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安心国内受託サービスガイド

安心国内受託サービスガイド オミックス解析からの仮説創出とセルベース解析による 実証サイクルの必要性 ・NGS 解析受託 ・DIAプロテオーム解析受託・マルチオミックス解析受託 ・新リピドーム・メタボローム解析受託 ・オミックス解析メニュー ・オミックス解析受託サービスご利用案内 ・TrueSTABLE Cell　～ HAC を用いた安定発現細胞作製～ ・ヒト・マウス遺伝子とmiRNA 標的配列クローンの分譲、 　その改変と新規作製 委託業務実施機関： 公益財団法人かずさDNA 研究所 供給元および委託業務実施機関： 株式会社かずさゲノムテクノロジーズ プロメガ株式会社 安心国内受託 サービスガイド オミックス解析からの仮説創出とセルベース解析による 実証サイクルの必要性 近年のライフサイエンスの研究活動ではオミックス解析など仮説創出型のアプローチが多くとられています。 しかし、これらの手法から網羅的で大量のデータが得られたとしても生物学的な意味が即座に得られる訳で はなく、細胞など生きた生体システムを用いた仮説検証型のアプローチとの両輪をうまく回転させることが 非常に重要です。 現在汎用されている次世代シーケンサーや質量分析装置によるオミックス解析は、技術の進歩による恩恵を 受け、従来個々の「点」を深く探る解析から「面」としてとらえる解析へとシフトし、生成される情報量も桁 違いに増加し、多くの新しい知見を得ることができるようになりました。しかし、これらの手法は細胞を破壊 し、その時点での生体分子を網羅的にプロファイリングできるという利点がある一方で、それぞれの系の「ス ナップショット」しか得られないという致命的な弱点もあります。こうしたオミックス解析の知見を細胞内の 動的な反応と結びつけて仮説検証を進める上で、セルベース解析は一つの重要なツールとなります。プロメガ は発光・蛍光タンパク質をレポーターとした様々な革新的な測定技術を保有されており、特にそのレポーター をなるべく内在性に近い状態で測定できるようにしたセルベース解析サービスを開始されました。これにより、 細胞のターゲットを絞った動的挙動を発光・蛍光レポーターで測定し、細胞内でどのような生体分子の量的 プロファイルの変化が生じているかをオミックス解析するという一つのサイクルが完結します。これら実験サ イクルを回す上で多くの研究者の方がこれまで大きなフラストレーションを感じてこられた様々なギャップ （マンパワー、一時的に必要な機器、高額装置と運用スキル、専門的な解析技術）を埋める、様々なサービ スをプロメガが創出し、日本の研究者の皆様にお届けしてくださることに期待したいと思います。 公益財団法人かずさDNA 研究所 副所長 ゲノム事業推進部長 小原收 先生 刺激など ORF Clone セルベース解析 （生体応答性、フェノタイプ検証、 ハイスループット） オミックス解析 （網羅性・多層・スナップショット） 代謝物 タンパク質 核酸 （RNA & DNA） Target ( 薬剤標的、診断マーカー候補など) 導入 細胞 （リコンビナントサンプル） セルベース解析 （in vivo 解析） 薬剤・診断マーカー 標的候補 オミックス解析 （in vitro 解析） 細胞 （ ネイティブサンプル） 抽出 安心国内受託サービスの概要 安心国内受託サービス総合サイト www.promega.co.jp/products/jutaku/ 2 NGS 解析受託 PacBio Sequel® 臨床オミックス解析グループ遺伝子分析チーム イントロダクション 第3 世代シーケンサーと呼ばれるPacBio Sequel® は、DNA 一分子をシー ケンスします。連続した60 kb 以上の塩基配列も読み取ることができ、 全ゲノムシーケンス、アイソフォーム検出、完全長転写産物解読、融合 遺伝子検出、ロングアンプリコン解析に用いられています。かずさ DNA 研究所は2018 年6 月に、PacBio Sequel® を用いた解析で高品質デー タを取得できる機関として、開発元のパシフィック・バイオサイエンス 社から国内第一号の認証サービスプロバイダーの認定を受けました。 ロングリードシーケンスでゲノムのより深淵な秘密を解読 私たちはORF クローンの分譲やベクターコンストラクション、質量分析 などの受託解析から基礎医学発展のためのマーカー開発や機能性食品 の開発などの共同研究まで幅広い研究支援を行っています。弊所の中 心的技術である次世代シーケンシング（New Generation Sequencing、 NGS）マシンについては、イルミナ社のNextSeq 2000、NextSeq 500、 MiSeq に加え、MGI 社のDNBSEQ-G400 を保有しており、これらを用い た受託解析サービスの提供を行っています。全ゲノムシーケンス、 Exome-Seq、Target-Seq、MBD-Seq、RNA-Seq、miRNA-Seq 等各種解析 に対応しており、通常の受託では難しい微量のサンプルや分解サンプ ルにも可能な限り対応します。さらに、10xGenomics 社の1 細胞RNASeq 、1 細胞TCR 解析についても受託を行なっております。 一方、2017 年10 月にパシフィック・バイオサイエンス社のPacBio Sequel® を導入し、一分子シーケンスの受託解析を開始しました。2020 年2 月に Sequel II、続いて2021 年1 月にはSequel IIe を導入しました。 PacBio を用いたロングリードと、他のショートリード解析との最大の違 いはもちろんリード長が長いことですが、これまでNGS の主戦場であっ たショートリードではソフトウエアや解析手法の助けがあってもカバー できない不可能な解析も多々あり、一度に長く解読できるロングリード シーケンシングでより複雑な生命暗号をさらに深く解読できるようにな ります。2022 年4 月には、T2T コンソーシアムにより、テロメアやセン トロメアも含めたヒト完全長のゲノム解読が発表されましたが、その中 で同社のロングリードシーケンサーは中心的な役割を果たしました。 ロングリードシーケンシングでできること： • Iso-Seq（アイソフォームシーケンス）：スプライスされて生じる転写産物 のアイソフォームは、ショートリードのデータから完全にカバーする ことができません。 • 構造多型・変異の解析：様々な疾患の原因となるゲノムの構造多型や 変異（欠失・挿入・増幅・逆位・転座etc.）の構造は、SNP（一塩基多型） よりもはるかに長く、複雑で、ショートリードで検出することが困難。 • ハプロタイプの解析：SNP の場合も、それが相同染色体のうちのどち らに生じているか（フェージング）は、ショートリードでは見分けら れません。 • リピート配列の解析：ゲノムには、機能が未知のものも含め様々な高頻 度反復配列があります。これらは、ショートリードではマッピングが できず、解析結果から削除されてしまう対象です。 • リファレンス配列の存在しない未解析の生物、非モデル生物の新規ゲ ノム配列決定 ロングリードシーケンサーは様々な新発見をもたらす機器である一方、 誰もが高品質のデータを取得できるわけではありません。この機器で はこれまで必要であったサンプルDNA の増幅は行わなくて済む代わり に、質の良いDNA、すなわちインタクトで不純物を含まないDNA がマ イクログラム単位で必要になります。私たちは長年培われた“かずさ DNA 研究所メソッド”を活かし、厳密なサンプル調製からデータ解析 を行い高品質なデータの取得が可能です。パシフィック・バイオサイエン ス社は、シーケンス解析だけでなく各プロセスを厳格に評価し、高品質 データを取得できる施設を認証サービスプロバイダーとして認定してお り、我々認証サービスプロバイダーはパシフィック・バイオサイエンス社 との強い結びつきにより最新かつ正確な情報を共有しており、ご依頼 いただいた解析に反映させることができます。 さらに網羅的解析としてトランスクリプトーム解析（発現解析RNA-seq） とプロテオーム解析を組合わせたマルチオミックス解析も開始しました。 ショート& ロングシーケンスだけでなく所内プロテオーム解析チームと 連動したマルチオミックス解析についてのご質問などいつでもお寄せく ださい。 かずさDNA 研究所は1994 年に世界 初のDNA 専門研究機関として千葉県 の支援を受けスタートし、植物やヒト の遺伝子研究を中心に成果を上げて 参りました。臨床オミックス解析グルー プ遺伝子分析チームは、開所以来20 年余にわたり培ったDNA シーケンシン グ技術（DNA 塩基配列の読み取り技 術）を中心とする各種ノウハウの継承 ならびに、次々と公開される新しい技 術の整備や独自の開発を担っていま す。そして、医療や農業を含めた幅広 い分野に関わる産学官の皆様のご依 頼に応じてこれらの技術を有償で提供することにより、サポート事 業を継続的に維持する仕組みを作り上げています。 