RNAgents® Total RNA Isolation System Protocol

Revised 6/03 Part #RNagentJ 技術的なお問合せは: e-mail: prometec@jp.promega.com • Tel: 03-3669-7980 • Fax: 03-3669-7982 簡易プロトコル 用意するもの ■ 付属のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを15分間室温 で温める。使用前に有機層と水層が分かれていることを確認する。 ■ Denaturing Solutionを氷上で冷やす。必要に応じて､1×PBS buffer を用 意し同様に冷やしておく。 A. RNA抽出 1. Technical Bulletin # TB087 Section IVに示すように、組織又は細胞を Denaturing Solution中で破砕する。 2. 破砕した組織や細胞に推奨量の2M 酢酸ナトリウム (pH 4.0; 表を参照) を加えチューブを4-5回転倒混和して、十分に混ぜる。 3. 下層(有機層)のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを Step 2.のチューブに推奨量加える。チューブに蓋をし､よく混ざるよう に3-5回転倒混和し、その後10秒間激しく攪拌する。氷上で15分間冷や す。 4. EPC処理又は滅菌したチューブへ混和物を移し、10,000 ×g 、4℃、20 分間遠心する。 5. RNAを含有する水層を注意深く採取し､DEPC処理又は滅菌したチュー ブへ移す。 B. RNAの沈殿 1. A-5でチューブに移した水層と等量のイソプロパノールを加え、-20℃で 少なくとも5分間インキュベートし､RNAを沈殿させる。 2. 10,000×g、4℃、10分間遠心し、RNAをペレットとして回収する。 （注） RNAをRT-PCRに使用する場合は次に「RNAの洗浄」のプロトコ ルへ進み、以下のStep 3-5は省いても構いません。 3. 上清を捨てる。推奨量のDenaturing Solution(表参照)で再懸濁し、RNA のペレットを完全に溶解するまでボルテックスする。 4. 等量のイソプロパノールを加え、本セクションのStep1, 2に従い､RNA を沈殿させる。 5. RNA の洗浄へ進む。 C. RNA の洗浄 1. 氷冷した75％エタノール1mL(サンプル量が少ない場合)もしくは10mL (サンプル量が多い場合) 加え、沈殿物（RNA）を洗う。RNase-freeのピ ペットチップまたはガラス棒で沈殿物（RNA）を破砕する。10,000×g 、 4℃、10分間遠心する。 2. ペレットをRNase-free環境下または、真空デシケーター内で5-20分間 (ペレットの大きさによる)乾燥させる。 (注)乾燥させすぎないようにお気をつけください。 3. Nuclease-Free Water 又はRNase-free TE bufferでRNAを溶解し、-20℃ で保存する。 RNAgents® Total RNA Isolation System Protocol INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS Z5110 Quick PROTOCOL 酢酸ナトリウムを� ライセートに追加� フェノール：クロロホルム：� イソアミルアルコールを� チューブに加え、混和後、氷冷� 上部の水層を� 新しいチューブに移す� 新しいチューブに移し、遠心� イソプロパノールを添加後、� -20℃でインキュベーション� 遠心後、上澄を除去� 遠心後、上澄を除去� RNAペレットを風乾し、� 水またはTEに溶解し保存� RNAの洗浄：� 氷冷した75%エタノールを添加� イソプロパノールを加え、� 遠心後、上澄を除去� （RT-PCRを行う場合は、� 　”RNAの洗浄” にジャンプ）� Denaturing Solutionを加え� ボルテックス� チューブサイズ 2M Phenol : Denaturing (推奨する Denaturing Sodium Chloroform : Solution 最小のもの) 組織 培養細胞 & Solution Acetate IAA (2nd Addition) 30ml 1,000mg 1.0×108 12ml 1,200μl 12ml 5ml 30ml 750mg 7.5×107 9ml 900μl 9ml 15ml 500mg 5.0×107 6ml 600μl 6ml 2.5ml 15ml 250mg 2.5×107 3ml 300μl 3ml 15ml 100mg 1.0×107 1.2ml 120μl 1.2ml 2ml 75mg 7.5×106 900μl 90μl 900μl 500μl 1.5ml 50mg 5.0×106 600μl 60μl 600μl 1.5ml 25mg 2.5×106 300μl 30μl 300μl 0.5ml 10mg 1.0×106 120μl 12μl 120μl 100μl 0.5ml 5mg 5.0×105 60μl 6μl 60μl IAA: Isoamyl Alcohol