現在ホットなタンパク質分解誘導剤はPROTACsを含めて多数報告、開発されていますが、そのうちの一つであるMolecular Glueは分子サイズが小さく比較的細胞透過性がよいことが特徴の一つです。本ポスターではPROTACsと同様にMolecular Glueをプロメガの標的タンパク質分解プラットフォームで評価した事例をご紹介しています。 本ポスターでは下記のアプリケーション事例が示されています。

• Molecular Glueによる標的タンパク質分解のライブセル解析および細胞生存性・毒性アッセイとのマルチプレックス事例
• Molecular GlueによるE3 Ligaseと標的タンパク質の相互作用解析および標的タンパク質のユビキチン化評価
• PROTACsとMolecular Glueの細胞透過性比較

今、PROTAC (PROteolysis TArgeting Chimera) をはじめとする標的タンパク質分解が新しい創薬モダリティとして非常に注目されています。PROTACsは標的タンパク質結合部位・E3 Ligase結合部位・リンカーを合成して作られますが、合成したPROTACの評価には、膜透過性、細胞内での安定性、標的タンパク質への結合、ユビキチン-プロテアソーム複合体の形成、分解のモニタリングなど多岐にわたるプロセスを評価するシステムが必要です。プロメガは生細胞でこれら5つのプロセスを評価できるアッセイ系を提供しています。
本ポスターでは、生細胞におけるPROTACsと標的タンパク質の結合解析、およびこれを応用したPROTACsの細胞透過性評価事例を紹介しています。

本ポスターでは下記のアプリケーション事例が示されています。

• 標的タンパク質またはE3 LigaseとPROTACsの結合解析
• PROTACsの細胞透過性評価
• 新たなE3 Ligaseの事例としてXIAP、cIAP1およびMDM2と化合物の結合解析データ

国内CRO、カルナバイオサイエンス社とのコラボレーションポスターです。カルナバイオサイエンスが提供するキナーゼ酵素活性アッセイQuickScount™法とプロメガのNanoBRET™ TE法を用いてキノームワイドにキナーゼ阻害剤選択性の比較を行い、アッセイ間で高い相関性がみられること、またNanoBRET™ TE法のライブセルアッセイではより阻害剤の選択性が高い結果が得られることを示しています。

本ポスターでは下記のアプリケーション事例が示されています。

• Type I, IIおよびアロステリック阻害剤評価
• 膜受容体型キナーゼの評価
• 野生型と変異体キナーゼの阻害剤結合比較
• キナーゼ-化合物親和性とResidence Time比較
• 可逆的および不可逆的阻害剤のResidence Time測定

キナーゼはこれまで最も有望かつ成功を収めた創薬ターゲットの一つであり、また依然として有望な創薬ターゲットとして日々研究開発が進められている標的分子です。キナーゼ阻害剤の解析はin vitroのbiochemicalな酵素アッセイから生細胞内での結合アッセイに移行しつつあり、このニーズに応えてプロメガはNanoBRET™ テクノロジーを用いたTarget Engagement Assayを開発しています。また最近ホットなタンパク質分解誘導キメラ分子（PROTACs）にキナーゼ阻害剤を組み込み、キナーゼPROTACsを開発する動きも進んでいます。 本ポスターでは、キナーゼの中でも最近注目されているCDKに着目し、NanoBRET™ TEによる細胞でのCDK阻害剤とPROTACsの解析事例をご紹介します。

• NF-kB pathway: IkBalphaとp65のトータルおよびリン酸化のモニタリング
• JAK/STAT pathway: STAT3のトータルおよびリン酸化のモニタリング
• mTOR/PI3K/AKT pathway: AKTトータルおよびリン酸化の検出

結論：NanoBiT™ Cell based immunoassaysのメリットとして以下が挙げられます。

• CDK阻害剤の細胞内におけるCDK選択性とサイクリンバイアスの検証が可能です。
• タイプI、タイプII阻害剤を細胞内で解析可能です。
• 細胞内でのキナーゼと化合物の結合親和性および解離速度（Residence Time）を解析可能です。
• キナーゼPROTACsとキナーゼ、E3リガーゼとの結合を細胞内で評価可能です。

NanoBiT™ テクノロジーを応用したLumit™ Immunoassayでは、NanoBiT™ 標識抗体を用いてAdd and Readでのホモジニアスアッセイができるため、従来のウェスタンブロット解析やELISAに比べ迅速簡便なアッセイが可能になります。このポスターでは、がんや炎症に関連するNF-kB、JAK/STAT、mTOR/PI3K/AKTなどのシグナル伝達経路について、NanoBiT™ 標識二次抗体と2種類の一次抗体を用いたリン酸化レベルやタンパク質量の変化について評価した事例を紹介しています。

【Lumit™ Immunoassayのメリット】

本ポスターでは下記のアプリケーション事例が示されています。

• 生物発光ベースのアッセイのため化合物干渉が少なく、高感度なアッセイが可能
• Add and Readの簡便なホモジニアスアッセイ
• HTSフォーマットにも対応
• 抗体を変えることで目的タンパク質に対応したアッセイも構築可能