公益財団法人 かずさDNA 研究所 遺伝子分析チーム チーム長 長谷川嘉則 先生 概要 • DNA を冠した日本初の研究所“かずさDNA 研究所”によるNGS 受託解析サービス • 日本初のPacBio Sequel® の認証サービスプロバイダーによるSequel®（ロングリード）シーケンシングサービス • 日本の研究者にきめ細かい事前コンサルティングおよびアフターフォロー オミックス解析 3 DIA プロテオーム解析受託・マルチオミックス解析受託 概要 • DIA-MS 技術によるプロテオーム解析を開始（9,500 タンパク質の網羅的、比較可能な解析） • 真のプロテオーム解析とトランスクリプトーム解析（RNAseq）を組み合わせたリーズナブルなオミックス解析を提案 • マルチオミクス解析はフェノールグアニジン系の試薬に漬けたサンプルを送るだけでデータを取得 オミックス解析 はじめに DNA シーケンシングの黎明期だった 1970 年後半から1980 年代始めに 大学院で生命科学の研究をされていたシニア世代にとっては当時の 「シーケンシング」と言えば、タンパク質のアミノ酸配列決定だったと いう生命科学の歴史を思い出されることもあると思います。生体システ ムの機能を司る主役は、間違いなくタンパク質です。タンパク質の定性 的・定量的な計測データから生体システムの機能的な「状態」を記載す ることは王道中の王道です。しかし、これまで多くの方は圧倒的にトラン スクリプトーム解析を生体システムの網羅的な記載に用いてきました が、転写はタンパク質翻訳への過程に過ぎず、タンパク質解析への回 帰が 不可欠であることは明らかです。 次世代プロテオミクス解析 タンパク質に関する網羅的な解析が主役になりきれなかった原因は、 トランクリプトーム解析などと比較すると分析深度が低く、一般的なプ ロテオーム解析では約 3000 ～ 5000 種類のタンパク質を同定・比較定 量できる程度にとどまっていたことです。これでは様々な分野で着目さ れることの多いキナーゼや転写因子などの微量タンパク質を観測する には不十分であり、さらなる分析深度の拡大が期待され続けてきました （図 1）。かずさ DNA 研究所では次世代プロテオミクスと称されている 分析深度、定量性に優れた DIA プロテオミクス技術をを取り入れ、さら に最新鋭の質量分析計（Orbitrap Exploris 480, Thermo Fisher Scienti c 社） で測定することにより、最大 9500 種類のタンパク質を同定・比較定量 （HEK293 細胞を用いた系で行った場合。観測できるタンパク数はサン プルの種類に依存）を行えるシステムを構築しています。私たちは同じ 検体からこうした網羅的解析のための RNA とタンパク質を同時に調製 できる系も確立しており、更により微量タンパク質からの高感度検出に 向けての開発研究を実施しており、正当な「オミックス解析」と呼ぶに ふさわしい解析メニューを開発中です。当受託ではここで構築した最先 端のプロテ オーム解析サービスを提供します。また、この技術をベース にした高深度リン酸化プロテオーム解析なども対応しておりますので、 ご興味があればお問い合わせください。 図2. RNA-Seq とプロテオーム解析で観測された mRNA とタンパク質をコー ドする遺伝子の重複　上図はRNA-Seq と5 年前に測定したデータ依存型分 析法（DDA）よるプロテオーム解析との比較、右図はRNA-Seq と本受託サー ビスの高深度DIA プロテオーム解析との比較を示す。分析したサンプルは HEK293 細胞である。RNA-Seq とプロテオーム解析のそれぞれの解析で用い たデータベースに共通して存在した遺伝子のみを対象とした。以前のプロテ オーム解析ではRNA-Seq で観測できる遺伝子数との差が大きかったが、本 受託サービスの高深度DIA プロテオーム解析ではその点が大きく改善され、 マルチオミクス解析を行う上で対象となる分子が大幅に増加した。 5 年前に取得したDDA プロテオ＝ム解析 RNA-Seq 12144 genes （FPKM>1） RNA-Seq 12144 genes （FPKM>1） 従来の プロテオーム解析 3152 genes 高深度DIA プロテオーム解析 9503 genes 本受託サービス 9002 3142 10 2955 9189 314 図1. DIA プロテオーム解析による分析深度の飛躍的進歩　HEK293 細胞を用 いて高深度 DIA プロテオーム解析で観測されたタンパク質のダイナミック レンジを示す。本解析ではHEK293 細胞から約 8400 種類のタンパク質が観 測された（同定の閾値：Protein FDR < 1%, Peptide FDR < 1%）。一般的なプロ テオーム解析を想定して、発現量の多い 5000 タンパク質からキナーゼなら びに転写因子の数を調べるとキナーゼが 228 種類、転写因子が 502 種類で あった。それに対して観測された全タンパク質ではキナーゼが 500 種類、転 写因子が 1300 種類と格段に増加した。このことから、キナーゼや転写因子 を含めた微量タンパク質を対象とする場合に高深度 DIA プロテオーム解析を 行うことに大きなアドバンテージがある。 プロテオーム解析技術の開発を主な 研究テーマとして取り組んでおり、開 発した技術や培ってきたノウハウをも と様々な研究室と共同研究を行い、 それぞれのニーズに対応しながら多種 多様なサンプルのプロテオーム解析 をしてまいりました。プロテオミクス という言葉ができてから20 年以上経 ちますが、残念ながらだれもが簡単 にプロテオーム解析が行えるわけで はなく、同じ質量分析計を持っていて も使い手によって観測できるタンパク 質数が倍近く変わることも珍しくあり ません。高度なプロテオーム解析を 実現させるためには、サンプルの種類ごとに応じた適切な前処 理、目的に合わせた適切な質量分析計のセッティング、パフォー マンスを維持するための質量分析計の適切な管理が必要不可欠 です。本受託解析ではこれまでの経験をもとに以上の点を押さ えた高度なプロテオーム解析を提供できればと思ってます。 公益財団法人かずさ DNA 研究所 臨床オミックス ユニット 研究員 川島祐介 研究員 4 新リピドーム・メタボローム解析受託 はじめに リピドミクス・メタボロミクスは、ゲノム情報の発現過程の最下流に位 置しているオミックス解析の一つの分野で、生体内に存在する代謝物 を解析して、代謝変化の背後に関わる分子の探索を行い、表現型や生 体機能との関連性を明らかにする研究です。近年、これらの代謝オミ クス技術は、医療・食品・環境など様々な分野で応用されている一方で、 未だ技術的なハードルの高さが問題となっています。その理由として、 それぞれの代謝物に物性の違いがあり（主には親水性と脂溶性に大別 される）、生体内での濃度域も大きく異なるために、最先端の分析機器 のみならず、それぞれの代謝物の性質に関する知識や経験に裏付けら れた方法論が必要となるためです。 本受託サービスでは、“難しいと感じられる”リピドミクス・メタボロミク スの先端的な分析・解析技術を“より身近に感じられる”ように情報提供 できればと考えております。中でも、本受託サービスの特徴として、技術 的なハードルが非常に高いとされてきた脂質のノンバイアス解析について、 脂質のエキスパートの独自開発技術によって、従来にはない“高精度かつ 高網羅的な”探索が可能になっており、新しい研究展開も期待されます。 次世代リピドミクス・メタボロミクスの“次世代”の所以は、代謝全貌 に迫るプラットフォームとしての位置づけと捉えているためで、他には ないハイレベルでの生命現象などの理解に向けて、今後サービス提供 を予定しております。 リピドーム・メタボローム解析サービス内容 生体内に多種多様に存在する代謝物は、ゲノム情報を有しておらず、増 幅させることができないため、液体クロマトグラフィー質量分析計（LCMS） やガスクロマトグラフィー質量分析計（GC-MS）が、これらを高感 度で一斉的に捉える重要な基盤技術となります。本受託サービスの次 世代オミクス解析技術は、主にフォーカス（ターゲット） 法とノンバイア ス（ノンターゲット）法という2 つのアプローチに分類され、対象とな る代謝物や研究目的に合わせて選択の提案もさせて頂きます。 フォーカス（ターゲット）法とは? 現在広く普及しているリピドミクス・メタボロミクス技術であり、三連 四重極型（Triple-Q 型）MS を用いた Multiple Reaction Monitoring（MRM） と呼ばれる分析法が適用されることが多いです（概略図・左部および注 ①参照）。このフォーカス法は、対象分子の選択性の高い分析法や最適 化された前処理法を組み合わせることによって、生体中に極微量（数 nM あるいはそれ以下）に存在する代謝物の検出や標的パスウェイの代 謝物群の“高深度な”探索に適しています。 リピドミクスのフォーカス型受託のサービスでは、構成脂肪酸の組成解 析のメニュー（GC-MS）だけでなく、生体機能の恒常維持や病態との関連 性で注目されている酸化脂肪酸（エイコサノイド・ドコサノイドなど）やコ レステロール代謝物（胆汁酸・ステロール・性ホルモン・副腎皮質ホルモン など）を対象とした最新の解析メニュー（LC-MS）も展開しております。 メタボロミクスのフォーカス型受託のサービスでは、GC-MS による親 水性の一次代謝物を中心とした解析メニューだけでなく、探索可能なパ スウェィをさらに広げた“ワイド”フォーカス法と呼ばれる GC-MS と LC-MS を組み合わせたアプローチによって、“より包括的な”親水性代 謝物の解析メニューを展開しております。 