2016年にノーベル賞医学・生理学賞の受賞となったオートファジーを評価するシステムです。
オートファジーは細胞内のタンパク質等の分解に深く関与しており、オートファジーの破綻が疾患に結びつく事が分かってきています。
このシステムには相補的なNanoLuc ルシフェラーゼの結合システムNanoBiT（NanoLuc Binary Technology）の原理を応用した、多機能発光タンパクタグHiBiTの技術が活用されています。
オートファジーのマーカーであるLC-3タンパクとHiBiTを融合タンパクとして細胞内に発現させます。
オートファジーが進むとLC-3タンパクが分解されるため、システムに付属する試薬を用いて、HiBiT-LC-3の発光量の変化よりオートファジーの活性を評価します。 これまでのオートファジー評価法では、下記のデメリットがありました。

グルコース、乳酸、グルタミン、グルタミン酸は細胞における主要な栄養因子であるともに、これらの因子の細胞内外のバランスの変化は細胞の性質に大きな影響を及ぼします。プロメガでは発光測定技術を元に、これらの細胞内外の因子を測定する技術（LGGGアッセイ;Lactate測定アッセイ、Glucose検出アッセイ、Glutamine検出アッセイ、Glutamate検出アッセイ）を確立しています。
今回はこのプロメガの技術と、音響技術を使った微量の液体サンプル自動分注装置Echo® Liquid Handlerシステムを活用し、1536wellでの細胞外のアッセイモデル、72時間までのLGGGの量の変化、ミトコンドリア呼吸鎖の阻害剤Metforiminを添加した際の検討例を示しています。
糖代謝およびグルタミン代謝の主要因子を1536wellフォーマットで高感度かつに経時に測定できることを示しています。

がんおよび炎症のキーとなるpathwayについてImmunoBiTアッセイを使用したセルベースでのキナーゼアッセイの実施例をご紹介しております。下記pathwayのキーとなるタンパクについて定量および阻害を見ています。

• NF-kB pathway: IkBalpha のトータルおよびリン酸化のモニタリング
• JAK/STAT pathway: STAT3 のトータルおよびリン酸化のモニタリング
• BTK pathway: BTK のリン酸化の検出
  結論：ImmunoBiTのメリットとして以下が挙げられます。
• NanoLucの発光を利用：化合物の阻害が少ない
• ホモジニアスアッセイで簡便、また細胞を改変（トランスフェクション等）する必要がない
• WB, ELISA, 蛍光アッセイに比べ少ない手順で検出可能
• HTSに最適
• 抗体を変えればご自身の目的タンパクにも適用可能

2016年にオートファジーがノーベル賞医学・生理学賞を受賞し、細胞内タンパク質分解の破綻による疾患が注目を 集めています。しかしこれまでは細胞内タンパク質をリアルタイムに、また高ハイスループットでモニターすることが難しく、解決すべき課題の一つとなっていました。
プロメガはこの課題の解決法として、独自のNanoLucテクノロジーを用いて目的タンパク質とProteasomeの相互作用をリアルタイム検出する手法を開発しました。目的タンパク質にNanoLucを融合させ、ProteasomeサブユニットにHaloTagを融合させることで、目的タンパク質とProteasomeの相互作用をNanoBRETテクノロジーで検出できるようにしています。同時にNanoLucシグナルにより目的タンパク質量の定量も行うことができます。この技術の発展系として、NanoLucの代わりにHiBiTタグを使用し、ゲノム編集でHiBiT付加したタンパク質の分解モニタリングデータも掲載しています。ポスター1349-Eと合わせてご参照ください。

タンパク質の分解、細胞膜上から細胞内への取込み、リン酸化などのダイナミックな変化は細胞の生理活性や疾患の要因として重要な意味を持つにも関わらず、生きた細胞での解析が遅れていた分野です。特に内在性レベルでの解析には非常に高感度の検出法が必要とされるため、特に難しい課題となっていました。
プロメガが開発した高発光タグHiBiTは、これらの解析を大きく進める可能性を秘めています。このポスターではわずか11アミノ酸でありながら高発光のペプチドタグHiBiTを使用し、内在性レベルでのタンパク質ダイナミクスをモニ タリングしています。HiBiTをゲノム編集で目的タンパク質に融合させ、HiBiTと結合して発光活性を示すLgBiTタンパク質を細胞に安定発現させる系を構築し、HiBiT融合タンパク質のリアルタイムモニタリングを行っています。
またこの系とHaloTag融合タンパク質を組合せてNanoBRETを行えば内在性レベルでのタンパク質相互作用解析も可能になり、HaloTag融合タンパク質の代わりに蛍光標識した抗リン酸化抗体を使えばNanoBRETにより内在性レベルでのタンパク質リン酸化を検出するアッセイ系も構築可能です。内在性レベルでタンパク質を解析したい方、必見です。

RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Assay はリアルタイムにアポトーシスを検出するキットです。NanoBiTの原理を利用しています。RT-Gloと同様、最初1回添加のみで48時間までのリアルタイムに発光測定できます。エンドポイントアッセイも可能です。また、CellToxGreen様の膜非透過型核酸結合蛍光色素とともにネクローシス検出のマルチアッセイもできます。ポスターではアポトーシス、ネクローシスのリアルタイム マルチアッセイ、48時間のリアルタイムデータ、Caspase-Gloとの相関、発光イメージングのデータを掲載しております。
※イメージングデータは国内でオリンパスと共同でデータ取得しております。このような発光イメージングにご興味のある方はご連絡ください。

アポトーシスの過程における各ステップを、発光および蛍光イメージングによりモニタリングしたデータを 紹介しております。Luciferase安定発現細胞に対してVivoGlo caspase 3/7基質、およびAnnexinV necrosis assayにて測定することにより、アポトーシスの過程として 1. Caspase 活性、2. AnnexinV 陽性、3. ネクローシスの3つのイベントについて、リアルタイムにイメージングすることに成功しました。
※国内でオリンパスと共同で取得したデータです。このような発光イメージングにご興味のある方はご連絡ください。

Succinate-Glo は、代謝産物としてSuccinate（コハク酸）を生じる脱メチル化酵素の活性を簡便に検出できるアッセイシステムです。
このアッセイでは、脱メチル化酵素活性測定に加え、タンパク質・DNA・RNAの水酸化酵素／酸化 還元酵素の活性測定にも使用することができます。またこのポスターでは、酵素活性の測定だけではなく酵素反応速度論の解析や、阻害剤の阻害様式の検討（Fe(II)または2-oxoglutarate 競合的か）に使用したデータを紹介しています。また、少ない反応液量にも対応しており、化合物によるアッセイ系への干渉が少ないため、high-throughput screening (HTS)にも適したアッセイシステムです。ポスターでは、JMJD2Cメチル化酵素の阻害剤スクリーニングを実施したデータも紹介しています。

化学反応の速度は温度に大きく依存するため、温度の変動は実験結果に影響を及ぼす要因となります。プレートリーダーの測定チャンバー内の温度は必ずしも室温に等しいとは限らず、機器からの放熱によって室温よりも 2～10℃も高くなることがあるため、測定データの精度に影響を及ぼす可能性があります。
このポスターでは、TECAN 社の冷却モジュール TeCool™ を用いて、ホタルルシフェラーゼ発光反応ベースのGloアッセイに及ぼす温度変化の影響について検討してい ます。ポスターでは測定時の温度変化が、酵素反応のキネティクスに影響すること、化合物スクリーニングの誤判定をもたらす可能性、などを示しています。こうした温度変化の影響に対して、冷却モジュールを使用する方法や、あらかじめ測定プレートを測定チャンバー内で平衡化する方法が効果的であるデータを紹介しています。高い精度をもつ最適なデータを確保するためには、測定時の温度管理を 適切に実施することが重要です。

がん治療を始め、様々な疾患治療に抗体医薬品が応用されつつあります。抗体医薬品の評価には細胞を使用 するバイオアッセイが欠かせませんが、細胞を使うアッセイだけにハイスループット化が難しいという懸念があります。
プロメガが提供する数々のバイオアッセイは96-well plateフォーマットだけでなく384-well plateフォーマットにも対応しており、今後ますますニーズが高まる抗体医薬品評価の高速化の強力なツールです。このポスターでは開発競争が激しい PD-1/PD-L1パスウェイを始めとするCo-Inhibitoryパスウェイのブロック抗体バイオアッセイ、CD40やOX40パスウェイを始めとするCo-Stimulatory パスウェイのブロック抗体、アゴニスト抗体バイオアッセイを紹介します。