NanoBiT™ 標識二次抗体はカスタム品として販売中です。またポスター内で使用しているバリデーション済み一次抗体情報をご希望の方はお問合せください。

Lumit™ Immunoassay特設ページ： https://www.promega.jp/products/small-molecule-drug-discovery/immunoassay/

NanoBiT™ テクノロジーを応用したLumit™ Immunoassayでは、NanoBiT™ 標識抗体を用いてAdd and Readフォーマットの迅速簡便なアッセイを実現します。Lumit™ Immunoassayでは以下3つのフォーマットでのアッセイ構築が可能です（添付図参照）。

1. NanoBiT標識一次抗体を用いるDirectアッセイ
2. NanoBiT標識二次抗体を用いるIndirectアッセイ
3. NanoBiT標識抗体とNanoBiT標識トレーサータンパク質を用いるCompetitiveアッセイ

このポスターではそれぞれのアッセイフォーマットについて、以下のようなアプリケーション例を紹介しています。

本ポスターでは下記のアプリケーション事例が示されています。

• Direct：サイトカインの検出
• Indirect：NF-kBシグナル伝達経路の解析（リン酸化レベルやタンパク質量の変動）
• Competitive：胎児性Fc受容体（FcRn）と抗体の結合評価

またNanoBiT™ 標識キットを用いてお持ちの抗体やタンパク質にNanoBiTを標識することで、オリジナルのアッセイ系を構築することも可能です。NanoBiT標識キット、NanoBiT™ 標識2次抗体、FcRnアッセイキットはカスタム品として販売中です。またパネル4で紹介しているサイトカイン検出キットも販売中もしくは開発中です。詳細ご希望の方はお問い合わせください。

Lumit™ Immunoassay特設ページ： https://www.promega.jp/products/small-mbrolecule-drug-discovery/immunoassay/

G-protein coupled receptors (GPCRs) は創薬標的として極めて重要な膜タンパク質ファミリーであり、市販医薬品の標的分子の約30％以上を占めるとも言われています。GPCRは細胞膜上に発現し、細胞外からのリガンド刺激に応答して、細胞内のシグナル伝達分子を活性化させることにより細胞応答を誘起します。プロメガではGPCRおよびGPCR経路の活性化や特性を、様々な高感度な発光測定系で評価するアプリケーションを確立しています。

本ポスターでは最新の技術を活用し、下記のアプリケーションを実施しています。

1. HiBiT融合GPCR発現細胞を用いた、NanoBRETでのLigand bindingアッセイ
2. 一過性発現の条件と、ゲノム編集を実施した細胞株でのLigand bindingアッセイの比較
3. HiBiT融合GPCR発現細胞を用いた、Ligand Selectivityのプロファイリング
4. HiBiT融合GPCR発現細胞を用いた、受容体の細胞内局在化とリサイクリングの評価
5. NanoBiTシステムを用いた、GPCRとβ-arrestinの会合の評価
6. Glosensor cAMPテクノロジーおよびcAMP-Gloシステムを用いた、細胞内cAMPの測定・評価

新規発光タグHiBiTは11アミン酸と小さく、タンパク構造への影響が小さくなっています。
また、ノックインも容易に行いやすくなり、生理的な発現条件下での評価を可能にします。
HiBiTと相補的なLgBiTタンパクを添加することで発光活性が亢進することを指標に、HiBiT付加GPCRの膜状の発現や、細胞内局在化、膜所へのリサイクリングの評価も可能です。
GPCRに結合するLigandを蛍光標識し、GCPRと蛍光標識リガンドが結合した際に生じるBRETよりnon-RIでのLigand bindingアッセイも可能です。
GPCRだけではなく、GPCRとβ-arrestinとの会合や、2nd messengerである細胞内cAMPの変動も発光アッセイにより評価が可能です。

高感度な発光法を活用して、プロメガではこの他にも様々なアプリケーションを確立しています。 GPCR関連の情報に関してご興味がございましたら、お気軽に担当営業または代理店にお問い合わせください。

高血圧、高血糖、中心性肥満などを特徴とするメタボリックシンドロームは、より重篤な代謝疾患である糖尿病や、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)/非アルコール性脂肪肝炎(NASH)のリスク増加に深く寄与します。
プロメガではこれまでの代謝産物測定技術を応用し、肥満症・メタボリックシンドロームに関係する因子を発光法にて高感度に測定する技術を開発しました。 NAD(P)Hを介した酵素リサイクリング法を用いて、最終的に発光シグナルにて脂質代謝産物を検出します。

本ポスターでは細胞ベースのアッセイを中心に、下記のアプリケーション例を示しています。

1. トリグリセリドの検出・測定
2. グルコース・グリセロールの検出・測定
3. インスリン刺激によるグルコール取り込み能の評価
4. HiBiTテクノロジーを活用したGLUT4の膜輸送活性の評価
5. Lumitテクノロジーを活用した、インスリンの測定

(Lumitに関しては、1342-C_SLAS2020 Promega CHeid Lumit posterおよび1064-E_SLAS2020 Promega HZegzouti Lumit cellular pathway posterもご覧ください)