ノンバイアス（ノンターゲット）法とは? 四重極飛行時間型（QTOF）MS などの高分解能なMS を用いた“高網羅 的な” 解析技術であり、近年注目されています。その背景の一つとして、 フォーカス法は分析前に予め設定した代謝物のみが解析対象となり探 索範囲が限られるために、“高網羅的な”代謝変化を探索する目的には マッチングしないことが挙げられます。このノンバイアス法は、フォー カス法とは異なって予め対象分子を絞り込まず、代謝物の定性および 定量的なデータを同時的に取得可能なData Dependent Acquisition（DDA） モードなどと呼ばれる分析を駆使して、未知分子を含めた代謝変動のス クリーニングに適しています（概略図・右部および注②参照）。この分析 法では、膨大な定性・定量情報を入手可能ですが、これらのデータ処理 の効率性や代謝物の同定精度などの高いクオリティーが求められます。 このために、高度なインフォマティクス技術が不可欠であり、これまで ボトルネックとなっていました。 本リピドミクス・メタボロミクスの受託サービスでは、かずさ DNA 研究所 独自の高精度な in-house 同定ソフトウェアや内外の化合物ライブラリー 検索、さらには高分離分析技術などを組み合わせた先端的なノンバイア ス解析技術を通じて、脂質代謝物や親水性（二次）代謝物の“高精度か つ高網羅的な”同定・相対定量解析メニューを提供することが可能です。 特に、多種多様な脂質は、エネルギー源や生体膜の構成成分として細胞 の形成・恒常性維持や、メディエーターとして細胞内や細胞間の情報伝達 を担うなど様々な働きや疾患との関連性で注目されておりますので、他に はない脂質のエキスパートによる日本初サービスをご活用下さい。 ※注①　MRM 分析： 三連四重極型 MS の最初の四重極（Q1）で、分析対象の分子量のイオンを選択的に通過 させ、次の四重極（Q2）で Collision-Induced Dissociation（CID）により生じたフラグメント イオンのうち、その中から特定の部分構造を持つイオンを最後の四重極（Q3）で選択的 に通過させ検出することで、その分子構造特異的な検出を行うことが可能です。 ※注②　DDA 分析： 高分解能な四重極飛行時間型 MS などにおいて、最初にサンプル中に含まれる脂質分子 の網羅的な検出を行い（MS スキャンニング）、次に設定した強度閾値を越えたものにつ いて自動的に構造解析を行う（MS/MS）モードが適用されます。 我々はリピドミクス・メタボロミクス の黎明期から技術開発や応用研究に 取り組んでおり、植物から医学に至 る幅広い領域で、数多くの実 績を積 み重ねてきました。一方で、代謝オミ クスの研究展開には、代謝物の性質 に関する知識や LC,GC-MS の前処理・ 分析・解析などの専門的な技術が必 要なため、未だハードルが高く普及の 障壁となっているのが現状です。 本受託サービスでは、このようなハー ドルのためにリピドミクス・メタボロ ミクスに馴染みがない方々にも安心 してお試し頂けるように、解析前後でのコンサルティング制度も 取り入れております。この取り組みにより、専門的視点から目的 に合わせた最適な前処理法・分析法・解析法を選び出し、できる だけ多くの分子の検出や着目する対象を捉えて、研究進展に貢 献できるように努めたいと考えております。 また、本受託サービスの技術的な特徴として、リピドミクス・メ タボロミクスを「オミクス研究」としても位置づけを重視した網 羅性の高い“ワイド”フォーカス解析やノンバイアス解析のメ ニューがあり、予想外の代謝変動やマーカー分子の発見に繋が ることも期待されます。さらに、かずさゲノムテクノロジーズ（KGT） との連携によりプロテミクスなどを含めたマルチオミクス解析の サービスを提供しており、他にはない広範囲かつ高深度な代謝 解析プラットフォームを開発展開したいと考えております。 公益財団法人 かずさDNA 研究所 生体分子解析グループ グループリーダー 池田和貴 概要 • 先端的な研究ノウハウを技術展開した多分野向けの次世代リピドーム・メタボローム受託解析サービス • スペシャリストによるコンサルティングを含めた充実のフォローアップ体制 • 脂質研究のエキスパートの独自開発の先端技術による“高精度かつ高網羅的な”ノンバイアス解析 5 疾患検体 LC/MS GC/MS LC/MS（ 高分解能型） モデル生物培養細胞微生物植物 定性・統計 相対定量 健康や病気に 関わる分子の発見 微生物などから 有用成分の発見 食品中の 機能性成分を発見 未知分子の 探索と同定 メタボロミクス/ リピドミクス技術を通して ヘルスケア・医療・農業・食品などの幅広い分野へ貢献 ノンバイアス解析 “高網羅的な”データ （未知分子を含む） “高深度な”データ （標的代謝物やパスウェイ） 代謝マップ 数百 分子 数千 分子 フォーカッシング解析 6 NGS 解析受託 • サンプル量および品質が下記リスト記載の量に満たない場合でも、解析可能な場合がございます。予めご相談ください。 解析メニュー作業内容取得データ目安必要サンプル量納期 ロングリードシーケンス（PacBio® Sequel II / IIe） RNA クオリティチェック+ ライブラリ調製+ シーケンサーラン 400 万 – 500 万well 由来の リードTotal RNA：4 μg 以上（100 ng/μl 以上） 8-12 週間 （4 セルの場合 DNA は 8 週間） HiFi Read：10-30 Gb （HiFi データ作成後） continuous long read:90-130 Gb （DNA の品質による） HiFi Read：30 μg 以上 continuous long read：20 μg 以上 HiFi read データ作成 （オプションメニュー） ーーー2 週間 ゲノム解析 全ゲノムシークエンス ライブラリ調製+ シーケンサーラン ご依頼内容ごとに設定DNA：2 μg 以上（100 ng/μL 以上） 4 週間～ Human Exome-Seq （150bp Paired-End） アジレントV6 or V7 4,000 万リード、6 Gb DNA：2 μg 以上（100 ng/μL 以上） 8 週間 発現解析 真核生物 mRNA-Seq （TypeA； 75 bp Single-Read） クオリティチェック+ ライブラリ調製+ シーケンサーラン 1,500 万リード、1125Mb total RNA：2 μg 以上（40 ng/μL 以上） 4 週間 真核生物 mRNA-Seq （TypeB； 75 bp Paired-End） 3,000 万リード、2.25Gb total RNA：2 μg 以上（40 ng/μL 以上） miRNA-Seq（75 bp Single-Read） 1,500 万リード、1125Mb total RNA：4 μg 以上（200 ng/μL 以上） 8 週間 3'RNA-Seq 100 万リードtotal RNA：2 μg 以上（40 ng/μL 以上） シングルセル3'RNA Seq 100 万リードシングルセル エピジェネティクス関連 Human Bisul te-Seq （75 bp Paired-End） ライブラリ調製+ シーケンサーラン 3,000 万リード、2.25 Gb DNA：4 μg 以上（100 ng/μL 以上） 8 週間～ MBD-Seq（75 bp Paired-End） 3,000 万リード、2.25 Gb DNA：4 μg 以上（100 ng/μL 以上） ChIP-Seq（75 bp Single-Read） ご依頼内容ごとに設定クロマチン免疫沈降後DNA：100 ng 以上 （10 ng/μL 以上） お問い合わせ ライブラリ調製 mRNA-Seq 用材料RNA のクオリ ティーチェック＋ ライブラリ調製＋ 調製したライブラ リーのクオリティー チェック（長さ、濃度） 納品物は作製済みの ライブラリーとなります。 total RNA：2 μg 以上（40 ng/μL 以上） 3 週間 Total RNA-Seq 用total RNA：2 μg 以上（40 ng/μL 以上） Human Exome-Seq 用DNA：2 μg 以上（100 ng/μL 以上） 全ゲノム、Target-Seq 用DNA：2 μg 以上（100 ng/μL 以上） シーケンサーラン（レーン貸切） NextSeq 500*1 75 bp Single-Read シーケンサーラン 4 億リード、最大30 Gb 4 週間 75 bp Paired-End Mid 2.6 億リード、最大19.5 Gb 150 bp Paired-End Mid 2.6 億リード、最大39 Gb 75 bp Paired-End 8 億リード、最大60 Gb 150 bp Paired-End 8 億リード、最大120 Gb MiSeq 150 bp Piared-End 2700 万リード、4 Gb 8 週間 250 bp Paired-End 2700 万リード、6.7 Gb 300 bp Paired-End 4,700 万リード、14.1 Gb 150 bp Paired-End Micro 800 万リード、1.2 Gb 150 bp Paired-End Nano 200 万リード、300 Mb 250 bp Paired-End Nano 200 万リード、500 Mb DNBSEQG400RS 50 bp Single-Read 16 億リード、80 Gb 8 週間 100 bp Single-Read 16 億リード、160 Gb 400 bp Single-Read 16 億リード、640 Gb 100 bp Paired-End 32 億リード、320 Gb 150 bp Paired-End 32 億リード、480 Gb 200 bp Paired-End 32 億リード、640 Gb イルミナライブラリー Conversion 費用 Conversion を実施 （ランは含みません） 3 週間 オプションメニュー クオリティチェック（バイオアナライザー） 1 週間 濃度測定（定量PCR） 1 週間 1 細胞NGS 解析受託（Chromium system） RNA-seq、TCR、BCR サンプル調製*2 ＋ ライブラリ調製＋ シーケンサーラン＋ データ解析 （出張サービスあり） お問い合わせ *1 NextSeq 2000 もございます。