >5mg 500μl プロメガ株式会社 図３. 各組織試料10mg からReliaPrep™ RNA Tissue Miniprep Systemを用いて精製 図１.ReliaPrep™ RNA Cell Miniprep System で精製された各種細胞からのRNA量と純度 各10万個の HeLa, HEK293, 3T3 およびCHO細胞 から精製。 図２. 異なる溶出ボリュームによる収量と濃度 10万個の HeLa 細胞から精製。7–30(2 × 15)μlで溶出。 上段 A. 平均収量 下段 B. 平均濃度と回収率 溶出ボリュームによる収量・濃度 技術的なお問合せは、テクニカルサポートまで Phone: 03-3669-7980 E-mail: prometec.jp@promega.com ReliaPrep製品詳細・プロトコール詳細は、 下記WEBサイトをご確認ください。 www.promega.jp/Products/Nucleic-AcidExtraction/rna/ReliaPrep-RNA-Miniprep-Systems/ ReliaPrep™ RNA Miniprep System Cell: Z6010 10preps, Z6011 50preps, Z6012 250preps Tissue: Z6110 10preps, Z6111 50preps, Z6112 250preps 参考データ 大切なRNAを守る！！ RNaseフリーの環境を作るポイント 1．RNA作業用専用スペースの確保 2．使い捨てゴム手袋の着用 3．RNaseフリーのチューブやフィルターチップの使用 4．ピペットなどの器具や試薬類は“RNA専用”に 5．RNase除去剤の使用 細胞からのRNA収量・純度 マウス組織からの標準的な収量 PLG107