メニューはホームページをご覧ください。 *2 細胞懸濁液からのシングルセルの調製準備 オミックス解析メニュー　取得データ量は目安の数値であり、それらのデータ量を保証するものではありません。 7 抗体の可変領域解析 解析メニュー納期 基本解析3 - 4 週間 CDR 同定1 - 2 週間 5'-RACE 法により5'UTR から定常領域までの塩基配列を取得し、シグナル配列部分の開始メチオニンから可変領域の末端部分までの配列を報告します。かずさDNA 研究所では大規 模cDNA プロジェクトでの経験を生かし、抗体産生細胞からRNA 抽出を行い、迅速な可変領域配列の決定を行います。 * 多検体解析のためのボリュームディスカウントなどもご用意しております。 * 解析についても別途お見積りいたします。お問合わせフォームにてご相談ください。 DIA プロテオーム解析 本サービスはタンパク質配列が解析されている生物種を対象としたものです。 解析メニュー作業内容取得データ目安必要サンプル量納期 発現タンパク質の同定と相対定量解析 簡易DIA プロテオーム解析LC-MS/MS（DIA） タンパク質抽出*+ トリプシン消化+ 質量分析 （同定ならびに相対定量解析） 5000 - 7000 タンパク質タンパク質：40 μg 以上 目安：細胞5 × 105 以上、 組織10 mg 以上、 血清/ 血漿1 μL 以上、 尿200 μL 以上 脂肪細胞や脳組織など 脂質を多く含むサンプルは20 mg 以上 4 週間 標準DIA プロテオーム解析 LC-MS/MS（DIA） 7000 - 8500 タンパク質 高深度DIA プロテオーム解析 LC-MS/MS（DIA） 8500 - 10000 タンパク質 リン酸化タンパク質の同定と相対定量解析 標準DIA リン酸化プロテオーム解析 GPF+LC-MS/MS（DDA、ライブラリ作製用） LC-MS/MS（DIA、相対定量解析用） タンパク質抽出*+ トリプシン消化+ リン酸化ペプチド濃縮+ 質量分析 8000 - 12000 リン酸化ペプチド断片タンパク質：1 mg 以上 目安：細胞 1ｘ 107 以上、 組織 50 mg 以上 4 週間 高深度DIA リン酸化プロテオーム解析 GPF+LC-MS/MS（DDA、ライブラリ作製用） LC-MS/MS（DIA、相対定量解析用） 12000 - 20000 リン酸化ペプチド断片 ゲルバンド中のタンパク質同定 ゲルバンド中のタンパク質同定 LC-MS/MS（DDA） ゲル内消化（トリプシン消化）+ 質量分析ータンパク質バンドが 検出できていれば可能4 週間 免疫沈降したサンプルのタンパク質同定 免疫沈降したサンプルのタンパク質同定 LC-MS/MS（DIA） サンプル：ビーズ免疫沈降したサンプルの前処理+ トリプシン消化＋ 質量分析 ー 2 ～ 3 μg の抗体で免疫沈降した タンパク質 （オンビーズ法による推奨プロト コルをホームページに掲載） 4 週間 免疫沈降したサンプルのタンパク質同定 LC-MS/MS（DIA） サンプル：溶出物 2 ～ 3 μg の抗体で免疫沈降した タンパク質 オプションメニュー クリーナップ処理 （タンパク抽出物、体液、培養上清などの液体状の サンプルの場合は必須） サンプルの溶液の種類、液量、 濃度により、有機溶媒沈殿法、 TCA 沈殿法、順相系ビーズを使用 ー ー 納期に 影響せず ヒト血清/ 血漿高存在量タンパク質14 種類除去 & クリーナップ処理 カラムによる除去+ クリーナップ処理血清/ 血漿10 μL 以上 マウス・ラット血清/ 血漿アルブミン・IgG 除去 & クリーナップ処理 ヒト・マウス・ラット以外血清/ 血漿 アルブミン除去& クリーナップ処理 （FBS が含まれる培養上清からのアルブミン除去 にも対応） 乾燥ろ紙血（DBS）からの難溶性タンパク質抽出 疎水性タンパク質濃縮、かつ、 親水性タンパク質（ヘモグロビン、 アルブミン、グロブリンなど）除去 DBS 直径1.2 cm 程度の ディスク1 枚分以上 ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織から のタンパク質抽出 ホルマリンによる分子架橋の除去 + タンパク質抽出 ホルマリン固定パラフィン包埋組織 （固定が48 時間以下のもの） 厚さ：10 ～ 20 μm 表面：50 mm2 以上 ゲルの切り出しーー 解析アップグレード データ納品後、 同じサンプルを 使用して 高深度解析を実施 簡易→標準DIA 質量分析 5000 - 7000 → 7000 - 8500 （タンパク質） 追加のサンプルは不要 （データ納品後、2 週間以内に お申込み、4 週間以内に発注を 行ってください。） 標準 DIA →高深度 DIA 7000 - 8500 4 週間 → 8500 - 10000 （タンパク質） 標準DIA リン酸化→ 高深度DIA リン酸化 8000 - 12000 → 12000 - 20000 （リン酸化ペプチド断片） 同一サンプル繰り返し測定（一度DIA プロテオーム 解析で測定したサンプルを、再度測定） ー 追加のサンプルは不要納期に 影響せず データ解析 （GO 解析, Pathway 解析, Upstream 解析） geneXplain platform ー1 週間～ ペプチドーム解析 ペプチドーム解析によるペプチド同定 LC-MS/MS（DDA） 質量分析ーお問い合わせお問い ペプチドーム解析によるペプチド同定・相対定量解析： 合わせ LC-MS/MS（DDA, ライブラリ作製用, DIA, 相対定量解析用） 8 * サンプルが凍結培養細胞、凍結組織の場合。その他のサンプルはご相談ください。 リピドーム・メタボローム解析受託 本サービスはヒトやマウス、微生物（腸内細菌を含む）植物由来のサンプルを対象としたサービスです。その他の生物種に関してはお問合せください。 解析メニュー作業内容取得データ目安必要サンプル量納期 リピドーム解析 高網羅的な脂質解析 脂質ノンバイアス解析： 高網羅的な脂質代謝物の同定・ 相対定量解析 コンサルティング+ 代謝物抽出+ 分離分析 （LC-MS（DDA））+ 解析レポート （統計解析を含む） 独自の先端的なin-house 同定ソフトウェアや分離 分析技術による脂質の網羅的なスクリーニング （500-1000 分子程度を検出想定） 対象： 遊離脂肪酸（中鎖～極長鎖型）、リゾリン脂質類、 リン脂質類、スフィンゴイド類（S1P を含む）、セラ ミド類、糖セラミド類（ガングリオシドなど）、グリ セロ脂質類（中性脂質など）、グリセロ糖脂質類 （MGDG など）、ステロールエステル類（コレステロー ルエステルなど）、脂肪酸代謝物（アシルカルニチン・ CoA など）、リポアミノ類（アナンダミドなど）等 目安： 細胞1 × 106 以上 組織50 mg 以上 血清/ 血漿50 μL 以上 * 少ない場合は要相談 8 週間～ 標的した脂質の高深度解析 脂質ワイドフォーカス解析 （短～長鎖脂肪酸）： 短～長鎖脂肪酸（総脂質中） の包括的な相対定量解析 コンサルティング+ 代謝物抽出+ 分離分析（GC-MS（SCAN）&LC/ MS（MRM））+ 解析レポート （統計解析を含む） C2 ～ C24 程度の脂肪酸の高分離分析 （20-40 分子程度を検出想定） 対象： 飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸（シス型・トランス型） 目安： 細胞1 × 106 以上 凍結組織50 mg 以上 血清/ 血漿50 μL 以上 * 少ない場合は要相談 8 週間～ 脂質フォーカス解析（酸化脂肪酸）： 酸化脂肪酸の相対定量解析 コンサルティング+ 代謝物抽出+ 分離分析 （LC-MS/MS（MRM））+ 解析レポート （統計解析を含む） ω -3 とω -6 系脂肪酸（C18, 20, 22）由来の 酸化代謝物の一斉分析 （50-100 分子程度を検出想定） 対象： リノール酸由来、リノレン酸由来、アラキドン酸由 来、EPA 由来、DHA 由来など 目安： 細胞1 × 106 以上 凍結組織100 mg 以上 血清/ 血漿100 μL 以上 * 少ない場合は要相談 8 週間～ 脂質フォーカス解析 （コレステロール類)： コレステロール代謝物の 相対定量解析 コンサルティング+ 代謝物抽出+ 分離分析（LC-MS（MRM））+ 解析レポート（統計解析を含む） コレステロール由来の代謝物の一斉分析 （30-50 分子程度を検出想定） 対象: 胆汁酸、コレステロールおよび前駆体、 性ホルモン、副腎皮質ホルモンなど 目安： 細胞1 × 106 以上 凍結組織200 mg 以上 血清/ 血漿100 μL 以上 * 少ない場合は要相談 8 週間～ メタボローム解析 網羅的な親水性代謝物解析 親水性代謝物ノンバイアス解析： 網羅的な親水性代謝物（二次） の推定・相対定量解析 コンサルティング+ 代謝物抽出+ 分離分析（LC-MS（DDA））+ 解析レポート（統計解析を含む） 高分解能質量分析による親水性二次代謝物の 網羅的なスクリーニング 対象: フラボノイド、アルカロイド、ポリケタイド、芳香 族生理活性物質など 細胞1 × 106 以上 凍結組織200 mg 以上 血清/ 血漿100 μL 以上 植物体100 mg 以上 ＊少ない場合は要相談 8 週間～ 標的した親水性代謝物の高深度解析 親水性代謝物ワイドフォーカス解析： 包括的な親水性代謝物（一次） の相対定量解析 コンサルティング+ 代謝物抽出+ 分離分析（GC-MS（MRM）& LC-MS（MRM））+ 解析レポート （統計解析・パスウェイマップ を含む） GC-MS とLC-MS を組み合わせによる 包括性の高い親水性代謝物の一斉分析 （100-200 分子程度を検出想定） 対象： アミノ酸および誘導体、有機酸（解糖系・TCA 回路 関連物質、脂肪酸等）、核酸、糖・糖リン酸、水溶 性ビタミン、補酵素など 目安： 細胞 1 × 106 以上 凍結組織200 mg 以上 血清/ 血漿100 μL 以上 * 少ない場合は要相談 8 週間～ 親水性代謝物フォーカス解析： 特定の親水性代謝物（一次）に 絞り込んだ相対定量解析 コンサルティング+ 代謝物抽出＋ 分離分析（GC-MS（MRM）or LC-MS（MRM））＋ 解析レポート（統計解析を含 む、GC-MS の場合はパスウェ イマップを含む） GC-MS もしくはLC-MS による“特定範囲の”親水 性代謝物に“絞り込んだ”分析 （50-100 分子程度を検出想定） 対象: アミノ酸および誘導体、有機酸（解糖系・TCA 回路 関連物質、脂肪酸等）、 核酸、糖・糖リン酸、水溶性ビタミン、補酵素など 細胞 1 × 106 以上 凍結組織200 mg 以上 血清/ 血漿100 μL 以上 植物体100 mg 以上 ＊少ない場合は要相談 オプション 香気成分解析 コンサルティング＋香気成分 捕集・抽出＋分離分析（GC-MS （Scan））＋解析レポート GC-MS による香気（揮発性）成分にフォーカスした スクリーニング 対象: テルペン、アルコール、アルデヒド、エステルなど お問い合わせ8-12 週間 解析アップグレード： 取得データの高深度なデータ解析 および解釈・説明 データ再解析や学術調査 （論文等）などを実施の上で コンサルティング ー4 週間 マルチオミックス解析受託 本サービスはタンパク質配列が解析されている生物種を対象としたものです。フェノールグアニジン系の試薬、もしくはRNA 保護試薬に細胞や組織 を浸してお送りください。RNA/ タンパク質抽出以降を弊社で実施いたします。 解析内容はトランスクリプトーム解析、プロテオーム解析、メタボローム解析メニューからご希望の項目を選択し組み合わせることができます。 ゲノム解析の追加をご希望の場合はお問合せください。 • 作業内容： トランスクリプトーム解析とプロテオーム解析のマルチオミックスの場合 RNA / タンパク質＊ / 代謝物抽出+ 次世代シーケンシング+ 質量分析+ 簡易データ解析** * サンプルが凍結培養細胞、凍結組織の場合。その他のサンプルはご相談ください。 ** ヒト、マウス由来サンプルの場合 • 納期目安　5 ～ 9 週間 • 必要サンプル量（目安）　 細胞1 × 107 以上、組織50 mg 以上、血清/ 血漿1 μL 以上、尿200 μL 以上 メニュー、サンプル種により必要サンプル量は増減します。お問合せの上ご確認ください。 9 NGS 解析受託サービス 使用機器 NextSeq 500、NextSeq 2000、MiSeq［イルミナ社］、PacBio Sequel II、PacBio Sequel IIe［PacBio 社］、DNBSEQ-G400RS［MGI 社］ 納品物 ロングリード、ゲノム解析、発現解析、エピジェネティクス関連およびランのみ（レーン貸切）は、Fastq ファイルと作業報告書の入った DVD またはHDD サンプル送付方法 サンプル調製方法送付方法 ゲノムDNA TE または市販のDNA 抽出キットの溶出液保冷剤を同梱し冷凍便 RNA RNase フリー水または市販のRNA 抽出キットの溶出液ドライアイスを同梱し冷凍便 ライブラリー市販のライブラリー調整キットのプロトコールに従って溶解保冷剤を同梱し冷凍便 抗体産生細胞（ハイブリドーマ） ハイブリドーマをPBS 中で2 回遠心し、上清を除いて速やかに冷凍したものドライアイスを同梱し冷凍便 • 送付サンプルは必ず抽出したDNA またはRNA または調製済みライブラリーの状態にしてお送りください。細胞・組織などの状態でのサンプル受 け取りはできません。 • データ解析のみのご依頼の場合：依頼書記載のサンプル名称と、データにご登録されている名称は統一してください。ヒトサンプルの場合は匿名 化をお願いいたします。作業内容ならびにお見積もり内容の確定後にデータをご送付ください。 プロテオーム解析受託サービス 使用機器 Orbitrap Exploris 480［Thermo Fisher Scienti c 社］、Q-Exactive HF-X［Thermo Fisher Scienti c 社］ 納品物 M S 測定データ（ .rawファイル）、タンパク質同定・相対定量解析データ（解析ソフトウェア DIA-NN で出力されるデータ）、観測されたタンパ ク質名、タンパク質の定量値などを記載したリスト（Excel ファイル）をHDD、DVD-R またはUSB メモリスティックに収納して納品いたします。 サンプル送付方法 サンプル調製方法送付方法 培養細胞培地を除去後、PBS にて2 回洗浄し、チューブに入れて液体窒素で凍結* ドライアイスを同梱し冷凍便 組織取り出した組織をPBS にて血液を除去し、チューブに入れて液体窒素で凍結* ドライアイスを同梱し冷凍便 タンパク質抽出物、血漿・血清チューブに入れて液体窒素で凍結* ドライアイスを同梱し冷凍便 培養上清500 xg、5 分程度の弱い遠心で細胞を除去し、さらに15,000 xg、10 分程度の遠心で細胞片など を除去した上清をチューブに入れて液体窒素で凍結* ドライアイスを同梱し冷凍便 ゲル片（CBB 染色、質量分析用銀染色、他）切り出したゲルをチューブに入れてパラフィルムを巻く保冷剤を同梱し冷蔵便 ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE） 組織 弊社から送付いたしますエッペンドルフ社のセーフロックチューブに入れてパラフィルムを巻く （ホルマリン固定時間が48 時間以下のサンプルのみ受託を引き受けることが可能） 常温便 * 長期保存の場合はスクリュータイプのしっかりと密閉できるチューブを推奨 * 液体窒素がない場合は速やかに-80℃で凍結（ 金属ブロックなどがあれば、事前に-80℃に入れ、そこにサンプルを置いて急速に凍結させることを推奨） • 必要サンプル量は各メニューの記載をご参照ください。 • サンプル必要量以下の場合でも分析をお引き受けすることは可能ですが、サンプル量が少量になるに伴って観測できるタンパク質も減少します。ま た、1 回分の分析量しか得られなかった場合にマシントラブル等で十分な測定結果が得られなかったときは無償で再測定は行いますが、サンプル の補償はできません。サンプルが必要量あるかどうか分からない場合でも、こちらでタンパク定量を行い、必要量以下のときはお客様にご連絡す るようにしております。 • サンプルチューブは弊社から送付いたしますエッペンドルフ社のセーフロックチューブを推奨します（特に微量サンプルの場合は強く推奨）。 チューブはオートクレーブしていないものをご使用ください。 • ゲルサンプルの場合はケラチンなどのコンタミネーションが確認される場合が多くあります。電気泳動、染色、切り出しなど必ず手袋をして実験者 由来のコンタミネーションが起こらないように注意してください。また、ゲルの切り出しはバンド以外のゲルが極力入らないように切り出してくだ さい。ゲル体積が増えると非特異的吸着も増え、損失を招くことになります。 オミックス解析受託サービスご利用案内 お打合せ、お見積り兼発注書・ 解析依頼書の受け取り 解 見 解析依頼書 見積もり兼発注書 ・販売店に発注書提出 ・ 解析依頼書にサンプル情報を 記入し送付（Email） 解 解析依頼書 見 見積もり兼発注書 かずさゲノム テクノロジーズ社 E-mail 販売代理店 ご注文の流れ お問合せ・お見積りフォームに 必要事項を記入し送信 • サンプル送付前にサンプル情報を記載した解析依頼書(Excel ファイル) をメールにてお送りください。 • サンプル送付時にはプリントアウトした解析依頼書を同梱してください。 10 リピドーム・メタボローム解析受託サービス 使用機器 ノンバイアス解析 メタボロミクス：Q Exactive（Thermo Fisher Scienti c）　リピドミクス：TripleTOF 6600（SCIEX） フォーカシング解析 メタボロミクス：LCMS-8050、GCMS-TQ8050 NX、GCMS-QP2010 Ultra（SHIMADZU）　 リピドミクス：LCMS-8060（SHIMADZU） 納品物 MS 測定データ（Raw ファイル）、代謝物同定・相対定量解析データ（Excel ファイル）をHDD、DVD-R またはUSB メモリスティックに収納し て納品いたします。 サンプル送付方法 サンプル調製方法送付方法 細胞培地を除去後、PBS にて2 回洗浄し、チューブに入れて液体窒素で凍結＊ ドライアイスを同梱し冷凍便 組織取り出した組織をPBS にて血液を除去し、チューブに入れて液体窒素で凍結＊ ドライアイスを同梱し冷凍便 血清・血漿チューブに入れて液体窒素で凍結＊ ドライアイスを同梱し冷凍便 * 長期保存の場合はスクリュータイプのしっかりと密閉できるチューブを推奨します。 * 液体窒素がない場合は速やかに-80℃で凍結してください（金属ブロックなどがあれば、事前に-80℃に入れ、そこにサンプルを置いて急速に凍結させることを推奨） • 必要サンプル量は各メニューの記載をご参照ください。 • サンプルが必要量以下の場合、分析をお引き受けすることは可能ですが、サンプル量が少量になるに伴って観測できる代謝物も減少します。また、 1 回分の分析量しか得られなかった場合にマシントラブル等で十分な測定結果が得られなかったときは無償で再測定は行いますが、サンプルの補 償はできません。サンプルが必要量以下のときは、お客様にご連絡するようにしております。 • 微量なサンプルや静電気等でチューブ内で失われやすいサンプルは、弊社から送付いたします専用チューブで送付いただくようお願いする場合があ ります。 マルチオミックス解析受託サービス 納品物 作業報告書、fastq ファイル、プロテオームデータ一式（MS 測定データ、解析ソフトウェアDIA-NN で出力されるデータ、観測されたタンパ ク質名およびタンパク質の定量値などを記載したリスト） サンプル送付方法 サンプル調製方法送付方法 培養細胞培地を除去後、PBS にて2 回洗浄し、フェノールグアニジン系などの試薬を加え チューブに入れて液体窒素で凍結ドライアイスを同梱し冷凍便 組織取り出した組織をPBS にて血液を除去し、フェノールグアニジン系などの試薬が 入ったチューブに入れて液体窒素で凍結ドライアイスを同梱し冷凍便 • 細胞、組織にフェノールグアニジン系の試薬*、もしくはRNA 保護試薬** を加えた状態でお送りください。ホモジナイズは不要です。 その他のサンプルはご相談ください。 *ISOGEN（ニッポンジーン社）、TRIzol（ThermoFisher 社）、QIAzol（QIAGEN 社）など**RNAlater（ThermoFisher 社）など • 必要サンプル量は各メニューの記載をご参照ください。 • サンプルチューブはエッペンドルフ社のセーフロックチューブを推奨します（特に微量サンプルの場合は強く推奨）。チューブはオートクレーブして いないものをご使用ください。 お問合せ・お見積りフォームは各サービスホームページから www.promega.co.jp/products/jutaku/ サンプル・解析依頼書送付先 〒292-0818　千葉県木更津市かずさ鎌足2-6-7 株式会社かずさゲノムテクノロジーズ Tel：0438-52-2001　Mail：otoiawase@kazusagt.com ＊注意：サンプルは平日に到着するようご指定ください サンプル送付 （印刷した解析依頼書を同梱） 解析依頼書 かずさゲノム テクノロジーズ社 宅急便 解 11 安定発現株 TrueSTABLE Cell　～ HAC を用いた安定発現細胞作製～ 概要 • かずさDNA 研究所のHAC および新規lox テクノロジーを利用した新しい安定発現細胞TrueSTABLE Cell 作成 サービスを開始 • ゲノムを傷つけない人工染色体（HAC）技術でコピー数、発現量もコントロール可、新規組換え技術によるシステマチックな構築作業 • プロメガのルシフェラーゼ& タグ技術を導入でき、セルベース解析も受託可能 図2. HAC への目的遺伝子の部位特異的組換え HAC 発現ベクター トランスフェクション GFP A B C 従来法 新導入法 従来のランダム インデグレーション ゲノムに傷 （どこに、何カ所入るかも不明） 複数種の安定発現株を 一度に作成可能 何度でも入れ替え可能 導入効率に優れるVloxP-SloxP サイト ※さらに3 つの変異型 loxP サイトも利用可能 （オプション） VloxP SloxP ・ かずさORF リソース ・ プロメガの発現& 検出系 表1. TrueSTABLE Cell と従来の安定発現細胞株との比較 特長従来法（プラスミドベクターを使用する場合） 新導入法（TrueSTABLE Cell） 導入 導入先ゲノム（ランダムに挿入される） HAC（HAC 上の定位置に挿入［挿入カセット］） 導入コピー数 （細胞あたり1 種類の遺伝子について） コピー数の制御は困難（各クローンによりバラバラ） ※過剰発現で細胞毒性を持つタンパク質の場合、発現株が得られない可能性もある。1 コピー 導入可能サイズ10 Kb 程度数100 kb 程度（移動元に依存：プラスミド・BAC クローン） 作業効率形質転換効率が低い（薬剤選択、大量のスクリーニングが必要） 新規loxP によりシステマチック（複数種の安定発現株作成も容易） 発現量コピー数・挿入部位に依存一定（プロモーターに依存） 発現の安定性低い（低下する場合あり） ※ クロマチン構造変化による発現抑制を受ける場合がある 安定（プロモーターの性質を維持） ※ HAC が宿主染色体と同程度に細胞中で安定である。 樹立に要する時間3 ～ 4 ヶ月程度1.5 ヶ月程度 これまで一般的に作成されていた安定性発現細胞は、用時トランスフェ クションの問題点を解決するものの、宿主ゲノムDNA に傷をつけ、また 取り込まれる宿主DNA の部位、個数が多種多様で、さまざまなクローン が作られ、同じものを作ることは困難です。かずさゲノムテクノロジー ズでは、HAC にかずさDNA 研究所の新規部位特異的組換え酵素システ ム（VloxP-SloxP テクノロジー）およびプロメガのHiBiT 技術を応用して、 これらの問題を解決しました。 真の安定発現細胞を求めて これまでの安定発現細胞 遺伝子組換え安定発現細胞はタンパク質の大量生産、長期的なタンパ ク質の機能解析、薬理学的研究、遺伝子治療の道具として、生命科学 研究において非常に高い需要があります。従来の安定発現細胞株の作 製には①目的遺伝子のトランスフェクション、②薬剤選別、③クローニン グ、④増殖、⑤発現解析といったステップを要し、多大な時間と労力を 要します。従来法のうち代表的な手法であるRandom integration 法は、 宿主のゲノムDNA を傷つけることによるアーティファクトが懸念される 上、導入コピー数の厳密な制御は不可能です。さらに長期培養により 発現量が減少するなど、発現量のコントロールは困難を極めます。その ため同一クローンを用いた解析でも培養を重ねることで再現性が低下 する場合や、クローン間の表現型の比較（例えば目的遺伝子の野生型 と変異型）が単に発現量の差を反映した結果であることなどが懸念さ れます。 HAC とは HAC とは人工的に作られた47 本目のヒト染色体です（図1）。HAC は、 細胞分裂時に宿主細胞の染色体と同様に複製、分配され、長期に渡り 細胞内で安定に保持されます。宿主細胞の染色体とは独立に存在する ため、宿主細胞のゲノムDNA を傷つけることはありません（図2、表1）。 図1. HEK293 細胞に導入したHAC HAC 12 新規安定発現細胞TrueSTABLE Cell 作成システムの利点 弊社がご提供するHAC を用いたTrueSTABLE Cell では、従来の安定発 現細胞と比較して以下の利点があります。かずさDNA 研究所が開発し た部位特異的相同組換え手法を用いることで、①宿主のゲノムDNA を 傷つけない、② 1 細胞当たり1 コピーの遺伝子を決まった位置に挿入す ることが可能、③ HAC 上の決まった位置に遺伝子が挿入されるため、 同じプロモーターを用いた場合発現量をほぼ一定に調節することが可 能、④サイレンシング等の影響を受けにくく、長期に安定した発現が可 能、⑤単一HAC 内の複数の異なる部位特異的組換え領域を用いること で、複数の遺伝子を発現する細胞株の樹立も可能。以上の特徴により、 長期に渡る表現型解析やクローン間の比較を常に一定の発現量の下で 行うことができます。また、HAC では挿入可能なDNA の長さにほぼ制 限がないため、転写調節領域等の非翻訳領域を含めた配列やポリシス トロニックな配列を導入し、その影響を解析することもできます。加え て、薬剤選別も不要であり、薬剤耐性株単離に要する時間や選別によ るバイアスを回避できます。 迅速な構築 従来の安定発現細胞株作製では細胞を十分量増やしたのちqRT-PCR や western blotting 等による発現解析が行われています。弊社では発現解 析にプロメガ株式会社が開発した高感度の検出系を用いることで、発 現解析のための細胞増殖に要する時間を大幅に短縮することが可能に なりました。さらに、弊社のシステムでは複数の遺伝子を同時に細胞に トランスフェクションした場合、1 細胞当たり1 種の遺伝子のみ挿入さ れるため、目的遺伝子が多種にわたる場合でも同時に作製が可能であり 迅速に構築できます。 目的遺伝子の作製から発現解析までサポート 目的遺伝子を持つプラスミドベクターの構築に関して、かずさDNA 研 究所が持つ豊富な遺伝子資源をもとに、プロメガ株式会社が開発した フレキシクローニング技術を用いて迅速な構築が可能です。また、 各種タグ、シグナル配列の融合などにも対応しております。さらに、 安定発現細胞作製後の発現解析、タグに応じた解析も提供可能です。 KGT のご紹介 株式会社かずさゲノムテクノロジー ズ（Kazusa Genome Technologies： KGT）は、2015 年に公益財団法人 かずさDNA 研究所（KDRI）からス ピンオフして設立された会社です。 KDRI の所有する遺伝子資源に Promega Corporation の先端テクノ ロジーを融合した各種クローンを はじめ関連技術受託サービス提供 などをコアビジネスとして、様々 な連携機関との多方面への事業展 開を行い、お客様の広いニーズに マッチしたサービス提供を行って います。 株式会社かずさゲノム テクノロジーズ（KGT） 安定発現株細胞作製 受託サービス名細胞納期 参考価格（¥） アカデミア企業 TrueSTABLE Cell 作成サービス （Target Insertion） （A）HEK293 2 カ月～ 600,000 ～ 1,000,000 ～ （B） お客様ご提供の細胞（汎用培養細胞の場合） 3.5 カ月～ 1,400,000 ～ 1,800,000 ～ 安定発現細胞作成サービス （Random integration：従来の安定発現株作成法による） （C）HEK293 3.5 カ月～ 800,000 ～ 1,200,000 ～ （D） お客様ご提供の細胞（汎用培養細胞の場合） 3.5 カ月～ お問い合わせお問い合わせ オプション 受託サービス名納期参考価格（¥） セルベース解析：プロメガの HiBiT、NanoLuc®、HaloTag® などのレポーターの定量、 NanoBRET® および NanoBiT® PPI 解析やpmirGLO を用いたmiRNA 活性測定お問い合わせお問い合わせ 受託内容例：上記TrueSTABLE Cell 作製サービス（A）の場合 • 作業内容　 ① 目的遺伝子のHEK293（HAC を含む）への導入 ※目的遺伝子（ORF）は材料としてご提供ください。Flexi® ORF Clone（18 ページ）より別途購入も可能です。 ② HEK293（HAC を含む）での目的遺伝子発現の確認 ※ HiBiT、NanoLuc®、HaloTag® などプロメガの検出タグによる発現確認の場合は作業、試薬代は料金に含まれます。 ［注意］上記以外のタンパク質検出法による発現確認については別途お見積りいたします。 • 納品物　目的遺伝子を導入したHEK293 最低3 クローン（各106 個細胞）、発現確認データ その他（B）（C）（D）については別途お見積りいたします。 ※ 納品された細胞に対する遺伝子改変はライセンス上不可となります。 ※ お客様から提供物（ベクター、細胞など）がある場合、それらを用いた実験受託の可否についてライセンス等を必ずご確認ください。 ※ 本サービスで利用する HAC はクロモリサーチ社で開発されたものです。 本サービスの詳細、お問合せ、見積依頼は以下をご覧ください。 www.promega.co.jp/products/jutaku/truestablecell/ 13 クローン分譲・改変 ヒト・マウス遺伝子とmiRNA 標的配列クローンの分譲、 その改変と新規作製 概要 • かずさDNA 研究所、国内研究機関の遺伝子リソースをクローン化して分譲 • 購入時の面倒な書類の記入は不要。大学、公的研究機関はもちろん、企業における面倒なライセンス契約も不要 • オンラインで見積り兼注文用紙を自動発行 かずさDNA 研究所をはじめとする国内研究機関が有する各種リソース （主にヒトのORF、プロモーター、miRNA 結合配列）とプロメガのレポー ター/ タグ技術（NanoLuc® 、ホタルルシフェラーゼ［luc2］、ウミシイタケ ルシフェラーゼ［Rluc］、HaloTag® ）を組み合わせたクローンコレクション です。シグナル伝達、細胞内タンパク質イメージング、タンパク質間相 互作用、miRNA などの研究、スクリーニング等様々な用途にご利用い ただけます。 クローン ヒト・マウス遺伝子クローン　かずさDNA 研究所のクローンリソース 長鎖に特化したかずさcDNA コレクション（> 4,000 クローン）と幅広い ラインナップのOC（The ORFeome Collaboration）ORF コレクションの2 つのリソースをベースとした独自のクローンリソースを、NanoLuc® Flexi® ベクター（pFN31K またはpFC32K）やHaloTag® Flexi® ベクター（pFN21A） などに導入したクローンを提供しています。10,000 種以上のヒトORF から選択可能であり、ORF は他のFlexi® Vector へ容易に移し換えできます。 miRNA 標的配列クローン　MiCheck miRNA Biosensor Clone microRNA による発現制御の影響をルシフェラーゼアッセイで検討する ためのクローンです。各組織や未分化細胞で発現の高いmicroRNA そし て疾患（主にがん）と関連性のあるmicroRNA を189 種類選抜しました。 これらのクローンは、国立研究開発法人国立精神・神経医療研究セン ター神経研究所神経薬理研究部・室長北條浩彦先生が作製されたク ローンをプロメガが付託され販売するものです。 クローンブック Flexi® ORF クローンを様々な分野の代表的なパスウェイでカテゴライズ しました。各研究分野カテゴリーの分類分けあるいはフリーワード検索 などで目的のORF を簡便にピックアップし、エクセルファイルとして書 き出し& 保存、メールに添付して見積もり依頼することができます。 クローンの大量調製 クローン各種の標準容量は100 ng（Flexi® NanoLuc® Clone は500 ng 以内）ですが、追加料金にて増量できます。 増量カタログ番号追加料金（¥） 10 μg EFCSCU 20,000 50 μg EFCSCU50 30,000 100 μg EFCSCU100 60,000 上記以上ーご相談ください ヒト/ マウス遺伝子クローン クローンタイプベクターインサート容量参考納期Product ID（PID） Flexi® Nanoluc® Clone pFN31K またはpFC32K Vector （Neo 遺伝子含む） ヒトORF（NanoLuc® 付加、 N 末端かC 末端かを選択可能） ～ 500 ng （50 ng/μlTE） 3 週間～ Flexi® HaloTag® Type pFN21A： 哺乳類発現用Flexi® ベクターで、 N 末端にHaloTag® を付加 ヒトORF （N 末端にHaloTag® 付加） 100 ng / 10 μL 約2 週間～ 1 カ 月 FHCxxxxxN または FHCxxxxxC Flexi® Cloning Type pF1K-base： 大腸菌発現用Flexi® ベクターを改変 ヒトORF FXCxxxxx マウスORF RXCxxxxx Original ORFeome Clone Type pDONR223、pENTR221 など （Gateway システム） ヒトORF（Stop コドンあり） ORSxxxxx ヒトORF（Stop コドンなし） ORHxxxxx マウスORF（Stop コドンあり） MRSxxxxx マウスORF（Stop コドンなし） MRHxxxxx Original Kazusa Clone Type pBluescript II SK（+）などヒトcDNA（ORF+UTR） ORKxxxxx miRNA 標的配列クローン クローンタイプベクターインサート容量参考納期Product ID（PID） MiCheck miRNA Biosensor Clone psiCHECK™ -2 microRNA 標的配列 （ヒト157 種、マウス32 種） 100 ng / 10 μl 約2 週間MICxxxxxxx 本サービスの詳細、お問合せ、見積依頼は以下をご覧ください。 www.promega.co.jp/products/jutaku/ 14 クローンの改変・作製 タグの付け換え、遺伝子変異導入、ORF の多種Flexi® ベクターへのサ ブクローニングなど承ります。 Flexi® ベクターへのサブクローニングについて Flexi-Flexi サブクローニングでは、既に目的のインサートを含むFlexi® Cloning Type クローンなどのFlexi® ベクターから異なる種類のFlexi® ベク ターにサブクローニングいたします。Non-Flexi サブクローニングでは、 Flexi® ベクター以外のベクターからFlexi® ベクターへインサートをサブク ローニングいたします。 サブクローニング例： • Flexi® ORF Clone から他のFlexi® ベクターへのORF 移し替え • Flexi® HaloTag® Clone（N 末融合）からFlexi® HaloTag® ベクター（C 末融 合）へのORF 移し替え • Flexi® ベクター以外の他種ベクターからFlexi® ベクターへの移し替え 新規構築 ▶ カスタムクローニング分譲クローンのリストにない遺伝子を Flexi® ベ クターにクローニングします。 ▶ オリジナルベクター構築ご指定いただいたベクターと遺伝子配列で、 新規クローン作製やオリジナルのベクター構築を行います。 ＊ お客様から提供物（ベクターなど）がある場合、それらを用いた実験受託の可否に ついてライセンス等を必ずご確認ください。 レポーターアッセイのためのベクター構築 NanoLuc®、Fluc、HiBiT、HaloTag® などプロメガのタグを用いたベクター 構築を行います。構築物を使用した安定発現細胞株（12-13 ページ）の 作製も承ります。 ［例］ ▶ 指定のプロモーター領域＋ルシフェラーゼ遺伝子のベクター構築 ▶ miRNA の機能を検証するための 3’- UTR ＋ルシフェラーゼ遺伝子の ベクター構築 ▶ 各種シグナル応答配列＋ルシフェラーゼ遺伝子を導入した安定発現 株作製 オプション：構築したルシフェラーゼアッセイベクターを用いた コントロール実験 構築したベクターを実際に細胞に導入し、発光シグナルが検出できるこ とを検証します。 プロメガクラブでベクター・細胞デザイン構築相談承ります プロメガユーザーのための会員サービス、プロメガクラブにご登録いた だきますと、目的のアッセイに適したベクターおよび細胞のデザインを 弊社テクニカルサービスで無償サポートいたします。 本サービスの詳細、お問合せ、見積依頼は以下をご覧ください。 www.promega.co.jp/products/jutaku/ exisubcloning/ 分譲クローンの改変 メニュー内容サイズ納期価格（¥） Flexi® ベクターへの サブクローニング Flexi® -Flexi® サブクローニング：Flexi® ベクター間でのインサート乗せ換え1 回分150,000 ～ * Non-Flexi® サブクローニング：Flexi® ベクター以外のベクターからFlexi® ベクターへ インサートのインサート乗せ換え1 回分200,000 ～ * 遺伝子の完全長化、修復公共データベースの最新情報をもとに、既存のFlexi® ORF Clone に含まれる遺伝子を 完全長化し、アップデートされたORF クローンとしてご提供1 クローン要見積り Flexi® HaloTag® クローンへの シグナルペプチド付加 遺伝子由来シグナルペプチド付加：遺伝子本来のシグナルペプチドの直後にHaloTag® を 挿入、遺伝子本来の局在が期待される1 クローン要見積り IL6 シグナルペプチド付加：IL6（インターロイキン6 遺伝子）シグナルペプチドを N 末端側に付加したHaloTag® ベクターにORF を導入、強制的な膜への局在が期待される1 クローン約1 ヶ月～ 200,000 ～ 変異導入SNP 間あるいはバリアント間の変更やその他の変異導入、欠失作業など1 か所要見積り マウスクローン受託 かずさDNA 研究所ではマウスクローンに関しても豊富な資源を有しており、解析の終了 したcDNA クローンについては入手可能です（www.kazusa.or.jp/rouge/ 参照）。その他の ご要望にお応えできる場合もございます。詳細については別途お問い合わせください。 ー * サブクローニング先のFlexi® ベクター料金（30%OFF［他のキャンペーンとの併用はできません］）も含まれており、お求めやすくなっています。 新規構築 メニュー内容サイズ納期価格（¥） カスタムクローニングFlexi® ORF Clone コレクションに無いORF のFlexi® ベクターへのクローニング （配列確認、発現確認を含む）など1 クローン要見積り オリジナルベクター構築Flexi® Vector 以外のベクターを用いた様々なクローニング及びその発現確認1 クローン要見積り 15 図3. 従来の安定発現細胞株とQuEstHAC™ Cell の比較 図2. HAC への目的遺伝子の部位特異的組換え • 各コンストラクトを細胞に導入 し、NanoBRET™またはNanoBiT® システムで測定 • 最もBRET Ratio または発光値の 高い組み合わせを実験に採用 NanoLuc （NanoBRET） or SmBiT（NanoBiT） HaloTag（NanoBRET） or LgBiT（NanoBiT） A B C D E G H F タンパク質間相互作用：NanoBRET™、NanoBiT® 検討用 ベクターセット作製 NanoBRET™、NanoBiT® システムは、生細胞でリアルタイムにタンパ ク質の相互作用を定量的にモニタリングできる数少ない手法です。 これらのシステムはタンパク質間の相互作用を蛍光あるいは発光シグ ナルとして検出するため、標的となる2 つのタンパク質にそれぞれ蛍 光タンパク質タグ（HaloTag®）あるいは発光タンパク質タグ（NanoLuc®、 LgBiT、SmBiT）を付加する必要があります。高感度なシステム構築の ためには、N 末端、C 末端、またタグの配向について最適な組み合わ せを検討することが推奨され、その場合合計8 種類のベクターを用意 する必要があります。弊社では豊富なクローンリソースをもとに、これ らシステム最適化の検討用ベクターを受託作製し、ご提供いたします。 細胞アッセイに「プロメガクラブ」 プロメガクラブはご登録いただくと様々な特典が受けられる会員サー ビス（無料）です。発光法実験でお悩みの方に「オンライン問診」、 機器の無償貸し出しやオンラインセミナーなどご利用いただけます。 【お薦めオンラインセミナー】 ・ 発光を利用したリアルタイム細胞内 タンパク質相互作用（PPI）アッセイ ・ レポーターアッセイの最前線； Genetic Reporter とProtein Reporter 本サービスのお問合せ、見積依頼は以下をご覧ください。 https://promegajp.formstack.com/forms/genomics_serv NanoBRET™、NanoBiT® 検討用ベクターセット作製 メニュー内容サイズ納期価格（¥） NanoBRET™ 検討用セット作製NanoBRET™ でタンパク質- タンパク質間相互作用アッセイシステムを構築するための、 検討用ベクターセット（8 種類）を作製8 クローン約1 ヶ月～ 575,500 ～ NanoBiT® 検討用セット作製NanoBiT® でタンパク質- タンパク質間相互作用アッセイシステムを構築するための、 検討用ベクターセット（8 種類）を作製8 クローン約1 ヶ月～ 540,000 ～ ・本サービスはサブクローニングのみであり、発現チェックは行っておりません。 ・HaloTag® やルシフェラーゼなどの遺伝子を含むベクターの使用には「パテントおよび免責事項」の内容をご確認いただく必要があります。 NanoBRET™ の場合 ① 8 clone ¥520,000 HaloTag®-POIX, POIX-HaloTag® NanoLuc®-POIX, POIX-NanoLuc® HaloTag®-POIY, POIY-HaloTag® NanoLuc®-POIY, POIY-NanoLuc® ② pFC14K HaloTag® CMV Flexi® Vector Cat. #G9661 ¥55,500- 注） 総額¥575,500 はProtein X, Y ともにHaloTag® 標準クローンがある場合です。 NanoBiT® の場合 ① 8 clone ¥390,000 SmBiT-POIX, POIX-SmBiT LgBiT-POIX, POIX-LgBiT SmBiT-POIY, POIY-SmBiT LgBiT-POIY,  POIY-LgBiT ② NanoBiT® PPI Flexi® Starter System Cat.# N2015 ¥150,000- 注） 総額¥540,000 はProtein X, Y ともにHaloTag® 標準クローンがあり、 Flexi® starter kit を用いた場合です。MCS の場合は、￥40,000 が加算されます。 各セットの内訳 プロメガクラブ検 索 プロメガクラブ詳細は テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982　● E-Mail : prometec@jp.promega.com PK2211-01B 販売店 日本語 Web site：www.promega.co.jp プロメガ株式会社 本　　　社　〒103-0001 東京都中央区日本橋小伝馬町1-5 PMO日本橋江戸通 Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所　〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2022年11月現在のものであり予告なしに変更することがあります。